茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于茶樹基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種茶樹葉片過氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因及其編碼蛋白，同時還涉及利用調(diào)節(jié)過氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因表達(dá)強(qiáng)度在茶樹低溫防御中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明給出了一種茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因，為SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時給出了上述基因編碼的蛋白質(zhì)，為SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時給出了上述基因的用途，用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抵御低溫脅迫能力得以增強(qiáng)。
【專利說明】茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于茶樹基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種茶樹葉片過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因及其編碼蛋白，同時還涉及利用調(diào)節(jié)過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因表達(dá)強(qiáng)度在茶樹低溫防御中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物正常生長狀態(tài)下體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡之中，而在逆境脅迫下，體內(nèi)自由基(超氧自由基O2._、羥自由基.0Η等)和過氧化氫(H2O2)等大量積累，破壞了動態(tài)平衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，并危及正常生命活動。植物為了保證生命活動的正常進(jìn)行，常通過各種抗逆代謝途徑的調(diào)節(jié)來抵御脅迫。
[0003]過氧化物酶體(Peroxisome)是一類參與光呼吸調(diào)節(jié)、脂肪酸β氧化、乙醒酸循環(huán)、氮素代謝及植物激素合成等多種重要生化反應(yīng)的細(xì)胞器，普遍存在于真核生物體細(xì)胞內(nèi)。植物體內(nèi)存在大量過氧化物酶體，其內(nèi)含有氧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶等多種酶類，是植物解除逆境因子和毒害的重要場所。過氧化物酶體在植物體內(nèi)呈動態(tài)分布且對外界生物及非生物脅迫信號敏感，其數(shù)量和大小受到不同的環(huán)境、代謝和發(fā)育過程的影響。過氧化物酶體生物合成因子(Peroxin, PEX)是一類過氧化物酶體膜蛋白，對過氧化物酶體膜結(jié)構(gòu)組裝、膜蛋白定位、基質(zhì)蛋白輸入和過氧化物酶體分裂/增殖等均有重要調(diào)節(jié)作用，其中PEXll蛋白家族是調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖及維持穩(wěn)態(tài)的膜延伸因子。
[0004]茶樹喜溫暖氣候，低溫不僅限制其生長，如果低溫出現(xiàn)的早春茶芽萌動季節(jié)，還會導(dǎo)致冷害和凍害的發(fā)生，嚴(yán)重時甚至造成春茶的絕收。因此，茶樹低溫防御研究具有重要意義。茶樹低溫防御一方面可以采用建防風(fēng)林、小拱棚和大棚或者煙熏等栽培措施加以控制，另一方面，可通過耐低溫茶樹品種篩選等育種途徑來實(shí)現(xiàn)。常規(guī)的耐低溫品種的選育主要通過雜交、輻射誘變等途徑獲得，但由于耐低溫雜交親本本身較難獲得，而輻射誘變方向存在不確定性，往往使耐低溫品種選育效率偏低。如何通過現(xiàn)代分子生物學(xué)手段進(jìn)行耐低溫等高抗性茶樹種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育是目前乃至今后一段時間內(nèi)茶學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因及其編碼蛋白，通過調(diào)節(jié)該基因表達(dá)可提高茶樹抵御低溫脅迫能力。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種茶樹葉片過氧化物酶體生物合成因子基因CsPEXll，為SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0007]本發(fā)明還同時提供了上述茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXll基因編碼的蛋白質(zhì)，為SEQ ID No:2所不的氣基酸序列。
