專利名稱：產(chǎn)氫工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)氫工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
18世紀(jì)工業(yè)革命以來建立的化石能源體系正面臨著兩大挑戰(zhàn)煤炭、石油、天 然氣等化石燃料的不可再生性；以及石油煉制產(chǎn)業(yè)引起的溫室效應(yīng)、酸雨、粉塵污 染等種種環(huán)境問題。這些都極大的推動(dòng)了風(fēng)能、太陽能、水能、生物質(zhì)能、地?zé)崮?和海洋能等可再生能源產(chǎn)業(yè)的研究和發(fā)展。
生物質(zhì)能一直是人類賴以生存的重要能源，僅次于煤炭、石油和天然氣，居于 世界能源消費(fèi)總量的第四位，在整個(gè)能源系統(tǒng)中占有重要地位。在我國，生物質(zhì)能 占全部能源消耗總量的20%。但長期以來，生物質(zhì)能在我國商業(yè)用能結(jié)構(gòu)中的比率 極小，主要是作為一次性能源在農(nóng)村利用，約占農(nóng)村總能耗的70%左右。以生物質(zhì) 為原料的生物煉制作為一個(gè)相對比較年輕的研究領(lǐng)域，系統(tǒng)的研究和開發(fā)主要是在 歐洲進(jìn)行的；而工業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展則主要是在美國。美國生物質(zhì)技術(shù)顧問委員會(huì)開展 了一個(gè)關(guān)于生物能量、生物燃料和生物產(chǎn)物的長期計(jì)劃和目標(biāo)，基于生物質(zhì)的運(yùn)輸 燃料從2001年占美國燃料消耗的0. 5%將增長到2030年的20%。從2006年1月1 日起，我國開始施行《中華人民共和國可再生能源法》，將大大促進(jìn)可再生能源的 開發(fā)利用，增加能源供應(yīng)，改善能源結(jié)構(gòu)，保障能源安全，保護(hù)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社 會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。在生物煉制中，基于生物原料的燃料包括固體、液體和氣體三種 形式，如生物柴油、乙醇、甲醇、甲烷和氫氣等，是目前世界上被廣泛關(guān)注的幾種 能源形式。
因?yàn)闅錃獗旧頍o毒，燃燒后僅生成水，所以被認(rèn)為是理想的清潔能源。氫氣不 但是一種優(yōu)質(zhì)燃料，還是石油、化工、化肥和冶金工業(yè)的重要原料。所有氣體中， 氫氣最輕，導(dǎo)熱性最好；除核燃料外，氫的發(fā)熱值是所有化石燃料、化工燃料和生 物燃料中最高的；氫可以氣態(tài)、液態(tài)或固態(tài)的金屬氫化物形式出現(xiàn)，能適應(yīng)貯運(yùn)及 各種應(yīng)用環(huán)境的不同要求。通過生命周期分析，在所有燃料中，氫氣有最高的原料 靈活性，來源于可再生生產(chǎn)途徑的氫氣對環(huán)境友好，不涉及溫室氣體排放，最終可 實(shí)現(xiàn)化石能源到可再生能源的平穩(wěn)轉(zhuǎn)換。相對于日益完備的氫能利用的下游體系，氫氣卻沒有在以可再生資源為原料的 生產(chǎn)方面實(shí)現(xiàn)突破。目前，氫氣主要還是來自化石燃料的重整轉(zhuǎn)化(占?xì)錃鈦碓吹?br> 96%)和電解水制氫(占?xì)錃鈦碓吹?%)，這顯然未能擺脫原有的化石能源體系。因此，
如何可持續(xù)地從自然界中獲取氫氣尤其受到人們的關(guān)注。生物制氫是解決這一問題
的重要途徑之一?，F(xiàn)代生物制氫的研究始于20世紀(jì)70年代的能源危機(jī)，到90年 代隨著對溫室效應(yīng)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，生物制氫作為可持續(xù)發(fā)展的工業(yè)技術(shù)再次引起人 們的重視。生物制氫技術(shù)包括光驅(qū)動(dòng)過程和厭氧發(fā)酵兩條路線前者利用光合細(xì)菌 直接將太陽能轉(zhuǎn)化為氫氣，是一個(gè)非常理想的過程，但是由于光利用效率很低，光 反應(yīng)器設(shè)計(jì)困難等因素，近期內(nèi)很難推廣應(yīng)用；而后者采用的是產(chǎn)氫菌厭氧發(fā)酵，
它的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)氫速度快，反應(yīng)器設(shè)計(jì)簡單，且能夠利用可再生資源和廢棄有機(jī)物進(jìn) 行生產(chǎn)，相對于前者更容易在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
