專利名稱：茶樹(shù)胞質(zhì)型蘋(píng)果酸脫氫酶基因及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶樹(shù)胞質(zhì)型蘋(píng)果酸脫氫酶基因及其編碼蛋白。
背景技術(shù)：
蘋(píng)果酸脫氫酶廣泛分布在生物體內(nèi)，存在于乙醛酸體的gMDH、線粒體的 mMDH、過(guò)氧化物酶體的pMDH、葉綠體的chMDH、細(xì)胞質(zhì)的cyMDH，雖然上述蘋(píng)果 酸脫氫酶的功能不同、組織上存在著差異，細(xì)胞內(nèi)定位不同、表達(dá)的種類不同， 但是均屬于MDH同工酶。目前MDH同工酶被廣泛應(yīng)用于生物分子系統(tǒng)學(xué)分析、遺 傳多樣性及變異、個(gè)體發(fā)育和物種雜交等研究中。同工酶是同一種或?qū)僦校?不同基因位點(diǎn)或等位基因編碼的多肽鏈單體，呈純聚體或雜聚體，它們的一級(jí) 結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生理功能有所不同，但催化功能相同的多態(tài)性酶類。同工酶 廣泛存在于生物界中，現(xiàn)已有60多種動(dòng)、植物體內(nèi)的同工酶被研究報(bào)道。同工 酶的特點(diǎn)是具有明顯的種屬、組織和發(fā)育階段的特異性，既可作為生理指標(biāo)， 又是可靠的遺傳標(biāo)志。
蘋(píng)果酸脫氫酶(malate dehydrogenase, MDH)是三羧酸循環(huán)(TCA)的關(guān)鍵酶 之一，它在檸檬酸循環(huán)中催化蘋(píng)果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換，其中草酰乙 酸是生物體內(nèi)生化反應(yīng)的一個(gè)重要的中間產(chǎn)物，連接多條重要的代謝途徑，是 氨基酸形成所必需的碳骨架的主要來(lái)源之一。除此以外，蘋(píng)果酸脫氫酶還在細(xì) 胞的多種生理活動(dòng)中有著重要的作用，如涉及線粒體的能量代謝、蘋(píng)果酸一天 冬氨酸穿梭系統(tǒng)、植物的抗病性以及植物抗病過(guò)程中的活性氧代謝等。
茶樹(shù)[6kz e7h'a幻'; e/ w's (L.) 0. Kuntze]屬于山茶科山茶屬，為多年生 常綠木本植物。茶樹(shù)具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是一種世界范圍內(nèi)的廣泛流行飲品， 其次生代謝物更是有著極大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。盡管蘋(píng)果酸脫氫酶具有重要的生理生 化功能，但是迄今為止，在茶樹(shù)中尚未見(jiàn)到有完整的蘋(píng)果酸脫氫酶基因克隆的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第l個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種新的茶樹(shù)胞質(zhì)型蘋(píng)果酸脫氫 酶基因。
本發(fā)明所要解決的第2個(gè)技術(shù)問(wèn)題提供是上述基因編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所要解決的第3個(gè)技術(shù)問(wèn)題上述蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
本發(fā)明從茶樹(shù)中獲得C^-cyM^基因，其編碼如SEQ ID NO:l所示的氨基酸 序列，將C孤-C7M 膽因與pGEX-4T-l質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-MDH; 該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組蛋白GST-MDH。
本發(fā)明的蘋(píng)果酸脫氫酶在制備手性藥物，特別是在分離D， L-蘋(píng)果酸的應(yīng)用。
本發(fā)明的蘋(píng)果酸脫氫酶在茶樹(shù)雜交育種中的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，含有^歷-cj^^基因的蘋(píng)果酸脫氫酶可廣泛應(yīng)用分 離D， L-蘋(píng)果酸及在茶樹(shù)F1雜交種中的應(yīng)用。


圖1 Ca/z -cyMW基因的PCR擴(kuò)增的示意圖
Ml: Marker DL2000; 11:基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
圖2 Ca/z -cy巡W基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的擴(kuò)增的示意圖
M2: Marker DL2000; 21:蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
圖3重組質(zhì)粒的雙酶切的示意圖。
M3: Marker DL2000; 31:雙酶切的重組質(zhì)粒pGEX-MDH; 32:雙酶切的后 的cyMDH; 33:雙酶切后的pGEX-4T-l質(zhì)粒。 圖4 pGEX-MDH的蛋白質(zhì)電泳的示意圖。 M4:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量41表達(dá)的重組蛋白 圖5 Cam-cyMDH蛋白的疏水性圖。
具體實(shí)施例方式
4下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說(shuō)明。 實(shí)施例l:
1、 茶葉總RNA的提取與cDNA的獲得。
采用植物總RNA純化試劑盒(MAC服REY-NAGEL公司)提取茶樹(shù)(龍井43) 總RNA,將提取出的茶樹(shù)總RNA采用Reverse Transcription System試劑盒 (Promega公司)獲得總cDNA，并將總cDNA于-20。C保存。
2、 蘋(píng)果酸脫氫酶全序列的獲得。 設(shè)計(jì)上下游引物cyMDH-5，和cyMDH-3， cyMDH-5，序列GAAAAGGTTTTCAACGCACTCTCT， cy-MDH3，序列TTGGACAAAMCTGTTACCAAGTAG