[0008]本發(fā)明還同時提供了上述茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXll基因的用途，用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因茶樹，所述轉(zhuǎn)基因茶樹的抵御低溫脅迫能力得以增強(qiáng)。所述植物為茶樹、煙草。
[0009]本發(fā)明所述基因是應(yīng)用消減雜交技術(shù)從茶樹冷誘導(dǎo)葉片與正常葉片中分離的差異基因片段，然后采用RACE技術(shù)獲得CsPEXl I全長基因。該基因序列全長982bp，其開放閱讀框ORF長708bp，位于SEQ ID No:1中5’第61位至768位堿基，編碼一個由235個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(766位至768位堿基為開放閱讀框的最后三個堿基為終止密碼子，不編碼氨基酸)JnSEQ ID No:2所示。經(jīng)與美國生物信息數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比對證實(shí)，SEQ ID No:1所示的核苷酸序列與與蓖麻(登錄號為XP_002511795.1)、葡萄(登錄號為XP_002273596.1)等的過氧化物酶體生物合成因子PEXll基因序列具有82-85%的同源性。研究表明，PEXll蛋白家族是膜延伸因子，主要控制過氧化物酶體增殖及穩(wěn)態(tài)維持；而且水稻(Oryza sativa L.)中PEXll蛋白家族成員在過氧化氫刺激、鹽脅迫和低氮脅迫過程中有不同的表達(dá)形式。檢索顯示，目前也尚未有葡萄和蓖麻過氧化物酶體生物合成因子基因功能及其表達(dá)分析等相關(guān)文獻(xiàn)，茶樹中也沒有過氧化物酶體生物合成因子相關(guān)基因等的公開資料。
[0010]本發(fā)明還提供了上述CsPEXll基因編碼的蛋白質(zhì)，由235個氨基酸殘基組成，其具有SEQ ID No:2所示的序列。分析顯示，該蛋白為脂溶性蛋白，脂溶指數(shù)達(dá)104.55，屬于PEXll過氧化物酶體膜蛋白家族成員之一。該蛋白分子量約為25.93kD，等電點(diǎn)為9.79，其中強(qiáng)堿性氨基酸(Lys，Arg)占14.9%、強(qiáng)酸性氨基酸(Asp，Glu)占8.1%、疏水性氨基酸(Ala, He, Leu, Phe, Trp, Val) 37.9%、極性氛基酸(Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr) 26.5%、其他氨基酸(Met, Gly，Hi s，Pro )12.9%，蛋白結(jié)構(gòu)中含有78.72% α螺旋，0.85% β折疊及20.43%的其他結(jié)構(gòu)。經(jīng)與美國生物信息數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比對證實(shí)，SEQID No:2所示的氨基酸序列與蓖麻和葡萄等具有86-89%的一致性。此外，檢索還顯示，目前尚未見茶樹中CsPEXll蛋白序列等文獻(xiàn)報(bào)道。
[0011]本發(fā)明提供茶樹CsPEXll基因表達(dá)強(qiáng)度與冷脅迫關(guān)聯(lián)分析。依據(jù)上述獲得的茶樹CsPEXll基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物，序列如SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示，設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小為 296bp ;同時以茶樹肌動蛋白(Actin,ACT)基因(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923)為參比基因設(shè)計(jì)引物，序列如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14，設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小為419bp。在茶樹品種園中采集不同品種茶樹新梢，實(shí)驗(yàn)組以4°C低溫處理4h，對照組溫度控制為25°C，其它實(shí)驗(yàn)條件相同。經(jīng)總RNA提取、cDNA第一鏈合成、RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，不同品種茶樹新梢低溫處理后CsPEXll基因表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于同品種的對照新梢(圖1)。說明CsPEXll基因表達(dá)上調(diào)是茶樹對于低溫脅迫的一種應(yīng)激機(jī)制之一，兩者之間存在密切因果關(guān)聯(lián)關(guān)系。
