專利名稱：：一種唾液乳桿菌及其食品組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種新型益生菌和包含該益生菌的食品組合物，尤其是一種唾液乳桿菌和包含該唾液乳桿菌的食品組合物。
背景技術(shù)：
：口腔是人體與外界相通的重要部位，空氣在這里進出，營養(yǎng)和病菌也從口進入。影響口腔微生物組成的三個因素是營養(yǎng)、氧化還原電勢和黏附力?？谇晃⑸锏纳鷳B(tài)環(huán)境是唾液。唾液中含有豐富的營養(yǎng)，其中有機物(包括糖、氨基酸、維生素、氨和尿素等)占0.5%，無機鹽占0.2%，水分占99%以上。唾液中的微生物大部分是鏈球菌，在唾液和牙齦縫中的乳桿菌不到1%，含有少量的腸球菌?？谇恢邪l(fā)現(xiàn)的乳酸菌有唾液鏈球菌、緩癥鏈球菌、血液鏈球菌、變形鏈球菌、腸球菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、埃氏唾液乳桿菌、齒唾液乳桿菌等。年齡對口腔微生物的種類和數(shù)量影響較大。一般情況下嬰幼兒口腔中的細(xì)菌數(shù)很少，或是過路菌，唾液乳桿菌雖然只占2%，但是它是人體口腔中的唯一的常住菌。對于人體的消化系統(tǒng)，消化道又包括食道、胃、小腸、結(jié)腸、回腸、大腸、肛門，全長達10m，表面積非常大，人體生長、維持生命需要的能量和營養(yǎng)全部在這里獲得。有益細(xì)菌在腸道內(nèi)幫助人體消化食物，將食物轉(zhuǎn)化成人體本身不能合成的營養(yǎng)。人體消化道內(nèi)細(xì)菌總數(shù)達1014個，有400-500個種和亞種。從糞便的細(xì)菌中分離到的乳酸菌中有唾液乳桿菌，嗜酸乳桿菌等。因此，唾液乳桿菌從入口到腸道的整個消化系統(tǒng)都具有很重要的作用。唾液乳桿菌是人體和動物體內(nèi)廣泛存在的乳桿菌，很少有唾液乳桿菌引發(fā)各種疾病的報道，一些研究報道了唾液乳桿菌的生理活性功能，包括抑菌功能，黏附功能和免疫調(diào)節(jié)功能等，以期將唾液乳桿菌作為人類和動物的益生菌使用。由于環(huán)境中多環(huán)芳烴化合物的不完全燃燒和氮的氧化，硝基芳烴在自然界中廣泛存在。許多硝基芳烴化合物能夠在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)基因突變。4-硝基喹啉-l-氧化物(4-Nitroquinolinl-oxide,簡稱4-NQO)屬硝基芳烴，是一種很強的化學(xué)誘變劑和致癌物質(zhì)，能直接對DNA鏈產(chǎn)生剪切作用并形成電子轉(zhuǎn)移加合物。哺乳動物細(xì)胞中的酶將4-NQO代謝為4-羥氨基喹啉(4-HAQO)，4HAQO直接與DNA鏈形成電子轉(zhuǎn)移加合物造成基因毒性，是4-NQO基因毒性的直接作用形式。4-NQO向4-HAQO的轉(zhuǎn)化過程是普遍存在的，這一步反應(yīng)是造成原核細(xì)胞及真核細(xì)胞基因毒性的關(guān)鍵物質(zhì)，將4-HAQO迅速轉(zhuǎn)化是脫除基因毒性的關(guān)鍵步驟。本發(fā)明的唾液乳桿菌菌株能夠?qū)?-HAQO迅速轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)，從而起到脫基因毒性的效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新型益生菌，該益生菌來源于人體健康腸道，對酸、膽鹽、消化液具有良好的耐受性，對腸道上皮細(xì)胞有黏附力，并具有免疫調(diào)節(jié)功能和脫除基因毒性物質(zhì)4-NQO基因毒性的功能。本發(fā)明的另一目的是提供一種包含有上述益生菌的組合物，尤其是一種包含上述益生菌的食品組合物，以供消費者方便的食用，同時具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。本發(fā)明提供了一種唾液乳桿菌，該唾液乳桿菌對胃液、消化液有良好的耐受性，并對個體具有免疫刺激功能和脫除基因毒性物質(zhì)4-NQO基因毒性的功能。本發(fā)明的唾液乳桿菌在pH2.0-3.0的酸性溶液中培養(yǎng)2小時，或在0.05-1.5%膽鹽濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時，仍有大量存活。優(yōu)選的，該唾液乳桿菌是FDL89(Lactobacillussalivarius)菌株，該菌株于2007年11月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC2263，或其衍生菌株。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的所述唾液乳桿菌的組合物。在一具體實施方式中，所述組合物是食品組合物，該組合物還含有食品學(xué)上可接受的載體。在另一實施方式中，該食品組合物包含105-101GCFU/mL的本發(fā)明所述的唾液乳桿菌和食品學(xué)上可接受的載體。另一方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明所述的唾液乳桿菌制備的純培養(yǎng)物。在一具體實施方式中，制備該純培養(yǎng)物所用的培養(yǎng)基是牛奶。