專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于固定化方法的脂肪酶固定方法及其在阿魏酸酯化反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以離子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶固定方法及其在阿魏酸酯化反 應(yīng)中的應(yīng)用，具體說(shuō)涉及一種采用大孔隙鏊合型苯乙烯系離子交換樹(shù)脂D403固定脂肪酶 的方法并用該酶催化酯化反應(yīng)。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase, EC3. 1. 1. 3)又稱(chēng)三?；视王；饷?，是一類(lèi)特殊的?；?解酶，普遍存在于動(dòng)、植物和微生物中。它不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合 成反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酸解反應(yīng)等反應(yīng)，是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、紡織 和化工工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、造紙行業(yè)等。隨著世界范圍內(nèi)能源短缺和環(huán)境保護(hù)的需要，生物柴 油(即脂肪酸單酯)的應(yīng)用成為關(guān)注和研究的熱點(diǎn)，其中生物酶法合成生物柴油已成為生 物柴油研究的重要方向，其途徑就是利用動(dòng)植物及廢棄物油脂，經(jīng)脂肪酶的催化進(jìn)行酰基 轉(zhuǎn)移反應(yīng)。由于脂肪酶的價(jià)格昂貴，對(duì)環(huán)境變化的耐受力極低，很難重復(fù)利用，難與底產(chǎn)物 分離，因而難以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝的連續(xù)化和自動(dòng)化，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。為了降低酶催化法 的成本，將其固定于合適的載體形成固定化脂肪酶，是解決上述不足和進(jìn)一步提高固定化 脂肪酶穩(wěn)定性的有效途徑。固定化脂肪酶具有可以回收，重復(fù)使用，穩(wěn)定性高，產(chǎn)品質(zhì)量高 等優(yōu)點(diǎn)。許多國(guó)家如日本、美國(guó)、印度和中國(guó)等競(jìng)相開(kāi)展了固定化脂肪酶的研究。脂肪酶的 固定化技術(shù)不僅在工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)化和自動(dòng)化上有重要價(jià)值，而且在生物學(xué)的基本理論研 究、在臨床醫(yī)學(xué)和促進(jìn)其他生化技術(shù)的發(fā)展中都有重大的意義。 脂肪酶的固定化方法大致分為物理法和化學(xué)法。物理法主要有吸附法和包埋法； 化學(xué)法有共價(jià)偶聯(lián)法和交聯(lián)法。譚天偉的課題組以紡織物膜如尼龍、棉織物膜、纖維素膜、 PS膜、真絲、聚酯類(lèi)織物膜作為固定化載體，固定化假絲酵母脂肪酶99-125合成棕櫚酸異 辛酯以及采用廉價(jià)的廢油作為原料進(jìn)行酶促合成FAME (譚天偉等，中國(guó)專(zhuān)利，2006 ;陳必強(qiáng) 等，化工學(xué)報(bào)，2004 ;高靜等，化工學(xué)報(bào)，2005)。 以大孔樹(shù)脂為載體采用吸附法固定化脂肪酶，如高紅娟等以AB-8、HZ-841、HZ-802 種大孔樹(shù)脂做載體，采用物理吸附法，制備出固定化南極假絲酵母脂肪酶(CALB)，并用其 進(jìn)行了拆分2-辛醇的研究(精細(xì)化工，2008)。吳茜茜等以大孔樹(shù)脂DIOI固定化中性脂 肪酶，研究了固定化條件對(duì)酶催化活性的影響，得到了最佳固定化條件(食品與發(fā)酵工業(yè)， 2008)。高陽(yáng)等以不同大孔樹(shù)脂NKA-9、 AB_8、 H103、 D4020、 NKA等吸附法固定化假絲酵母 99-125脂肪酶，通過(guò)固定化條件的優(yōu)化，比較了不同樹(shù)脂的固定化效率和固定化酶的催 化效果，并在微水體系中利用大豆油合成生物柴油，在微水有機(jī)相中的應(yīng)用表明非極性樹(shù) 脂NKA是最佳的固定化栽體(生物工程學(xué)報(bào)，2006)。王衛(wèi)飛等選擇3種大孔樹(shù)脂AB-8、 HZ-802、HZ-841吸附固定化Thermomyces la皿ginosus脂肪酶，用AB-8樹(shù)脂固定化的脂肪 酶比酶活最高，達(dá)到37451U/g(王衛(wèi)飛等，中國(guó)油脂，2008)。李潯等采用大孔樹(shù)脂D3520作 載體，獲得以載體涂布法固定化脂肪酶的最適固定化條件(李潯等，應(yīng)用化工，2008)。虞英等以D311離子交換樹(shù)脂為載體，通過(guò)離子交換吸附法對(duì)Lipolase 100L脂肪酶進(jìn)行固定化