[0012]本發(fā)明進(jìn)而采用dsRNAi技術(shù)驗(yàn)證了 CsPEXll基因表達(dá)與茶樹耐低溫脅迫的關(guān)聯(lián)關(guān)系。根據(jù)dsRNAi原理設(shè)計(jì)了用于構(gòu)建雙鏈干涉表達(dá)載體的引物，其中在上游引物的5’端添加了限制性內(nèi)切酶XbaI與AscI的酶切位點(diǎn)(TCTAGA和GGCGCGCC)和兩個保護(hù)堿基(AA)，在下游引物 的5’端添加了限制性內(nèi)切酶BamHI與SwaI的酶切位點(diǎn)(GGATCC和ATTTAAAT)和兩個保護(hù)堿基(AA)，具體序列如SEQ ID No: 15和SEQ ID No: 16所示，設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小為491bp。以茶樹新梢為材料，經(jīng)RNA提取、cDNA第一鏈合成、RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳，將目標(biāo)產(chǎn)物從凝膠中割出，采用DNA凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶，并插入T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌擴(kuò)增后，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切、割膠純化以及連接反應(yīng)將目的片段正向和反向插入雙鏈干涉載體PFGC5941，構(gòu)建包含茶樹CsPEXll基因的雙鏈干涉載體pFGC5941-dsCsPEXll。將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增后，采用凍融法將pFGC5941_dsCsPEXll導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌15834。經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化茶樹無菌苗莖段，獲得含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶樹小植株。同時采用野生發(fā)根農(nóng)桿菌侵染茶樹無菌苗莖段獲得了不含雙鏈干涉CsPEXll基因的野生對照茶樹小植株。對上述轉(zhuǎn)基因茶樹小植株和野生茶樹小植株進(jìn)行耐低溫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在低溫條件下，含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因小植株內(nèi)源CsPEXll基因表達(dá)強(qiáng)度以及對低溫的忍耐力均顯著低于野生小植株。說明CsPEXll基因表達(dá)與茶樹的耐低溫能力關(guān)系十分密切。
[0013]本發(fā)明還提供一種利用該基因提高植物耐低溫脅迫能力的驗(yàn)證及應(yīng)用方法。該方法涉及含有所述基因的重組載體以及由所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植物。增強(qiáng)植物耐低溫脅迫驗(yàn)證采用轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行鑒定，具體做法包括:設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物SEQ IDNo:17 (包含Xba I酶切位點(diǎn)TCTAGA和保護(hù)堿基AA)和SEQ ID No:18 (包含Sac I酶切位點(diǎn)GAGCTC和保護(hù)堿基AA)、RT-PCR擴(kuò)增茶樹CsPEXll基因并插入T載體、經(jīng)酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建含茶樹CsPEXll的pBI121-CsPEXll表達(dá)載體、經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因煙草再生苗。對冷脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草及野生型對照的生理指標(biāo)測定及CsPEXll基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)茶樹CsPEXll基因煙草，葉片中CsPEXll基因強(qiáng)表達(dá)，過氧化物酶體穩(wěn)定性提高，MDA含量顯著低于野生對照，對低溫脅迫的忍耐性也顯著提高。
[0014]由此可見，茶樹CsPEXll基因表達(dá)與茶樹耐低溫能力關(guān)系密切，提高CsPEXll基因表達(dá)水平可提高茶樹對低溫脅迫的抵御能力。
[0015]本發(fā)明的要點(diǎn)在于提供了 SEQ ID No:1所示的核苷酸序列和SEQ ID No:2所示的開放閱讀框氨基酸序列及其在提高植物抗冷脅迫上的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0017]圖1是不同品種茶樹冷脅迫葉片與常溫對照葉片中CsPEXll基因表達(dá)圖；
