專利名稱：貝類多倍體倍性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程育種的多倍體誘導(dǎo)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人工 誘導(dǎo)貝類多倍體中使用的倍性檢測(cè)方法，尤指在規(guī)?；T導(dǎo)鮑魚、牡 蠣、扇貝等貝類多倍體時(shí)使用的一種貝類多倍體倍性檢測(cè)方法。
賴絲
無論是人工誘導(dǎo)多倍體的研究實(shí)驗(yàn)，還是多倍體規(guī)?；B(yǎng)殖生 產(chǎn)，都要求在早期胚胎發(fā)育階段就能快速且及時(shí)地對(duì)多倍體率做出檢 測(cè)，從而對(duì)其誘導(dǎo)結(jié)果的有效性做出準(zhǔn)確的評(píng)估。在目前的貝類多倍 體人工誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，往往通過取樣早期胚胎、幼蟲、稚貝、成貝組織， 經(jīng)染色體制片后進(jìn)行染色體條數(shù)統(tǒng)計(jì)，或者取樣并制成細(xì)胞懸液后， 使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性檢測(cè)來鑒定多倍體誘導(dǎo)的效果。雖然這兩種 方法被廣泛使用于目前的多倍體誘導(dǎo)研究中，尤其是流式細(xì)胞儀檢測(cè) 法具有快速和準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)。但染色體制片時(shí)易弓I起染色體缺失， 且鑒定過程耗時(shí)較長(zhǎng)，無法及時(shí)地獲得鑒定結(jié)果；而流式細(xì)胞儀檢測(cè) 時(shí)需要一定數(shù)量的細(xì)胞樣品，這對(duì)發(fā)育早期的個(gè)體很難鑒定，還有價(jià) 格昂貴，使用成本高。再者，這兩種方法都要求操作者具有專業(yè)的實(shí) 驗(yàn)操作水平。所以，這兩種鑒定方法都無法對(duì)其多倍體率做出快速且 及時(shí)地檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種設(shè)備簡(jiǎn)單、容易掌握、能夠快速檢測(cè) 和統(tǒng)計(jì)出多倍體率的貝類多倍體倍性檢測(cè)方法，該方法能即時(shí)了解了 誘導(dǎo)方法的有效性，提高了誘導(dǎo)方法的準(zhǔn)確性。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是-
本發(fā)明是一種貝類多倍體倍性檢測(cè)方法，其操作步驟如下當(dāng)理 化因子作用于貝類受精卵，抑制第1極體或第2極體釋放來誘導(dǎo)貝類
多倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，在顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)僅釋 放1個(gè)極體和釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù)，并計(jì)算多倍體率。
該方法包括三倍體率檢測(cè)法和四倍體率檢測(cè)法。四倍體率檢測(cè)法 又分為抑制第1極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法和同時(shí)抑制第1極體和 第2極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法。
1、 三倍體率檢測(cè)法
當(dāng)理化因子作用于貝類受精卵，抑制第2極體釋放來誘導(dǎo)貝類三 倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，在顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)僅釋放
1個(gè)極體和釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù)，并計(jì)算三倍體率；計(jì)算公式
三倍體率二僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)/(僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)
+釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù))X100%。
2、 四倍體率檢測(cè)法
(1)抑制第l極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法 當(dāng)理化因子作用于貝類受精卵，抑制第1極體的釋放來誘導(dǎo)產(chǎn)生 貝類四倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)此 細(xì)胞期內(nèi)僅釋放1個(gè)極體和釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù)，并計(jì)算四倍體 率；計(jì)算公式四倍體率=僅釋放1個(gè)極體未的受精卵數(shù)/ (僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)+釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù))X 100%。
(2)同時(shí)抑制第1極體和第2極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法 當(dāng)理化因子作用于貝類受精卵，同時(shí)抑制第1極體和第2極體的 釋放來誘導(dǎo)產(chǎn)生貝類四倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，顯微 鏡下分別統(tǒng)計(jì)此細(xì)胞期內(nèi)無極體釋放的受精卵數(shù)和總受精卵數(shù)，并計(jì) 算四倍體率；計(jì)算公式四倍體率=(無極體釋放的卵數(shù)一對(duì)照組的 無極體釋放的卵數(shù))/總卵數(shù)X1009&。
