專利名稱：一種肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及一種具有自發(fā)性肺高轉(zhuǎn)移潛能的人乳
腺癌細(xì)胞系及其建立方法。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，乳腺癌已經(jīng)成為嚴(yán)重危害婦女健康的首要惡性腫瘤。2008年癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào) 告指出，美國(guó)婦女如果活到85歲的話，則一生中將有1/8的人(約12. 7% )患乳腺癌。在所 有女性腫瘤中乳腺癌高居榜首，占到26%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了第2位的肺癌和第3位的結(jié)直腸癌， 更令其他癌癥望塵莫及。近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的改變，我國(guó)的乳腺癌發(fā) 病率也呈明顯上升趨勢(shì)，已在大城市女性各種惡性腫瘤中居于首位。以上海為例，自1989 年起乳腺癌已經(jīng)成為女性第一位的惡性腫瘤，1991年乳腺癌的粗發(fā)病率為36. 6/10萬(wàn)， 1997年為46. 0/10萬(wàn)，2000年為56. 2/10萬(wàn)，2004年上升為74. 2/10萬(wàn)，年均遞增3. 96% 。 臨床研究顯示，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移一直是乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。尸檢資料顯示，死 于乳腺癌的患者中，60% 80%伴有肺轉(zhuǎn)移。因此，加強(qiáng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究很有 必要，而建立可靠的肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系和動(dòng)物模型則是當(dāng)務(wù)之急。 現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了在人乳腺癌細(xì)胞系中，可用于小鼠移植瘤模型轉(zhuǎn)移研究的細(xì)胞系 有MDA-MB-435、 MDA-MB-231 、 MCF-7、 MAII禾P BCML-TA299等。其中MDA-MB-435在裸鼠乳腺 脂肪墊(mfp)原位接種后4、8和12周時(shí)肺轉(zhuǎn)移率分別為30%、70%和100%，其中，亞克隆 細(xì)胞MDA-MB-435HM在4周時(shí)肺轉(zhuǎn)移率達(dá)100% 。 MDA-MB-435作為肺高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞 系的典型代表曾被長(zhǎng)期廣泛使用。但近年來(lái)關(guān)于MDA-MB-435的細(xì)胞起源爭(zhēng)議頗大，有研究 指出該細(xì)胞系可能來(lái)自于黑色素瘤而非乳腺癌(Nat Genet，2000) ;MDA_MB_231也是一種 常用的人乳腺癌細(xì)胞系，具有成瘤率高(100% )、潛伏期短(15天)等優(yōu)點(diǎn)，但其自發(fā)性肺 轉(zhuǎn)移率不高，一般不超過(guò)10%。顯而易見(jiàn)，直接用MDA-MB-231進(jìn)行肺轉(zhuǎn)移相關(guān)研究并非所 宜。所幸已有人從MDA-MB-231中分離出一種高轉(zhuǎn)移性亞克隆MDA-MB-231LM2 (4175)，只用 相當(dāng)少的該細(xì)胞(2X103)尾靜脈注射即可使小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，左心室注射可成功建立骨轉(zhuǎn) 移模型。在13只mfp原位接種該細(xì)胞(1 X 106)的BALB/c裸鼠中到38天時(shí)計(jì)有7只檢出 了肺部轉(zhuǎn)移灶，肺轉(zhuǎn)移率為53.8% (Nature, 2005)。鑒于經(jīng)尾靜脈一次性大量注射癌細(xì)胞 造成的肺轉(zhuǎn)移在很大程度上偏離臨床實(shí)際情況，而原位接種該細(xì)胞時(shí)的自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率仍 然較低(約50% )且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)(歷時(shí)超過(guò)5周)，因此認(rèn)為從MDA-MB-231中分離出自 發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率更高的亞克隆細(xì)胞系既是必要的，也是可能的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系一MDA-MB-231/08-001H。本
發(fā)明的肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系能用于乳腺癌肺轉(zhuǎn)移機(jī)理及相關(guān)藥物的研究。 本發(fā)明采用美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的人乳腺癌細(xì)胞系