[0018]圖中Actin代表茶樹肌動蛋白參比基因，該基因表達(dá)亮度一致說明該cDNA模板濃度一致；CsPEXll代表茶樹葉片過氧化物酶體生物合成因子基因；J1表示“鳩坑”茶樹品種低溫脅迫處理葉片、J2表示“鳩坑”茶樹品種常溫對照葉片、LI表示“龍井43”茶樹品種低溫脅迫處理葉片、L2表示“龍井43”茶樹品種常溫對照葉片、SI表示“水古”茶樹品種低溫脅迫處理葉片、S2表示“水古”茶樹品種常溫對照葉片。
[0019]圖2低溫脅迫對含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗內(nèi)源CsPEXll基因表達(dá)及MDA含量的影響圖；
[0020]圖A為低溫脅迫對含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗內(nèi)源CsPEXll基因表達(dá)的影響。M表示IOObp Marker，并標(biāo)記出300bp條帶；S1、S2表示含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗(2個重復(fù))的C sPEXll-PCR凝膠泳道；S3、S4表示野生型對照茶苗(2個重復(fù))的CsPEXl 1-PCR凝膠泳道；電泳條帶顯示在約300bp處，與預(yù)計(jì)茶樹CsPEXl I基因的RT-PCR產(chǎn)物大小(296bp)相符，該圖表示茶苗導(dǎo)入雙鏈干涉CsPEXll基因后內(nèi)源CsPEXll基因表達(dá)減弱。
[0021]圖B為低溫脅迫對含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗MDA含量的影響。S1、S2表示含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗(2個重復(fù))；S3、S4表示野生型對照茶苗(2個重復(fù))。該圖表明茶苗導(dǎo)入雙鏈干涉CsPEXll基因后葉片MDA含量較對照高75%以上。
[0022]圖3是pBI 121-CsPEXl I表達(dá)載體構(gòu)建圖；
[0023]圖中A表示pBI121載體；
[0024]圖中B 表示 Xba I 及 Sac I 酶切 pMD18_T_CsPEXll 后 DNA 片段；
[0025]圖中 C 表示酶切 pBI121 載體及 pMD18_T_CsPEXll 經(jīng) DNA Ligation Kit Ver.2.1連接后獲得的重組pBI 121-CsPEXl I表達(dá)載體。[0026]圖4是轉(zhuǎn)茶樹CsPEXll基因煙草PCR鑒定圖；
[0027]圖中M表示IOObp Marker,并標(biāo)記出800bp及700bp條帶；B1、B2表示野生對照煙草植株(2個重復(fù))的CsPEXll-PCR凝膠泳道，該泳道無條帶表明野生對照植株基因組中未轉(zhuǎn)入重組茶樹CsPEXll基因；A1、A2表示轉(zhuǎn)茶樹CsPEXll基因煙草(2個重復(fù))的CsPEXll-PCR凝膠泳道，電泳條帶顯示在700-800bp間，與預(yù)計(jì)茶樹CsPEXll基因的產(chǎn)物大小(744bp)相符，表示該植株成功轉(zhuǎn)化茶樹CsPEXll重組基因，即為轉(zhuǎn)茶樹CsPEXll基因煙草。
[0028]圖5是轉(zhuǎn)茶樹CsPEXll基因煙草與野生型煙草冷脅迫生理指標(biāo)及CsPEXll基因表達(dá)對比圖；
[0029]圖中A表示冷脅迫轉(zhuǎn)基因煙草及野生煙草葉片中CsPEXll基因表達(dá):凝膠檢測顯示各樣品ISsRNA亮度一致，說明各樣品RNA模板濃度一致；在該條件下低溫脅迫處理后轉(zhuǎn)茶樹CsPEXll基因煙草中CsPEXll基因高表達(dá)，而野生煙草因未轉(zhuǎn)入茶樹CsPEXll，所以沒有該基因表達(dá)；
[0030]圖中B表示冷脅迫轉(zhuǎn)基因煙草及野生煙草葉片中丙二醛(MDA)含量測定；
[0031]圖中C顯示轉(zhuǎn)基因煙草低溫處理后葉片損傷程度；
[0032]從圖中可知，在低溫脅迫下轉(zhuǎn)茶樹CsPEXll基因的煙草相應(yīng)基因表達(dá)強(qiáng)度明顯上調(diào)，促進(jìn)了過氧化物酶體生物合成因子合成，提高了過氧化物酶體的穩(wěn)定性及其對自由基的代謝能力，從而使MDA含量顯著低于野生對照，最終使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較野生對照更高的耐低溫能力。
[0033]圖6是轉(zhuǎn)茶樹、蓖麻和葡萄過氧化物酶體生物合成因子基因煙草葉片丙二醛(MDA)含量對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，以便于更好地理解，但并不限定本發(fā)明。實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0035]實(shí)施例1:茶樹過氧化物酶體生物合成因子基因CsPEXll的分離與克隆
