專利名稱：：一種用于構(gòu)建hpRNA的載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于構(gòu)建hpRNA的載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：hpRNA在植物體內(nèi)會(huì)被處理成為siRNA從而誘導(dǎo)RNA干擾，構(gòu)建hpRNA被廣泛應(yīng)用于RNA干擾和基因沉默。hpRNA的編碼區(qū)包含兩段反向互補(bǔ)的目的基因片段，兩片段之間夾有一段環(huán)片段(loopregion)。該編碼區(qū)構(gòu)建到質(zhì)粒上，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生自身互補(bǔ)的單鏈hpRNA。目前構(gòu)建hpRNA的方法雖然已有較大的進(jìn)展，但仍存在費(fèi)用高、耗時(shí)大、操作繁瑣、技術(shù)不易掌握等缺陷。hpRNA載體pHANNNIBAL和pKANNIBAL是通過(guò)傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶和連接系統(tǒng)進(jìn)行構(gòu)建的(Wesley,S.，Helliwell，C.，Smith,N.，Wang，M.,Rouse,D.，Liu，Q.,Gooding,P.,Singh,S.，Abbott,D.,Stoutjesdijk,P.etal.(2001)Constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants.PlantJ，27，581-590.);通過(guò)一步或兩步PCR得到目標(biāo)片段，利用限制性內(nèi)切酶依次連入載體中；除了酶切位點(diǎn)的局限性，該方法的主要問題是其耗時(shí)過(guò)大，故只能在小規(guī)模構(gòu)建中使用。Gateway系統(tǒng)較傳統(tǒng)方法有了較大改進(jìn)。其主要利用lambda噬菌體生活周期中會(huì)與寄主基因組發(fā)生位點(diǎn)特異的同源重組的特性，利用LR反應(yīng)進(jìn)行構(gòu)建(Landy,A.(1989)Dynamic,structural,andregulatoryaspectsoflambdasite-specificrecombination.AnnuRevBiochem，58，913-949.);質(zhì)粒pHELLSGATE4，pHELLSGATE8和p服LLSGATE12均為通過(guò)該系統(tǒng)進(jìn)行hpRNA構(gòu)建(Helliwe11，C.andWaterhouse，P.(2003)Constructsandmethodsforhigh-throughputgenesilencinginplants.Methods,30，289-295.);然而通過(guò)前兩個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行的構(gòu)建會(huì)出現(xiàn)非預(yù)期的位點(diǎn)重組，產(chǎn)生反向無(wú)功能的內(nèi)含子；而通過(guò)p亞LLSGATE12質(zhì)粒進(jìn)行的構(gòu)建雖然保證了內(nèi)含子的有效性，但其PTGS的效率不穩(wěn)定(Wesley,S.，Helliwell,C.，Smith,N.，Wang,M.，Rouse,D.,Liu,Q.，Gooding,P.,Singh,S.，Abbott,D.，Stoutjesdijk，P.etal.(2001)Constructdesignforefficienteffectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants.PlantJ，27，581-590.);更重要的是該方法中用到的酶成本過(guò)高。DA-ihpRNA(Xiao,Y.，Yin,M.,Hou，andPei，Y.(2006)Directamplificationofintron-containinghairpinRNAconstructfromgenomicDNA.Biotechniques，41,548,550,552.)方法是基于基因組DNA序列的，其利用特定基因的自身的內(nèi)含子產(chǎn)生hpRNA;該方法雖然簡(jiǎn)單快捷，但目標(biāo)片段的位置受到極大的限制。最近出現(xiàn)了一種一步構(gòu)建hpRNA的方法，該方法利用ZeBaTA載體(Chen，S.，Songkumarn,P.，Liu,J.andWang,G.(2009)AVersatileZeroBackgroundT-vectorSystemforGeneCloningandFunctionalGenomics.PlantPhysiol.);該方法中hpRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)是由兩段反向的目標(biāo)序列和任意的中間片段進(jìn)行搭接PCR得到的；然而，實(shí)際操作中，由于PCR抑制效應(yīng)，通過(guò)搭接PCR—步產(chǎn)生hpRNA片段是很難做到的；此外，每個(gè)構(gòu)建都需要通過(guò)搭接PCR逐個(gè)引入環(huán)片段，使得該方法難以作為大規(guī)模篩選。MOOE-PCR方法中，同樣作為環(huán)片段的內(nèi)含子每次都需要單獨(dú)引入；且其搭接PCR的條件需要根據(jù)不同基因的特性逐個(gè)進(jìn)行優(yōu)化(Yan，P.，Shen，W.，Gao，X.，Duan，J.andZhou，P.(2009)Rapidone-stepconstructionofhairpinRNA.BiochemBiophysResCommun，383，464-468.)。隨著基因組信息的大量涌現(xiàn)，發(fā)展一種簡(jiǎn)單有效，可以高通量構(gòu)建hpRNA的方法是極為必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于構(gòu)建hpRNA的載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種表達(dá)盒，為雙鏈互補(bǔ)的DNA片段，從啟動(dòng)子到終止子轉(zhuǎn)錄方向定義為5'—3'方向，依次包括啟動(dòng)子、DNA片段A、20個(gè)以上脫氧核糖核苷酸組成的lo(5p核苷酸序列、DNA片段B、DNA片段C和終止子；所述DNA片段A的5'—3'的鏈，自上游至下游依次由LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)，LIC1片段、限制性內(nèi)切酶A識(shí)別位點(diǎn)、與LIC3片段反向互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸組成的片段和LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)組成；所述DNA片段B的5'—3'的鏈，自上游至下游依次由LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)、LIC2片段和限制性內(nèi)切酶B識(shí)別位點(diǎn)組成；所述DNA片段C的5'—3'的鏈，自上游至下游依次由限制性內(nèi)切酶C識(shí)別位點(diǎn)、與LIC4片段反向互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸組成的片段和LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)組成；所述L工C1片段、LIC2片段、LIC3片段和LIC4片段均由12至50個(gè)脫氧核糖核苷酸組成(同一個(gè)表達(dá)盒中，LIC1片段、LIC2片段、LIC3片段和LIC4片段的核苷酸數(shù)目可不一致)；所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)為A、T、C和G這四種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)的一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述DNA片段A滿足如下(I)或(II)或(III)的條件(I)所述DNA片段A被所述限制性內(nèi)切酶A酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生平末端；所述DNA片段A的5'—3'的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段A的5'—3'的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(II)所述DNA片段A被所述限制性內(nèi)切酶A酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