(虞英等，食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007)。唐良華等采用大孔吸附樹(shù)脂AB-8、 D-201、 D_204、
X-5，大孔吸附樹(shù)脂HZ801、 HZ802固定化擴(kuò)展青霉TS414脂肪酶，建立了適于非水相中選擇
性拆分(R， S)-布洛芬的固定化方法(唐良華等，過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2008)。 蔡宏舉等用自制大孔載體固定化脂肪酶，即以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，二
乙烯基苯為聚合交聯(lián)劑，采用固液聯(lián)合致孔方式，通過(guò)本體聚合制備了具有大孔結(jié)構(gòu)的含
環(huán)氧基的多孔載體。載體上的環(huán)氧基團(tuán)水解成羥基后，以戊二醛為偶聯(lián)劑，用載體偶聯(lián)法 固定化假絲酵母脂肪酶，對(duì)固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化，比較了固定化酶與游離酶的酶學(xué)參數(shù) (蔡宏舉等，過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2007)。郭道義等采用甲基三甲氧基硅和四甲氧基硅縮水和水 解反應(yīng)形成的硅膠包埋固定化洋蔥假胞菌G63脂肪酶。研究了酶用量、醇油摩爾比、反應(yīng)溫 度、含水量對(duì)合成生物柴油的影響(郭道義等，中國(guó)油脂，2008)。豐宗清采用殼聚糖(CS) 負(fù)載在(MCM-41)介孔分子篩表面得到有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合物(CS-MCM-41)，用于制備固定化 假單胞脂肪酶，研究了磷酸鹽緩沖溶液的pH值、酶量、固定化時(shí)間和溫度等條件對(duì)固定化 脂肪酶(PSL/CS-MCM-41)催化活性的影響，得到適宜的固定化條件(豐宗清，農(nóng)業(yè)科學(xué)研 究，200S)。以殼聚糖為載體，用物理吸附固定化脂肪酶，對(duì)影響固定化過(guò)程的各種因素進(jìn)行 考察，確定最優(yōu)條件，并比較了游離酶和固定化酶的最適溫度、pH、酶的熱穩(wěn)定性以及表觀(guān) Km(李志國(guó)等，華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004)。鄭毅等采用吸附與交聯(lián)相結(jié)合的方法固定化米曲 霉脂肪酶選擇性富集魚(yú)油"_3多不飽和脂肪酸甘油酯，載體為硅藻土、交聯(lián)劑為0. 5%戊 二醛(鄭毅等，化工學(xué)報(bào)，2006)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種將大孔隙鏊合型苯乙烯系離子交換樹(shù)脂D403預(yù)處 理，并以此為載體，用于固定化吸附脂肪酶的固定方法。 本發(fā)明的另一個(gè)目的，是將經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂固定后的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng) 中的應(yīng)用。 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的而采用的技術(shù)方案是
1、樹(shù)脂預(yù)處理 將準(zhǔn)備裝離子交換柱使用的離子交換樹(shù)脂，先用50-6(TC熱水反復(fù)2-3次浸洗，每 隔15分鐘換水一次，浸洗時(shí)要不時(shí)攪動(dòng)，換水3次后結(jié)束第一輪浸洗，重復(fù)上述浸洗步驟， 但換水間隔時(shí)間改為每隔30分鐘換水一次，總共換水4-5次，結(jié)束第二輪浸洗。
水洗后，用0. 5N NaOH以每小時(shí)1. 5倍床層體積緩慢流過(guò)樹(shù)脂，總用量為樹(shù)脂體積 的2-3倍。此后用水沖洗至出水pH值為8. 5-9. 5時(shí)，改用3倍樹(shù)脂體積、百分比濃度為5% 的NaCl溶液以每小時(shí)1. 5倍床層體積流過(guò)樹(shù)脂。再用0. 5N鹽酸以每小時(shí)1. 5倍床層體積 流過(guò)樹(shù)脂，總用量為樹(shù)脂體積的2-3倍。最后先用水沖洗至出水pH為4. 5-5. 5，再用去離子 水沖洗至出水pH值為6. 0-7. 0時(shí)，即可得到預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂備用。