[0036]I)利用抑制性消減雜交(SSH)分離茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXll基因
[0037]選取生長勢一致的福鼎大白茶樹品種2年生盆栽茶苗，實(shí)驗(yàn)前先將盆栽茶苗轉(zhuǎn)移至25°C左右的培養(yǎng)室中，光照強(qiáng)度50ymol/(m2.s)&12h/d，相對濕度80%，預(yù)培養(yǎng)7天。試驗(yàn)用茶苗(3盆)轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱進(jìn)行4°C處理，光照強(qiáng)度50ymOl/(m2.s)&12h/d，相對濕度80%，對照組仍保持在25°C左右環(huán)境中，其他條件與處理組相同，培養(yǎng)5天后采摘處理組和對照嫩葉進(jìn)行凍存(即，于_80°C凍存3天)。凍存樣品經(jīng)液氮充分研磨后，以TRIzoI法(Invitrogen Life Technologies)分別提取處理組與對照組茶樹葉片總RNA,并以01igotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit(寶生物[大連]有限公司)分別純化兩組mRNAo利用 PCR-Slelect? cDNA Subtraction KitCClontech Laboratories,Lnc., MountainView, USA)進(jìn)行抑制性消減雜交:分別取處理組和對照組各2 μ g純化mRNA，以SMARTScribe逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一鏈合成,進(jìn)而以20 X Second-Strand酶混合物合成cDNA第二鏈，獲得雙鏈cDNA (ds cDNA)。各組ds cDNA經(jīng)Rsal消化后分成兩管，分別與接頭Adaptorl(SEQ ID No:3所示)和Adaptor2R (SEQ ID No:4所示)連接成為tester cDNA，未連接接頭的為driver cDNA。兩次雜交中第一次為過量driver cDNA分別加入兩份tester cDNA中變性后退火雜交，使原來有豐度差別的tester單鏈cDNA均等化，合并兩份雜交產(chǎn)物，另加上新的變性driver cDNA再次進(jìn)行雜交退火，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的雜交體分子，并用DNA酶補(bǔ)平末端。進(jìn)而進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，第一次PCR使兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA片段得以指數(shù)擴(kuò)增，第二次PCR利用巢式引物富集差異表達(dá)的基因片段，具體操作參見試劑盒(即PCR-Slelect? cDNA Subtraction Kit試劑盒)使用說明。將差異基因片段PCR產(chǎn)物插入PMD18-T載體(寶生物[大連]有限公司)，并以M13引物組合(分別如SEQ ID No:9和SEQ ID No: 10所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性克隆委托Invitrogen公司進(jìn)行測序。
[0038]序列分析:測得序列利用Vecscreen (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)除去載體與接頭序列得到 EST 片段,經(jīng) Blast(http://blast,ncb1.nlm.nih.gov/)序列同源性比對，獲得一個與蓖麻(登錄號為XP_002511795.1)、葡萄(登錄號為XP_002273596.1)等的過氧化物酶體生物合成因子PEXll基因同源性較高的茶樹新EST序列。
[0039] 2)茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXll基因克隆
[0040]依據(jù)上述獲得的EST序列，比對發(fā)現(xiàn)3’端序列已完整,采用Primer Premier5軟件(Premier Inc.)設(shè)計(jì)特異引物(SEQ ID No:5和SEQ ID No:7所示)進(jìn)行基因5’末端克隆進(jìn)而獲得基因序列全長。
