專利名稱：牛分枝桿菌lip突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程技術(shù)，特別是牛分枝桿菌溶血磷脂酶突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
牛結(jié)核病被國際獸疫局(OIE)列為B類動(dòng)物疫病，是一種人獸共患傳染病，可以通過吸入含菌氣溶膠或食用受污染的乳制品而從牛傳染到人。牛分枝桿菌是引起牛結(jié)核病 (bTB)的病原體，侵染宿主廣泛，可感染多種家畜和野生動(dòng)物，對人類和動(dòng)物健康構(gòu)成巨大危害。
溶血磷脂酶(Lysophospholipase)(以下簡稱LIP)廣泛分布于哺乳類動(dòng)物的組織和細(xì)胞中，在控制體內(nèi)溶血磷脂的水平以保持正常的生物學(xué)功能方面起著重要作用。溶血磷脂酶可以催化溶血磷脂水解為磷酸甘油和溶血磷脂酸，是催化溶血磷脂失活的主要途徑，被認(rèn)為在調(diào)節(jié)生物活性脂質(zhì)水平中起關(guān)鍵作用，溶血磷脂是磷脂代謝的中間產(chǎn)物，通常呈低水平地廣泛分布于各種生物的細(xì)胞膜上，具有除垢劑樣特性和溶膜特征，是一種很強(qiáng)的生物活性因子，磷脂代謝是結(jié)核分枝桿菌的各種代謝途徑中最重要的一條途徑，許多脂類都被發(fā)現(xiàn)與結(jié)核分枝桿菌的致病性和病原性有關(guān)系，有資料提出，脂類可以作為一種碳源，在慢性感染期促進(jìn)了結(jié)核分枝桿菌的生長，在長期的結(jié)核桿菌休眠期它或許能貯存所需的能量并且可以作為膜脂形成所必須的一種貯藏形式，體內(nèi)的脂類的貯藏對分支桿菌的生長很重要，并且對結(jié)核桿菌適應(yīng)宿主細(xì)胞的環(huán)境也很重要。
利用基因工程重組技術(shù)，對牛分枝桿菌溶血磷脂酶蛋白進(jìn)行克隆、原核表達(dá)、純化及免疫印跡分析，進(jìn)一步研究牛分枝桿菌溶血磷脂酶蛋白的功能，從而為掌握牛結(jié)核分枝桿菌的演化和致病機(jī)理以及控制該病具有十分重大的意義。目前涉及這一領(lǐng)域的研究尚處于空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種牛分枝桿菌LIP突變體蛋白；
本發(fā)明的目的之二是提供牛分枝桿菌LIP突變體蛋白制備方法；
本發(fā)明的目的之三是提供牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的一種用途。
本發(fā)明的目的按照下述方案實(shí)現(xiàn)
一種牛分枝桿菌LIP突變體蛋白，其LIP蛋白中心區(qū)的2個(gè)半胱氨酸(Cys)分別突變成甘氨酸(Gly)和絲氨酸(kr)。
一種制備牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的方法，其工藝過程包括
1)構(gòu)建含pET 30a/LIP的基因工程菌；
2)利用改進(jìn)的培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
3)裂解菌體，溶解包涵體，純化LIP突變體蛋白；
上述構(gòu)建含pET 30a/LIP的基因工程菌的工藝過程為按照NCBI公布的NC_002945序列和編碼甘氨酸和絲氨酸殘基的密碼子GGT、GGT、GGC和AGT、AGT、AGC的密碼子設(shè)計(jì)合成并擴(kuò)增其成熟蛋白的PCR引物，以牛分枝桿菌染色體DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，回收720bp左右DNA片段，與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞；純化重組質(zhì)粒，用EcoR I酶切鑒定，并測序，測序正確的陽性質(zhì)粒經(jīng)Mc I/ KpnI雙酶切后，與用經(jīng)過Me I/Kpnl雙酶切的pET 30a(+)連接后，轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)菌株，用上述引物做菌落PCR，篩選陽性克隆，得到含有表達(dá)載體的宿主菌。
上述改進(jìn)的培養(yǎng)基為蛋白胨15g，酵母提取物30g，葡萄糖5g，NaCl 10g，甘油 5ml，將上列組分溶解于900ml水中高壓滅菌，冷卻到50°C，隨后加入IOOml滅菌的KC1， KH2PO4及Na2HPO4的溶液，使終體積為100ml，用0. 22um的濾膜過濾除菌。
上述裂解菌體，溶解包涵體，純化LIP突變體蛋白的工藝過程為取出經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心分離，菌體用裂解緩沖液重懸，在冰浴條件下超聲破碎，離心，沉淀即為包涵體，將獲得的包涵體蛋白用低濃度變性劑和/或溫和去垢劑TritonX-IOO洗滌，沉淀用含 8mol/L尿素的包涵體溶解液溶解，溶解后的上清加適量上樣緩沖液，混勻，進(jìn)行SDS-PAGE， 電泳結(jié)束后用預(yù)冷的0. 25mol/L KCl浸泡膠至顯示出乳白色的蛋白條帶，切下目的條帶放入透析袋內(nèi)，用水平電泳洗脫裝置洗脫目的蛋白，結(jié)束前，將透析袋換個(gè)方向電泳15min，電泳結(jié)束后，收集透析袋內(nèi)的蛋白溶液，置于新透析袋，以PBS緩沖液透析過夜，透析后的樣品，取上清液測定蛋白濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