2、脂肪酶的固定 將1. 0g-2. 5g脂肪酶粉溶于45mL-70mL 0. lmol/L pH值為7. 5-9. 0的磷酸鹽緩沖 液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中，加入10g-50g已經(jīng) 預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附8h-10h，搖床轉(zhuǎn)速80rpm ;過(guò)濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹(shù)脂固定 化脂肪酶。 本發(fā)明所述的脂肪酶是指黑曲霉、米曲霉、擴(kuò)展青霉或洋蔥假單胞菌產(chǎn)生的脂肪 酶。 3、阿魏酸酯化反應(yīng) 阿魏酸酯化反應(yīng)可以采用雙有機(jī)試劑異辛烷/ 丁酮或以純離子液1-辛基_3-甲 基咪唑六氟磷酸鹽([Omim]PF6)為溶劑。 當(dāng)以雙有機(jī)試劑異辛烷/丁酮(體積比85 : 15)為溶劑時(shí)，在具塞三角燒瓶中分 別加入阿魏酸3. 0mg-20. Omg、油醇98mg、異辛烷/ 丁酮10ml (85 : 15， V/V)、分子篩100mg 和大孔吸附樹(shù)脂固定化脂肪酶30-300mg進(jìn)行混合反應(yīng)，反應(yīng)溫度65t:，搖床轉(zhuǎn)速150rpm， 酯化反應(yīng)8天，阿魏酸酯化成阿魏酸酯。 當(dāng)以純離子液[Omim]PF6為溶劑時(shí)，在具塞三角燒瓶中分別加入阿魏酸 3. 0-20. Omg、 [Omim]PF6 1. 5mL、油醇45mg、固定化脂肪酶加量為30-200mg，反應(yīng)溫度75°C， 搖床轉(zhuǎn)速為300rpm，酯化反應(yīng)6天，阿魏酸酯化成阿魏酸酯。 采用本發(fā)明所述的方法，吸附樹(shù)脂材料易得，工業(yè)化成本低易于推廣，同時(shí)，以離 子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中，阿魏酸轉(zhuǎn)化為阿魏酸酯的轉(zhuǎn)化率最高可 達(dá)93%，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例1 1、離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理 取400g準(zhǔn)備裝離子交換柱的大孔隙鏊合型苯乙烯系離子交換樹(shù)脂D403，用500mL 55t:熱水浸洗，每隔約15分鐘換水一次，浸洗時(shí)要不時(shí)攪動(dòng)，換水3次后，重復(fù)上述浸洗步 驟，但換水間隔時(shí)間改為每隔30分鐘換水一次，總共換水4次。水洗后，用750mL 0. 5N NaOH 緩慢流過(guò)離子交換樹(shù)脂，流速為每小時(shí)1. 5倍床層體積。然后用水沖洗，此時(shí)出水的pH為 8. 5，再用900mL 5%的NaCl溶液流過(guò)樹(shù)脂，流速為每小時(shí)1. 5倍床層體積流過(guò)。用750mL 0. 5N鹽酸流過(guò)樹(shù)脂，流速為每小時(shí)1. 5倍床層體積流過(guò)，用水沖洗至出水pH為5. 5左右。 用去離子水沖洗至出水pH值為7. 0時(shí)，即可得到預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂備用。
2、脂肪酶固定化 在250mL三角瓶中，將1.0g黑曲霉脂肪酶粉溶于50mL0. lmol/L pH值8. O的磷 酸鹽緩沖液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入25g 預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附10h，搖床轉(zhuǎn)速 80rpm，過(guò)濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹(shù)脂固定化 的黑曲霉脂肪酶。經(jīng)上述固定化后的黑曲霉脂肪酶回收率50X，蛋白吸附量為40mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反應(yīng) 以混合雙有機(jī)試劑異辛烷/丁酮(體積比85 : 15)為溶齊U，在50mL具塞三角燒 瓶中分別加入阿魏酸4. 8mg、油醇98mg、異辛烷/ 丁酮10ml、4埃分子篩100mg、固定化的黑 曲霉脂肪酶100mg，反應(yīng)溫度65°C ，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，反應(yīng)8天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，轉(zhuǎn)化