在另一實施方式中，該培養(yǎng)基還包含糖和穩(wěn)定劑，其中，糖50-100克/升，穩(wěn)定劑3-8克/升，添加了105-1010CFU/毫升本發(fā)明所述的唾液乳桿菌的凍干菌粉或新鮮培養(yǎng)液，且其中該穩(wěn)定劑是本領(lǐng)域公知的常規(guī)穩(wěn)定劑。在又一實施方式中，上述純培養(yǎng)物是牛奶制品或牛奶發(fā)酵制品。又一方面，本發(fā)明提供了制備牛奶純培養(yǎng)物的方法，其包括如下步驟1)配料；2使容；3)均質(zhì)；4)殺菌；5)冷卻后接種發(fā)酵；6)測酸后打冷、檢測；7)灌裝；其中，步驟5)中使用本發(fā)明所述的唾液乳桿菌。在一具體實施方式中，上述步驟l)中的配料方法如下將50-10克糖，3-8克穩(wěn)定劑混合后用牛奶定容到1000毫升；上述步驟5)中以凍干菌粉或新鮮培養(yǎng)液以105-1010CFU/mL的濃度接入到原料混合物，在40-42r下發(fā)酵。在又一具體實施方式中，上述步驟2)和3)之間還包括步驟2.1)水合20分鐘；步驟2.2)在6(TC-65'C下預(yù)熱；步驟2.3)在溫度6(TC-65。C和壓力-90-80Kpa下脫氣。在又一具體實施方式中，上述步驟6)為將發(fā)酵奶全部打入貯罐冷卻至20士2。C，攪^拌15-100秒后，及時灌裝。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的所述唾液乳桿菌或其組合物在食品工業(yè)或制備調(diào)節(jié)免疫力的生物制劑中的應(yīng)用。以下附圖僅旨在于對本發(fā)明做示意性說明和解釋，并不限定本發(fā)明的范圍。其中，圖1顯示的是唾液乳桿菌FDL89各劑量處理對小鼠體重的變化影響；圖2顯示的是唾液乳桿菌丄.sa/Zw^'wsFDL89與4-NQO共培養(yǎng)過程的HPLC圖譜；圖3顯示的是不同濃度唾液乳桿菌丄.^/hw7'wsFDB89與4-NQO共培養(yǎng)液的HPLC圖譜；圖4顯示的是唾液乳桿菌L.salivariusFDB89與4-NQO共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)譜分析圖。圖5顯示的是制備一種含有本發(fā)明的唾液乳桿菌的食品組合物的流程圖。具體實施例方式為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對照附圖說明本發(fā)明的具體實施方式。其中，相同的部件采用相同的標(biāo)號。本發(fā)明人經(jīng)多次篩選和培育，從長壽之鄉(xiāng)巴馬瑤族自治縣的長壽老人糞便中分離得到一株唾液乳桿菌FDL89(Lactobacillussalivarius)，該菌株對酸、膽鹽、消化液具有良好的耐受性能，具有體外脫除4-NQO基因毒性的功能，經(jīng)動物實驗證明，對試驗小鼠具有免疫刺激作用和調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的功能。唾液乳桿菌FDL89于2007年11月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC2263。本發(fā)明所述的唾液乳桿菌應(yīng)理解為包括唾液乳桿菌FDL89，以及衍生自該唾液乳桿菌FDL89的菌株，尤其是具有耐酸、耐膽鹽及消化液，具有體外脫除4-NQO基因毒性功能，對試驗動物具有免疫剌激功能的菌株。唾液乳桿菌FDL89的基本生物學(xué)特性與已知的該種屬的典型微生物基本相同，不同在于本發(fā)明微生物具有耐酸、耐膽鹽、體外脫除4-NQO基因毒性及調(diào)節(jié)免疫作用。具體而言，耐酸性能試驗證明，本發(fā)明的唾液乳桿菌FDL89在pH2.0-3.0的酸性溶液中培養(yǎng)2小時，仍存在大量的活菌數(shù)。耐膽鹽性能試驗證明，本發(fā)明的唾液乳桿菌FDL89沉在含0.05-0.3%膽鹽濃度的培養(yǎng)液中生長性能良好。能耐受0.3-1.5%膽鹽濃度，在1.5%膽鹽濃度培養(yǎng)24小時，仍存在大量的活菌數(shù)。通過SOS顯色反應(yīng)評價本發(fā)明的唾液乳桿菌FDL89菌株脫除4-NQO基因毒性的能力。實驗證明，本發(fā)明的唾液乳桿菌FDL89菌株的基因毒性脫除率為92.91%。通過高效液相色譜法和質(zhì)譜法研究唾液乳桿菌FDL89對4-NQO的轉(zhuǎn)化過程。實驗證明，唾液乳桿菌FDL89菌株首先將4-NQO轉(zhuǎn)化為直接毒性4-羥氨基喹啉(4-HAQO)，隨后將4-HAQO轉(zhuǎn)為為無毒的4-氨基喹啉(4-AQ)，同時產(chǎn)生少量的4-氨基喹啉-N-氧化物(4-AQO)。動物試驗證明，本發(fā)明的唾液乳桿菌顯著提高動物體淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力、巨噬細(xì)胞的吞噬活性以及自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的活性，能提高動物血清對免疫刺激產(chǎn)生抗體的能力。這表明本發(fā)明的唾液乳桿菌FDL89對動物體具有顯著的免疫刺激功能。試驗還證明，發(fā)揮免疫刺激功能的活菌濃度為10M01QCFU/mL。因此，本發(fā)明的唾液乳桿菌可作為有效成分，用于提高人體的免疫力。