專利名稱：豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型多重實時熒光pcr檢測引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實時熒光PCR檢測方法，具體涉及豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與 豬圓環(huán)病毒2型多重STOR Green I實時熒光PCR檢測引物及方法。
背景技術(shù)：
豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCW)都能夠不同程 度的導(dǎo)致妊娠母豬的繁殖障礙，引起母豬流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊化及不孕 等，在豬群中具傳播快、胚胎致死率高、流行范圍廣、傳播途徑多、病原體頑固等特點，每年 給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。而且經(jīng)?；旌细腥?，靠中和試驗和分離病毒來確診容易造成假 陰性，而且操作繁瑣，所需時間長，尋求一種操作簡單、快速的檢測、鑒別診斷方法是防制這 類疾病的基礎(chǔ)。目前，針對以上三種病毒病的診斷方法有很多，這些方法具有操作復(fù)雜、費時費 力、敏感度差及陰性率高等缺點；臨床已經(jīng)使用的PCR診斷技術(shù)，雖然有靈敏度高、特異性 強(qiáng)、快速、簡便等優(yōu)點，但不能準(zhǔn)確定量；基于TaqMan技術(shù)熒光定量PCR方法能定量，但是 成本較高，且需要合成特異性探針。亟需研究和開發(fā)簡便、快速、特異、成本低、定量的檢測 方法。STOR Green I是非特異性結(jié)合于雙鏈DNA的熒光染料，可以和多種擴(kuò)增序列結(jié)合。 SYBRGreen I實時熒光PCR檢測方法可以不用設(shè)計和合成特異的熒光標(biāo)記的探針直接擴(kuò)增 檢測任何基因的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題設(shè)計與合成出豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒 2型引物后，利用引物用STOR Green I實時熒光PCR檢測方法同時檢測出豬偽狂犬病毒、豬 細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型三種病毒。本發(fā)明的技術(shù)方案是豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型多重STOR Green I實時熒光PCR檢測引物的序列如下豬圓環(huán)病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘；下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；豬細(xì)小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'；豬偽狂犬病毒引物的序列如下上游引物Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。利用上述引物檢測豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型的多重SYBRGreen I實時熒光PCR檢測方法，包括提取樣品的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光 PCR反應(yīng)體系和STOR Green I實時熒光PCR擴(kuò)增程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測。所述STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份SYBR Green I PreMix 17 μ 1所述SYBR Green I實時熒光PCR擴(kuò)增程序為95°C預(yù)變性5min ；進(jìn)入循環(huán)，95°C 變性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95°C，然后再降至 65°C，開始以0. 5°C /s遞增至95°C檢測熒光信號得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。本發(fā)明的有益效果是能夠同時有效診斷和檢測出PPV、PRV和PCV2三種病毒。能 最少檢測出189拷貝豬偽狂犬病毒質(zhì)粒、203拷貝豬細(xì)小病毒質(zhì)粒和173拷貝豬圓環(huán)病毒 2型質(zhì)粒，不能檢測出非特異的豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬流感病毒，有利于 妊娠母豬繁殖障礙性病毒的鑒別與診斷，并且具有的較好敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，為PRV、 PPV.PCV2的檢測提供了一種新的方法，可作為規(guī)?；i場PRV、PPV、PCV2的凈化檢測方法， 建立無PRV、PPV、PCV2的豬群，同時也為PRV、PPV、PCV2感染的分子流行病學(xué)調(diào)查，研究PRV、 PPV、PCV2分子發(fā)病機(jī)制，早期診斷，診斷試劑盒的研制與開發(fā)，藥物或疫苗的免疫機(jī)制提供 了試驗依據(jù)和技術(shù)手段。