上述牛分枝桿菌LIP突變體蛋白作為抗原開發(fā)試劑盒。
本發(fā)明還對牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證
本發(fā)明采用透析復(fù)性，將洗脫的蛋白放入透析袋，依次用含有(T6mol/L濃度梯度的尿素的基礎(chǔ)緩沖液(60mmol/L Tris HCl,2mmol/L EDTA，5mmol/LGSH，10%甘油，8mmol/ L PMSF)按濃度梯度由大到小，進(jìn)行透析復(fù)性，每個(gè)濃度在4°C透析4、h，最后在pH 7. 4的 PBS緩沖液中透析過夜。
本發(fā)明提供了一種可高效表達(dá)LIP突變基因工程菌hherichia coliPET30/LIP。 該菌具有kana抗性，對人體無害，且在IPTG的誘導(dǎo)下，能夠大量表達(dá)LIP突變體蛋白。
本發(fā)明還將獲得的LIP突變體蛋白按《分子克隆》所述方法進(jìn)行 Western-blotting.將純化的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，加牛結(jié)核病陽性血清 (1 50比例稀釋)，洗滌，加二抗(兔抗牛)和顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LIP突變體蛋白能與牛分枝桿菌陽性血清發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)。
本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)，首次在體外表達(dá)并獲得了具有活性的牛分枝桿菌LIP 突變體蛋白，并且建立了純化、復(fù)性的方法；利用本發(fā)明的方法，LIP蛋白的表達(dá)量可達(dá) 20mg/L培養(yǎng)基。
本發(fā)明揭示了牛分枝桿菌LIP突變體蛋白能夠與牛分枝桿菌陽性血清發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)，因此可以用牛分枝桿菌LIP突變體蛋白作為抗原來開發(fā)試劑盒。


圖1是LIP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，1為Marker，3和4為擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2是pET 30a-LIP重組載體的&ic I/Kpn I雙酶切電泳圖，1為Marker，2、3為重組載體；
圖3是轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pET 30a_LIP突變體蛋白表達(dá)的電泳圖，1、2為空載體對照，3為蛋白Marker，4-9分別是重組蛋白在誘導(dǎo)2h、3h、4h、5h、6h、12h的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
圖4是純化后的LIP突變蛋白電泳圖，其中1為蛋白Marker，2為收集管；其中 1.低分子質(zhì)量蛋白Marker ;2.純化的重組蛋白；
圖5是LIP突變體蛋白經(jīng)Wfestern blotting顯影后的圖，其中3為蛋白Marker， 1、2為表達(dá)蛋白；
圖6是牛分枝桿菌LIP突變體基因片段的核苷酸序列表；
圖7是牛分枝桿菌LIP突變體蛋白表達(dá)載體構(gòu)建示意具體實(shí)施例方式
1、基因工程菌的構(gòu)建
根據(jù)GenBank中報(bào)道的牛分枝桿菌溶血磷脂酶基因核苷酸序列，用primer5. 0軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海Mgon公司合成。引物序列如下
LIP-S :5，-ATATGGTACCGAGCATGCCCGCCGCTACGAC-3‘(橫線為 Kpn I 酶切位點(diǎn))，
LIP-AS 5 ’ -GTACGAGCTCCTACAACCGCTCGGTGAGCCAG-3 ’ (橫線為 c I 酶切位點(diǎn))。
采用CTAB方法提取牛分枝桿菌基因組DNA。以牛分枝桿菌染色體DNA為模板，以 LIP-S、LIP-AS為引物，參照TaKaRa Ex Taq PCR試劑盒對溶血磷酯酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)總體積為50 μ L，模板DNA添加量為0. 5 μ g。PCR程序95°C熱變性!Min ；再95°C 熱變性lmin、60°C退火lmin、72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸IOmin0
反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳(圖1)，用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司B 型小量DNA片段快速膠回收試劑盒回收720bp左右DNA片段后，與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞；再用北京天根生物醫(yī)學(xué)科技有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒純化提取重組質(zhì)粒，測序，測序正確的陽性質(zhì)粒經(jīng)Me I/Kpnl雙酶切后，與用經(jīng)過Me Ι/Κρη I雙酶切的pET30a (連接過夜，轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)菌株，用上述PCR引物做菌落PCR，快速篩選克隆， 所得克隆再經(jīng)Me Ι/Κρη I雙酶切(圖幻及0嫩測序鑒定。經(jīng)上述篩選獲得hherichia coli PET30/LIP。
2、重組蛋白的表達(dá)及純化
培養(yǎng)基的制備蛋白胨15g，酵母提取物30g，葡萄糖5g，NaCl 10g，甘油5ml，將上列組分溶解于900ml水中高壓滅菌，冷卻到50°C，隨后加入IOOml滅菌的KC1，KH2PO4及 Na2HPO4的溶液，使終體積為100ml，用0. 22um的濾膜過濾除菌。
將含有表達(dá)載體的宿主菌接種到改良的液體培養(yǎng)基，待菌生長到A6tltl約0. 8時(shí)，加終濃度為1. 2mmol/L IPTG，37°C分別誘導(dǎo)2h,3h,4h,5h,6hU2h后，取出菌液離心，菌體用裂解緩沖液(60mmol/L Tris HCl, 1. Ommol/L EDTA,40mmol/L NaCl，4%甘油，pH = 8. 0)重懸，在冰浴條件下超聲破碎，8000-10000rpm/min，離心lOmin，沉淀即為包涵體，上清和沉淀用SDS-PAGE電泳檢測(圖幻。結(jié)果在預(yù)期的30ku處出現(xiàn)特異的、大量表達(dá)的蛋白條帶，表達(dá)量占菌體總蛋白53.3%。
將獲得的包涵體蛋白依次用洗滌液1(含lOmmol/L Tris HC1，0. 2mol/L尿素， 0. 5 % Triton X-100,10mmol/L EDTA，pH 8.0)和洗滌液 II (lOmmol/L TrisHCl,0. 5 % Triton X-100, lOmmol/L EDTA, pH 8.0)洗滌。然后用變性緩沖液(8mol/L 尿素，0. 5mol/L NaCl,20mmol/L Tris HCl，pH 7.8)溶解，溶解后的上清加適量上樣緩沖液，混勻，進(jìn)行 SDS-PAGE。電泳結(jié)束后用預(yù)冷的0. 25mol/LKCl浸泡膠至顯示出乳白色的蛋白條帶，切下目的條帶放入透析袋內(nèi)，用夾子將透析袋的兩端夾緊。用水平電泳洗脫裝置洗脫目的蛋白，一般洗脫3- 左右。結(jié)束前，將透析袋換個(gè)方向電泳15min。電泳結(jié)束后，收集透析袋內(nèi)的蛋白溶液，置于新透析袋，以PBS緩沖液透析過夜。透析后的樣品，取上清測定蛋白濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖4)。
3、蛋白質(zhì)的透析復(fù)性
將洗脫的蛋白放入透析袋依次在加有6mOl/L、3mOl/L、lmOl/L、0mOl/L尿素的基礎(chǔ)緩沖液 60mmol/L Tris HCl,2mmol/L EDTA,5mmol/L GSH，10%甘油，8mmol/LPMSF)中進(jìn)行透析復(fù)性，每個(gè)濃度在4°C透析4、h，最后在pH 7. 4的PBS緩沖液中透析過夜。復(fù)性結(jié)束后，利用美國Millipore 30KD蛋白收集管在4°C，5000rpm/min離心lOmin，棄去沉淀，上清即為復(fù)性好的蛋白。
4、Western-blotting按《分子克隆》所述方法進(jìn)行。將純化的蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，加牛結(jié)核病陽性血清(1 50比例稀釋)，洗滌，加二抗(兔抗牛) 和顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LIP突變體蛋白能與牛分枝桿菌陽性血清發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)(圖5)。 具體步驟如下
SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30min，將浸泡過的與膠同樣大小的NC膜和濾紙，按纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖維墊的結(jié)構(gòu)，裝入轉(zhuǎn)印夾。轉(zhuǎn)印時(shí)凝膠側(cè)接負(fù)極，NC膜側(cè)接正極，電泳槽冰浴，20V恒壓轉(zhuǎn)印池。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，置于封閉液中室溫振搖封閉Ih ；取出NC膜置于用封閉液稀釋好的牛結(jié)核病陽性血清陽性血清內(nèi)，室溫振搖池；PBST洗滌3次，每次5min ；置于用封閉液稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛的抗體溶液中，室溫振搖Ih ；PBST洗滌3次，每次5min ；最后將NC膜浸入DAB溶液中顯色，用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。
5、牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的核苷酸序列與編碼的氨基酸序列