(1) 由于本發(fā)明在早期胚胎發(fā)育時(shí)期就可對(duì)貝類多倍體誘導(dǎo)實(shí) 驗(yàn)和規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)的多倍體率進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)，所以能直觀、準(zhǔn)確 并即時(shí)地對(duì)誘導(dǎo)效果做出鑒定。
(2) 由于本發(fā)明能直觀、準(zhǔn)確并即時(shí)地對(duì)誘導(dǎo)效果做出鑒定， 有助于迅速調(diào)整各誘導(dǎo)參數(shù)至最佳組合，從而避免多倍體誘導(dǎo)的盲目 性和常規(guī)染色體倍性檢測(cè)的延遲性，縮短實(shí)驗(yàn)周期，節(jié)約成本。
(3) 由于本發(fā)明只需通過簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)就能有 效地對(duì)多倍體誘導(dǎo)效果做出鑒定，對(duì)工作人員的實(shí)驗(yàn)操作水平要求不 高，在生產(chǎn)中的可操作性更強(qiáng)。
綜上所述，本發(fā)明與常規(guī)貝類多倍體倍性檢測(cè)法相比，能快速地 檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)出多倍體率，更直觀、準(zhǔn)確且即時(shí)地鑒定多倍體誘導(dǎo)的有 效性，避免了染色體倍性檢測(cè)的延遲性和多倍體誘導(dǎo)的盲目性，縮短 實(shí)驗(yàn)周期，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。有利于人工誘導(dǎo)貝類多倍體技術(shù)在生產(chǎn)上 的大規(guī)模推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是一種觀察極體釋放情況來檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)多倍體率，從而鑒 定人工誘導(dǎo)多倍體有效性的方法，包括三倍體率檢測(cè)法和四倍體率檢
5測(cè)法；所述的三倍體率檢測(cè)法，即理化因子抑制第2極體釋放誘導(dǎo)貝 類三倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)僅釋 放1個(gè)極體和釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù)，并計(jì)算三倍體率，計(jì)算公式 三倍體率=僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)/(僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù) +釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù))X100%;所述的四倍體率檢測(cè)法因誘導(dǎo) 方式的不同分為抑制第l極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法、同時(shí)抑制 第1極體和第2極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法。
所述的抑制第1極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法，即理化因子抑制 第1極體的釋放來誘導(dǎo)產(chǎn)生貝類四倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì) 胞期，顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)此細(xì)胞期內(nèi)第1極體未釋放的受精卵數(shù)和第 1極體釋放的受精卵數(shù)，并計(jì)算四倍體率，計(jì)算公式四倍體率=僅 釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)/ (僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)+釋放2個(gè)極 體的受精卵數(shù))X100%。
所述的同時(shí)抑制第1極體和第2極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法， 即理化因子同時(shí)抑制第1極體和第2極體釋放來誘導(dǎo)產(chǎn)生貝類四倍體 時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)此細(xì)胞期內(nèi)無 極體釋放的受精卵數(shù)和總受精卵數(shù)，并計(jì)算四倍體率，計(jì)算公式四 倍體率=(無極體釋放的卵數(shù)-對(duì)照組的無極體釋放的卵數(shù))/總卵數(shù)X 100%。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種用極體個(gè)數(shù)法即時(shí)鑒定多倍體率的檢測(cè)方法
所表達(dá)的多倍體率與成貝的多倍體率呈正相關(guān)性。
實(shí)施例1:抑制貝類受精卵第二極體的釋放誘導(dǎo)三倍體 在胚胎發(fā)育早期的2 — 4細(xì)胞期，鏡檢到1個(gè)極體的受精卵數(shù)有
70個(gè)，2個(gè)極體的受精卵數(shù)有50個(gè)，則其三倍體率二70/(70+50)X
100%=58. 3% .