圖1為PRV gH基因質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果；圖2為PPV VP2部分基因質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果；圖3為PCV20RF2部分基因質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果；其中，圖1，圖2，圖3中1.目的片段M. DL 2000Marker圖4為多重STOR Green I熒光定量PCR反應(yīng)溶解曲線；圖5為多重STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)特異性試驗溶解曲線；圖6為多重STORGreen I實時熒光PCR反應(yīng)同一濃度重復(fù)性試驗溶解曲線；圖7為多重STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)不同濃度重復(fù)性試驗溶解曲線。
具體實施例方式實施例豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型多重STOR Green I實時熒光PCR檢 測引物的序列如下豬圓環(huán)病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3'；下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；PlP5P2 P6DNAddH20_
0. 5+0. 5+0. 5 μ 1 0. 5+0. 5+0. 5 μ 1 1 + 1 + 1 μ 1 2μ 1
豬細(xì)小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'；豬偽狂犬病毒引物的序列如下上游引物Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。利用上述引物檢測豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型的多重STOR GreenI實時熒光PCR檢測方法，包括提取樣品的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光 PCR反應(yīng)體系和STOR Green I實時熒光PCR擴(kuò)增程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測。
所述STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份
SYBR Green I PreMix 17 μ 1
Ρ1/Ρ3/Ρ50. 5+0. 5+0. 5 μ 1
Ρ2/Ρ4/Ρ60. 5+0. 5+0. 5 μ 1
DNA1+1+1 μ 1
(MH2O2 μ 1_25 μ 1所述SYBR Green I實時熒光PCR擴(kuò)增程序為95°C預(yù)變性5min ；進(jìn)入循環(huán)，95°C 變性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95°C，然后再降至 65°C，開始以0. 5°C /s遞增至95°C檢測熒光信號得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。上述實施例中，關(guān)于材料和方法如下1材料與方法1. 1 材料1. 1. 1毒株、細(xì)胞株和菌株P(guān)K-15細(xì)胞，豬偽狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株均購自中國獸藥監(jiān)察所；豬細(xì)小病毒，豬圓環(huán) 病毒2型，豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬瘟病毒和豬流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株均購自河南省動物 性食品安全重點實驗室；工程菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞購自大連寶生物工程有限公司。1. 1. 2常用溶液及培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)貯存液，100mg/ml ；IPTG濃度為 100mg/ml ；X-gal濃度為20mg/ml，保存于棕色瓶內(nèi)或用鋁箔包裹的瓶內(nèi)，以上溶液均貯存 于-20°C備用。1. 1. 3主要儀器及試劑紫外凝膠成像系統(tǒng)購自美國ALPHA INNOTECH公司；Rotor-Gene 3000型實時定量 PCR擴(kuò)增儀購自澳大利亞基因公司、PTC-200型PCR儀購自美國MJ公司、3K30型高速冷凍 離心機(jī)購自德國SIGMA公司等。SYBR Green I PreMix ；EX TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000購自大連寶生物工 程有限公司；Protein K購自華美生物工程公司；DMEM培養(yǎng)基購自GIBC0BRL公司；胎牛血 清購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自LTI公司；T4DNA連接酶、PGEM-T Easy質(zhì)粒載體均購 自!Iomega公司；DNA凝膠回收試劑盒購自杭州維特潔生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物公司。1. 2 方法1. 2. 1PCV2的培養(yǎng)增殖將PCV2同步接種于未貼壁的冊-15細(xì)胞，接毒量為培養(yǎng)液的1/10，將細(xì)胞置于 37V,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 后，終止培養(yǎng)并收毒。