本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明的唾液乳桿菌FDL89作為有效成分的食品組合物。食品組合物可以為固態(tài)(如凍千粉、膠囊、顆粒劑、片劑、含片)或液體(如口服液、飲料)或其他合適的形狀。在食品組合物中，本發(fā)明的微生物含量通常為組合物的1-99%，絕對數(shù)量為105-101QCFU/mL。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1從健康長壽老人糞便中提取的唾液乳桿菌FDL89中國廣西巴馬瑤族自治縣是聞名于世的長壽之鄉(xiāng)，1991年11月1日，在日本東京召開的國際自然醫(yī)學(xué)會第13次會議上，正式確認(rèn)為世界第五長壽之鄉(xiāng)。巴馬瑤族自治縣甲篆鄉(xiāng)是該縣的長壽帶，2005年人口普査甲篆鄉(xiāng)全鄉(xiāng)人口25115人，其中百歲老人21人。本發(fā)明人于2006年，以巴馬縣甲篆鄉(xiāng)90歲以上的老人為對象，針對老人的身體健康狀況、生活習(xí)慣、飲食衛(wèi)生情況等進行問詢，采集身體健康，1年以上不服用藥物的健康長壽老人的糞便樣品，用滅菌蛋白棟水保存新鮮糞便，4'C冷藏，在4小時之內(nèi)運送至實驗室，完成樣品處理和培養(yǎng)。以無菌玻棒將糞便樣品搗碎，震蕩均勻，取lmL樣品溶液，加入9mL滅菌稀釋液，按十倍稀釋法將樣品稀釋至108，取104-1010稀釋度溶液lmL于無菌培養(yǎng)皿中，倒入NPNL雙歧桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻后冷卻凝固，放入?yún)捬醮校?7i:厭氧培養(yǎng)48-72小時。經(jīng)多次篩選和培育，得到唾液乳桿菌FDL89的純培養(yǎng)物。唾液乳桿菌FDL89(Lactobacillussalivarius)，2007年11月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC2263。實施例2唾液乳桿菌FDL89對胃液和腸液的耐受性人工胃液NaC10.2g/100mL、胃蛋白酶(pepsin)0.32g/100mL，用濃度為1mol/L的HCl調(diào)整pH值為2.0、3.0，過濾除菌備用。人工腸液kH2P040.68g/100mL、胰蛋白酶(Trypsin)0.1g/100mL，0.3%牛膽鹽，pH7.5耐受性測定將培養(yǎng)液經(jīng)離心(3600r/min，10min)收集菌體，用滅菌生理鹽水離心洗滌2次，將其菌體懸浮于5mL滅菌生理鹽水中制成菌懸液。然后菌懸lmL分別接種于含9mL過濾除菌處理的pH值為2.5的人工胃液中，并在37。C培養(yǎng)，在開始(0h)和培養(yǎng)0.5、1、2h分別取樣，測定其活菌數(shù)。然后取在人工胃液中消化2h后的培養(yǎng)液1mL，分別接種于9mL過濾除菌的pH值為7.5的人工腸液中，繼續(xù)置37t:下厭氧培養(yǎng)，并分別在0、3、6h測定活菌數(shù):活菌數(shù)O小時3.5x:108人工胃液pH2.51小時4.7x:1082小時2.0x108O小時107人工腸液1小時9扁62小時1.2x106實施例3唾液乳桿菌FDL89的免疫調(diào)節(jié)功能受試菌唾液乳桿菌FDL89:分離自廣西巴馬長壽老人糞便，經(jīng)鑒定為Lactobacillussalivariussubsp.salivarius，2007年11月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(菌種保藏號CGMCC2263)。實驗動物Balb/c雌性小鼠68周齡，體重1822g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。試劑與設(shè)備試齊U:RPMI1640培養(yǎng)基干粉Gibco公司；青霉素(PenicillinGSodiunSalt)、鏈霉素(StreptomycinSulfate)、Hepes、丙酮酸鈉(PyruvicAcid)、PMS、硝基氯化四氮唑(INT)等Amresco公司；MTT:Promega公司；刀豆球蛋白A(ConA)、DL-乳酸鋰Sigma公司；氧化型輔酶I(NAD):Roche公司；胎牛血清(FBS):PAA公司；綿羊紅細(xì)胞(SRBC):北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心；雞紅細(xì)胞(CRBC;):中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院；K562細(xì)胞中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)；補體、都氏試劑、Giemsa染料中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所；培菲康(國藥準(zhǔn)字S10950032;產(chǎn)品批號20071104，每粒(210mg)含活菌數(shù)不低于1.0xl07CFU/mL):上海醫(yī)藥(集團)有限公司信誼制藥總廠；其余試劑均為分析純。