MDA-MB-231 (ATCC編號(hào)HTB-26，由一位51歲高加索女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離而得)為親本細(xì)胞，通過(guò)組合利用scid和BALB/c皿/皿小鼠、尾靜脈注射和乳腺脂肪墊 (mfp)交叉接種、原位移植瘤卸載促轉(zhuǎn)移灶形成、體內(nèi)連續(xù)篩選、體外擴(kuò)增和傳代等策略，分 離得到了具有自發(fā)性肺高轉(zhuǎn)移潛能的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/08-001H，已于2008年8 月25日保藏，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，北京市 朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101，保藏編號(hào)CGMCC No. 2635，分類命名人 乳腺癌細(xì)胞系。 本細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性經(jīng)微衛(wèi)星DNA檢領(lǐng)U，結(jié)果顯示 MDA-MB-231/08-001H與其親本細(xì)胞MDA-MB-231均為人源性細(xì)胞，但兩者之間至少有92 個(gè)差異表達(dá)基因；在體外的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力和侵襲能力均高于其親本細(xì)胞；在scid 小鼠和BALB/c裸小鼠移植瘤模型其成瘤性和肺轉(zhuǎn)移率均顯著性地超過(guò)親本細(xì)胞。接種 MDA-MB-231/08-001H細(xì)胞4周后在scid小鼠其原位瘤體積為4224. 67 ±1038. 95mm3，重量 為2. 09±0. 51g(n = 6)，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率為100%，轉(zhuǎn)移灶中位數(shù)為41個(gè)/肺。與此相對(duì)， 接種MDA-MB-231細(xì)胞后原位瘤體積為749. 63±282. 35mm3，重量為0. 37±0. 13g(n = 6)， 自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率為0% 。在BALB/c裸小鼠也得到了類似的結(jié)果。
本發(fā)明的細(xì)胞系具有以下特點(diǎn) 1)遺傳背景清楚，生物學(xué)特性穩(wěn)定。該細(xì)胞系來(lái)自于廣泛使用的人乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231，經(jīng)鑒定屬于人源性細(xì)胞，其生長(zhǎng)、侵襲能力、成瘤性等基本生物學(xué)特性與親本 細(xì)胞一致，經(jīng)多次傳代及修飾后仍保持穩(wěn)定。 2)應(yīng)用面寬，適宜于在多種免疫缺陷動(dòng)物建立人乳腺癌移植瘤模型。該細(xì)胞系既 可在T、 B細(xì)胞雙重缺陷的scid小鼠建立移植瘤模型，也可在只有T細(xì)胞缺陷的BALB/c裸 小鼠成功地建立移植瘤模型。 3)建立模型的方法接近于臨床實(shí)際情況，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率高，實(shí)驗(yàn)周期短。該細(xì)胞
系采用乳腺脂肪墊(mfp)接種，無(wú)論在scid小鼠還是在BALB/c裸小鼠均可穩(wěn)定可靠地建
立起移植瘤模型，4周時(shí)的肺轉(zhuǎn)移率可達(dá)100%，轉(zhuǎn)移灶密集且常有融合趨勢(shì)。 本發(fā)明細(xì)胞系及由此建立的動(dòng)物模型能模擬從腫瘤細(xì)胞在植入位點(diǎn)的生長(zhǎng)到在
靶器官形成轉(zhuǎn)移灶的全過(guò)程，與臨床實(shí)際情況十分吻合，可以方便地用于乳腺癌肺轉(zhuǎn)移機(jī)
理及相關(guān)藥物的研究。


圖1是人乳腺癌MDA-MB-231/08-001H細(xì)胞系在scid小鼠的移植瘤。 圖2人乳腺癌MDA-MB-231/08-001H細(xì)胞系在scid小鼠和BALB/c裸鼠的肺轉(zhuǎn)移，
其中的箭頭所指是轉(zhuǎn)移灶。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的篩選和建系 本發(fā)明所涉及的細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FCS)的Leibovitz's L_15細(xì)胞 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度為37t:，氣體環(huán)境為5% 0)2/95%空氣，濕度為飽和濕度。傳代時(shí)，用 0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1 : 3的比例傳代。