5率為91. 8%。 實(shí)施例2 1、離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理 同實(shí)施例1 2、脂肪酶固定化 在250mL三角瓶中，將2. 5g黑曲霉脂肪酶粉溶于70mL 0. lmol/L pH值7. 5的磷 酸鹽緩沖液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入45g 預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附8h，搖床轉(zhuǎn)速 80rpm，過(guò)濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹(shù)脂固定化 的黑曲霉脂肪酶。經(jīng)上述固定化后的黑曲霉脂肪酶回收率48.8X，蛋白吸附量為42mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反應(yīng) 以純離子液[Omim]PF6為溶劑，在具塞三角燒瓶中分別加入阿魏酸8. 2mg、 [Omim]
PF6 1. 5mL、油醇45mg、固定化的黑曲霉脂肪酶100mg，反應(yīng)溫度75。C，搖床轉(zhuǎn)速為300rpm，
反應(yīng)6天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，轉(zhuǎn)化率達(dá)87%。 實(shí)施例3 1、離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理 同實(shí)施例1 2、脂肪酶固定化 在250mL三角瓶中，將1.5g擴(kuò)展青霉脂肪酶粉溶于65mL0. lmol/L pH值9. 0的 磷酸鹽緩沖液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入 10g預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附8. 5h，搖床 轉(zhuǎn)速80rpm，過(guò)濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹(shù)脂固 定化的擴(kuò)展青霉脂肪酶。經(jīng)上述固定化后的擴(kuò)展青霉脂肪酶回收率52. 5%，蛋白吸附量為 47mg/g。 3、催化阿魏酸酯化反應(yīng) 以混合雙有機(jī)試劑異辛烷/丁酮(體積比85 : 15)為溶齊U，在50mL具塞三角燒
瓶中分別加入阿魏酸20. 0mg、油醇98mg、異辛烷/丁酮10mL、4埃分子篩100mg、固定化的擴(kuò)
展青霉脂肪酶240mg，反應(yīng)溫度65°C ，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，反應(yīng)8天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，轉(zhuǎn)
化率為93.4%。 實(shí)施例4 1、離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理 同實(shí)施例1 2、脂肪酶固定化 在250mL三角瓶中，將2. Og洋蔥假單胞菌脂肪酶粉溶于60mL0. lmol/L pH值9. 0 的磷酸鹽緩沖液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入 10g預(yù)處理的大孔吸附樹(shù)脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附10h，搖床轉(zhuǎn) 速80rpm，過(guò)濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹(shù)脂固定 化的洋蔥假單胞菌脂肪酶。經(jīng)上述固定化后的洋蔥假單胞菌脂肪酶回收率50. 5%，蛋白吸 附量為46mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反應(yīng) 當(dāng)以純離子液
PF6為溶劑時(shí)，在具塞三角燒瓶中分別加入阿魏酸15. Omg、 [Omim]PF6 1. 5mL、油醇45mg、固定化的洋蔥假單胞菌脂肪酶為50mg，反應(yīng)溫度75。C，搖床 轉(zhuǎn)速為300rpm，反應(yīng)6天，阿魏酸酯化阿魏酸酯，轉(zhuǎn)化率達(dá)88. 9% 。
權(quán)利要求