設(shè)備生物培養(yǎng)箱；C02細(xì)胞培養(yǎng)箱(NAPCO);倒置顯微鏡(CK2，日本產(chǎn));YJ-875型超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備廠；^Quant連續(xù)波長酶標(biāo)儀(Bio-tec);CS-15R低溫離心機Bechman公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板Costar公司；微量振蕩器(WZ-2A);細(xì)胞計數(shù)板。實驗動物分組及處理Bal/C小鼠隨機分組，空白組每只灌服脫脂乳0.211117山陽性對照組每只灌服培菲康膠囊藥液(28mg/mL)0.2mL/d;低劑量、中劑量、高劑量組每天分別灌服lxl06、lxl08、lxlO^CFU/mL的受試菌。灌胃4周，25。C詞養(yǎng)，自由飲水采食，每周換兩次墊料，每周稱一次體重。在處死前5d腹腔注射0.5mL2%的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)致敏。檢測項目1.綿羊紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)實驗動物處死前一天用游標(biāo)卡尺測量左后足趾部厚度，在測量部位皮下注射20%的SRBC每只20nl，24h后再次測量左后足趾部厚度，同-部位多次測量取平均值。以攻擊前后的足趾厚度差值來表示DTH的厚度。2.滴片法測定巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬率常規(guī)分離小鼠腹腔細(xì)胞液，細(xì)胞液與1%雞紅細(xì)胞等體積混和，加入胎牛血清使其終濃度為10%。混合細(xì)胞液滴加到用3%瓊脂封閉邊緣的玻片封閉圈內(nèi)，37X:培養(yǎng)20min，結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細(xì)胞沖掉，于甲醇液中固定lmin，Giemsa液染色15min，蒸餾水沖洗干凈，晾干。用40x顯微鏡計數(shù)吞噬率(每IOO個巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞所占的百分比)。3.乳酸脫氫酶(LDH)法測定自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)活性耙細(xì)胞(K562)傳代培養(yǎng)，使用前洗滌、調(diào)整細(xì)胞濃度為4x105個/mL。制備小鼠脾細(xì)胞，用無菌水輕晃20秒以裂解紅細(xì)胞，立即加入2xhank，s液恢復(fù)原液壓，再次洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為2xl(T個/mL。反應(yīng)孔取靶細(xì)胞(K562)和效應(yīng)細(xì)胞(脾細(xì)胞)各100^1加入96孔板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加入靶細(xì)胞和培養(yǎng)基各100靶細(xì)胞最大釋放孔加入靶細(xì)胞和2.5%Triton各100pl。上述各項均設(shè)3個平行孔，于37'C培養(yǎng)4h后吸取上清100jil于新的培養(yǎng)板中，加入LDH基質(zhì)液(DL-乳酸鋰5xlO-2mol/L，硝基氯化四氮唑(INT)6.6x10-4mol/L,PMS2.8xl0-4mol/L，氧化型輔酶I(NAD)L3xlO-3mol/L，溶于Tris-HCL(0.2mol/L，pH8.2)，需現(xiàn)用現(xiàn)配)100pl/孔，室溫反應(yīng)10min后每孔加入1mol/lHCL30|_d，在酶標(biāo)儀490nm處測OD值。.4.血清半數(shù)溶血值(HC50)小鼠摘除眼球取血收集血清，血清臨用前用生理鹽水稀釋500倍，補體稀釋10倍。將稀釋后的血清0.5mL至于試管內(nèi)，依次加入10%SRBC0.25mL，補體0.5mL，空白對照管用生理鹽水0.5mL代替血清。置37。C恒溫水浴中保溫30min，冰浴終止反應(yīng)。2000r/min離心10min，取上清0.5mL，加入都氏試劑1.5mL;同時取10%SRBC0.125mL，加都氏試劑至2mL作為半數(shù)溶血對照，充分混勻。放置10min后，以空白對照管作為空白，于540nm處測定各管光密度值。5.T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖無菌取出脾，置于盛有適量無菌Hank's液(含5%胎牛血清，1%雙抗)的小平皿中，用眼科手術(shù)剪輕輕將脾剪碎，用注射器內(nèi)芯將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用無菌吸管將細(xì)胞懸液吸入10mL離心管。用Hank's液洗3次，每次離心10min(1800r/min)。用添加了10%胎牛血清，1%雙抗的完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整小鼠脾細(xì)胞密度為2xlOVmL。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入脾細(xì)胞懸浮液，每孔O.lmL，再加入含有或不含有ConA的完全RPMI-1640培養(yǎng)液，每孔O.lmL。