生3，粘性末端；所述3'粘性末端的突出核苷酸序列由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段A的5'—3'的鏈，除了所述3'粘性末端的突出核苷酸和所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成;所述DNA片段A的5'—3'的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(III)所述DNA片段A被所述限制性內(nèi)切酶A酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生5'粘性末端；所述DNA片段A的3'—5'的鏈，所述5'粘性末端的突出核苷酸序列中，5'—3'最后一位脫氧核糖核苷酸為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述DNA片段A的5'—3'的鏈，所述5'粘性末端的突出核苷酸序列中，5'—3'最后一位脫氧核糖核苷酸為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述5'粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5'—3'最后一位脫氧核糖核苷酸外，由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段A的5'—3'的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段A的5'—3'的鏈，除了所述5'粘性末端的突出核苷酸和所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段B滿足如下(IV)或(V)或(VI)的條件(IV)所述DNA片段B被所述限制性內(nèi)切酶B酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生平末端；所述DNA片段B的5'—3'的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(V)所述DNA片段B被所述限制性內(nèi)切酶B酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生3'粘性末端；所述3'粘性末端的突出核苷酸序列由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段B的5'—3'的鏈，除了所述3'粘性末端的突出核苷酸和所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(VI)所述DNA片段B被所述限制性內(nèi)切酶B酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生5'粘性末端；所述DNA片段B的3'—5'的鏈，所述5，粘性末端的突出核苷酸序列中，5'—3'最后一位脫氧核糖核苷酸為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述5'粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5'—3'最后一位脫氧核糖核苷酸外，由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段B的5'—3'的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段C滿足如下(Vn)或(VIII)或(IX)的條件(Vn)所述DNA片段C被所述限制性內(nèi)切酶C酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生平末端；所述DNA片段C的5'—3'的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(VDI)所述DNA片段C被所述限制性內(nèi)切酶C酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生3'粘性末端；所述3'粘性末端的突出核苷酸序列由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段C的5'—3'的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；9(IX)所述DNA片段C被所述限制性內(nèi)切酶C酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生5'粘性末端；所述DNA片段C的5'—3'的鏈，所述5'粘性末端的突出核苷酸序列中，5'—3'最后一位脫氧核糖核苷酸為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述5，粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5'—3'最后一位脫氧核糖核苷酸外，由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段C的5'—3'的鏈，除了所述5，粘性末端的突出核苷酸和所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成。所述表達(dá)盒可依次包括所述啟動(dòng)子、所述DNA片段A、所述20個(gè)以上脫氧核糖核苷酸組成的loop核苷酸序列、所述DNA片段B、負(fù)篩選基因、所述DNA片段C和所述終止子。所述啟動(dòng)子可為在植物中具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄功能的任意啟動(dòng)子，包括組織特異性啟動(dòng)子(只在植物某些組織中啟動(dòng)表達(dá))，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(包括各類誘導(dǎo)因子添加所引起的表達(dá))，組成型表達(dá)啟動(dòng)子等，也可以使用若干串聯(lián)的啟動(dòng)子(如串聯(lián)的35S啟動(dòng)子)。所述lo叩核苷酸序列可為常用的PdkIntron(正向、反向均可)等，也可為與靶基因相對(duì)應(yīng)的內(nèi)含子(正向、反向均可)，其它任意核酸序列也可以代替Intron作為spacer隔斷兩邊反向互補(bǔ)靶基因序列。所述負(fù)篩選基因用于提高篩選效率，可為具有類似實(shí)施例中ccdB負(fù)篩選功能的基因。所述終止子可為任何在植物中具有終止轉(zhuǎn)錄功能的終止子，如Nos終止子。所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)具體可為核苷酸T，所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)具體可為核苷酸A。所述LIC1片段具體可如序列表的序列1所示；所述LIC2片段具體可如序列表的序列2所示；所述LIC3片段具體可如序列表的序列3所示；所述LIC4片段具體可如序列表的序列4所示。所述35S啟動(dòng)子具體可如序列表的序列5所示。所述反向互補(bǔ)的Pdk內(nèi)含子具體可如序列表的序列6所示。所述ccdB基因具體可如序列表的序列7所示；所述Nos終止子具體可如序列表的序列8所示。所述限制性內(nèi)切酶A、所述限制性內(nèi)切酶B和所述限制性內(nèi)切酶C可為相同的限制性內(nèi)切酶。所述限制性內(nèi)切酶A、所述限制性內(nèi)切酶B和所述限制性內(nèi)切酶C均可為Smal。所述表達(dá)盒具體可為序列表的序列9所示的DNA。所述表達(dá)盒可以亞克隆到不同的骨架載體，從而采用不同的選擇標(biāo)記，如利用壯觀霉素作為細(xì)菌中的選擇標(biāo)記，利用慶大霉素作為植物中的篩選基因等。含有以上任一所述表達(dá)盒的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體具體可為序列表的序列10所示的DNA。