專(zhuān)利名稱(chēng)：β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品安全檢測(cè)試劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種β -內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒 以及β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)40年代第一個(gè)β -內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素——青霉素問(wèn)世以來(lái)，抗生素在細(xì) 菌感染性疾病的治療中發(fā)揮了重要作用，95%以上由細(xì)菌感染引起的疾病得到控制。然而 隨著內(nèi)酞胺類(lèi)抗生物藥物的不斷開(kāi)發(fā)和在臨床上的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株越來(lái)越多，其 中最主要的耐藥機(jī)制是這些菌株能產(chǎn)生內(nèi)酸胺酶。研究表明β -內(nèi)酰胺酶是水解β “內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素分子中β “內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的一 類(lèi)酶，根據(jù)酶蛋白的氨基酸序列的同源性分為A類(lèi)、B類(lèi)、C類(lèi)及D類(lèi)，其中超廣譜β _內(nèi)酰 胺酶(extended-spectrum β -lactamases, ESBL)是分解β -內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素底物范圍比 以往的A類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶更廣的酶。β-內(nèi)酞胺酶水解抗生素，使之失去抗菌活性，從而導(dǎo) 致臨床抗菌治療失敗。葡萄球菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌及部分腸球菌都是由此酶表 現(xiàn)出抗藥性。經(jīng)常使用抗生素會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生耐藥性的后果相當(dāng)嚴(yán)重，抗生素失 去效果。對(duì)內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的細(xì)菌感染應(yīng)用內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素治療，不僅得不到 治療效果，而且還成為新的耐性菌蔓延的原因，引起病人住院時(shí)間延長(zhǎng)、費(fèi)用增加和死亡率 上升。因此，在確定正確的治療方案前必須迅速且正確地檢測(cè)這些病原菌是否產(chǎn)生內(nèi) 酰胺酶，這對(duì)于快速識(shí)別耐藥菌株及控制耐藥菌株傳播有重要作用，也有助于相應(yīng)感染性 疾病的治療和預(yù)防。趙旺勝等于1997年報(bào)道了四種β -內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法(四種檢測(cè)β -內(nèi)酰胺酶 方法的實(shí)驗(yàn)比較，南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(中文版)，1997年11月第17卷第6期)(1)碘測(cè)量 法溶解青霉素G于0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中(pH6. 0)，制成6000mg/L，配制1 %可溶性淀 粉液和2%碘溶液，測(cè)定時(shí)取0. Iml青霉素溶液與2ml待測(cè)菌液混合，置室溫30分鐘，加2滴 淀粉溶液，再加1滴碘液混合，10分鐘內(nèi)能使藍(lán)色完全消退的菌株為β -內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株。 (2)微生物法將對(duì)青霉素敏感的指示菌接種在血平板上，平板中心貼每片1 μ g青霉素紙 片，沿紙片周?chē)怪眲澗€，接種待測(cè)菌，陽(yáng)性和陰性對(duì)照菌，37°C孵育24小時(shí)，如待測(cè)菌產(chǎn) 生β -內(nèi)酰胺酶，則待測(cè)菌處的指示菌出現(xiàn)凹痕。