[0041]取福鼎大白茶茶樹品種自然常規(guī)新梢(I芽2葉)，液氮研磨后以 TRIzol 法(Invitrogen Life Technologies)提取茶樹葉片總 RNA,并以01igotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit (寶生物[大連]有限公司)純化 mRNA,取I μ g純化mRNA，以TaKaRa5’ -Full RACE Kit試劑盒(寶生物[大連]有限公司)進(jìn)行5’端基因序列克隆,mRNA的5’端經(jīng)Alkaline Phosphatase (CIAP,堿性磷酸酶)的去磷酸化作用和Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)的“去帽子”反應(yīng)后，與試劑盒中提供的5’RACE接頭連接成為Ligated RNA。Ligated RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV合成第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板，以特異性引物(SEQ ID No: 5所示)和5’Outer Primer (SEQ ID No:6所示，試劑盒提供)進(jìn)行Outer-PCR反應(yīng)，取I μ I Outer-PCR產(chǎn)物，以特異性引物(SEQ IDΝο:7所示)和5’ Inner Primer (SEQ ID No:8所示,試劑盒提供)進(jìn)行Inner-PCR反應(yīng),預(yù)計(jì)5’END產(chǎn)物長度為650bp-750bp之間，具體操作參見試劑盒使用說明。將上述RACE產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，并割取目標(biāo)條帶，以TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0 (寶生物[大連]有限公司)進(jìn)行條帶回收,插入pMD18_T載體(寶生物[大連]有限公司)，并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌(全式金[北京]有限公司)，具體操作參見純化試劑盒、載體及工程菌使用說明。經(jīng)藍(lán)白斑篩選及通用引物M13 (如SEQ ID No:9和SEQID No: 10所示)PCR檢測后，陽性克隆委托Invitrogen公司進(jìn)行序列分析。
[0042]將成功測序獲得的片段序列由SeqMan軟件(DNAStar公司)根據(jù)重疊區(qū)域進(jìn)行片段拼接，獲得CsPEXlI全長序列，該基因長度為982bp，具體如SEQ ID No:1所示。經(jīng)與美國生物信息數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比對證實(shí),該序列與蓖麻、番爺和葡萄等具有85%以上的同源性。該序列開放閱讀框ORF長708bp，位于SEQ ID No:1中5’端第61位至768位堿基(如SEQ ID No:1劃線部分所示)，經(jīng)SeqBuilder軟件推演得到了包含235個氨基酸的蛋白序列，具體如SEQ ID No:2所示，氨基酸序列與蓖麻、番茄和葡萄等具有85%以上的同源性。證明所獲得的是編碼茶樹過氧化物酶體生物合成因子基因CsPEXII的全長基因序列。已有研究表明，PEXll蛋白是調(diào)節(jié)過氧化物酶體伸長和增殖的關(guān)鍵因子，對過氧化物酶體穩(wěn)定性有重要貢獻(xiàn)；在水稻(Oryza sativa L.)中PEXll蛋白成員在過氧化氫刺激、鹽脅迫和低氮脅迫中有不同的表達(dá)形式。但目前沒有針對蓖麻、葡萄和番茄等過氧化物酶體生物合成因子基因的功能分析。數(shù)據(jù)庫查找顯示，茶樹中未有發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體生物合成因子相關(guān)基因，證明本發(fā)明序列是一種新的茶樹基因序列。同時，在其它植物中，尚未有關(guān)于該基因表達(dá)與抗低溫脅迫相關(guān)的報(bào)道。
[0043]實(shí)施例2:茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因相對基因表達(dá)強(qiáng)度與低溫脅迫關(guān)聯(lián)分析
[0044]1)不同茶樹品種冷脅迫葉片與對照葉片中CsPEXII基因表達(dá)
[0045]依據(jù)上述獲得的茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因序列，采用PrimerPremier5 軟件(Premier Inc.)設(shè)計(jì)表達(dá)引物(序列如 SEQ ID No:ll 和 SEQ ID No: 12 PJf示)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為296bp。同時以茶樹肌動蛋白(Actin)基因(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923)為參比基因設(shè)計(jì)引物(序列如 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No:14)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為419bp。