發(fā)酵法制氫的研究始于90年代中期，但由于研究小組不多，進(jìn)展并不大。90年 代末到本世紀(jì)初，由于逐步意識(shí)到發(fā)酵制氫具有在近期內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的潛力，在暗 發(fā)酵制氫方面的科研投入也大大增加。大量的微生物具有不同程度的產(chǎn)氫能力，因 此利用發(fā)酵產(chǎn)氫微生物將葡萄糖等生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為氫氣，在技術(shù)本身沒有問題，而一 直困擾其應(yīng)用的是制氫過程經(jīng)濟(jì)性的問題，即如何降低發(fā)酵制氫的成本，使之可以 和化石能源催化重整制氫的經(jīng)濟(jì)性相比擬，或者使之可以與其他生物能源(生物制 甲垸、燃料酒精、生物柴油)相競爭。當(dāng)前的核心問題是如何提高從葡萄糖到氫氣 的轉(zhuǎn)化得率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)氫工程菌及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的產(chǎn)氫工程菌，是在氫氣產(chǎn)生菌中過量表達(dá)與煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸再生相關(guān)的基因和/或敲除氫氣產(chǎn)生菌中消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的代謝路 徑實(shí)現(xiàn)的。
上述工程菌中，所述與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸再生相關(guān)的基因包括甲酸脫氫酶 基因。所述甲酸脫氫酶基因的脫氧核糖核苷酸序列如GenBank AJ011046所示，其 編碼的蛋白的氨基酸序列如GenBank CAA09466所示。
上述工程菌中，所述敲除氫氣產(chǎn)生菌中消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的代謝路徑 是通過敲除氫氣產(chǎn)生菌中的乳酸生成路徑實(shí)現(xiàn)的。所述敲除氫氣產(chǎn)生菌中的乳酸生 成路徑是通過滅活氫氣產(chǎn)生菌中的乳酸脫氫酶實(shí)現(xiàn)的，所述滅活是通過同源重組實(shí)酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的脫氧核糖核 苷酸序列如序列表中序列2所示。
上述工程菌中，所述氫氣產(chǎn)生菌包括兼性厭氧菌和專性厭氧菌，如腸桿菌 (五她ro&a"m'aceae)、 梭菌(C7o欲誠扁)、巨型球菌(Megow/^flera)、 韋榮氏球菌 (Fe/〃o"e〃a)、互養(yǎng)球菌0S^"^op/zococc附)、線形醋菌(Jceto/ /flme"化m)、醋微球菌 ^4ceto附/croZ /w附)、醋弓瓜菌(y4c"/v/6n'o)、 t以桿菌CSac&ro/c/e51)、 |力力樂桿菌 (jPerv/afo6ac&〃'w附)、瘤胃球菌(i wm/"ococcuy)、 真桿菌(五w6flcten'w附)禾口糞球菌 (Co^ococcm)等。具體可為產(chǎn)氣腸桿菌(五.或類腐敗梭菌
(C./ arapwfr折cwm);更具體的可為產(chǎn)氣腸桿菌(￡>7/era6 cter IAM1183 或類腐敗梭菌(C/o^Wwmpara/ "^/ cwm) ATCC17796。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備氫氣的方法。
本發(fā)明所提供的制備氫氣的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)上述工程菌，得到氫氣。
上述方法中，所述工程菌的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為25~50°C，培養(yǎng)時(shí)間為5~40 h，培養(yǎng)基的pH為4.5 9.0?？梢砸云咸烟亲鳛樘荚?。
上述工程菌在制備氫氣中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
就產(chǎn)氫微生物的產(chǎn)氫代謝路徑而言，到目前為止研究比較清楚的有兩大類一 類是以甲酸為前體物質(zhì)，在甲酸裂解產(chǎn)氫酶系(Formate hydrogen lyase)的作用下 產(chǎn)生氫氣(HCOO—+H+—H2+C02);另一類是以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 為前體，以鐵氧還蛋白為介導(dǎo)，在氫酶(Hydrogenase)的作用下生產(chǎn)氫氣 (NADH+H+—NAD++H2)。
由于分子生物學(xué)的發(fā)展，可以通過對代謝途徑進(jìn)行操作，進(jìn)而提高細(xì)胞產(chǎn)氫的 得率。目前研究較多的是甲酸裂解產(chǎn)氫路徑，而較少或者沒有非常有效的對NADH 產(chǎn)氫路徑的研究。