⑶紙片法取20張濾紙片(IcmX2cm) 放入Iml青霉素溶液中浸濕，待紙片干后備用，用接種環(huán)挑取待檢菌5 10個(gè)菌落涂于紙 片上，放入帶蓋的平板內(nèi)置37°C孵育30分鐘，產(chǎn)內(nèi)酰胺酶的菌株可使紙片的顏色由藍(lán) 紫色變黃。(4)酸測(cè)定法取0. Iml青霉素酚紅溶液與2ml待測(cè)菌懸液混合，10-15分鐘內(nèi) 變?yōu)辄S色為內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性。張堅(jiān)磊等1999年報(bào)道了應(yīng)用碘試紙條法快速檢測(cè)β-酞 胺酶(陜西醫(yī)學(xué)檢臉，第14卷第1期1999年2月)，該法是在碘測(cè)量法的基礎(chǔ)上建立以青 霉素為底物的試紙條法，菌落涂于試紙條上，通過(guò)試紙條顏色的變化判斷是否產(chǎn)生內(nèi) 酰胺酶。
葉楓等對(duì)四種方法檢測(cè)超廣譜β -內(nèi)酰胺酶進(jìn)行了比較(四種方法檢測(cè)超廣譜 β -內(nèi)酰胺酶的敏感性比較，《廣東醫(yī)學(xué)》，2004年5月第25卷第5期)，采用了紙片擴(kuò)散法、 雙紙片協(xié)同法、Etest法和VITEK全自動(dòng)細(xì)菌分析法，這些方法需要通過(guò)培養(yǎng)耐藥菌及判斷 抑菌圈，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，結(jié)果易受偶然因素影響，VITEK全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)及其藥敏卡檢測(cè) 方法快速簡(jiǎn)便，但需要特殊的機(jī)器。中國(guó)專(zhuān)利CN200380107185.6公開(kāi)了一種β-內(nèi)酰胺 酶檢測(cè)試劑組合物、β “內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒以及β “內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法，在產(chǎn)色頭孢菌素 法中使用的β“內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑組合物含有β“內(nèi)酰胺酶檢測(cè)底物與β“內(nèi)酰胺酶抑制 劑。以上方法是在臨床細(xì)菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)上檢測(cè)細(xì)菌是否產(chǎn)生β -內(nèi)酰胺酶來(lái)判斷病 原菌的耐藥性，適合臨床上檢驗(yàn)微生物產(chǎn)生的內(nèi)源性內(nèi)酰胺酶。另一方面，內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素由于毒性小、化療指數(shù)高、抗菌譜廣、價(jià)格便宜，在 非臨床領(lǐng)域也獲得了廣泛的使用，比如畜牧業(yè)就大量使用內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素治療奶牛乳 腺炎，結(jié)果使奶源的抗生素殘留問(wèn)題比較嚴(yán)重。鄭穎等研究了 ΤΕΜ-116型超廣譜β -內(nèi)酰胺 酶對(duì)牛奶中抗生素的清除(《中國(guó)抗生素雜志》，2008年2月第33卷第2期)，通過(guò)試驗(yàn)作者 發(fā)現(xiàn)在不太苛刻的條件下β-內(nèi)酰胺酶很容易清除牛奶中殘留的青霉素G。中國(guó)專(zhuān)利(申 請(qǐng)?zhí)枺?00610051915.0)公開(kāi)了一種β _內(nèi)酰胺酶、其制備方法及其應(yīng)用，其中也對(duì)β-內(nèi) 酰胺酶對(duì)牛奶中殘留抗生素的去除效果進(jìn)行了研究，結(jié)果也表明內(nèi)酰胺酶在奶制品中 可以分解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。這些結(jié)果似乎表明β-內(nèi)酰胺酶可以完全降解牛奶中殘留 的抗生素，減少奶業(yè)的損失，有可能成為一種新型食品添加劑。