專利名稱：一種牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組、快速檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑，具體涉及一種牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組、 快速檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)背景由結(jié)核分支桿菌引起的肺結(jié)核，是非常嚴(yán)重的一種人畜共患傳染病，通過 吸入含細(xì)菌的氣溶膠或食用被細(xì)菌污染的奶制品而弓i起動(dòng)物及人發(fā)病，而且很 難治愈?；寂３１憩F(xiàn)出短而促的干咳，日漸消瘦，貧而等現(xiàn)象，有的也會(huì)表現(xiàn)出體 表淋巴結(jié)腫大，如肩前、股后、腹股溝、頜下、咽和頸淋巴結(jié)。病情惡化時(shí)可 能會(huì)發(fā)生全身性結(jié)核。胸膜和腹膜發(fā)生結(jié)核病灶時(shí)出現(xiàn)所謂的"珍珠病"，胸部 聽診有摩擦音。多數(shù)病牛乳房會(huì)受侵害，表現(xiàn)出慢性乳房炎的癥狀。犢牛常發(fā) 生腸道結(jié)核，出現(xiàn)消化道不良、頑固性下痢、消瘦等癥狀，最后死亡。世界上很多國家包括我國都是采取"檢疫-撲殺"的措施，病情較輕者可以 隔離治療。如果處理不及時(shí)，對(duì)牛群及人類的自身安全和健康都會(huì)造成極大的 損害。因此對(duì)結(jié)核病疫情的密切關(guān)注己迫在眉睫，控制本病的傳播和蔓延，及時(shí) 檢疫，根除病牛。要做到這些必需加強(qiáng)對(duì)本病的研究以及建立一種適用于我國 牛結(jié)核病的臨床檢測(cè)方法，以達(dá)到控制和消滅結(jié)核病的目的。目前對(duì)牛結(jié)核分支桿菌的臨床檢測(cè)主要集中于提純結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)試驗(yàn)，但不足之處在于對(duì)因感染其他分支桿菌致敏的動(dòng)物沒有特異性，不能判 斷病情，且在那些因病情嚴(yán)重導(dǎo)致免疫反應(yīng)低下的動(dòng)物易出現(xiàn)假陰性。而當(dāng)感 染副結(jié)核分支桿菌等環(huán)境分支桿菌時(shí)，則可能呈現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因此，尋求特 異敏感的診斷抗原以及制定一套嚴(yán)格統(tǒng)一的規(guī)范化操作標(biāo)準(zhǔn)，已成為牛結(jié)核病 診斷技術(shù)研究的重要方面。
等溫?cái)U(kuò)增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測(cè)技術(shù)是病原核酸檢測(cè) 技術(shù)上的長足進(jìn)步，現(xiàn)己建立起來的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)具有很多的優(yōu)越性，LAMP主要是利用4種 不同的特異性引物(引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP)識(shí)別靶基因的 6個(gè)特定區(qū)段，在聚合酶和等溫條件下高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列，擴(kuò) 增反應(yīng)結(jié)束后，通常是采用染色劑對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。LAMP中所用到的聚 合酶通常都選用具有鏈置換特性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶。對(duì) LAMP來說，4種特異性引物的設(shè)計(jì)是其關(guān)鍵所在。
LAMP因其自身的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被用于病原微生物的檢測(cè)和傳染性疾病的診 斷。如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的檢測(cè)、分支桿菌屬檢 測(cè)、腺病毒性結(jié)膜炎檢測(cè)、真菌檢測(cè)等，現(xiàn)尚未見有LAMP用于牛結(jié)核分枝 桿菌檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)設(shè)計(jì)的，對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌具有高特異性的牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用上述引物組對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌進(jìn) 行高效、高特異性的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用上述快速檢測(cè)方法對(duì)牛結(jié)核分枝 桿菌進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的一、 本發(fā)明的牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組，是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)， 根據(jù)己公開的牛結(jié)核分枝桿菌基因序列，選取牛結(jié)核分枝桿菌基因的特異性序 列，然后分析設(shè)計(jì)出的，能專一性鑒別牛結(jié)核分枝桿菌的特異性引物組，通過 PCR來鑒定牛結(jié)核分枝桿菌基因，該引物組包含如下四條引物外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。