本發(fā)明還保護(hù)一種構(gòu)建hpRNA載體的方法，包括如下步驟用限制性內(nèi)切酶A、限制性內(nèi)切酶B和限制性內(nèi)切酶C酶切所述重組載體，用與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸和T4DNA聚合酶處理酶切產(chǎn)物，得到產(chǎn)物甲；用與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸和T4DNA聚合酶處理DNA片段I和DNA片段II，得到產(chǎn)物乙；將產(chǎn)物甲和產(chǎn)物乙混合，得到hpRNA載體；所述DNA片段I由目標(biāo)基因片段及其上游序列和下游序列組成；所述目標(biāo)基因片段上游序列為與如下核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將所述重組載體用限制性內(nèi)切酶A酶切，再經(jīng)過(guò)T4DNA聚合酶和與LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸處理得到的LIC1端的粘性末端；所述目標(biāo)基因片段下游序列為與如下核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將所述重組載體用限制性內(nèi)切酶B酶切，再經(jīng)過(guò)T4DNA聚合酶和與LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸處理得到的LIC2端的粘性末端；所述DNA片段II由目標(biāo)基因片段及其上游序列和下游序列組成；所述目標(biāo)基因片段上游序列為與如下核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將所述重組載體用限制性內(nèi)切酶C酶切，再經(jīng)過(guò)T4DNA聚合酶和與LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸處理得到的LIC4端的粘性末端；所述目標(biāo)基因片段下游序列為與如下核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將所述重組載體用限制性內(nèi)切酶A酶切，再經(jīng)過(guò)T4DNA聚合酶和與LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸處理得到的LIC3端的粘性末端。所述重組載體具體可為序列表的序列10所示的DNA。應(yīng)用所述方法構(gòu)建得到的hpRNA載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以上任一所述表達(dá)盒、任一所述重組載體或hpRNA載體均可應(yīng)用于抑制目的基因表達(dá)(或沉默目的基因)。應(yīng)用所述hpRNA構(gòu)建載體進(jìn)行目的基因沉默的方法如下(一)設(shè)計(jì)引物根據(jù)DNA片段I中的目標(biāo)基因片段及其上游序列設(shè)計(jì)上游引物；根據(jù)DNA片段I中的目標(biāo)基因片段及其下游序列設(shè)計(jì)下游引物。根據(jù)DNA片段II中的目標(biāo)基因片段及其上游序列設(shè)計(jì)上游引物；根據(jù)DNA片段II中的目標(biāo)基因片段及其下游序列設(shè)計(jì)下游引物。當(dāng)所處重組載體用所述限制性內(nèi)切酶A、所述限制性內(nèi)切酶B和所述限制性內(nèi)切酶C酶切后均產(chǎn)生平末端時(shí)，可基于如下原則設(shè)計(jì)引物對(duì)用于制備DNA片段I的引物對(duì)(引物對(duì)甲)上游引物序列由LIC1、限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別位點(diǎn)中切割位點(diǎn)上游的核苷酸、LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)和耙基因5'特異性序列組成；下游引物序列由LIC2、限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別位點(diǎn)中切割位點(diǎn)上游的核苷酸、LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)和靶基因3'特異性互補(bǔ)序列組成。用于制備DNA片段II的引物可為(引物對(duì)乙)上游引物序列由LIC4、限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別位點(diǎn)中切割位點(diǎn)上游的核苷酸、LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)和耙基因5'互補(bǔ)序列組成；下游引物序列由LIC3、限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別位點(diǎn)中切割位點(diǎn)上游的核苷酸、LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)和靶基因3，特異性序列組成。引物對(duì)乙用于直接對(duì)待測(cè)基因模板進(jìn)行擴(kuò)增。用于制備DNA片段II的引物還可為(引物對(duì)丙)上游引物序列由LIC4、限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別位點(diǎn)中切割位點(diǎn)上游的核苷酸、LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)、LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)、LIC1、限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別位點(diǎn)中切割位點(diǎn)上游的核苷酸和LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)組成。下游引物序列由LIC3、限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別位點(diǎn)中切割位點(diǎn)上游的核苷酸、LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)、LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)、LIC2、限制性內(nèi)切酶A的識(shí)別位點(diǎn)中切割位點(diǎn)上游的核苷酸和LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)組成。引物對(duì)丙用于對(duì)引物對(duì)甲的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。(二)制備正向基因片段和反向基因片段以目的基因片段的DNA為模板，用引物對(duì)甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段I。以目的基因片段的DNA為模板，用引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段II?；蛘?，以DNA片段I為模板，用引物對(duì)丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段II。(三)0Z-LIC方法將所述重組載體(如實(shí)施實(shí)例中pRNAi-LIC)，首先通過(guò)所選擇的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理，繼而在同時(shí)具有3'-5'DNA外切酶活性和5'-3'DNA聚合酶活性(如實(shí)施實(shí)例中的T4DNA聚合酶，或者Pfu等DNA聚合酶)的LIC酶反應(yīng)系統(tǒng)中，加入同單核苷酸終止位點(diǎn)相同堿基的脫氧核糖核苷酸進(jìn)行孵育。所使用LIC酶發(fā)揮3'-5'DNA外切酶活性活性直到單核苷酸終止位點(diǎn)處，由于與該位點(diǎn)相同外源脫氧核糖核苷酸的存在使得LIC酶能夠發(fā)揮5'-3'DNA聚合酶活性，在該位點(diǎn)處達(dá)到平衡，最終產(chǎn)生具有3'突出的LIC粘性末端。正向以及反向靶基因片段在同時(shí)具有3，-5，DNA外切酶活性和5，-3，DNA聚合酶活性(如實(shí)施實(shí)例中的T4DNA聚合酶，或者Pfu等DNA聚合酶)的LIC酶反應(yīng)系統(tǒng)中，加入同LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)堿基的脫氧核糖核苷酸進(jìn)行孵育。所使用LIC酶發(fā)揮3'-5'DNA外切酶活性活性直到LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)處，由于與該位點(diǎn)互補(bǔ)的外源核糖核苷酸的存在使得LIC酶能夠發(fā)揮5'-3'DNA聚合酶活性，在該位點(diǎn)處達(dá)到平衡，最終產(chǎn)生具有5'突出的LIC粘性末端。將處理好的載體以及兩個(gè)靶基因片段混合后孵育能夠使得各自上面的LIC序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，產(chǎn)生具有缺口的環(huán)狀質(zhì)粒，從而轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌自身修復(fù)能力進(jìn)行補(bǔ)缺。