每只小鼠設(shè)空白對照孔和試驗孔各設(shè)5個重復(fù)孔，空白對照孔不含ConA，試驗孔ConA終濃度為1.5pg/mL。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入37r，5%(302飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后，每孔吸棄上清70pL，加入20^iLMTT顯色液(5mg/mL)，37。C顯色4h，加入細(xì)胞裂解液0.1mL，37"C過夜。用酶標(biāo)儀于570nm下測定OD值。刺激率=(試驗孔OD值一對照孔OD值)/對照孔OD值6.體重變化每周測定各組小鼠的體重一次，記錄小鼠生長狀況。7.實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用X士SD表示，SPSS13.0統(tǒng)計軟件做方差分析和t-檢驗。結(jié)果如表1所示唾液乳桿菌FDL89<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表1FDL89不同劑量處理對小鼠免疫指標(biāo)的影響*:p<0.05;**p<0.01(1)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)——足趾增厚法唾液乳桿菌FDL89各劑量處理組小鼠的足趾厚度差均顯著高于對照組(p<0.01)，其中低劑量的作用效果顯著高于中劑量，中劑量和高劑量之間差異不顯著。(見表1)(2)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗唾液乳桿菌FDL89的低劑量和中劑量的吞噬率顯著高于對照組(p〈0.05)，其中中劑量的效果極顯著(p<0.01)，顯著高于低劑量。(見表l)(3)自然殺傷細(xì)胞活性唾液乳桿菌FDL89高劑量的反應(yīng)吸光值顯著高于對照組(p〈0.05)。(見表1)(4)血清溶血值唾液乳桿菌FDL89各劑量處理組小鼠的HC50值顯著高于對照組(p〈0.01)，各劑量組之間差異不顯著。(見表l)(5)T淋巴細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)化增殖唾液乳桿菌各劑量對淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化增殖能力的促進作用不明顯，各劑量組與對照組差異不顯著(p<0.05),各劑量之間差異也不顯著。(見表l)(6)喂養(yǎng)過程中小鼠體重的變化唾液乳桿菌FDL89各劑量處理對小鼠體重的變化影響不顯著(p〈0.05)。(見圖1)結(jié)論唾液乳桿菌FDL89活菌能夠顯著促進小鼠致敏淋巴細(xì)胞增殖能力，提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性，增強血清中溶血素抗體的產(chǎn)生能力；體外對淋巴細(xì)胞的增殖促進作用不顯著。在受試過程中，對小鼠體重變化影響不顯著，不影響小鼠的正常生長狀況。實施例4唾液乳桿菌脫除基因毒性功能(一)材料與方法受試菌唾液乳桿菌FDL89:分離自廣西巴馬長壽老人糞便，經(jīng)鑒定為LactobaciUussalivariussubsp.salivarius，2007年U月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(菌種保藏號CGMCC2263)。干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌(分離至商業(yè)化乳制品，經(jīng)16SrDNA序列同源性鑒定)SOS顯色反應(yīng)試劑M63培養(yǎng)基瓊脂15g，KH2P0413.6g，(NH4)2S042g，F(xiàn)eS04.7H200.5mg，MgS04.7H200.2g/L蒸餾水，用K0H調(diào)節(jié)pH值為7。SOS點實驗中無轉(zhuǎn)化活性的STA培養(yǎng)基乳糖(20%)2ml，葡萄糖(20%)0.5ml，色氨酸(l。/。)2ml，蘇氨酸(l。/。)2ml，組氨酸(l。/。)2ml，尿嘧啶(l。/。)2ml，硫胺素(1%)2ml，氨節(jié)青霉素(10mg/ml)2ml，X-gal(20mg/mlDMSO)2ml過濾除菌，力口到1LM63培養(yǎng)基中。SOS指示菌￡.co/ZPQ37培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，配成1L溶液，pH72;La培養(yǎng)基L培養(yǎng)基加20嗎/ml的氨芐青霉素。SOS顯色反應(yīng)的緩沖溶液和試劑B緩沖液Na2HP0316.1g，NaH2P03'H205.5g，KC10.75g，MgS0.7H200.25g，SDS1g，^巰基乙醇2.7ml，用蒸餾水配成1L溶液，pH調(diào)至7。P緩沖液羥甲基氨基甲垸(C4HuN03):121g，SDSlg，用蒸餾水配成1L溶液，用鹽酸調(diào)pH至8.8。ONPG(4mg/ml):400mgONPG加至Ul00ml的pH7buffer中。pH7buffer:61ml0.1MNa2HPO3'7H2O，39ml0.1MNaH2PO3.H2O。