反復(fù)凍融2 3次，收集病毒液， 直接進(jìn)行病毒RNA的提取或-80°C貯存?zhèn)溆谩?. 2. 2PPV的培養(yǎng)增殖將處于對數(shù)生長期的PK-15細(xì)胞用0. 25%的胰酶消化后，放入37°C,5% CO2的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁長至生長表面的60% 70%時，取出培養(yǎng)瓶用PBS液洗2 3次 后，按培養(yǎng)液1/10體積的接種量接種PPV病毒，然后將細(xì)胞置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)7 后收毒。將收集的病毒液反復(fù)凍融3 次，直接進(jìn)行病毒DNA的提取或_70°C貯存?zhèn)溆谩?. 2. 3PRV的培養(yǎng)增殖當(dāng)H(-15細(xì)胞達(dá)90%以上時，接種100TCID5(1PRV，37°C吸附lh，洗去未吸附病毒，加 入適量的細(xì)胞維持液，待細(xì)胞病變達(dá)到70%時，終止培養(yǎng)，反復(fù)凍融2 3次，收集病毒液， 直接進(jìn)行病毒DNA的提取或_80°C貯存?zhèn)溆谩?.2. 4引物設(shè)計與合成以GenBank公布豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因為參照序列(AF027217)，豬細(xì)小病毒 NADL-2株(NC001718)VP2基因序列，Klupp等報道的豬偽狂犬病毒gH基因序列，用I^rimer Premier5. 0生物軟件分別設(shè)計出1對特異性引物，預(yù)計擴(kuò)增片段分別為171bp、313bp和 35^p，引物的序列如下豬圓環(huán)病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘；下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；豬細(xì)小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3'；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'；豬偽狂犬病毒引物的序列如下上游引物Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。1. 2. 5PCV2、PPV、PRV 病毒 DNA 的提取傳統(tǒng)的蛋白酶K提取方法取增殖的病毒液各450μ 1，加入等體積樣品裂解緩沖 液
，混勻，再加入蛋白酶 K (終 濃度為200 μ g/m L)，56°C水浴lh，然后加入等體積的平衡酚，混勻，IOOOOrpm離心5min。 取上清，經(jīng)酚氯仿異戊醇05 24 1)再次抽提后用2倍體積的異丙醇沉淀，-200C 放置30min，12000rpm離心lOmin，70 %乙醇洗滌2次，干燥，加入25 μ 1超純水溶解，貯存 于-20°C備用。1. 2. 6豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒cDNA的制備
分別取400 u l的病毒液，加入400 u l Trizol，劇烈振蕩；加入100 u l氯仿異戊醇(241)劇烈振蕩30s，混勻；放入臺式離心機(jī)12000rpm，室溫離心5min；取上層水相，小心轉(zhuǎn)移至經(jīng)DEPC水處理過的1．5ml無菌離心管中，加入150 u l無水乙醇，混勻；將上步中的溶液全部轉(zhuǎn)移到UnLQ一10柱子中，室溫放置2min，使溶液中的RNA盡可能的與柱子的濾膜相結(jié)合，8000rpm，離心lmin；取出柱子棄去收集管中的廢液，將柱子放入收集管中并加入450 u 1RPE Solution，室溫靜置2min，10000rpm，離心30s，并重復(fù)一次；取出柱子，棄去廢液，12000rpm，空離3min；取出柱子，放入經(jīng)DEPC水處理過的1．5ml無菌離心管中，于柱內(nèi)膜中央加入16 u l DEPC水，55—80℃放置2min；10000rpm，離心lmin，收集管內(nèi)溶液，其中含有所抽提的三種病毒的RNA，可立即使用或一70℃貯存?zhèn)溆谩?br> 在提取的三種病毒的RNA中分別加入反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物(10pmol／u 1)，4 u ldNTP(2．5mmol／L)，70℃放置5min，冰浴2min；加入4 u l反轉(zhuǎn)錄Buffer，2 u l 0．1M DTT，l u l Rnaseinfnibitor(40u／IX 1)，42℃放置2min；加入l u 1M—MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200u／u 1)，42℃作用lh，70℃放置15min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA于一20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 1．2．7質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品的制備