本發(fā)明的牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組除上述4條引物外，還可多增加1 對(duì)環(huán)狀引物環(huán)狀引物L(fēng)F，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示； 環(huán)狀引物L(fēng)B，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。上述環(huán)狀引物L(fēng)F和LB可以結(jié)合于LAMP反應(yīng)生成的啞鈴狀產(chǎn)物的環(huán)狀 部位，因此環(huán)狀引物的增加使得整個(gè)引物組多了2個(gè)耙基因識(shí)別區(qū)域，提高了 引物組的特異度。二、 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法，是利用上述引物組，對(duì)牛結(jié)核分歧桿菌進(jìn)行 高效和高特異性的檢測(cè)，其具體步驟如下(1) 樣品處理處理待測(cè)樣品并采用本領(lǐng)域的常規(guī)做法提取樣品的DNA;(2) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程采用人工合成的引物組對(duì)樣品DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增牛結(jié)核分枝桿菌的特異性片段；
(3)反應(yīng)后處理LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，向LAMP擴(kuò)增體系中加入顯 色劑，根據(jù)所觀察的顏色判斷結(jié)果。
上述歩驟(1)中，待測(cè)樣品通常是選擇痰液棉拭子或血液樣品。
上述步驟(2)中，所述人工合成的引物組，包含如下四條引物外引物
F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQID NO:2所示；內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；內(nèi)引物BIP， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
上述步驟(2)中，LAMP的反應(yīng)體系采用本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行LAMP反應(yīng) 時(shí)常用的反應(yīng)體系，如LAMP反應(yīng)一般都包含BWDNA聚合酶、Ssf DNA聚合 酶緩沖液、25mmol4iLMgS04、 5nmol4iL甜菜堿和4種dNTP等，可參考教科書 以及LAMP試劑盒中的反應(yīng)體系配制，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
上述步驟(2)中，LAMP反應(yīng)的反應(yīng)條件可采用本領(lǐng)域人員操作LAMP 反應(yīng)時(shí)的常規(guī)反應(yīng)條件，優(yōu)選恒溫反應(yīng)溫度為60 63"C，恒溫反應(yīng)時(shí)間為45 60min， 80°C 2 10min終止反應(yīng)。
上述步驟(3)中，顯色劑可選擇任何一種常用的熒光染料，優(yōu)選SYBR Green I或EvaGreen。
上述步驟(3)中，當(dāng)熒光染色劑加入反應(yīng)液后不變色，則說明為陰性， 如果變色則為陽性，以SYBR Green I為例，SYBR Green I為橙色，若SYBR Green I加入到LAMP反應(yīng)液后依然顯橙色，則說明待測(cè)樣品中不含有牛結(jié)核分枝桿 菌，若SYBR Green I加入到LAMP反應(yīng)液后變成綠色，則說明待測(cè)樣品中含有 牛結(jié)核分枝桿菌。上述步驟(2)中，引物組還可以包含一對(duì)環(huán)狀引物環(huán)狀引物L(fēng)F，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；環(huán)狀引物L(fēng)B,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6 所示。環(huán)狀引物L(fēng)F和LB可以結(jié)合于LAMP反應(yīng)生成的啞鈴狀產(chǎn)物的環(huán)狀部 位，同時(shí)啟動(dòng)DNA鏈置換反應(yīng)，生成一系列核酸結(jié)構(gòu)，從而有效提高LAMP 的反應(yīng)速度和效率。三、本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒，是利用上述快速檢測(cè)方法來對(duì)待測(cè)樣品是否含 有牛結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)的，該試劑盒包含本發(fā)明的牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用 引物組(外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；外引物B3，其核苷 酸序列如SEQ ID NO:2所示；內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示)和陽性對(duì)照品(牛結(jié)核分枝 桿菌基因組DNA)，該檢測(cè)試劑盒使用時(shí)，將待測(cè)樣品DNA與引物組進(jìn)行常 規(guī)的LAMP反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，可優(yōu)選在63 65'C的恒溫條件，反應(yīng)時(shí)間為 45 60min，然后于80°C 2 10min終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物后用顯色劑染色，將染 色結(jié)果和陽性對(duì)照組的染色結(jié)果進(jìn)行比較，從而判斷待測(cè)樣品是否含有牛結(jié)核 分枝桿菌。上述檢測(cè)試劑盒還包含環(huán)狀引物L(fēng)F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示 和環(huán)狀引物L(fēng)B，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。