[0046]選取3個不同茶樹品種(鳩坑、龍井43和水古)2年生盆栽茶苗，每個品種選取生長勢相當(dāng)?shù)?盆用于試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前先將盆栽茶苗轉(zhuǎn)移至25°C左右的培養(yǎng)室中，光照強(qiáng)度50 u mol/(m2 ? s) &12h/d，相對濕度80%，預(yù)培養(yǎng)7天。實(shí)驗(yàn)組茶苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱進(jìn)行4°C處理，光照強(qiáng)度50 u mol/(m2 ? s) &12h/d，相對濕度80%，對照組仍保持在25°C左右環(huán)境中，其他條件與處理組相同，培養(yǎng)I天后采摘嫩度一致的葉片進(jìn)行凍存(即，于_80°C凍存3天)。取各樣品葉片IOOmg,經(jīng)液氮研磨后，以TRIzol法(Invitrogen Life Technologies)提取各組茶樹葉片總 RNA,以 Takara PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (寶生物[大連]有限公司)合成cDNA第一鏈，具體操作參照試劑盒說明書。以第一鏈cDNA為模板，以CsPEXII特異性引物SEQ ID No: 11和SEQ ID No: 12進(jìn)行RT-PCR表達(dá)驗(yàn)證。RT-PCR采用全式金2XEasy Taq? PCR SuperMix(全式金[北京]有限公司)進(jìn)行，以肌動蛋白Actin作為參比基因。
[0047]15 ill 反應(yīng)體系為:ddH204.1 ;2XEasy Taq? PCR SuperMix7.5 U I ；Primer (SEQ ID No:11 和 SEQ ID No:12 或者 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No: 14; IOmMeach) 0.6 u I ；cDNA (濃度為 lOOng/u I) 2u 10 PCR 擴(kuò)增條件為:94°C 預(yù)變性 3min ;94°C 變性45s,50°C (CsPEXlI特異性表達(dá)引物)或60°C (Actin參比基因引物)退火30s、72°C延伸30s、30個循環(huán)；72°C后延伸lOmin。產(chǎn)物以2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。[0048]基因表達(dá)結(jié)果顯示，不同品種低溫脅迫處理后，CsPEXll基因表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于同品種的正常溫度對照葉片。說明CsPEXll基因表達(dá)上調(diào)是茶樹對于冷脅迫的一種普遍應(yīng)激響應(yīng)之一，兩者之間存在密切因果關(guān)聯(lián)關(guān)系。
[0049]2)茶樹CsPEXll基因表達(dá)與耐低溫能力的關(guān)聯(lián)關(guān)系驗(yàn)證
[0050]根據(jù)dsRNAi原理設(shè)計(jì)了用于構(gòu)建雙鏈干涉表達(dá)載體的引物，其中在上游引物的5’端添加了限制性內(nèi)切酶XbaI與AscI的酶切位點(diǎn)(TCTAGA和GGCGCGCC)和兩個保護(hù)堿基(AA)，在下游引物的5’端添加了限制性內(nèi)切酶BamHI與SwaI的酶切位點(diǎn)(GGATCC和ATTTAAAT)和兩個保護(hù)堿基(AA)，具體上下游引物序列如SEQ ID No:15和SEQ ID No:16所示，設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小為491bp。以福鼎大白茶茶樹新梢為材料，以TRIzoI法提取茶樹葉片總RNA，以SEQ ID No:15和SEQ ID No:16為引物，采用本實(shí)施例步驟I)中的相同方法進(jìn)行cDNA第一鏈合成、RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳。將目標(biāo)產(chǎn)物從凝膠中割出，采用實(shí)施例1步驟(2)中相同的方法進(jìn)行目標(biāo)條帶回收，并插入pMDlS-T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌擴(kuò)增，獲得含茶樹CsPEXll基因片段的T載體pMD18-T-pCsPEXll。
[0051]以UNIQ-1O柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(生工生物工程[上海]股份有限公司)，提取雙鏈干涉載體質(zhì)粒 pFGC5941 (Arabidopsis Biological Resource Center)和含茶樹 CsPEXll 基因片段的 T 載體 pMD18-T-pCsPEXll,分別以 AscI 和 SwaI (New EnglandBioLabs)進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以凝膠DNA純化試劑盒純化回收PFGC5941大片段和pCsPEXll目的片段，T4-DNA連接酶16 °C連接過夜，構(gòu)建含正向CsPEXl I插入序列的重組質(zhì)粒pFGC5941-CsPEXl