以提取的PCV2DNA、PRV DNA和PPV DNA為模板，用優(yōu)化的條件擴(kuò)增ORF2基因片段、州基因片段和NSl基因片段。在50 u l反應(yīng)體系中分別依次加入lo×PCR緩沖液5 u l，MgCl，3mmol／L，dNTPs濃度為200 u m／L，Taq酶1U，引物濃度P1／Pa／P5、P2／P4／P6為0．5 u l，模板5 u l，最后用雙蒸水補(bǔ)至50 u l，將EP管置PCR儀，按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增95℃預(yù)變性5min后，進(jìn)入循環(huán)95℃30s，55℃30s，72℃40s，30個循環(huán)后，72℃延伸10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。2．5％瓊脂糖凝膠電泳。
將擴(kuò)增出目的片段按膠回收試劑盒回收，按照載體連接試劑盒將目的片段與pGEM—TEasy載體相連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測序。經(jīng)測序驗證的陽性質(zhì)粒作為模板標(biāo)準(zhǔn)品，并分別命名為pGEM—VP2、pGEM—gH和pGEM—PCV2。
1．2．8PPV、PRV、PCV2多重SYBR Green工實時熒光PCR反應(yīng)體系條件的優(yōu)化
SYBR Green工實時熒光PCR反應(yīng)體系如下
在25 u l體系中加入以下成份
SYBR Green工PreMix15 u l
P1／Pa／P50．5+0．5+0．5 ix l
P2／P4／P60．5+0．5+0．5 ix l
DNA1+1+1 IX l
ddH。04 IX l[Oloo]
0]]25 u l
瞬時離心后，將EP管置于熒光定量PCR儀上95℃預(yù)變性5min；進(jìn)入循環(huán)，95℃變性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95℃，然后再降至65℃，開始以0．5℃／s遞增至95℃檢測熒光信號得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。同時設(shè)立無模板的陰性對照。本發(fā)明反應(yīng)條件的優(yōu)化是在3種病毒質(zhì)粒模板等量的條件下進(jìn)行的。
1．2．8．1引物濃度的優(yōu)化
分別以50pmol/y 1 的引物濃度 0. 2 μ 1、0· 3μ 1、0· 4μ 1、0· 5μ 1、0· 6μ 1、0· 7μ 1、 0.8μ 1、0.9μ 1進(jìn)行STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)，以選取擴(kuò)增該病毒的最佳引物濃度。 添加時取相等體積的引物量。1.2.8. 2退火溫度的優(yōu)化多重SYBR Green I 實時熒光 PCR 分別以 52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C 的退火溫度進(jìn)行反應(yīng)，以確定最佳的退火溫度。1. 2. 8. 3SYBR PreMix 濃度的優(yōu)化本發(fā)明中熒光染料預(yù)混酶STOR Green I PreMix的濃度是5υ/μ 1，固定STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系的總體積，通過改變熒光染料預(yù)混酶STOR PreMix的添加量 來篩選STOR Green I熒光定量PCR反應(yīng)體系中STOR PreMix的最佳濃度。分別以10 μ 1、 12μ 1、15μ 1、17μ 1、20μ 1、22μ 1 的濃度進(jìn)行篩選。1.2. 9特異性檢驗按照STOR Green I熒光定量反應(yīng)體系，分別加入PCV2、PPV、PRV細(xì)胞毒DNA 1 μ 1 (約20ng)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞毒cDNA 1 μ 1 (約20ng)，豬流感病毒細(xì)胞毒 cDNA 1 μ 1 (約20ng)，豬瘟病毒細(xì)胞毒cDNA 1 μ 1 (約20ng)，同時設(shè)陰性對照，驗證其特異性。1.2. 10重復(fù)性檢驗選取PCV2、PPV、PRV同一濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多重SYBR Green I實時熒光PCR 反應(yīng)重復(fù)性試驗，反應(yīng)重復(fù)3次；將不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多重STOR Green I實時 熒光PCR反應(yīng)重復(fù)性試驗，反應(yīng)重復(fù)3次；通過每種病毒的Tm值和溶解曲線的分析，驗證 PCV2、PPV、PRV多重STOR Green I實時熒光PCR方法的穩(wěn)定性。1.2. 11實時熒光PCR敏感性測定分別將PCV2、PPV、PRV的重組質(zhì)粒測OD26tl值，計算出每微升的拷貝數(shù)，然后進(jìn)行 10倍梯度稀釋，以此作為模板進(jìn)行多重STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)，進(jìn)而確定多重 SYBRGreen I實時熒光PCR反應(yīng)檢測每種病毒的敏感性。1. 2. 12疑似PCV2、PPV、PRV病料樣品檢測及與常規(guī)PCR檢測方法的比較取采自河南省鄭州、洛陽、南陽地市豬場的疑似PCV2、PPV、PRV感染的病料進(jìn)行多 重STOR Green I實時熒光PCR和檢測，以證實該方法的實用性。2 結(jié)果2.1質(zhì)粒PCR擴(kuò)增如圖1，圖2，圖3的PRV gH基因、PPV VP2、PCV20RF2部分基因質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果所 示，分別擴(kuò)增出了與預(yù)計大小相一致的171bp、355bp和31!3bp的片段。