上述檢測(cè)試劑盒還可以包含^WDNA聚合酶、顯色劑和LAMP反應(yīng)液，所 述顯色劑可選擇任何一種常用的熒光染料，優(yōu)選SYBR Green I或EvaGreen，所 述LAMP反應(yīng)液可參考本領(lǐng)域人員進(jìn)行LAMP反應(yīng)時(shí)常用的反應(yīng)液配方，如 LAMP反應(yīng)液可含有內(nèi)引物BIP和FIP 35~45 pmol爾L 、夕卜弓I物F3和B3 4 6pmol/VL、環(huán)狀引物L(fēng)F和LB 15~25 pmol/^iL、 MgS04 20 30mmol/|_iL、甜菜堿4 7nmol/^L、 4個(gè)dNTP 20 30mmol/fiL和10體積。/。 Sw DNA聚合酶緩沖液 (10x)，所述5W DNA聚合酶緩沖液(10x)含200 mM Tris-HCl (pH 8.8)、 100mMKCl、00mM (NH4) 2S04、 20 mM MgS04和0.1體積％ Triton X-100。
上述檢測(cè)試劑盒使用時(shí)可按照如下步驟操作
(1) 處理待測(cè)樣品，提取樣品的DNA;
(2) 采用所述試劑盒中的引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò) 增牛轉(zhuǎn)核分枝桿菌的特異性片段；
(3) 向上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和陽性對(duì)照組中分別加入熒光染色 劑，觀察顏色變化，如果樣品組顯色與對(duì)照組相同則為陽性，否則為陰性。選 擇染色劑S1^R Oew/為例，Sl"5i Oee"/為橙色，加入到反應(yīng)體系和陽 性對(duì)照組后，陽性對(duì)照組中的顏色變?yōu)榫G色，如果反應(yīng)體系的顏色還是橙色那 么就說明待測(cè)樣品中沒有感染牛結(jié)核分支桿菌，如果反應(yīng)體系的顏色變成和陽 性對(duì)照組一樣的綠色，就說明待測(cè)樣品感染了牛結(jié)核分枝桿菌。
為了檢測(cè)時(shí)更加迅速方便，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒除了上述4條引物、Bst DNA聚合酶、熒光染色劑、陽性對(duì)照液和LAMP反應(yīng)液外，還可以包含樣品 DNA提取液。所述樣品DNA提取液，是提取待測(cè)樣品(如痰液棉拭子或血液 樣品等)中的DNA，其提取液的配制可參考常規(guī)的DNA提取液的配制方法， 并可根據(jù)不同待測(cè)樣品進(jìn)行稍微的改動(dòng)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
l.本發(fā)明根據(jù)已公開的牛結(jié)核分枝桿菌基因序列，選取牛結(jié)核分枝桿菌基 因的特異性序列，然后分析設(shè)計(jì)出牛結(jié)核分枝桿菌引物組的，具有高特異性， 能夠準(zhǔn)確且專一性地鑒別牛結(jié)核分枝桿菌；2.本發(fā)明的引物組在原有4條引物的基礎(chǔ)上，增加l對(duì)環(huán)狀引物，可以有效地縮短檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間和增加反應(yīng)的特異度，增加了 2個(gè)靶基因識(shí)別區(qū)域；3.本發(fā)明的快速檢測(cè)方法可快速高效擴(kuò)增待測(cè)樣品，整個(gè)擴(kuò)增在不到lh即可完成，且產(chǎn)率高，所使用的牛結(jié)核分枝桿菌引物組特異性高，可大大提高其擴(kuò)增效率，擴(kuò)增時(shí)間在原來的基礎(chǔ)上減少1/3~1/2，使用環(huán)狀引物可以在現(xiàn) 有的基礎(chǔ)上縮短1/3 1/2的時(shí)間；4. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，且靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需IO拷貝或更少；5. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法多采用一套環(huán)狀引物，從而有效地提高了 LAMP 的反應(yīng)速度和效率；6. 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷 靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性；7. 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，通過熒光染色劑的顏色變化，可通過肉 眼觀察鑒定，且陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例l牛結(jié)核分枝桿菌基因的快速檢測(cè)本實(shí)施例采用牛的痰液棉拭子作為檢測(cè)樣品，其具體檢測(cè)方法包括如下步驟1、處理待檢樣品，制取樣品的DNA; (1)準(zhǔn)備新鮮牛的痰液棉拭待用；(2)材料準(zhǔn)備 A.待檢樣品的處理
痰液棉拭子的處理
將痰液棉拭子中加適量約0.5ml滅菌的0.9°/。生理鹽水至于1.5ml離心管 中，放入60。C以上水浴鍋或隔熱裝置中加熱30min以上，搖勻直接可作為模 板使用。
2、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)
(1) 人工合成牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組，該引物組包含如下六條引物 外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；
外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示； 內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示； 環(huán)狀引物L(fēng)F，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示； 環(huán)狀引物L(fēng)B，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