I，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，將陽性重組克隆于液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，以UNIQ-1O柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒pFGC5941-CsPEXll，同時提取含茶樹CsPEXll基因片段的T載體 pMD18-T-pCsPEXll ;分別以 BamHI 和 XbaI(New England BioLabs)進(jìn)行雙酶切，回收陽性重組質(zhì)粒pFGC5941-CsPEXll的大片段和pCsPEXll目的片段，T4-DNA連接酶16°C連接過夜，將茶樹CsPEXll反 向插入pFGC5941-CsPEXll，構(gòu)建具有雙鏈干涉效果的重組質(zhì)粒pFGC5941-dsCsPEXll，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，將陽性重組克隆于液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)繁。以UNIQ-1O柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒pFGC5941-dsCsPEXl I，采用凍融法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)發(fā)根農(nóng)桿菌15834。將含重組質(zhì)粒pFGC5941-dsCsPEXll的農(nóng)桿菌15834接種于20ml含100mmol/L乙酰丁香酮的液體YMB培養(yǎng)基中，28、0C 250r/min震蕩培養(yǎng)至0D600為0.5~0.8 ;將苗齡70天的浙農(nóng)129茶樹無菌苗莖段置于培養(yǎng)后的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，侵染IOmin后，無菌濾紙吸干多余的菌液，轉(zhuǎn)移于含100mmol/L乙酰丁香酮的固體YMB培養(yǎng)基，黑暗共培養(yǎng)2d后，以1000mg/L頭孢噻肟鈉(齊魯制藥有限公司)浸泡20min滅活農(nóng)桿菌，并轉(zhuǎn)移至含500mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基上，25，1:黑暗培養(yǎng)20d，獲得轉(zhuǎn)雙鏈干涉CsPEXll基因的茶樹小植株，并轉(zhuǎn)移至12h光照(50 u mol/(m2 ? s) ) /12h黑暗條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C)。同時采用相似方法，以野生農(nóng)桿菌15834侵染浙農(nóng)129茶樹無菌苗莖段，獲得不含雙鏈干涉CsPEXll基因?qū)φ招≈仓?。將上述兩類生長勢一致的小植株轉(zhuǎn)移至2°C條件下培養(yǎng)Id后，進(jìn)行葉片CsPEXll表達(dá)情況和丙二醛(MDA)含量分析，同時進(jìn)行葉片損傷評價。
[0052]丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定:稱取各處理(2°C條件下培養(yǎng)Id后的轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株)葉片0.1gJp 10%三氯乙酸0.2ml，于微量勻漿器中勻漿，并加入0.8mll0%三氯乙酸充分勻衆(zhòng),勻衆(zhòng)液以4000r/min離心IOmin,取0.2ml上清液,加A 0.2ml0.6%硫代巴比妥酸液,搖勻后沸水浴15min,冷卻后4000r/min離心IOmin,取上清作為處理分析液。同時采用相同方法以0.2ml蒸餾水代替勻漿液制備對照分析液。以對照分析液進(jìn)行調(diào)零，分別在532、600和450nm波長下測定吸光度，并按照下式進(jìn)行MDA含量計(jì)算。
[0053]
【權(quán)利要求】
1.茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因，其特征是:為SEQID No:1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征是:為SEQ ID No: 2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因的用途，其特征是:用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抵御低溫脅迫能力得以增強(qiáng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的茶樹過氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因的用途，其特征是:所述植物為茶樹、煙草。`
【文檔編號】A01H5/00GK103525826SQ201310428023
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】陸建良, 劉陽, 范方媛, 劉暢, 甘泉, 鄭新強(qiáng), 梁月榮 申請人:浙江大學(xué)