然而目前β _內(nèi)酰胺酶的安全性還沒(méi)有得到證實(shí)，β “內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素經(jīng)酶分解 的產(chǎn)物與抗生素的毒副作用之間的關(guān)系沒(méi)有進(jìn)行深入的研究，食品中添加內(nèi)酰胺酶雖 然可以分解抗生素，但人體長(zhǎng)期接觸抗生素酶分解產(chǎn)物也存在很大的風(fēng)險(xiǎn)。美國(guó)PANPACIFIC TECH COMPANY公司開(kāi)發(fā)的UscnlifeTM人和雞β -內(nèi)酰胺酶酶 聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，使用的方法用到的抗體為針對(duì)一種β “內(nèi)酰胺酶的抗體，而β “內(nèi)酰胺 酶種類(lèi)很多，結(jié)構(gòu)彼此不同，以一種內(nèi)酰胺酶為抗原制備抗體后配制的檢測(cè)試劑不能 檢測(cè)其他種類(lèi)的內(nèi)酰胺酶，這使得以酶聯(lián)免疫原理為基礎(chǔ)的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用受到限 制。因此本領(lǐng)域特別需要一種不依賴(lài)微生物培養(yǎng)、簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)食品中 添加的β -內(nèi)酰胺酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供可以迅速地檢測(cè)食品中添加的β-內(nèi)酰胺酶的一種β-內(nèi)酰 胺酶檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明試劑盒是在酶活性分析原理的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的，對(duì)不同類(lèi)型的β -內(nèi)酰胺酶 都能夠檢測(cè)。試劑盒由包裝盒、樣品檢測(cè)瓶、陽(yáng)性對(duì)照瓶、陰性對(duì)照瓶、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)酰胺酶溶 液試劑瓶、淀粉溶液試劑瓶、碘-碘化鉀溶液試劑瓶、取樣移液器和托架組成，樣品檢測(cè)瓶、 陽(yáng)性對(duì)照瓶、陰性對(duì)照瓶中含有氨芐青霉素，陽(yáng)性對(duì)照瓶和陰性對(duì)照瓶中還含有脫脂奶粉。本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)β-內(nèi)酰胺酶溶液每毫升含有50-5000萬(wàn)單位β-內(nèi)酰胺酶、 5-50% (ν/ν)甘油、l-50mg 丙氨酸、I-IOOmg甘露醇，磷酸緩沖液 5-100mmol/L，pH4. 0-10. 0。該條件下標(biāo)準(zhǔn)β “內(nèi)酰胺酶溶液于2_8°C可穩(wěn)定保存6個(gè)月。本發(fā)明試劑盒碘_碘化鉀溶液含有0. 1-10% (w/v)碘和0. 1-20% (w/v)的碘化 鉀，其中優(yōu)選的碘-碘化鉀溶液含有0.5-3% (w/v)碘和2-5% (w/v)的碘化鉀。本發(fā)明試劑盒淀粉溶液含有0. 1-20% (w/v)的淀粉，其中優(yōu)選的淀粉溶液含有 1-2% (w/v)的淀粉。本發(fā)明試劑盒每個(gè)檢測(cè)瓶含有氨芐青霉素粉末0. l_50mg，其中優(yōu)選的每個(gè)檢測(cè)瓶 含有氨芐青霉素粉末l_3mg。氨芐青霉素粉末可以是稱(chēng)量法分裝，也可以采用溶解后凍干的 方法使每個(gè)檢測(cè)瓶中的氨芐青霉素含量達(dá)到l_3mg，并且水分含量小于3%。對(duì)比文獻(xiàn)中氨 芐青霉素每次反應(yīng)用量是0. 6每個(gè)，而試紙條法氨芐青霉素用量更低，本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 上確定的氨芐青霉素用量及保存狀態(tài)確保了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。粉末狀氨芐青霉素可 使其保持穩(wěn)定，克服氨芐青霉素在有水情況下容易分解影響檢測(cè)結(jié)果的局限性。經(jīng)過(guò)試驗(yàn) 確定的氨芐青霉素用量避免假陰性結(jié)果產(chǎn)生，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。