(2) LAMP反應(yīng)
LAMP反應(yīng)體系如表1所示，表1中的引物BIP、 FIP、 F3、 B3、 LoopF 和LoopB為上述引物組的6條引物。表1LAMP反應(yīng)體系試劑體積(或濃度)BstDNA聚合酶(8U/nL)1^1BstDNA聚合酶緩沖液(10 x)2.5|ilDNA樣品MgS04 (25mmo/VL)舌甘菜堿(5|imol/|jL)一dNTP (25mmol/|iL)BIP &FIP40 pmol/pLF3&B35 pmol/jiLLF&LB20 pmol/|_iLH20up to 25|iLLAMP反應(yīng)條件為63。C恒溫水浴60min， 80°C 2min，終止反應(yīng)。(3)反應(yīng)后處理向上述LAMP反應(yīng)液中加入l[iL SF^ C^ee" /，計(jì)時(shí)3 5min后觀察顯 色結(jié)果，5T^/ Oeew/的顏色為橙色，當(dāng)加入本實(shí)施例樣品LAMP反應(yīng)液后 顏色變?yōu)榫G色，說明本實(shí)施例樣品含有牛結(jié)核分枝桿菌。同時(shí)采用Real-time PCR對(duì)本實(shí)施例提取的樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié) 果為樣品中含有牛結(jié)核分枝桿菌，這一結(jié)果和本實(shí)施例的結(jié)果相吻合。實(shí)施例2檢測(cè)試劑盒快速檢測(cè)牛結(jié)核分枝桿菌基因本實(shí)施例采用檢測(cè)試劑盒對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒由 牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組、陽性對(duì)照品、顯色齊IJ、^WDNA聚合酶和LAMP反應(yīng)液組成，五種液體分別置于不同容器中，其中
a. 牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組由如下六條引物組成 外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示； 環(huán)狀引物L(fēng)F，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示； 環(huán)狀引物L(fēng)B，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；
b. fiWDNA聚合酶8U;
c. 陽性對(duì)照組為牛結(jié)核分枝桿菌基因組DNA;
d. 顯色劑為Syfi/ GVeew/;
e. LAMP反應(yīng)液含有內(nèi)引物BIP和FIP 40 pmol:L 、夕卜弓i物F3和B3 5pmol/(iL、環(huán)狀引物L(fēng)F和LB 20 pmol/nL、MgSC>4 25mmol/pL、甜菜堿5[xmol/iiL、 4個(gè)dNTP25mmol/iiL和10體積。/。fiWDNA聚合酶緩沖液(10x)，所述^^DNA 聚合酶緩沖液(10 x)含200mMTris-HCl(pH8.8)、100mMKCl、 100mM(NH4) 2S04 、 20 mM MgS04和0.1體積％ Triton X-100 。
本實(shí)施例的檢測(cè)步驟如下 (1)樣品處理
準(zhǔn)備待檢樣品牛血液樣品(-70°C低溫冰箱保存)。
血液樣品DNA提取采取血液2 3mL至預(yù)先加有EDTA抗凝劑的試管 中，用生理鹽水將血樣洗3次，棄上清，留沉淀備用；將血樣的沉淀用含100mg/L 蛋白酶K的0.5% SDS， 100mmol/L Tris-HC1， lmmol/L EDTA， pH8.0， 50'C水浴消化3h;經(jīng)1次酚和2次氯仿-異戊醇抽提后，往水相中加入1/10體積3mol/L醋酸鈉，無水乙醇沉淀2h或沉淀過夜，空氣干燥，重懸在雙蒸水中， -20'C保存。(2) LAMP反應(yīng)向反應(yīng)管巾加入上述樣品DNA2pL， BstDNA聚合酶lpl， LAMP反應(yīng) 液22pL， 6(TC水浴45分鐘，80°C 10min終止反應(yīng)。 (3)反應(yīng)后處理向上述反應(yīng)液和陽性對(duì)照品中分別加入顯色劑Si^i GVeew/，顯色劑為 橙色，加入到陽性對(duì)照組后變?yōu)榫G色，而加入到樣品反應(yīng)液后依然為橙色，由 此說明本實(shí)施例的樣品中不含有牛結(jié)核分枝桿菌。同時(shí)采用Real-time PCR對(duì)本實(shí)施例提取的樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié) 果為樣品中不含有牛結(jié)核分枝桿菌，這一結(jié)果和本實(shí)施例的結(jié)果相吻合。實(shí)施例1和實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果，均與相應(yīng)的傳統(tǒng)熒光定量PCR結(jié)果具 有一致性，說明本發(fā)明的方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中是否含有牛結(jié)核分枝桿菌。一種牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組、快速檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒序列表 SEQUENCE LISTING
<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> —種牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組、快速檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒
<130>
<160> 6