采用全自動(dòng)測序儀對LIP突變體基因片段的核苷酸序列進(jìn)行了測定。目的基因片段大小為720bp。測序結(jié)果表明，STI毒素中心的2個(gè)Cys分別成功突變成Ser和Gly，其它核苷酸序列與NCBI報(bào)道的序列一致。其序列表見圖6。
權(quán)利要求
1.一種牛分枝桿菌LIP突變體蛋白，其LIP蛋白中心區(qū)的2個(gè)半胱氨酸(Cys)分別突變成甘氨酸(Gly)和絲氨酸(kr)。
2.一種制備牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的方法，其工藝過程包括1)構(gòu)建含PET30a/LIP的基因工程菌；2)利用改進(jìn)的培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；3)裂解菌體，溶解包涵體，純化LIP突變體蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的制備牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的方法，構(gòu)建含pET30a/LIP的基因工程菌的工藝過程為按照NCBI公布的NC_0(^945序列和編碼甘氨酸和絲氨酸殘基的密碼子GGT、GGT、GGC和AGT、AGT、AGC的密碼子設(shè)計(jì)合成并擴(kuò)增其成熟蛋白的PGR引物，以牛分枝桿菌染色體DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，回收720bp左右DNA 片段，與PGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；純化重組質(zhì)粒，用EcoR I酶切鑒定，并測序，測序正確的陽性質(zhì)粒經(jīng)Me Ι/Κρη I雙酶切后，與用經(jīng)過Mcl/Kpn I雙酶切的 PET 30a (+)連接后，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌株，用上述引物做菌落PCR，篩選陽性克隆，得到含有表達(dá)載體的宿主菌。
4.如權(quán)利要求2所述的制備牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的方法，其改進(jìn)的培養(yǎng)基為 蛋白胨15g，酵母提取物30g，葡萄糖5g，NaCl 10g，甘油5ml，將上列組分溶解于900ml水中高壓滅菌，冷卻到50°C，隨后加入IOOml滅菌的KC1，KH2PO4及Na2HPO4的溶液，使終體積為 100ml，用0. 22um的濾膜過濾除菌。
5.如權(quán)利要求2所述的制備牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的方法，其裂解菌體，溶解包涵體，純化LIP突變體蛋白的工藝過程為取出經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心分離，菌體用裂解緩沖液重懸，在冰浴條件下超聲破碎，離心，沉淀即為包涵體，將獲得的包涵體蛋白用低濃度變性劑和/或溫和去垢劑TritonX-IOO洗滌，沉淀用含8mol/L尿素的包涵體溶解液溶解，溶解后的上清加適量上樣緩沖液，混勻，進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后用預(yù)冷的0. 25mol/L KCl浸泡膠至顯示出乳白色的蛋白條帶，切下目的條帶放入透析袋內(nèi)，用水平電泳洗脫裝置洗脫目的蛋白，結(jié)束前，將透析袋換個(gè)方向電泳15min，電泳結(jié)束后，收集透析袋內(nèi)的蛋白溶液，置于新透析袋，以PBS緩沖液透析過夜，透析后的樣品，取上清液測定蛋白濃度，并進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳。
6.牛分枝桿菌LIP突變體蛋白作為抗原開發(fā)試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明是一種牛分枝桿菌LIP突變體蛋白及其制備方法和應(yīng)用，牛分枝桿菌LIP突變體蛋白中心區(qū)的2個(gè)半胱氨酸(Cys)分別突變成甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)。制備牛分枝桿菌LIP突變體蛋白的方法，工藝過程包括1)構(gòu)建含pET 30a/LIP的基因工程菌；2)利用改進(jìn)的培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；3)裂解菌體，溶解包涵體，純化LIP突變體蛋白。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)，首次在體外表達(dá)并獲得了具有活性的牛分枝桿菌LIP突變體蛋白，并且建立了純化、復(fù)性的方法；利用本發(fā)明的方法，LIP蛋白的表達(dá)量可達(dá)20mg/L培養(yǎng)基。
文檔編號C12R1/32GK102533691SQ20091011748
公開日2012年7月4日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者周晶, 徐廣賢, 李敏, 王玉炯, 賈浩 申請人:寧夏大學(xué)