6實(shí)施例2:抑制貝類受精卵第一極體的釋放誘導(dǎo)四倍體 在胚胎發(fā)育早期的2—4細(xì)胞期，鏡檢到1個(gè)極體的受精卵數(shù)有
90個(gè)，2個(gè)極體的受精卵數(shù)有60個(gè)，則其四倍體率二90/(90+60)X
100%=60. 0% .
實(shí)施例3:抑制貝類受精卵第一極體和第二極體的釋放誘導(dǎo)四倍
體
在胚胎發(fā)育早期的2—4細(xì)胞期，鏡檢到樣品中無極體的卵數(shù)有 80個(gè)，有極體的卵數(shù)40個(gè)(其中有1個(gè)極體的卵數(shù)15個(gè)，有2個(gè)極體 的卵數(shù)25個(gè))，即鏡檢的總卵數(shù)為120個(gè)，而對(duì)照組的無極體的卵數(shù)有 20個(gè)，則其四倍體率=(80-20)/(80+40) X 100%=50. 0%。
權(quán)利要求
1、一種貝類多倍體倍性檢測(cè)方法，其特征在于其操作步驟如下當(dāng)理化因子作用于貝類受精卵，抑制第1極體或第2極體釋放來誘導(dǎo)貝類多倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，在顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)僅釋放1個(gè)極體和釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù)，并計(jì)算多倍體率。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類多倍體倍性檢測(cè)方法，其特征在于其三倍體率檢測(cè)法操作步驟如下當(dāng)理化因子作用于貝類受精卵，抑制第2極體釋放來誘導(dǎo)貝類三倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，在顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)僅釋放1個(gè)極體和釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù)，并計(jì)算三倍體率；計(jì)算公式三倍體率=僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)/(僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)+釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù))X 100%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類多倍體倍性檢測(cè)方法，其特征在于其抑制第l極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法操作步驟如下當(dāng)理化因子作用于貝類受精卵，抑制第1極體的釋放來誘導(dǎo)產(chǎn)生貝類四倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)此細(xì)胞期內(nèi)僅釋放1個(gè)極體和釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù)，并計(jì)算四倍體率；計(jì)算公式四倍體率=僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)/ (僅釋放1個(gè)極體的受精卵數(shù)+釋放2個(gè)極體的受精卵數(shù))X100%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類多倍體倍性檢測(cè)方法，其特征在于其同時(shí)抑制第1極體和第2極體釋放時(shí)的四倍體率檢測(cè)法操作步驟如下當(dāng)理化因子作用于貝類受精卵，同時(shí)抑制第1極體和第2極體的釋放來誘導(dǎo)產(chǎn)生貝類四倍體時(shí)，在早期胚胎發(fā)育的2-4細(xì)胞期，顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)此細(xì)胞期內(nèi)無極體釋放的受精卵數(shù)和總受精卵數(shù)，并計(jì)算四倍體率；計(jì)算公式四倍體率=(無極體釋放的卵數(shù)一對(duì)照組的無極體釋放的卵數(shù))/總卵數(shù)xiooyo。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種貝類多倍體倍性檢測(cè)方法，它包括三倍體率檢測(cè)法和四倍體率檢測(cè)法，屬于多倍體誘導(dǎo)技術(shù)領(lǐng)域。由于本發(fā)明只需在早期胚胎發(fā)育時(shí)期，通過簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)就可對(duì)多倍體率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，就能直觀、準(zhǔn)確并即時(shí)地對(duì)誘導(dǎo)效果做出鑒定，并有助于迅速調(diào)整各誘導(dǎo)參數(shù)至最佳組合，避免多倍體誘導(dǎo)的盲目性和常規(guī)染色體倍性鑒定的延遲性，縮短實(shí)驗(yàn)周期，節(jié)約成本，對(duì)工作人員的實(shí)驗(yàn)操作水平要求不高，完全能滿足貝類多倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)對(duì)誘導(dǎo)效果鑒定的要求。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK101643771SQ20091011224
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月15日
發(fā)明者姜永華, 張紅云, 陳昌生, 顧勇杰 申請(qǐng)人:集美大學(xué)