〈170〉 Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 18
〈212〉 DNA
<213〉 人工合成
<400〉 1
ggcttccaac aacccgat 18
<210> 2
<211〉 18
<212> 腿
<213〉 人工合成
〈400〉 2
ggtcaggatg ctgctgag 18
<210> 3
〈211〉 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gtactcgccg ccgttgaggg tcagtaccct gacctcgg 38
<210〉 4
<211> 38
<212> DNA
<213〉 人工合成
<400〉 4
accgttttcg cccccacctt ggcgtcagtc ttgagttg 38
<210> 5
〈211> 20
<212> DNA
<213〉 人工合成
<400> 5
tcgaccagat tcacatccgg 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA <213>人工合成
<400> 6
aacgccgcat tcgacaag 18
權(quán)利要求
1、一種牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組，其特征在于該引物組包含如下四條引物外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO4所示。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述引物組，其特征在于該引物組還包含一對(duì)環(huán)狀引物環(huán)狀引物L(fēng)F，其核苷酸序列如SEQIDNO.'5所示； 環(huán)狀引物L(fēng)B，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
3、 一種快速檢測(cè)方法，其特征在于該方法是采用權(quán)利要求1所述引物組， 對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入顯色劑，判斷 顯色結(jié)果。
4、 一種快速檢測(cè)方法，其特征在于該方法是采用權(quán)利要求2所述引物組， 對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入顯色劑，判斷 顯色結(jié)果。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述方法，其特征在于所述LAMP反應(yīng)的反應(yīng)溫 度為60 63。C，反應(yīng)時(shí)間為45 60min， 80°C 2~10min終止反應(yīng)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述方法，其特征在于所述顯色劑為SYBR Green I或EvaGreen。
7、 一種檢測(cè)試劑盒，其特征在于該檢測(cè)試劑盒包含權(quán)利要求1或2所述 弓I物組和陽性對(duì)照品，所述陽性對(duì)照品為牛結(jié)核分枝桿菌基因組DNA。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含SWDNA聚 合酶、顯色劑和LAMP反應(yīng)液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述試劑盒，其特征在于所述LAMP反應(yīng)液含有內(nèi)引 物BIP和FIP 35~45pmol/pL、外引物F3和B3 4 6pmol4iL、環(huán)狀引物L(fēng)F和 LB 15 25pmol/^L、 MgS04 20 30mmol/pL、甜菜堿4 7(imol/(iL、 4個(gè)dNTP 20~30mmol/^iL和10體積。/。10x SwDNA聚合酶緩沖液，所述10x^^DNA聚 合酶緩沖液含200mMpH 8.8的Tris-HCl、 100mMKCl、 100mM (NHU) 2S04、 20mM MgS04和0.1體積。/。Triton X-IOO。
全文摘要
本發(fā)明公開一種牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)用引物組、快速檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，該引物組是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，根據(jù)牛結(jié)核分枝桿菌基因的特異性序列設(shè)計(jì)而得，包含核苷酸序列如SEQ ID NO1～4所示引物，對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌具有高特異性。本發(fā)明的引物組中還包含一對(duì)核苷酸序列如SEQ IDNO5～6所示的環(huán)狀引物，環(huán)狀引物可結(jié)合于LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的環(huán)狀部位，提高引物特異性，同時(shí)有效提高LAMP的反應(yīng)速度和效率。本發(fā)明的快速檢測(cè)方法是利用上述引物組對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，通過顯色結(jié)果判斷樣品中是否含有牛結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明還根據(jù)上述快速檢測(cè)方法設(shè)計(jì)出檢測(cè)試劑盒，可對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行快速準(zhǔn)確專一性地鑒別。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101575640SQ200910037858
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日
發(fā)明者君 張, 李守軍 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)