1.肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的首輪篩選
①將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的MDA-MB-231細(xì)胞用0. 25%的胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞 懸液； ②無(wú)菌條件下，用lml注射器將腫瘤細(xì)胞接種于6周齡BALB/c雌性裸小鼠(BALB/ c皿de mice)左側(cè)第二乳頭的脂肪墊(mfp)或直接注射入尾靜脈(i.v.)，容量調(diào)整為 1 X 107細(xì)胞/0. lml/只(mfp)或2 X 106細(xì)胞/0. lml/只(i. v.); ③常規(guī)飼養(yǎng)4周后，斷頭放血，處死裸小鼠，并用75%的酒精浸泡消毒5分鐘； ④無(wú)菌操作，解剖裸小鼠，完整取出雙側(cè)肺，在生理鹽水中漂洗3次； ⑤在解剖顯微鏡下，用眼科剪剪取肺轉(zhuǎn)移灶，將其剪碎后，移至6孔板中培養(yǎng)； ⑥待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基； ⑦用半消化法和半機(jī)械法清除成纖維細(xì)胞； ⑧體外繼續(xù)擴(kuò)增本輪篩選所得的腫瘤細(xì)胞，部分用于下輪篩選，部分予以凍存?zhèn)?用。 肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的連續(xù)篩選和建系 同法進(jìn)行第2 6輪肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞的篩選，各輪所得的細(xì)胞分別命名為ml 5 (mfp 接種)、vl 5 (尾靜脈注射)或[v (n)m(n) ] (n = 1 5)(尾靜脈注射+mfp接種)。其中 2m4在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)逾20代，成為連續(xù)傳代的細(xì)胞系，命名為MDA-MB-231/08-001H。
MDA-MB-231/08-001H在經(jīng)蟲(chóng)熒光素酶(luciferase)和綠色熒光蛋白(GFP)的基 因修飾后，其成瘤性、肺轉(zhuǎn)移特性保持穩(wěn)定。 本發(fā)明通過(guò)組合利用scid和BALB/c皿/nu小鼠、尾靜脈注射和乳腺脂肪墊(mfp)
交叉接種、原位移植瘤卸載促轉(zhuǎn)移灶形成、體內(nèi)連續(xù)篩選、體外擴(kuò)增和傳代等策略，分離得 到了具有自發(fā)性肺高轉(zhuǎn)移潛能的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/08-001H。該細(xì)胞系體外培養(yǎng) 生長(zhǎng)良好，每5天傳代一次。 MDA-MB-231/08-001H和親本MDA-MB-231在D14S68微衛(wèi)星位點(diǎn)上均擴(kuò)增出與人乳 腺癌組織相同片段的產(chǎn)物，而裸鼠正常組織未見(jiàn)擴(kuò)增片段，表明MDA-MB-231/08-001H與人 乳腺癌組織的同源性，并且MDA-MB-231/08-001H在異種移植、裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代及體外培 養(yǎng)過(guò)程中具有遺傳穩(wěn)定性。 本發(fā)明采用CCK8法描記MDA-MB-231/08-001H和MDA-MB-231的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線， 結(jié)果表明，MDA-MB-231/08-001H細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力高于其親本細(xì)胞；流式細(xì)胞儀分析 的結(jié)果顯示，在MDA-MB-231/08-001H和MDA-MB-231細(xì)胞中，S期細(xì)胞所占的比例分別為 60. 44%和45. 10%。 實(shí)施例2小鼠移植瘤及肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)
1.BALB/c裸小鼠 ①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231和MDA-MB-231/08-001H細(xì)胞用0. 25%的胰蛋 白酶消化，分別制成單細(xì)胞懸液； ②無(wú)菌條件下，用lml注射器將腫瘤細(xì)胞接種于裸小鼠左側(cè)第二乳頭的脂肪墊， 接種量為1 X 107細(xì)胞/0. lml/只； ③隔天觀察裸小鼠的健康狀況和腫瘤細(xì)胞的成瘤性； ④4周后，各組隨機(jī)抽取6只裸小鼠，取其肺用Bouin氏液固定24小時(shí)，再用無(wú)水 酒精浸泡至肺組織顏色恢復(fù)，轉(zhuǎn)移灶為白色結(jié)節(jié)為止，并于解剖顯微鏡下觀察記錄各肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量；切取部分移植瘤行常規(guī)病理檢查，多余部分保存于液氮中。