pGEM-PCV、pGEM_PRV 和pGEM-PPV經(jīng)EcoR I酶切鑒定，得到產(chǎn)物與預(yù)期的條帶一致。測序與國內(nèi)流行的毒株相 比，核苷酸同源性在99. 6%,99. 8%,99. 7%以上。測得提取的PPV、PCV2、PRV質(zhì)粒DNA濃度分別為pGEM_VP2質(zhì)量濃度=141 μ g/ ml, pGEM-PCV2 質(zhì)量濃度=77. 5 μ g/ml, pGEM-gH 質(zhì)量濃度=145 μ g/ml。經(jīng)計算， PPVpGEM-VP2 質(zhì)粒濃度為 7. 86X IO13 拷貝 /ml，pGEM-PCV 質(zhì)粒濃度為 4. 53X IO13 拷貝 /ml， pGEM-gH質(zhì)粒濃度為8. 00X IO13拷貝/ml。2. 2PPV、PRV、PCV2多重STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果[O122] SYBR Green工雖然是一種無特異性的熒光染料，但在進(jìn)行多重PCR試驗時，它并非均一的和所有的目的片段結(jié)合，而是會和某些片段優(yōu)先結(jié)合，這就需要對反應(yīng)體系進(jìn)行條件優(yōu)化，保證體系中有足夠的染料和各種引物的比例適中。[O123] 2．2．1引物濃度優(yōu)化結(jié)果
PCV21PPV1PRY引物均采用50pmoL／u 10．5 u l的量在25 u l體系中進(jìn)行反應(yīng)，能夠產(chǎn)生特異性的單一峰值，陰性對照無特異性峰值產(chǎn)生。PCV21PPV1PRY多重SYBR Green工實時熒光PCR反應(yīng)的最佳引物濃度均為0．5 u l。[O125] 2．2．2退火溫度優(yōu)化結(jié)果
PPV1PRY1PCV2在退火溫度55℃時，均產(chǎn)生了特異性的峰值。PCV2／m值分別為81．5℃，81．5℃，81．3℃；PRY／m值分別為87．7℃，87．7℃，87．2℃；PPV／m值分別為74．2℃，74．6℃，74．9℃。陰性對照均無特異性峰值產(chǎn)生。PPV1PRY1PCV2多重SYBR Green工實時熒光PCR反應(yīng)的最佳退火溫度為55℃。[O127] 2．2．3SYBR Green工PreMix濃度的優(yōu)化結(jié)果[O128] PPV1PRY1PCV2多重SYBR Green工實時熒光PCR反應(yīng)中SYBR Green工PreMix添加量在17 u l時，三者均可產(chǎn)生特異性的峰值，陰性對照無特異性峰值產(chǎn)生。
2．3多重SYBR Green工實時熒光PCR反應(yīng)體系的確定[O130] 通過各個反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定了PPV1PRY1PCV2多重SYBR Green工實時熒光PCR反應(yīng)體系，在25 u l體系中加入以下成份
3]] SYBR Green工PreMix17 u l
P1／P3／P50．5+0．5+0．5 u l
P2／P4／P60．5+0．5+0．5 u l[O134] DNA1+1+1 u l[O135] ddH。02 u l[O136]．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一一[O137]25 u l
該反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)最終確定為95℃預(yù)變性5min；進(jìn)入循環(huán)，95℃變性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95℃，然后再降至65℃，開始以0．5℃／s遞增至95℃檢測熒光信號得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。[O139] 2．4PCV21PPV1PRY多重SYBR Green工實時熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線及PCV21PPV1PRY Tm值的確定
本發(fā)明利用Tm值的不同進(jìn)行核酸片段的區(qū)分，核酸片段的Tm值主要與GC含量1序列長度和序列結(jié)構(gòu)有關(guān)。PRY的擴(kuò)增片段基因序列長355bp，GC含量比一般病毒高，其Tm值最高，達(dá)到了87℃以上，很容易與其他病毒區(qū)分；PCV2擴(kuò)增片段長17lbp，Tm值比PRY的低，在82℃左右；PPV的擴(kuò)增片段為313bp，GC含量相對最低，Tm值比PRY1PCV2的Tm值都低，況且PRY1PPV和PCV2三者擴(kuò)增產(chǎn)物的長度也不同，所以PRY1PPV1PCV2的Tm值可以很好的區(qū)分。
按照PCV21PPV1PRY多重SYBR Green工實時熒光PCR反應(yīng)條件，以PCV21PPV1PRY的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)軟件Rotor—gen6．0分析后得到溶解曲線如圖4所示，從圖中可以看出三個特異性的峰值所對應(yīng)的溫度即為PRY擴(kuò)增片段的Tm值1PPV擴(kuò)增片段的Tm值和PCV2擴(kuò)增片段的Tm值，但是它們并不是固定不變的，它們的Tm值會在一定的溫 度范圍內(nèi)變動，通過多個批次試驗數(shù)據(jù)的收集整理后，最終確定了 PCV2、PPV、PRV 3種病毒 的 Tm 值，分別為:PCV280 81. 2°C，PRV 86 87. 5°C，PPV 73. 5 75. 2°C。陰性對照則 無峰值產(chǎn)生。三種病毒的Tm值相差較大，因此，可以利用三者擴(kuò)增產(chǎn)物片段Tm值的不同及 溶解曲線的3個特異性的峰進(jìn)行診斷與鑒別區(qū)分。