PNPP溶液(4mg/ml):400mgPNPP加至'j100mlPbuffer。4-NQO用DMSO配成lmg/ml的貯液，-20°(:凍存，用時以水稀釋。SOS顯色反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)程序指示菌的活化取0.05ml凍存的Eco/z'PQ37甘油菌接入5mlLa培養(yǎng)基中，37匸振蕩，過夜培養(yǎng)。取0.1ml指示菌的過夜培養(yǎng)液加到5mlLa培養(yǎng)基中，37。C震蕩(200rpm)培養(yǎng)2h左右，使菌數(shù)達到2xlOSCFU/ml。取lml菌液到9ml新鮮的L培養(yǎng)基中進行下一步反應(yīng)。取0.6ml該溶液到EP管中，加待測化合物(4-NQ0)，37。C震蕩培養(yǎng)2h。將0.6ml上述菌液平均分到兩個EP管中，3000g2min離心，生理鹽水洗滌，菌體沉淀重懸至0.3mlB緩沖液(X-系列)或P緩沖液(Y-系列)中，分別進行^-半乳糖苷酶反應(yīng)和堿性磷酸酶反應(yīng)，兩個反應(yīng)可以同時做?！?半乳糖苷酶反應(yīng)X-系列管中加2.7mlB緩沖液，37°C保溫5-10min。每管加0.6ml4mg/mlONPG溶液，反應(yīng)10-90min，力B2mllmol/L的NaC03終止反應(yīng)。可以根據(jù)具體情況調(diào)整反應(yīng)時間使八42()的時間在0.10.4。以無指示菌的陰性對照為空白讀A42。的值。堿性磷酸酶反應(yīng)Y-系列管中加2.7mlP緩沖液，37°C保溫5—10min。每管加0.6ml4mg/mlPNPP溶液，反應(yīng)10-90min，力[Uml2.5mol/L的HC1終止反應(yīng)，此時顏色消失。放置5min，力口lml2mol/Ltris(hydroxymethy)aminomethane使顏色恢復(fù)，恢復(fù)的顏色在幾小時內(nèi)保持穩(wěn)定?？梢愿鶕?jù)具體情況調(diào)整反應(yīng)時間使A42。的值在0.10.4。以無菌陰性對照為空白讀八420的值。結(jié)果表達公式(1):酶活性U=1000xA420/t(1)式中A，是420nm處的讀數(shù)，t是底物(ONPG或PNPP)的保溫時間。在蛋白合成受抑制時，化合物對^/A基因的誘導(dǎo)可以用f半乳糖苷酶與堿性磷酸酶的比值R反映(公式2)。(3-半乳糖苷酶活性一"。BxtP堿性磷酸酶活性—AmPxtB其中tB、A42。B以及tP、A42QP分別代表"-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶的反應(yīng)時間t及相應(yīng)時間A42Q的值。為了便于不同實驗之間尤其是不同實驗室之間進行比較，引出了SOS誘導(dǎo)因子(IFsos)的概念。誘導(dǎo)因子是濃度為c時的R值R(c)與濃度為O時R值R(O)的比值(公式3)。IFsos=R(c)/R(O)(3)唾液乳桿菌脫基因毒性作用檢測方法乳酸菌MRS的過夜培養(yǎng)液，離心(6000g，5min)，以生理鹽水洗漆，菌體沉淀重懸在生理鹽水中至終濃度為108-109CFU/ml(OD,為l.O左右)，取5ml菌懸液加4-NQO貯液，使其終濃度在20mg/L，制成乳酸菌與4-NQO共培養(yǎng)液，在37。C200rpm條件下震蕩180min培養(yǎng)。共培養(yǎng)后離心(6000g，15min)，取上清液以0.45pm濾膜過濾，取過濾液備用。SOS顯色反應(yīng)測定過濾上清液殘余的基因毒性活性。同時以生理鹽水做陰性對照，以不加乳酸菌的4-NQO做陽性對照。殘余基因毒性(。/。)-(/Frl)/(/fVwe(rl)"00(1)脫基因毒性(％)=1-殘余基因毒性(％)(2)/^Vweo:陽性對照4-NQO(20mg/L)的//「值；/Fx:共培養(yǎng)物上清液的/F值；1:陰性對照生理鹽水的/尸值。(二)結(jié)果結(jié)果如下表2唾液乳桿菌株抑制4-NQO基因毒性的能力試驗菌株脫基因毒性《)唾液乳桿菌FDL8992.91%干酪乳桿菌73.68%鼠李糖乳桿菌8.98%結(jié)論應(yīng)用SOS顯色反應(yīng)評價了長壽老人源唾液乳桿菌脫除4-NQO基因毒性的能力。4-NQO(終濃度為20mg/L)與待測菌(108-109CFU/ml)37。C共培養(yǎng)180min后，唾液乳桿菌FDL89菌株脫基因毒性能力最強，基因毒性脫除率為92.91%。實施例5唾液乳桿菌脫除基因毒性過程研究(一)材料與方法試驗菌株唾液乳桿菌FDL89:分離自廣西巴馬長壽老人糞便，經(jīng)鑒定為Lactobacmussalivariussubsp.salivarius，2007年11月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(菌種保藏號CGMCC2263)。試驗方法菌株活化乳酸菌甘油凍存管以1%(V/V)的接種量接入MRS培養(yǎng)基，在螺口管厭氧條件下37°C培養(yǎng)24h，活化兩代備用。脫基因毒性過程研究待測菌株在最適培養(yǎng)條件下過夜培養(yǎng)，以6000g的離心力離心5min，所得菌體沉淀用生理鹽水洗滌，再次離心，將洗滌后的菌體重懸在生理鹽水中制成菌懸液。