為克服構(gòu)建hpRNA中存在的問題，如酶切連接系統(tǒng)中酶切位點(diǎn)受限，Gateway系統(tǒng)中耗時(shí)耗錢過(guò)高，其它一些系統(tǒng)中PCR步驟過(guò)于復(fù)雜等，本發(fā)明提供了一種表達(dá)盒以及含有該表達(dá)盒的重組載體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用本發(fā)明的重組載體構(gòu)建hpRNA載體，只需要進(jìn)行一步克隆，不需要傳統(tǒng)的酶切連接系統(tǒng)，大大提升了hpRNA載體構(gòu)建的效率，節(jié)約了成本，幾乎100%陽(yáng)性，表現(xiàn)出良好的性能及穩(wěn)定性，可以有效誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。應(yīng)用本發(fā)明的hpRNA載體，可以高效穩(wěn)定的沉默目標(biāo)基因，可進(jìn)行高通量篩選，重復(fù)性高，十分可靠。本發(fā)明提供的表達(dá)盒、重組載體和hpRNA載體，在當(dāng)今基因序列爆發(fā)的時(shí)代為大規(guī)?；蚬δ芙M學(xué)的研究提供了途徑。圖1為pRNAi-LIC載體中hpRNA表達(dá)盒示意圖。圖2為0Z-LIC方法流程圖。圖3為實(shí)施例2中的GFP亮度檢測(cè)結(jié)果。圖4為實(shí)施例2中的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。圖5為實(shí)施例3中的GUS染色檢測(cè)結(jié)果。圖6為實(shí)施例3中的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。圖7為實(shí)施例4中根長(zhǎng)對(duì)Auxin激素敏感性檢測(cè)結(jié)果圖8為實(shí)施例4中RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。利用了LIC反應(yīng)的原理，用含有圖1所示表達(dá)盒的重組質(zhì)粒進(jìn)行hpRNA構(gòu)建，具體步驟及原理(如圖2所示)如下(1)第一輪PCR用引物對(duì)甲PCR擴(kuò)增DNA片段.；(2)第二輪PCR用引物對(duì)乙擴(kuò)增DNA片段II;或者以DNA片段I為模板，用引物對(duì)丙(通用引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段II(下述實(shí)施實(shí)例中采用此通用引物進(jìn)行)。(3)用限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒，得到3個(gè)片段兩端分別為L(zhǎng)IC1序列和LIC4序列的質(zhì)粒骨架片段(DNA片段in)、兩端分別為L(zhǎng)IC2和LIC3序列的Pdk內(nèi)含子(DNA片段IV)、ccdB基因片段(DNA片段V)。(4)用限制性內(nèi)切酶Smal酶切所述重組載體，用與dTTP和T4DNA聚合酶處理酶切產(chǎn)物，得到產(chǎn)物甲；用dATP相和T4DNA聚合酶處理DNA片段I和腦A片段II，得到產(chǎn)物乙；使得各個(gè)DNA片段上產(chǎn)生粘性末端；將產(chǎn)物甲和產(chǎn)物乙混合，具有粘末端的DNA片段III、DNA片段I、反向的DNA片段IV、DNA片段II依次首尾連接，形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒(hp脂A載體)；通過(guò)細(xì)菌的負(fù)篩選機(jī)制，含有ccdB基因片段(DNA片段V)的重組子不會(huì)形成克隆；該過(guò)程利用了T4DNA聚合酶的特性-①T4DNA聚合酶具有3'至5，外切酶的活性，；②在dNTP存在時(shí)T4DNA聚合酶同樣有5'至3'聚合酶活性的性質(zhì)。利用這個(gè)特性，按照LIC序列設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)特殊的LIC序列，便可以得到具有各個(gè)帶粘性末端的目的片段。(5)將步驟(4)得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a或DH10b大腸桿菌，在抗生素平板上進(jìn)行篩選。由于采用ccdB負(fù)篩選基因排除酶切不完全載體再生，陽(yáng)性克隆效率接近零背景。實(shí)施例中所用的引物見表l。表l實(shí)施例中所用的引物引物序列特征0X15'-AGAGCACACGACCCTTCGACGACMGACCCT-3'LIC4-CCC-TT-LIC1-CCC-T0X25'-CCAGCACGGAACCCTTGAGGAGMGAGCCCT-3'LIC3-CCC-TT-LIC2-CCC-T0X35'-CGACGACAAGACCCTgacgggaactacaagacacg-3，LICKCC-T-GFP5，14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>備注大寫粗體字母為L(zhǎng)KT序列，小寫字母為基因特異的序列。實(shí)施例1、重組質(zhì)粒的制備一、pRNAi-LIC質(zhì)粒的制備用序列表的序列9所示的表達(dá)盒制備重組載體pRNAi-LIC。pRNAi-LIC的DNA序列見序列表的序列10。pRNAi-LIC質(zhì)粒利用卡那霉素作為細(xì)菌及植物中的抗性篩選基因。序列9所示的表達(dá)盒中，自5'—3'，第1-769位核苷酸為串聯(lián)的35S啟動(dòng)子；第852位核苷酸為L(zhǎng)IC處理單核苷酸終止位點(diǎn)；第853-863位核苷酸為L(zhǎng)IC1片段；第864-869位核苷酸為Smal位點(diǎn)；第870-880位核苷酸為L(zhǎng)IC3片段反向互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸組成的片段;第881位核苷酸為L(zhǎng)IC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)；第887-2485位核苷酸為反向互補(bǔ)的Pdk內(nèi)含子；第2493位核苷酸為L(zhǎng)IC處理單核苷酸終止位點(diǎn)；第2494-2504位核苷酸為L(zhǎng)IC2片段；第2505-2510位核苷酸為Smal位點(diǎn)；第2792-3097位核苷酸為ccdB基因；第3119-3124位核苷酸為Smal位點(diǎn)；第3125-3135位核苷酸為L(zhǎng)IC4片段反向互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸；第3136位核苷酸為L(zhǎng)IC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)；第3150至3406位核苷酸為Nos終止子。pRNAi-LIC質(zhì)粒中，第1-3412位核苷酸為表達(dá)盒序列。實(shí)施例2、應(yīng)用pRNAi-LIC質(zhì)粒沉默GFP基因煙草Nc89:中煙種子有限責(zé)任公司。大腸桿菌DH5a:寶生物工程(大連)有限公司)一、外源咖A片段的獲得以pCAMBIA1302(購(gòu)自Canberra,ACT,Australia)為模板，利用引物0X3和0X4克隆長(zhǎng)度為368bp的GFP基因片段(序列參見11)利用通用引物0X1和0X2進(jìn)行第二輪PCR。二、hpRNA載體(pRNAi-GFP)的構(gòu)建常規(guī)方法提取pRNAi-LIC質(zhì)粒。在50ul體系中加入l-2ug質(zhì)粒，3ulSma'丄(Fermentas)以及5ulBufferTango，37°C，2h至過(guò)夜酶切。加入dTTP以及DTT至終濃度5mM，再加入10unitsT4DNA聚合酶(Fermentas)，22。C反應(yīng)30min，75°C，10min熱滅活。兩個(gè)靶基因片段可以在同一體系或者分別處理，加入50ng純化后的PCR片段，加入dATP以及DTT至終濃度5mM，再加入0.5unitT4DNA聚合酶(Fermentas)，同樣條件反應(yīng)并且滅活。將上述處理好的DNA片段以及載體按照一定比例混合，22。C孵育15min。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(用DH10b也可)，在含有卡那霉素和氯霉素平板中篩選重組子。提取重組子質(zhì)粒通過(guò)BamHI和SacI雙酶切鑒定以及測(cè)序鑒定。最終獲得具有反向重復(fù)序列的hpRNA表達(dá)質(zhì)粒。三、應(yīng)用hpRNA載體沉默GFP基因分別將pRNAi-GFP、pRNAi-LIC和pCAMBIA-1302轉(zhuǎn)入LBA4404農(nóng)桿菌(購(gòu)于Clontech公司)中。