一種基于固定化方法的以離子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶固定方法，將離子交換樹(shù)脂，分別用熱水進(jìn)行第一輪、第二輪浸洗；水洗后，先后使用NaOH溶液、NaCl溶液、鹽酸緩慢流過(guò)樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理，得到大孔吸附樹(shù)脂，其特征是將1.0g-2.5g脂肪酶粉溶于磷酸鹽緩沖液中，離心棄去沉淀后，吸取40mL上清酶液并加入10g-50g大孔吸附樹(shù)脂，而后置于30℃恒溫振蕩搖床中平衡吸附；過(guò)濾后得大孔吸附樹(shù)脂固定化的脂肪酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于固定化方法的以離子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶固定方法，其特征是脂肪酶的固定過(guò)程中，脂肪酶粉溶于磷酸鹽緩沖液時(shí)，磷酸鹽緩沖液的使用量為45mL-70mL，摩爾濃度為0. lmol/L， pH值為7. 5_9. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于固定化方法的以離子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶固定方法，其特征是脂肪酶的固定過(guò)程中恒溫振蕩搖床中平衡吸附時(shí)間為8h-10h，搖床轉(zhuǎn)速80rpm ;過(guò)濾后去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于固定化方法的以離子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶固定方法，其特征是所述的脂肪酶是指黑曲霉、米曲霉、擴(kuò)展青霉或洋蔥假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶。
5. —種基于固定化方法的以離子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征是阿魏酸酯化反應(yīng)采用雙有機(jī)試劑異辛烷/ 丁酮或以純離子液1-辛基_3-甲基咪唑六氟磷酸鹽為溶劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于固定化方法的以離子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征是當(dāng)以雙有機(jī)試劑異辛烷/ 丁酮為溶劑時(shí)，異辛烷/ 丁酮的混合體積比為85 : 15，阿魏酸用量3.0mg-20.0mg，油醇用量98mg，異辛烷/丁酮用量10mL，分子篩100mg，大孔吸附樹(shù)脂固定化脂肪酶用量30-300mg，酯化反應(yīng)溫度65。C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，酯化反應(yīng)8天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于固定化方法的以離子交換樹(shù)脂為載體的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征是當(dāng)以純離子液為溶劑時(shí)，加入阿魏酸用量3. 0-20. Omg，純離子液用量1. 5mL、油醇用量45mg、固定化脂肪酶用量為30-200mg，酯化反應(yīng)溫度75。C，搖床轉(zhuǎn)速為300rpm，反應(yīng)6天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用大孔隙離子交換樹(shù)脂D403固定脂肪酶的方法并用該酶催化酯化反應(yīng)。技術(shù)方案是將離子交換樹(shù)脂，用熱水浸洗；水洗后，先后使用NaOH溶液、NaCl溶液、鹽酸預(yù)處理，得到大孔吸附樹(shù)脂備用；將脂肪酶粉溶于磷酸鹽緩沖液中，離心棄沉淀后，取上清酶液并加入大孔吸附樹(shù)脂，置于恒溫振蕩搖床中平衡吸附；過(guò)濾后得大孔吸附樹(shù)脂固定化的脂肪酶。阿魏酸酯化反應(yīng)可以采用雙有機(jī)試劑異辛烷/丁酮或以純離子液1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([Omim]PF6)為溶劑；采用本發(fā)明所述的方法，吸附樹(shù)脂材料易得，同時(shí)以離子交換樹(shù)脂為載體的固定化的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中，阿魏酸轉(zhuǎn)化為阿魏酸酯的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)93％，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P33/00GK101712951SQ200910112638
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者劉煥珍, 王明茲, 鄭麗妃, 陳必鏈, 黃鍵 申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)