取一定菌懸液加4-NQO貯液配制菌體4-NQO共培養(yǎng)物，菌體濃度109-101QCFU/ml，4-NQO終濃度為20mg/L。共培養(yǎng)物在厭氧避光條件下震蕩培養(yǎng)(37。C，200rpm)3h。共培養(yǎng)物離心(6000g，5min)，取上清液以0.45jum濾膜過濾，制成無菌共培養(yǎng)液，進行紫外掃描和HPLC分析。HPLC-MS分析方法唾液乳桿菌￡.^//^^'^FDB89與4-NQO共培養(yǎng)液經(jīng)4"C冷藏36h后，用HPLC-MS分析。HPLC洗脫液A為超純水(0.1%TFA);洗脫液B為甲醇，采用梯度洗脫程序5-35min，10%~80%B。紫外檢測器355nm波長檢測。電噴霧電離源(ESI)，噴射電壓3.50kV;正離子模式，干燥氣(N2)流速為6.0L/min，溫度為35(TC，毛細(xì)管輸出電壓3500V。離子掃描范圍100-1000m/z。質(zhì)譜分析結(jié)果借助儀器附帶的軟件進行處理。(二)結(jié)果伴隨著脫基因毒性過程，唾液乳桿菌將4-NQO轉(zhuǎn)化為其它的化合物。應(yīng)用HPLC方法研究了唾液乳桿菌FDL89菌株與4-NQO的共培養(yǎng)液過程的HPLC圖譜變化。Ua/z'ran'"sFDB89在濃度為2xl09CFU/mL，與4-NQO共培養(yǎng)液隨時間的變化的HPLC圖見附圖2。其中，共培養(yǎng)時間為(A)0h;，(B)lh，(C)2h，(D)3h。圖中峰4為4-NQO，峰l,2,3為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。經(jīng)過3個小時的共培養(yǎng)，4-NQO峰面積降低，HPLC圖譜上又出現(xiàn)了3個產(chǎn)物峰，作為對照，丄.sa"van'usFDB89在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時培養(yǎng)液的HPLC圖譜中沒有出峰，HPLC圖譜中所出的峰都是4-NQO或者其轉(zhuǎn)化物。不同菌體濃度唾液乳桿菌與與4-NQO共培養(yǎng)3h的HPLC圖譜見附圖3。菌體濃度為(A)OCFUml-1;(B)2.1xl06CFUml";(C)3.5xl07CFUml.1;(D)5.4xl08CFUml";(E)2.3xl09CFUml.1;(F)9.3xl09CFUm1-1。圖中峰4為4-NQO，峰l，2，3為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。隨著菌體濃度增大，4-NQO的含量下降。在共培養(yǎng)的3小時內(nèi)，菌體濃度增大，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P2向P1及P3轉(zhuǎn)化的比例增大；當(dāng)菌體濃度達到9xl09CFU/ml時，3h內(nèi)就可以完全轉(zhuǎn)化為Pl物質(zhì)，說明這一步轉(zhuǎn)化與菌體濃度成正相關(guān)。HPLC-MS采用柱后串聯(lián)質(zhì)譜分析唾液乳桿菌FDL89對4-NQO的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，質(zhì)譜圖見附圖4。3個主要成分的m/z(M+H)+值分別為145、177和161，經(jīng)結(jié)構(gòu)推算，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物P1，P2和P3分別為4-氨基喹啉(4-AQ)、4-羥氨基喹啉-N-氧化物(4-HAQO)和4-氨基喹啉-N-氧化物(4-AQO)。結(jié)論唾液乳桿菌對4-NQO的轉(zhuǎn)化完全程度有菌量依賴效應(yīng)，對4-NQO的轉(zhuǎn)化過程是4管NQO-4-HAQO-4-AQ(+4-AQO)實施例6含唾液乳桿菌FDL89的食品組合物原料原料要求添加量白砂糖50-100克穩(wěn)定劑Y0825來自丹尼斯克3-8克唾液乳桿菌FDL89凍干菌粉和培養(yǎng)液10M010CFU/mL鮮牛奶符合國家《生鮮牛乳收購標(biāo)準(zhǔn)》定容至1000克1.工藝流程采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備含唾液乳桿菌FDL89的食品組合物。簡要地，所述方法包括如圖5所示流程。2.工藝要點說明2.1配料2丄1在配料罐中調(diào)入適量牛奶，牛奶的量淹沒攪拌葉，調(diào)奶過程攪拌不可開啟，調(diào)奶結(jié)束后開啟攪拌，原奶溫度小于10'C。2丄2牛奶不用升溫，將白砂糖、穩(wěn)定劑、膠原蛋白和抗氧化物的原料混合均勻后，加入循環(huán)的牛奶中，配料時攪拌開啟。2丄3配料完成后，停止循環(huán)，直接進行頂管操作.2.2定容2.2.1按配方進行定容，定容結(jié)束后攪拌lmin，取樣檢測。2.2.2水合20min，檢測合格后進行下一歩工序。定容后料液酸度小于180T，巴殺過程中開啟定容罐的攪拌。2.3預(yù)熱溫度60°C-65°C。2.4脫氣溫度:60。C陽65。C;壓力-90-80KPa。2.5均質(zhì)壓力:150-170bar。2.6殺菌溫度95士3。C;時間300秒。2.7冷卻冷卻至42士TC。