1、GFP亮度檢測(cè)將含pRNAi-GFP的農(nóng)桿菌與含pCAMBIA-1302的農(nóng)桿菌1:1混合，5000rpm離心五分鐘，沉淀用注射緩沖液(10mMMgCl2,lOraMMES，200raMacetosyringone)重懸，室溫放置4小時(shí)，進(jìn)行注射。將含pRNAi-LIC的農(nóng)桿菌與含pCAMBIA-1302的農(nóng)桿菌混合做相同處理，作為陰性對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組注射到煙草Nc89的同一葉片上，3天后在紫外光下觀察GFP亮度。結(jié)果見圖3。陰性對(duì)照(左)中有強(qiáng)GFP熒光，而實(shí)驗(yàn)組(右)中GFP表達(dá)被抑制。2、RT-PCR檢測(cè)將含pRNAi-GFP的農(nóng)桿菌與含pCAMBIA-1302的農(nóng)桿菌1:1混合，5000rpra離心五分鐘，沉淀用注射緩沖液(10函MgCl2,10mMMES,200raMacetosyringone)重懸，室溫放置4小時(shí)，進(jìn)行注射。將含pRNAi-LIC的農(nóng)桿菌與含pCAMBIA-1302的農(nóng)桿菌混合做相同處理，作為陰性對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組注射到不同的煙草Nc89上，3天后采集葉片提取RNA。進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(引物序列為5，-atgaagactaatctt-3，？5，-ttaaagctcatcatgtttgt-3，)。結(jié)果見圖4;1:陰性對(duì)照；2:實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中GFP基因的表達(dá)確實(shí)被沉默掉了。實(shí)施例3、應(yīng)用hpRNA沉默GUS基因一、外源DNA片段的獲得以pCAMBIA1301(購(gòu)自Canberra,ACT,Australia)為模板，利用引物0X5和0X6擴(kuò)增GUS基因片段(序列參見序列12)，以GUS基因片段為模板，利用通用引物0X1和0X2進(jìn)行第二輪PCR。二、hpRNA載體(p腿i-GUS)的構(gòu)建同實(shí)施例2的步驟二。三、應(yīng)用hpRNA載體沉默GUS基因分別將pRNAi-GUS、pRNAi-LIC和pCAMBIA-1301轉(zhuǎn)入LBA4404農(nóng)桿菌(購(gòu)于Clontech公司)中。1、GUS染色檢測(cè)將含pRNAi-GUS的農(nóng)桿菌與含pCAMBIA-1301的農(nóng)桿菌1:1混合，5000rpm離心五分鐘，沉淀用注射緩沖液(10mMMgCl2，10mMMES，200mMacetosyringone)重懸，室溫放置4小時(shí)，進(jìn)行注射。將含pRNAi-LIC的農(nóng)桿菌與含pCAMBIA-1301的農(nóng)桿菌混合做相同處理，作為陰性對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組注射到煙草Nc89的同一葉片上，注射植物4天后收集葉片浸入GUS染液中，0.lMPa真空處理5分鐘，37。C溫育直至藍(lán)色顯現(xiàn)。用PH7.0的50mM磷緩沖液洗，再依次用50%，75%和100%的乙醇各浸置五分鐘。最終浸入75%的乙醇，直至脫色完全。GUS染色結(jié)果見圖5。陰性對(duì)照(左)中有藍(lán)色，而實(shí)驗(yàn)組(右)中GUS表達(dá)被抑制。證明了hpRNA載體可以有效沉默目標(biāo)基因。2、RT-PCR檢測(cè)將含pRNAi-GUS的農(nóng)桿菌與含pCAMBIA-1301的農(nóng)桿菌1:1混合，5000rpm離心五分鐘，沉淀用注射緩沖液(10mMMgCh，10mMMES，200mMacetosyringone)重懸，室溫放置4小時(shí)，進(jìn)行注射。將含pRNAi-LIC的農(nóng)桿菌與含pCAMBIA-1301的農(nóng)桿菌混合做相同處理，作為陰性對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組注射到不同的煙草Nc89上，3天后采集葉片提取RNA。進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(弓l物膀lj為5'-cgaaaccaatgcctaaag"3，；5，-cacgccgtatgttattgc-3，)。結(jié)果見圖6;1:陰性對(duì)照；2:實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GUS基因的表達(dá)確實(shí)被沉默掉了。實(shí)施例4、hpRNA轉(zhuǎn)基因擬南芥沉默效果檢測(cè)(轉(zhuǎn)基因水平)本實(shí)施例從轉(zhuǎn)基因水平證明hpRNA能夠有效沉默目的基因。SGT1基因除參與到植物抗病反應(yīng)中，還能夠?qū)ΤＲ姷募に赜蟹磻?yīng)。本實(shí)施中所沉默基因?yàn)閿M南芥中基因SGTlb，其能夠響應(yīng)激素Anxin，引起根長(zhǎng)發(fā)育受到抑制(Gray,W.，Muskett，P.，Chuang,H.andParker,J.(2003)ArabidopsisSGTlbisrequiredforSCF(TIRl)-mediatedauxinresponse.PlantCell,15，1310-1319)，而突變體則對(duì)Auxin變得不敏感。利用這個(gè)特點(diǎn)，構(gòu)建AtSGTlb的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，檢測(cè)hpRNA在轉(zhuǎn)基因水平上具有有效沉默靶基因的作用。一、AtSGTlb基因片段的獲得從擬南芥Col-0(購(gòu)買自ArabidopsisBiologicalResourceCenter)中提取RNA，反轉(zhuǎn)獲得cDNA文庫(kù)，通過(guò)引物0X9和0X10從中將AtSGTlb片段擴(kuò)增出來(lái)(序列參見序列13)。以AtSGTlb基因片段為模板，利用通用引物0X1和0X2進(jìn)行第二輪PCR。二、hpRNA載體(pRNAi-AtSGTlb)的構(gòu)建同實(shí)施例2的步驟二。三、轉(zhuǎn)基因植物的獲得將pRNAi-AtSGTlb轉(zhuǎn)入LBA4404農(nóng)桿菌(購(gòu)于Clontech公司)中。利用文獻(xiàn)報(bào)道方法獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因植株(Zhang，X.，Henriques,R.，Lin，S.,Niu,Q.andChua，N.(2006)Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.NatProtoc，1，641-646.)。對(duì)抗生素篩選陽(yáng)性植株收取種子為Tl代。四、轉(zhuǎn)基因植物的鑒定1、通過(guò)植物根長(zhǎng)對(duì)Auxin激素敏感性檢測(cè)沉默AtSGTlb的效果在含有0.06uMAuxin的MS平板上鋪上野生型擬南芥種子(WT)作為對(duì)照，另一邊鋪上轉(zhuǎn)基因植株Tl代種子(AtSGTlbhpRNAi)。觀察根長(zhǎng)的生長(zhǎng)情況。結(jié)果見圖7。轉(zhuǎn)基因植株根長(zhǎng)相對(duì)對(duì)照更長(zhǎng)，表現(xiàn)為對(duì)Auxin不敏感(其中部分敏感植株則是由于基因分離的原因)。2、RT-PCR檢測(cè)將兩棵上述對(duì)Auxin不敏感植株(樣本2和樣本3)和一棵野生型植株(樣本1)繼續(xù)轉(zhuǎn)移至土壤中培養(yǎng)，取葉片提取RNA，進(jìn)行RT-PCR(引物為5，-CGATGTTCAGGCACGAGTTC-3，；5，-CGACAGTACCGTCCCATTC-3，)。結(jié)果見圖8。結(jié)果顯示，Auxin不敏感植株中該基因的RNA水平明顯被抑制。18序列表〈110〉清華大學(xué)<120〉一種用于構(gòu)建hpRNA的載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用<130〉CGGNARY92543<160〉13〈210>1<211〉11<212〉DNA<213〉人工序列.