為了防止少量氨芐青霉素粉末黏附到整個(gè)瓶壁或瓶塞，可加入對(duì)檢測(cè)反應(yīng)惰性的 輔料，比如甘露醇、脫脂奶粉、蔗糖、氨基酸、纖維素、聚乙二醇等。本發(fā)明β _內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法取陽(yáng)性對(duì)照瓶和陰性對(duì)照瓶各一支及樣品檢測(cè) 瓶，分別取1. 5ml蒸餾水加入陽(yáng)性對(duì)照瓶和陰性對(duì)照瓶，再向陽(yáng)性對(duì)照瓶中加入1 2滴 β -內(nèi)酰胺酶溶液，樣品檢測(cè)瓶中加入樣品1.5ml，各檢測(cè)瓶混合均勻后蓋好瓶塞，將各檢 測(cè)瓶卡入托架放入37°C恒溫水浴保溫30-180分鐘；然后向各檢測(cè)瓶加入4滴淀粉溶液，混 合均勻后再加入碘-碘化鉀溶液2滴，混合均勻，放置2分鐘，根據(jù)樣品檢測(cè)瓶顏色與陽(yáng)性 對(duì)照瓶和陰性對(duì)照瓶的比較確定樣品中是否含有β “內(nèi)酰胺酶。其中優(yōu)選的檢測(cè)瓶在37°C 恒溫水浴保溫時(shí)間為60-90分鐘，滴加碘液后在37°C水浴保溫2-5分鐘觀察結(jié)果.本發(fā)明通過(guò)下述方法定量測(cè)定樣品中β -內(nèi)酰胺酶含量將檢測(cè)樣品梯度稀釋?zhuān)?獲得呈陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)，檢測(cè)限乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中內(nèi)酰胺酶含量。檢 測(cè)限的測(cè)定是通過(guò)將標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)酰胺酶溶液按標(biāo)示的活性單位稀釋?zhuān)箼z測(cè)管酶含量分別 為9(^/1111、7(^/1111、5(^/1111、3(^/1111、1(^/1111，同時(shí)做不含酶的空白對(duì)照，按上述方法進(jìn)行酶 反應(yīng)及顯色，以反應(yīng)管顏色由白色發(fā)生轉(zhuǎn)變顯示藍(lán)色的酶含量為檢測(cè)最低限度，結(jié)果本發(fā) 明的試劑盒最低檢測(cè)限度可以達(dá)到30-50U/ml。β -內(nèi)酰胺酶的比活性為1500-2000U/mg， 因此本法可檢出的β -內(nèi)酰胺酶含量可達(dá)2-5ng/ml。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一、最低檢測(cè)限的測(cè)定1、溶液配制淀粉溶液稱(chēng)取Ig可溶性淀粉溶解于IOOml加熱的蒸餾水，過(guò)濾后備用。1 %碘-碘化鉀溶液稱(chēng)取碘化鉀4g，碘Ig溶解于IOOml蒸餾水，保存于棕色試劑 瓶備用。標(biāo)準(zhǔn)β -內(nèi)酰胺酶溶液1000萬(wàn)單位/支。2、實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)標(biāo)示的內(nèi)酰胺酶活性單位，用牛奶將酶液分別稀釋不同的倍數(shù)，使其含 量分別為90U/ml、70U/ml、50U/ml、30U/ml、10U/ml。取多個(gè)干凈的試管，分別加入Img青霉
5素鈉粉末，然后陰性對(duì)照管中加入1. 5ml純牛奶，陽(yáng)性對(duì)照管中加入1. 5ml純牛奶和100 μ 1 酶液充分混勻，其他試管依次加入梯度稀釋含酶牛奶樣品，混勻后放在37°C水浴鍋中加熱 80分鐘。保溫結(jié)束后每個(gè)反應(yīng)管中加入4滴淀粉溶液，混勻，再加入2滴碘-碘化鉀溶液， 混勻后觀察結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)管呈白色，陰性反應(yīng)管藍(lán)色，稀釋后樣品酶活性為50U/ml的反應(yīng)管顏色 出現(xiàn)變化，發(fā)生有白色向藍(lán)色的轉(zhuǎn)變，表明該方法能檢測(cè)出酶含量為50U/ml的β-內(nèi)酰胺 酶，既最低檢測(cè)限可達(dá)到50U/ml。實(shí)施例二、碘量對(duì)檢測(cè)限的影響1、溶液配制淀粉溶液稱(chēng)取Ig可溶性淀粉溶解于IOOml加熱的蒸餾水，過(guò)濾后備用。0. 6%碘-碘化鉀溶液稱(chēng)取碘化鉀2. 4g，碘0. 6g溶于IOOml蒸餾水，保存于棕色 試劑瓶備用。標(biāo)準(zhǔn)β -內(nèi)酰胺酶溶液750萬(wàn)單位/支。