以茶樹(shù)總cDNA為模板，PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C， 3min預(yù)變性；95 。C 30s， 55。C30s， 72°Clmin30s反應(yīng)35個(gè)循環(huán);72。C延伸10min; 4。C保存。1% 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物(圖l)， AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物， 連接到pMD19-T載體(TaKaRa公司)上，16'C連接過(guò)夜，把連接液轉(zhuǎn)移到大腸桿 菌￡ coh' DH5ci感受態(tài)細(xì)胞中，倒LB固體培養(yǎng)基(含Amp)并在其表面均勻涂 布40W5-溴-4-氯-3-吲哚-3 -D-半乳糖苷和7W異丙基-e -D-硫代半乳糖苷， 12h培養(yǎng)后，挑取白斑，將白斑放在LB(含Amp)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用pMD19-T載 體試劑中的引物M13—47/RV—M,進(jìn)行菌液PCR (菌落PCR條件為95°C， 3min 預(yù)變性；95°C 30s， 55。C45s， 72。Clmin反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min; 4。C保 存)驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，得到Cam-cyMDH基因，送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。 序列分析
該基因全長(zhǎng)1235bp，包含一個(gè)ATG起始密碼子和TAG終止密碼子以及22bp的 polyA尾巴，62bp長(zhǎng)的5'非編碼區(qū)和174bp長(zhǎng)的3'非編碼區(qū)，編碼一個(gè)含有332
個(gè)氨基殘基的蛋白質(zhì)。
用Protparam (http:〃au. expasy. org/tools/protparam. html)予頁(yè)測(cè)茶樹(shù)
5cy-MDH蛋白的理化性質(zhì)，推測(cè)該蛋白分子式為C，H254。N426 0472Sw，相對(duì)分子質(zhì)量為 35.557kD，等電點(diǎn)PI為5.91;理論推導(dǎo)半衰期大約為30h,不穩(wěn)定參數(shù)為33.93， 屬于穩(wěn)定蛋白(超過(guò)40認(rèn)為蛋白質(zhì)不穩(wěn)定)。該蛋白中含量比較多的氨基酸是Ala
(38個(gè),11.4%)、 Val (37個(gè)，11.1%)、 Leu (30個(gè)，9.0%)，該蛋白中含量比較 少的氨基酸是Phe (6個(gè)，1.8%)、 His (6個(gè)，1.8%)、 Trp (5個(gè)，1.5%)?？偟膸?負(fù)電荷的殘基(A印+ Glu)為34，帶正電荷的殘基(Arg + Lys)為30。脂肪指數(shù)
(Aliphatic index)為IOO. 15。親水性平均數(shù)(GRAVY)為O. 133，預(yù)測(cè)該蛋白 質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)，與其含有較多的Ala、 Val和Leu有關(guān)(圖5)。 實(shí)施例2:
1、 pGEX-MDH重組質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物
cyMDH-Fl: GAGATCGCGGATCCATGGCGAAAGAACCAGTTC;
cyMDH-F2: GTACGCCGCTCGAGAGAMGGCAAGAGTATGCCAGA，下劃線分別為萬(wàn)a/zz/7 I和WoI酶切位點(diǎn)。以實(shí)施例l中Cam-cyMDH基因全序列為模板，PCR擴(kuò)增蛋白 質(zhì)編碼區(qū)域，反應(yīng)條件為95°C， 3min預(yù)變性;95°C 30s， 55。C30s， 72。ClminlOs 反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72t:延伸10min; 4""C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)與載體pGEX-4T-1 (法瑪西亞公司)采用廁el和勘/zz^I雙酶切4小時(shí)候，連接，轉(zhuǎn)化至￡ co乃'DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，倒LB平板，篩選陽(yáng)性克隆，獲得表達(dá)質(zhì)粒pGEX-MDH。采用A^/e I 和^a^I雙酶切鑒定后(圖3)，送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列比 對(duì)發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1結(jié)果一致，擴(kuò)增的序列確為茶樹(shù)cyMDH編碼基因。
2、 蘋(píng)果酸脫氫酶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
將pGEX-MDH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至A Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克
隆于含5 ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 °C， 225 rpm，培養(yǎng)12小時(shí)，得到菌液。 取lml菌液接種于50 ml的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C， 225 rpm，振蕩培養(yǎng)至OD卿為O. 4-1. 0時(shí)(最好0.6);加入0.5 mM異丙基-5-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)， 2(TC誘導(dǎo)表達(dá)16h;