2. scid小鼠 以6周齡雌性scid小鼠為對(duì)象，方法同BALB/c裸小鼠實(shí)驗(yàn)。尾靜脈注射量為 2 X 106細(xì)胞/0. lml/只，mfp接種量為1 X 107細(xì)胞/0. lml/只。
結(jié)果顯示 Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，MDA-MB-231/08-001H細(xì)胞較其親本細(xì)胞有更強(qiáng)的侵 襲能力。前者穿透人工基底膜的細(xì)胞數(shù)是182士14/HP，后者穿透人工基底膜的細(xì)胞數(shù)是 94±6. 3/HP(P = 0. 01)。 接種MDA-MB-231/08-001H細(xì)胞4周后在scid小鼠其原位瘤體積為 4224. 67±1038. 95mm3，重量為2. 09±0. 51g(n = 6)，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率為100%，轉(zhuǎn)移灶中位 數(shù)為41個(gè)/肺。與此相對(duì)，接種MDA-MB-231細(xì)胞后原位瘤體積為749. 63±282. 35mm3，重 量為O. 37±0. 13g(n = 6)，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率為OX。在BALB/c裸小鼠也得到了類似的結(jié)果。
權(quán)利要求
一種肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系，其特征是所述的細(xì)胞系為肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/08-001H，保藏編號(hào)CGMCC No.2635，具有以下生物學(xué)特性為人源性細(xì)胞，與其親本細(xì)胞有92個(gè)差異表達(dá)基因；體外細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力和侵襲能力高于其親本細(xì)胞；成瘤性和肺轉(zhuǎn)移率超過(guò)親本細(xì)胞，接種4周后scid小鼠原位瘤體積為4224.67±1038.95mm3，重量為2.09±0.51g，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率較親本細(xì)胞高，轉(zhuǎn)移灶數(shù)目較親本細(xì)胞多。
2. 按權(quán)利要求l所述的肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系，其特征是所述的親本細(xì)胞是 MDA-MB-231， ATCC編號(hào)HTB-26。
3. 按權(quán)利要求1所述的肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系，其特征是所述的細(xì)胞系其生物學(xué) 特性經(jīng)多次傳代及修飾后保持穩(wěn)定。
4. 按權(quán)利要求1所述的肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系，其特征是所述細(xì)胞系能在T、B細(xì) 胞雙重缺陷的scid小鼠建立移植瘤模型和/或在只有T細(xì)胞缺陷的BALB/c裸小鼠建立移 植瘤模型。
5. 按權(quán)利要求1所述的肺高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系，其特征是所述的細(xì)胞系自發(fā)性肺 轉(zhuǎn)移率為100%，轉(zhuǎn)移灶中位數(shù)為41個(gè)/肺。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及一種具有自發(fā)性肺高轉(zhuǎn)移潛能的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/08-001H及其建立方法。本細(xì)胞系為人源性細(xì)胞，與其親本細(xì)胞有92個(gè)差異表達(dá)基因；體外細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力和侵襲能力高于其親本細(xì)胞；成瘤性和肺轉(zhuǎn)移率超過(guò)親本細(xì)胞，接種4周后scid小鼠原位瘤體積為4224.67±1038.95mm3，重量為2.09±0.51g，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移率為100％，轉(zhuǎn)移灶中位數(shù)為41個(gè)/肺。本發(fā)明細(xì)胞系及由此建立的動(dòng)物模型能模擬從腫瘤細(xì)胞在植入位點(diǎn)的生長(zhǎng)到在靶器官形成轉(zhuǎn)移灶的全過(guò)程，與臨床實(shí)際情況十分吻合，可以方便地用于乳腺癌肺轉(zhuǎn)移機(jī)理及相關(guān)藥物的研究。
文檔編號(hào)C12R1/91GK101775369SQ20091017445
公開(kāi)日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日
發(fā)明者侯意楓, 歐周羅, 羅建民, 邵志敏 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院