2、實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)標(biāo)示的內(nèi)酰胺酶活性單位，用牛奶將酶液分別稀釋不同的倍數(shù)，使其含 量分別為90U/ml、70U/ml、50U/ml、30U/ml、10U/ml。取多個(gè)干凈的試管，分別加入Img青霉 素鈉粉末，然后陰性對(duì)照管中加入1. 5ml純牛奶，陽(yáng)性對(duì)照管中加入1. 5ml純牛奶和100 μ 1 酶液充分混勻，其他試管依次加入梯度稀釋含酶牛奶樣品，混勻后放在37°C水浴鍋中加熱 80分鐘。保溫結(jié)束后每個(gè)反應(yīng)管中加入4滴淀粉溶液，混勻，再加入2滴碘-碘化鉀溶液， 混勻后觀察結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)管呈白色，陰性反應(yīng)管藍(lán)色，稀釋后樣品酶活性為30U/ml的反應(yīng)管顏色 出現(xiàn)變化，發(fā)生有白色向藍(lán)色的轉(zhuǎn)變，該條件下最低檢測(cè)限可達(dá)到30U/ml。實(shí)施例三、青霉素量對(duì)檢測(cè)限的影響1、溶液配制淀粉溶液稱(chēng)取Ig可溶性淀粉溶解于IOOml加熱的蒸餾水，過(guò)濾后備用。1 %碘-碘化鉀溶液稱(chēng)取碘化鉀4g，碘Ig溶解于IOOml蒸餾水，保存于棕色試劑 瓶備用。標(biāo)準(zhǔn)β -內(nèi)酰胺酶溶液1500萬(wàn)單位/支。2、實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)內(nèi)酰胺酶活性單位，用牛奶將酶液分別稀釋不同的倍數(shù)，使其含量分別 為90U/ml、70U/ml、50U/ml、30U/ml、10U/ml。取多個(gè)干凈的試管，分別加入5mg青霉素鈉粉 末，然后陰性對(duì)照管中加入1. 5ml純牛奶，陽(yáng)性對(duì)照管中加入1. 5ml純牛奶和100 μ 1酶液 充分混勻，其他試管依次加入梯度稀釋含酶牛奶樣品，混勻后放在37°C水浴鍋中加熱80分 鐘。保溫結(jié)束后每個(gè)反應(yīng)管中加入4滴淀粉溶液，混勻，再加入2滴碘-碘化鉀溶液，混勻 后觀察結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)管呈白色，陰性反應(yīng)管呈白色，稀釋后樣品反應(yīng)管白色，表明青霉素含量 提高陰性對(duì)照產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果，使檢測(cè)結(jié)果無(wú)法判斷。如上述方法測(cè)定，減少青霉素量，每個(gè)檢測(cè)管加入新鮮配制的青霉素使其加入量 為0. 5mg，反應(yīng)結(jié)束后觀察結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)管呈藍(lán)色，稀釋后樣品反應(yīng)管藍(lán)色，表明青霉素含
6量降低陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生陰性結(jié)果，使檢測(cè)結(jié)果無(wú)法判斷。實(shí)施例四、試劑盒的配制淀粉溶液稱(chēng)取Ig可溶性淀粉溶解于IOOml加熱的蒸餾水，過(guò)濾后分裝于 IOml試劑瓶中。1 %碘-碘化鉀溶液稱(chēng)取碘化鉀4g，碘Ig溶解于IOOml蒸餾水，分裝于IOml棕 色試劑瓶。標(biāo)準(zhǔn)β -內(nèi)酰胺酶溶液取β -內(nèi)酰胺酶原料(2000萬(wàn)單位/g) 50g, pH7. 0磷酸緩 沖液儲(chǔ)備液(500mmol/L)lml，50% (ν/ν)甘油25ml、丙氨酸1. 5g、甘露醇2g，試劑用少量水 溶解后液體試劑，混合均勻后加酶，最后定溶至100ml，分裝使酶含量為1000萬(wàn)單位/支。檢測(cè)瓶中青霉素粉末的分裝采用稱(chēng)重法在干燥的環(huán)境中稱(chēng)取Img青霉素粉末于 每一個(gè)檢測(cè)瓶。也可以采用溶解后凍干方法，用20mmol/L的磷酸緩沖液溶解青霉素使其含 量為lmg/mL，按Iml裝量分裝，迅速于-20°C預(yù)凍2小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，然后于_15°C冷凍干燥 凍干，這樣可保證檢測(cè)管青霉素的含量準(zhǔn)確均一。