將誘導(dǎo)表達(dá)好的菌液于4'C， 5,000 rpm，離心5 min，收集菌體，超聲波破 碎，在上清中發(fā)現(xiàn)重組蛋白GST-MDH (圖4)。
由于D-蘋(píng)果酸是一種非天然有機(jī)酸，是一種極其重要的4-碳有機(jī)手性酸， 主要用于手型藥物、手性添加劑、手性助劑等領(lǐng)域，本發(fā)明的蘋(píng)果酸脫氫酶可 以用于拆分D，L-蘋(píng)果酸，得到D-蘋(píng)果酸。
在茶樹(shù)F1雜交種中，利用電泳技術(shù)檢測(cè)本發(fā)明的蘋(píng)果酸脫氫酶與其它MDH 同工酶酶譜之間的差異來(lái)鑒定雜交種的純度，有利于鑒定、選擇高產(chǎn)、抗病、 抗逆優(yōu)勢(shì)的雜交種，這為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)效益。
序列表
<110〉安微師范大學(xué)
<120〉茶樹(shù)胞質(zhì)型蘋(píng)果酸脫氫酶基因及其編碼蛋白 〈130〉 1 〈160> 1
〈170〉 Patentln version 3.3
<210> 1 〈211〉 1235 〈212〉 DNA
<213> Camellia sinensis (L.) 0. Kuntze 〈400〉 1
gaaaaggttt tcaacgcact ctctcatttc gcatcgtctc ttcggtcaga tctctctcta 60caatggcgaa agaaccagtt cgcgtcctcg tcactggtgc tgcaggacaa attggatatg 120
ctcttgttxc tatgattgcc agaggagtta tgttgggacc agaccagccc gtgatccttc 180
acatgcttga tattccacct gctgctgagg cattgaatgg agtgaaaatg gaattggtgg 240
atgctgcgtt ccctcttctt aaaggtgttg ttgctaccac tgatgttgtt gaggcatgca 300
ctggcgtcag cattgcagtc atggtcggtg ggttccctag gaaagaaggc atggaaagaa 360
aagatgtgat gtcaaagaat gttgccattt acaaatctxa agcttctgct ctggagagtt 420
atgctgctgc aaactgcaag gttttggttg ttgctaaccc tgccaacacc aatgcgttga 480
ttctaaagga atttgcacca tcaatttccg agaaaaacat tacttgtttg acaaggttgg 540
accacaacag ggcccttggt caagtttcag agagattgaa tgttccagta tctgatgtga 600
aaaatgttat tatttggggt aatcattcct caactcagta tcctgatgtc aaccatgcaa 660
ctgtcaagac accagctgga gagaagcctg tccgtgagct tgttgctaat gatgaatggt 720
tgcatggaga atttataaca accgtccaac agcgtggagc tgctattatc aaggctagaa 780
agttgtctag cgcattgtct gctgctagct ctgcttgtga tcacattcgt gattgggtcc 840
8ctttgatggc tcatacaatg 900
tgccagctgg gcttatttat tctttccctg ttacttgttg caatggagta tggacaattg %0
ttcaaggtct cccaattgat gatctttcaa ggaaaaagtt ggacttgacc gccgaagagc 1020
ttactgagga aaaggctctg gcatactctt gcctttcttg aatttgctcc taacctcctt 1080
tatgctgcag taggtctcac gcttttgtgt gtttttggaa gaaacagcta cggttttgaa 1140
taatgccatt gttatgtgaa aacttaatgg aaggatagat ataaactccc ctacttggta 1200
acagtttttg tccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 123權(quán)利要求
1、茶樹(shù)胞質(zhì)型蘋(píng)果酸脫氫酶，其特征在于它具有SEQ ID NO1，所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權(quán)利要求1所述的蘋(píng)果酸脫氫酶的基因。
3、 權(quán)利要求1所述的蘋(píng)果酸脫氫酶在制備手性藥物中的應(yīng)用。
4、 權(quán)利要求1所述的蘋(píng)果酸脫氫酶在茶樹(shù)雜交育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了茶樹(shù)胞質(zhì)型蘋(píng)果酸脫氫酶基因及其編碼蛋白，所述的酶具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，含有Cam-cyMDH基因的蘋(píng)果酸脫氫酶可廣泛應(yīng)用分離D，L-蘋(píng)果酸及在茶樹(shù)F1雜交種中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/04GK101659944SQ20091014509
公開(kāi)日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2009年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月27日
發(fā)明者平 宋, 曹正宇, 朱國(guó)萍, 鵬 王, 王寶娟, 翟羽佳, 蘇蕊蕊, 葛亞?wèn)|, 陳露露 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)