<220〉<223〉<400〉1cgacgacaaga11<210〉2<211〉11<212>醒〈213〉人工序列<220〉〈223〉〈400〉2gaggagaagag11<210〉3<211>11<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉<400〉3ccagcacggaa11〈210〉4<211〉11〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉〈400〉4agagcacacg311<210>5<211>769<212〉腿<213〉人工序列〈220>〈223〉<400〉5肪gcttgcsttcgggaaaccg肌犯gg犯ggatgcctctaaaag肌gacgggagcacgacggctattgagagctatctgtgCCtgC3ggtcagtctcagatcctcggattatggcttctaccgacagtggttccaaccacactctcgtxtacttttcaaccacttcatcgC33C3tggtg卿ccagaggccattgcccac肪3tgccattccca犯gatgtcttcaaagactcc犯g肌3肌gggtaMaaaggacagtgagcacgacagctattgagagctatctgtccattgcgat3ggacccccaccaagtggatttatca肪g3tatcgggaaacctctcgtctacttttcaacaacttcatcga朋gg3犯ggCccacgaggaagatgtgatgg3C3gtCtC3gctcctcggatgatggcttctctccaagaataagggtaataaaggacagtatatcgttcaacatcgtggaatcaacatggt33gaccagagtccattgccc3caaa_tgccs60120180240300360420480540tcattgcgatd肌gga^ggctatcgttcaagatgcctctaccgacagtggtccca^aga600tggacccccacccacgaggaacatcgtggagttccaaccacgtcttcaaa660gc卿tggattg3tgtg￡Lt3tctccactgaCgt￡l￡Lggg3tgacgcac^itcccactatcc720ttcgcaagacccttcctctatat犯gg^gttcatttcatttggagagg769〈210〉6〈211〉1599〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉6ctgtaatcaatccaaMgtaagstca^tgaacatgatcta"tcatgttacc60ttgtttattc3tgttCg3Ct犯ttC3ttt3aatccattta120aaactacaagtattatttaggaatgttgatactatataaa1803tgatagatcttgcgctttgttatattagc3tt3g3tta_tgttttgttac240tgtttctattagtttgatattatttgttactttagcttgttatttaatattttgtttat1:300gataaattac犯gcagattgg肌tttCt^1att犯ctttt360atttagtaatggtataga^taataaacta11aatcataaaaaaatatta420ttttaatttatttattcttatttttactatagtattttatcattgatattta^ttcatca480aaccagctagatgggaccgacatatcagtatatattctta"taccgca^iaa540atcagcgcgca^ta^cgcatactgttatctggcttttagtaagccggatccacgcgatta600cgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgt肌ttcattaagcattctgccgacatg660gaagccatcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgcc720ttgcgtataatatttgcccatggtga^aacgggggcg卿aagttgtccatattggccac780gtttaaatcaa^ctggtga^aac"tc3ccc3gggattggctgagacga^aacatattctc840aataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaata900tatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatg^a^cgtttc960agtttgctcatgg肌3acggtgt犯c朋ggtcccatatcaccagctcacc1020gtcttlxattgccatacggaattccggatgagcattcatc鄉(xiāng)cgggcaagaatgtgaat1080aaaggccggagcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatc1140cagctgaacggtctggttataggtacattgdgC肌Ctg3Ctgaaatgcctca^a^tgttc1200tttacgatgccattgggatatatc肌cggtggtatatccagtgatttttttctccatttt1260agcttccttagctcctgaaaatctcgataaacgcccggtagtgatcttat1320ttcattatggtg犯agttggaacctcttaccggccgtatatcatcttacatgttcgatca138021aattcattaaaaataatatacttactctcaacttttatcttcttcgtcttacacatcact1440tgtcatatttttttacattactatgttgtttatgtaaacaatatatttataaattatttt1500ttcacaattataacaactatattattataatcatactaattaacatcacttaactatttt1560atactaaaaggaaaaaagaaaataattatttccttacca1599<210〉7<211〉306〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉〈400〉7atgcagtttacagagtgatactgctgtcagtggcgcatgagctgatctcaaggtttacacctat33aaga_ttattgacacgcctgggcgaataaagtctcccgtgaactttgaccaccgatatggccagtgccaccgcgaaaatgacatcgagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacggatggtgatccccctggccagtgcacgttacccggtggtgcatatcggggatgaaagcgtgccggtctccgttatcggggaagaagtgaaaaacgccattetacctgatgttctgggga60120180240300306〈210〉8〈211>257<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉〈400〉8gatcgttcaaatgattatcaatgacgttatacatttggcaataaagtttctataatttctgttgaattacttatgagatgggtttttatgac3aaat3t3gcgcgcsaacttaagattgaatcctgttgccggtcttgcggttaagcatgtaataattaacatgtaMgcattagagtcccgcaattatacatttaatactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagettcaaaa60120180240257〈210〉9〈211〉3412〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉9aagcttgcatgcctgcaggtcaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaM60atcaaagatacagtctcagaagaccagagggctattgagacttttcaacaaagggtaata120tcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagta180gaaaaggaagatggcttxtacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaa240gatgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggaacatcgtggaa300aaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatggtcaacatggt360ggagC3cgsc3ctctcgtctaictccgiEig犯t3tc3犯g3teicagtctcagagLgacca^g420ggctattgagacttttxaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgccc480agctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaagatggcttctacaaatgcca540tcattgcgata犯ggaaaggctatcgttcaagatgcctctaccgacagtggtcccaaaga600tggacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaa660gcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatcc720ttcgc犯gacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagggggccctctag780atgcatgctcgagcggccgccag"tgtgatggatatctgcagaattgccctcggggatccg840gggatccgagctcgacgacaagacccgggttccgtgctggaaccaactgtaatcaatcca900aatgtaagatcaatgataacacaatgacatgatctatcatgttaccttgtttattcatgt960tcgactaattcatttaattaatagtcaatccatttagaagttaMaaaactacaagtatt1020atttagaaattaataag犯tgttgattgasaat犯tactatat3肪3tg3tagstcttgc1080gctttgttatattagcattagattatgttttgttacattagattactgtttctattagtt1140tgatattatttgttactttagcttgttatttaatattttgtttattgataaattacaagc1200agattggaatttctaacaaaatatttattaacttttaaactaaaatatttagtaatggta1260tagatatttaatta/tataataaactattaatcataaaaaaatattattttaatttatt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cactgccactgaccggatgccgacgcgaagcg300ggtagatatcacactxtgtctggcttttggctgtgacgcacagttcatag￡Lgata_acctt360cacccggttgcc卿ggtgcggattcaccacttgcaaagtcccgctagtgccttgtccag420ttgcaaccacctgttgatccgcatcacgcagttcaacgct460<210〉13<211>354〈212〉腿<213〉人工序列<220>〈223〉<400>13cgatgttcaggcacgagttctaccagaaaccagaag肪gcggtggtgacaattttcgcca60taaggagaacgtaactgtcg8tgtttggtgagceigattctgagtgttgtca120ttgatgttgctggagaggaagcttatcatctccagccgagattgttcgggaageitaatac180cagag犯gtgcagatttgaagtattgtcgaccaaagttgagatccgtcttgcgaaagcag240agataa/tcax:ctgggcctcccttgaatatggtaa鄉(xiāng)gcaaagtgttttgCCC3肌CCC3300atgtctcatcagcgctgtcgcagagsccagtgtacccatcttctaagccagcaa35權(quán)利要求1、一種表達(dá)盒，為雙鏈互補(bǔ)的DNA片段，從啟動(dòng)子到終止子轉(zhuǎn)錄方向定義為5′→3′方向，依次包括啟動(dòng)子、DNA片段A、20個(gè)以上脫氧核糖核苷酸組成的loop核苷酸序列、DNA片段B、DNA片段C和終止子；所述DNA片段A的5′→3′的鏈，自上游至下游依次由LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)，LIC1片段、限制性內(nèi)切酶A識(shí)別位點(diǎn)、與LIC3片段反向互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸組成的片段和LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)組成；所述DNA片段B的5′→3′的鏈，自上游至下游依次由LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)、LIC2片段和限制性內(nèi)切酶B識(shí)別位點(diǎn)組成；所述DNA片段C的5′→3′的鏈，自上游至下游依次由限制性內(nèi)切酶C識(shí)別位點(diǎn)、與LIC4片段反向互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸組成的片段和LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)組成；所述LIC1片段、LIC2片段、LIC3片段和LIC4片段均由12至50個(gè)脫氧核糖核苷酸組成；所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)為A、T、C和G這四種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)的一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述DNA片段A滿足如下(I)或(II)或(III)的條件(I)所述DNA片段A被所述限制性內(nèi)切酶A酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生平末端；所述DNA片段A的5′→3′的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段A的5′→3′的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(II)所述DNA片段A被所述限制性內(nèi)切酶A酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段A的5′→3′的鏈，除了所述3’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段A的5′→3′的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(III)所述DNA片段A被所述限制性內(nèi)切酶A酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生5’粘性末端；所述DNA片段A的3′→5′的鏈，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脫氧核糖核苷酸為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述DNA片段A的5′→3′的鏈，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脫氧核糖核苷酸為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脫氧核糖核苷酸外，由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段A的5′→3′的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段A的5′→3′的鏈，除了所述5’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段B滿足如下(IV)或(V)或(VI)的條件(IV)所述DNA片段B被所述限制性內(nèi)切酶B酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生平末端；所述DNA片段B的5′→3′的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(V)所述DNA片段B被所述限制性內(nèi)切酶B酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段B的5′→3′的鏈，除了所述3’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(VI)所述DNA片段B被所述限制性內(nèi)切酶B酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生5’粘性末端；所述DNA片段B的3′→5′的鏈，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脫氧核糖核苷酸為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脫氧核糖核苷酸外，由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段B的5′→3′的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的上游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；所