配制青霉素溶液時(shí)也可以添加甘露醇使 其濃度為5mg/ml，這樣凍干時(shí)可防止壓塞時(shí)青霉素漂浮引起含量的減少。當(dāng)然也可以采用 其他使青霉素含量準(zhǔn)確的分裝方式。稱(chēng)取脫脂奶粉18g于陽(yáng)性對(duì)照瓶和陰性檢測(cè)品。實(shí)施例五、樣品中β -內(nèi)酰胺酶含量測(cè)定從檢測(cè)盒中取陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)瓶和陰性對(duì)照檢測(cè)瓶各一支，除去鋁塑蓋，打開(kāi)瓶塞。 取標(biāo)有“純凈水”的滴管，分別向兩個(gè)瓶中加入1. 5ml純凈水。再取標(biāo)有“ + ”號(hào)的滴管和陽(yáng) 性對(duì)照品液瓶，吸取陽(yáng)性對(duì)照品液后，向陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)瓶(+)中加入1 2滴β -內(nèi)酰胺酶 陽(yáng)性對(duì)照品液。將兩個(gè)對(duì)照檢測(cè)瓶分別蓋好瓶塞，振蕩使溶解均勻，備用。從檢測(cè)盒中取供試品檢測(cè)瓶6支，除去鋁塑蓋，打開(kāi)瓶塞。取標(biāo)有“供試品”的滴 管6支，分別吸取6個(gè)待檢測(cè)樣品各1. 5ml，分別加入到6個(gè)供試品檢測(cè)瓶中，將供試品檢測(cè) 瓶蓋好瓶塞，振蕩使溶解均勻。從檢測(cè)盒中取出浮漂，將陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)瓶、陰性對(duì)照檢測(cè)瓶和供試品檢測(cè)瓶卡入 浮漂中，放入37°C恒溫水浴中，計(jì)時(shí)，加熱80分鐘；加熱80分鐘后，取出上述步驟4中的陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)瓶、陰性對(duì)照檢測(cè)瓶和供試品 檢測(cè)瓶。分別向上述陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)瓶、陰性對(duì)照檢測(cè)瓶和供試品檢測(cè)瓶中加入4滴淀粉溶 液，振蕩；再加入2滴碘-碘化鉀溶液，振蕩；分別蓋好瓶塞，放置37度水浴2分鐘。2分鐘后，搖勻并觀察結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)瓶白色，陰性對(duì)照檢測(cè)瓶藍(lán)色，供試 品1、2、4、5號(hào)白色，說(shuō)明含有β -內(nèi)酰胺酶，含量大于50U/ml，3號(hào)檢測(cè)瓶藍(lán)色，說(shuō)明不含 β -內(nèi)酰胺酶，6號(hào)管顏色介于陰性和白色之間，說(shuō)明β -內(nèi)酰胺酶含量低于30-50U/ml。實(shí)施例六、樣品中β -內(nèi)酰胺酶的定量測(cè)定取實(shí)施例五經(jīng)測(cè)定含有β -內(nèi)酰胺酶的4樣品，用不含抗生素的牛奶分別稀釋2、 4、6、8、16、32、64倍，按實(shí)施例五的方法進(jìn)行β _內(nèi)酰胺酶含量的測(cè)定，結(jié)果樣品64倍稀 釋后結(jié)果為陰性，而2、4、6、8、16、32倍稀釋后檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，則樣品β -內(nèi)酰胺酶含量為 32*(30-50U/ml) = 960_1600U/ml。
權(quán)利要求
β 內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，由包裝盒、樣品檢測(cè)瓶、取樣移液器和托架組成，其特征在于還包括陽(yáng)性對(duì)照瓶、陰性對(duì)照瓶、標(biāo)準(zhǔn)β 內(nèi)酰胺酶、淀粉溶液、碘 碘化鉀溶液，樣品檢測(cè)瓶、陽(yáng)性對(duì)照瓶和陰性對(duì)照瓶中含有氨芐青霉素，陽(yáng)性對(duì)照品瓶和陰性對(duì)照瓶還含有脫脂奶粉。
2.如權(quán)利要求1所述的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，其特征是標(biāo)準(zhǔn)β “內(nèi)酰胺酶是溶液， 每毫升含有50-5000萬(wàn)單位β-內(nèi)酰胺酶、5-50% (ν/ν)甘油、l_50mg丙氨酸、I-IOOmg甘 露醇，磷酸緩沖液 5-100mmol/L，pH4. 0-10. 0。