2.8接種、發(fā)酵當(dāng)料液進入發(fā)酵罐1/3時，啟動攪拌，待進料結(jié)束后繼續(xù)攪拌10-15分鐘；停止攪拌，開始計時發(fā)酵。要求(1)對操作工的要求，剪短指甲，戴口罩；(2)接種時先將手，菌種袋以及菌種添加系統(tǒng)口周圍用75%的酒精噴霧消毒，再用明火消毒；2.9發(fā)酵酸度測定發(fā)酵4.0小時后，開始測酸，到達終點后及時破乳、打冷。2.10打冷、檢測將發(fā)酵奶全部打入貯罐冷卻至20士2。C，攪拌15-100的秒后，及時灌裝。2.11灌裝酸奶貯罐中的料液12小時內(nèi)(自冷卻完畢開始計時)灌完。2.12入庫產(chǎn)品在2小時內(nèi)入庫，并在2-6X:的冷庫中放置12小時以上。2.13出庫檢測合格后出庫。2.14在運輸和銷售過程中必須確保冷鏈配置(2-6°C)其中，所有的溫度指料液溫度而非設(shè)定溫度。以上所述僅為本發(fā)明示意性的具體實施方式，并非用以限定本發(fā)明的范圍。任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和原則的前提下所作的等同變化、修改與結(jié)合，均應(yīng)屬于本發(fā)明保護的范圍。權(quán)利要求1.一種唾液乳桿菌，該唾液乳桿菌對酸、膽鹽和消化液具有良好的耐受性，并具有免疫調(diào)節(jié)功能和脫除4-NQO基因毒性的功能。2.如權(quán)利要求1所述的唾液乳桿菌，其在pH2.0-3.0的酸性溶液中培養(yǎng)2小時，或在0.05-1.5%膽鹽濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時，仍有大量存活。3.如權(quán)利要求1所述的唾液乳桿菌，其中該唾液乳桿菌是FDL89(Lactobacillussalivarius)菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC2263，或其衍生菌株。4.如權(quán)利要求3所述的唾液乳桿菌，其中該唾液乳桿菌是FDL89(Lactobacillussalivarius)菌株。5.包含權(quán)利要求1-4任一項所述的唾液乳桿菌的組合物。6.如權(quán)利要求5所述的組合物，該組合物是食品組合物。7.如權(quán)利要求6所述的組合物，該組合物還包含食品學(xué)上可接受的載體。8.如權(quán)利要求5或6所述的組合物，該組合物包含105-101QCFU/mL所述唾液乳桿菌。9.用權(quán)利要求l-4任一項所述的唾液乳桿菌制備的純培養(yǎng)物，其中用牛奶作為培養(yǎng)基。10.如權(quán)利要求9所述的純培養(yǎng)物，其中所述牛奶中還含有糖和穩(wěn)定劑，其中糖50-100克/升，穩(wěn)定劑3-8克/升，并添加了10M(PCFU/毫升如權(quán)利要求l-4任一項所述的唾液乳桿菌。11.制備如權(quán)利要求9或10所述的純培養(yǎng)物的方法，其包括如下步驟1)配料；2)定容；3)均質(zhì)；4)殺菌；5)冷卻后接種發(fā)酵；6)測酸后打冷、檢測；7)灌裝；其中，步驟5)中使用如權(quán)利要求l-4任一項所述的唾液乳桿菌。12.如權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述步驟l)中的配料方法如下.-將50-10克糖，3-8克穩(wěn)定劑混合后用牛奶定容到1000毫升；步驟5)中以所述唾液乳桿菌的凍干菌粉或新鮮培養(yǎng)液以105-10ieCFU/mL的濃度接入到原料混合物，在40-42"C下發(fā)酵。13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述步驟2)和3)之間還包括步驟2.1)水合20分鐘；步驟2.2)在60-65。C下預(yù)熱；和步驟2.3)在溫度60。C-65。C和壓力-90-80Kpa下脫氣。14.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述步驟6)為將發(fā)酵奶全部打入貯罐冷卻至20士2。C，攪拌15-100秒后，及時灌裝。15.如權(quán)利要求1-4任一項所述的唾液乳桿菌在食品工業(yè)中的應(yīng)用。16.如權(quán)利要求1-4任一項所述的唾液乳桿菌在制備用于調(diào)節(jié)免疫力的生物制劑中的應(yīng)用。全文摘要一種唾液乳桿菌，該唾液乳桿菌對酸、膽鹽和消化液具有良好的耐受性，并具有免疫刺激功能。所述唾液乳桿菌在pH2.0-3.0的酸性溶液中培養(yǎng)2小時，或在0.05-1.5％膽鹽濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時，仍有大量存活。本發(fā)明還提供了包含有所述唾液乳桿菌的組合物尤其是一種食品組合物。本發(fā)明的唾液乳桿菌具有免疫刺激功能，包含該菌的食品組合物便于食用，并具有保健功效。文檔編號C12N1/20GK101538545SQ20091013158公開日2009年9月23日申請日期2009年4月8日優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日發(fā)明者劉愛萍,蔣菁莉,趙紅峰申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司