2. 5多重STOR Green I實時熒光PCR特異性檢驗結(jié)果從PCV2、PPV、PRV多重STOR Green I實時熒光PCR特異性試驗結(jié)果如圖5所示， 從圖中可以看出，對照組中豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒及陰性對照均 無特異性峰值產(chǎn)生。只有試驗組中的PCV2、PPV、PRV多重實時熒光PCR產(chǎn)生了特異性的三 個峰值。PCV2 Tm 值為 80. 5 °C，PPV Tm 值為 74. 5 °C，PRV Tm 值為 87. 5 °C。2. 6多重STOR Green I實時熒光PCR重復(fù)性試驗結(jié)果2. 6. 1同一濃度的PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I實時熒光PCR重復(fù)性試驗結(jié)
果3次重復(fù)性試驗中，各個病毒的Tm值都較為穩(wěn)定。如表1，圖6所示，對照組中豬 繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒及陰性對照均無特異性峰值產(chǎn)生。同濃度 的PCV2、PPV、PRV多重STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)具有很好的穩(wěn)定性。表1多重STOR Green I實時熒光PCR的同一濃度重復(fù)性試驗分析
權(quán)利要求
1.豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型多重STORGreen I實時熒光PCR檢測 引物，其特征在于豬圓環(huán)病毒2型引物的序列如下 上游引物 Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘； 下游引物 P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘； 豬細(xì)小病毒引物的序列如下 上游引物 P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘； 下游引物 P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'； 豬偽狂犬病毒引物的序列如下 上游引物 Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'； 下游引物 Ρ6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。
2.利用權(quán)利要求1所述引物檢測豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型的多重 SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取樣品的DNA后，按如下STOR Green I實時 熒光PCR反應(yīng)體系和STOR Green I實時熒光PCR擴(kuò)增程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測，其特征在于所述STOR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份SYBR Green I PreMix 17 μ 1Ρ1/Ρ3/Ρ50. 5+0. 5+0. 5 μ 1Ρ2/Ρ4/Ρ60. 5+0. 5+0. 5 μ 1DNA1+1+1 μ 1ddH2O2 μ 1 .25 μ 1所述STOR Green I實時熒光PCR擴(kuò)增程序為95°C預(yù)變性5min ；進(jìn)入循環(huán)，95°C變性 15s, 55°C退火20s，72°C延伸20s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95°C，然后再降至65°C， 開始以0. 5°C /s遞增至95°C檢測熒光信號得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型多重SYBR Green I實時熒光PCR檢測引物及方法，設(shè)計合成出引物，利用引物檢測豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型的多重SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取樣品的DNA后，利用SYBR Green I實時熒光PCR反應(yīng)體系和SYBR Green I實時熒光PCR擴(kuò)增程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測。本發(fā)明的有益效果是能夠同時有效診斷和檢測出豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒2型三種病毒，不能檢測出非特異的豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬流感病毒，有利于妊娠母豬繁殖障礙性病毒的鑒別與診斷，并且具有的較好敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。
文檔編號C12R1/93GK102071259SQ200910172719
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者黨玉麗, 崔保安, 李明鳳, 胡慧, 郭顯坡, 陳紅英, 魏戰(zhàn)勇 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)