3.如權(quán)利要求1或2所述的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，其特征是碘_碘化鉀溶液含有 0. 1-10% (w/v)碘和 0. 1-20% (w/v)的碘化鉀。
4.如權(quán)利要求3所述的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，其特征是碘-碘化鉀溶液含有1-3% (w/v)碘和2-5% (w/v)的碘化鉀。
5.如權(quán)利要求1、2、4任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，其特征是淀粉 溶液含有0. 1-20% (w/v)的淀粉。
6.如權(quán)利要求5所述的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，其特征是淀粉溶液含有1-2%(w/v) 的淀粉。
7.如權(quán)利要求1、2、4、6任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，其特征是每 個(gè)檢測(cè)瓶含有氨芐青霉素粉末0. l_50mg。
8.如權(quán)利要求7所述的內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，其特征是每個(gè)檢測(cè)瓶含有氨芐青霉 素粉末l-3mg。
9.內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法，其特征在于取陽(yáng)性檢測(cè)瓶和陰性檢測(cè)瓶各一支及樣品檢 測(cè)瓶，分別取1. 5ml蒸餾水加入陽(yáng)性檢測(cè)瓶和陰性檢測(cè)瓶，再向陽(yáng)性檢測(cè)瓶中加入1 2滴 β -內(nèi)酰胺酶溶液，樣品檢測(cè)瓶中加入樣品1.5ml，各檢測(cè)瓶混合均勻后蓋好瓶塞，將各檢 測(cè)瓶卡入托架放入37°C恒溫水浴保溫30-180分鐘；然后向各檢測(cè)瓶加入4滴淀粉溶液，混 合均勻后再加入碘-碘化鉀溶液2滴，混合均勻，放置2分鐘，根據(jù)樣品檢測(cè)瓶顏色與陽(yáng)性 檢測(cè)瓶和陰性檢測(cè)瓶的比較確定樣品中是否含有內(nèi)酰胺酶。
10.如權(quán)利要求9的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法，其特征在于通過(guò)下述方法定量測(cè)定樣品 中內(nèi)酰胺酶含量將檢測(cè)樣品梯度稀釋?zhuān)@得呈陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)，檢測(cè)限乘以 稀釋倍數(shù)即為樣品中內(nèi)酰胺酶含量。
11.如權(quán)利要求9的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法，其特征是檢測(cè)瓶在37°C恒溫水浴保溫 60-90分鐘，滴加碘液后37°C水浴保溫2-5分鐘觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，屬于食品安全檢測(cè)試劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明配制的檢測(cè)試劑盒由包裝盒、樣品檢測(cè)瓶、陽(yáng)性對(duì)照瓶、陰性對(duì)照瓶、標(biāo)準(zhǔn)β-內(nèi)酰胺酶溶液試劑瓶、淀粉溶液試劑瓶、碘-碘化鉀溶液試劑瓶、取樣移液器和托架組成，檢測(cè)瓶中含有氨芐青霉素，陽(yáng)性檢測(cè)瓶和陰性檢測(cè)瓶還含有輔料。本發(fā)明的試劑盒最低檢測(cè)限度可以達(dá)到30-50U/ml(2-5ng/ml)。本發(fā)明還涉及應(yīng)用上述檢測(cè)試劑盒測(cè)定食品中β-內(nèi)酰胺酶含量的方法。本發(fā)明尤其適用于乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK101914612SQ20091009773
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2009年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日
發(fā)明者劉國(guó)安, 劉沐榮, 劉翔, 吳揚(yáng), 張加慧 申請(qǐng)人:杭州北望生物技術(shù)有限公司