述DNA片段C滿足如下(VIII)或(VIII)或(IX)的條件(VII)所述DNA片段C被所述限制性內(nèi)切酶C酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生平末端；所述DNA片段C的5′→3′的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(VIII)所述DNA片段C被所述限制性內(nèi)切酶C酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段C的5′→3′的鏈，除了所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成；(IX)所述DNA片段C被所述限制性內(nèi)切酶C酶切后，在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生5’粘性末端；所述DNA片段C的5′→3′的鏈，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脫氧核糖核苷酸為與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的任意一個(gè)脫氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脫氧核糖核苷酸外，由任意脫氧核糖核苷酸組成；所述DNA片段C的5′→3′的鏈，除了所述5’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)外，所述切割位點(diǎn)的下游序列由與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)不同的剩余三種脫氧核糖核苷酸中的至少一種組成。2、如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其特征在于它依次包括啟動(dòng)子、DNA片段A、20個(gè)以上脫氧核糖核苷酸組成的loop核苷酸序列、DNA片段B、負(fù)篩選基因、DNA片段C和終止子；所述啟動(dòng)子由2個(gè)串聯(lián)的35S啟動(dòng)子組成、所述loop核苷酸序列為反向互補(bǔ)的Pdk內(nèi)含子、所述負(fù)篩選基因?yàn)閏cdB基因、所述終止子為Nos終止子。3、如權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)為核苷酸T，所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)為核苷酸A;所述LIC1片段如序列表的序列1所示；所述LIC2片段如序列表的序列2所示；所述LIC3片段如序列表的序列3所示；所述LIC4片段如序列表的序列4所示；所述35S啟動(dòng)子如序列表的序列5所示；所述反向互補(bǔ)的Pdk內(nèi)含子如序列表的序列6所示；所述ccdB基因如序列表的序列7所示；所述Nos終止子如序列表的序列8所示。4、如權(quán)利要求1至3中任一所述的表達(dá)盒，其特征在于所述限制性內(nèi)切酶A、所述限制性內(nèi)切酶B和所述限制性內(nèi)切酶C為相同的限制性內(nèi)切酶；所述限制性內(nèi)切酶A、所述限制性內(nèi)切酶B和所述限制性內(nèi)切酶C均為Smal。5、如權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒為序列表的序列9所示的DNA。6、含有權(quán)利要求1至5中任一所述表達(dá)盒的重組載體。7、如權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組載體的DNA序列如序列表的序列io所示。8、一種構(gòu)建hpRNA載體的方法，包括如下步驟用限制性內(nèi)切酶A、限制性內(nèi)切酶B和限制性內(nèi)切酶C酶切權(quán)利要求6所述重組載體，用與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸和T4DNA聚合酶處理酶切產(chǎn)物，得到產(chǎn)物甲；用與所述LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸和T4DNA聚合酶處理DNA片段I和DNA片段n，得到產(chǎn)物乙；將產(chǎn)物甲和產(chǎn)物乙混合，得到hpRNA載體；所述DNA片段I由目標(biāo)基因片段及其上游序列和下游序列組成；所述目標(biāo)基因片段上游序列為與如下核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將所述重組載體用限制性內(nèi)切酶A酶切，再經(jīng)過(guò)T4DNA聚合酶和與LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸處理得到的LIC1端的粘性末端；所述目標(biāo)基因片段下游序列為與如下核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將所述重組載體用限制性內(nèi)切酶B酶切，再經(jīng)過(guò)T4DNA聚合酶和與LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸處理得到的LIC2端的粘性末端；所述DNA片段II由目標(biāo)基因片段及其上游序列和下游序列組成；所述目標(biāo)基因片段上游序列為與如下核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將所述重組載體用限制性內(nèi)切酶C酶切，再經(jīng)過(guò)T4DNA聚合酶和與LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸處理得到的LIC4端的粘性末端；所述目標(biāo)基因片段下游序列為與如下核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將所述重組載體用限制性內(nèi)切酶A酶切，再經(jīng)過(guò)T4DNA聚合酶和與LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)相同的脫氧核糖核苷酸處理得到的LIC3端的粘性末端。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述重組載體的DNA序列如序列表的序列IO所示。10、權(quán)利要求8或9所述方法構(gòu)建得到的hpRNA載體。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于構(gòu)建hpRNA的載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的DNA片段，自上游至下游依次包括啟動(dòng)子、DNA片段A、loop核苷酸序列、DNA片段B、DNA片段C和終止子；DNA片段A依次由LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)，LIC1片段、限制性內(nèi)切酶A識(shí)別位點(diǎn)、與LIC3片段反向互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸組成的片段和LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)組成；DNA片段B依次由LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)、LIC2片段和限制性內(nèi)切酶B識(shí)別位點(diǎn)組成；DNA片段C依次由限制性內(nèi)切酶C識(shí)別位點(diǎn)、與LIC4片段反向互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸組成的片段和LIC處理單核苷酸終止位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)組成。應(yīng)用本發(fā)明的DNA片段構(gòu)建hpRNA載體，只需進(jìn)行一步克隆，大大提升了構(gòu)建的效率，節(jié)約了成本，幾乎100％陽(yáng)性，表現(xiàn)出良好的性能及穩(wěn)定性，可以在順式表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)基因水平中獲得有效轉(zhuǎn)錄后基因沉默。文檔編號(hào)C12N15/63GK101671667SQ20091009302公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2009年9月17日優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日發(fā)明者劉玉樂,胥國(guó)勇,寧隋申請(qǐng)人:清華大學(xué)