本發(fā)明以兩株典型的產(chǎn)氫細(xì)菌，兼性厭氧革蘭氏陰性產(chǎn)氣腸桿菌(五. IAM1183和專性厭氧革蘭氏陽性類腐敗梭菌(C.，ra戸,ny ci/m) ATCC17796為例， 對上述產(chǎn)氫細(xì)菌的NADH產(chǎn)氫路徑進(jìn)行代謝操作，通過敲除消耗NADH的代謝路 徑和使細(xì)胞產(chǎn)生更多的NADH，從而使細(xì)胞內(nèi)最重要的輔因子之一 NADH重新分 布，進(jìn)而促進(jìn)更多的代謝流進(jìn)入產(chǎn)氫路徑，提高細(xì)胞的氫氣產(chǎn)生率。
培養(yǎng)本發(fā)明的工程菌，可以大大提高氫氣的產(chǎn)生速率，單位體積的氫氣產(chǎn)量是 原始菌的2.2倍，而且消耗單位質(zhì)量葡萄糖的產(chǎn)氫率提高了 86.8%,基本上接近微生物產(chǎn)氫的理論得率。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物 材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
所涉及的分子生物學(xué)操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的標(biāo)準(zhǔn)操作(薩姆布魯 克J,弗里奇EF，曼妮阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)[譯].北京科 學(xué)出版社，1993)。
以下的實(shí)施例是為了便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
下面以典型的兼性厭氧革蘭氏陰性產(chǎn)氣腸桿菌(五wfew6a"w IAM1183和專性厭氧革蘭氏陽性類腐敗梭菌(C/ay&Wwm/ arapM的:/ cwm) ATCC17796 為例，以葡萄糖作為碳源，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的闡述。但并不限制本發(fā) 明。
產(chǎn)氣腸桿菌(五""ra^c^^eragewes) IAM1183，購自日本東京大學(xué)應(yīng)用微生 物研究所菌種庫。產(chǎn)氣腸桿菌(^&^ra6a"w^ragew")為兼性厭氧菌，最適培養(yǎng) 溫度為37"。適合產(chǎn)氣腸桿菌(五"fera6acter^rage"^)生長的培養(yǎng)基組成為葡 萄糖15 g/L、蛋白胨5 g/L、 (NH4)2S04 2 g/L、 KH2P04 14 g/L、 K2HP043H20 6 g/L、 MgSO40.2g/L。培養(yǎng)基的pH為6.0。產(chǎn)氣腸桿菌(￡"fera6fl"er flm ge"^)能夠利 用葡萄糖酸鹽、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-甘露醇、水楊苷、D-阿東 醇、間-肌醇、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、棉籽糖、L-鼠李糖、麥芽糖、D-木糖、海藻 糖、纖維二醇、a-甲基-D-葡萄糖苷、七葉靈、蜜二糖、D-阿拉伯糖醇、粘質(zhì)酸鹽、 D-甘露糖和甘油；也能利用丙二酸鹽、檸檬酸鹽和醋酸鹽作為唯一碳源，并能利用 一定濃度的甲酸。產(chǎn)氣腸桿菌(五Wm 6flctflerage"M)可以在logP值為3.2以上 的溶劑(異辛烷、庚垸、己烷、環(huán)己垸)中生存，還能在汞存在的條件下生存，表 明其具有處理富溶劑廢物的潛力。
類腐敗梭菌(C7a^^^w;wa; ^t cMm) ATCC17796，購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收 藏中心ATCC (American Type Culture Collection)。類腐敗梭菌(C/o^Wmw ;^r印i^訴cww)屬于梭菌類，可以產(chǎn)生孢子，有較好的產(chǎn)氫能力，最適培養(yǎng)溫度為 35 45°C。適合類腐敗梭菌(C/o欣W謂戸ra戸的,訓(xùn))生長的培養(yǎng)基組成為葡 萄糖15.0g/L、胰蛋白胨2.0g/L、酵母提取物4. 5g/L、碳酸鈉4. 0 g/L、半胱氨酸 鹽酸鹽3. 0 g/L。培養(yǎng)基的pH為6.0。類腐敗梭菌(C/o掛Wwm;^ra^fr折cwm)可利用葡萄糖、果糖、半乳糖、糖原、乳糖、麥芽糖、甘露糖、水楊苷、淀粉、蔗糖
和N-乙酰-D-氨基葡萄糖。類腐敗梭菌(C7a^誠Mm/^ra;7Mfr折cMm)還能利用一定 濃度的苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉苷、菊糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、 山梨醇、海藻糖、木糖、乙酸和丁酸。
實(shí)施例l、通過NADH再生調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的NADH水平，以提高細(xì)菌產(chǎn)氫率
NADH產(chǎn)氫路徑是產(chǎn)氣腸桿菌(五wtero&cferaeragwM)重要的產(chǎn)氫路徑之一， 要通過調(diào)控NADH代謝路徑提高細(xì)胞的產(chǎn)氫率，可通過使細(xì)胞產(chǎn)生更多的NADH實(shí) 現(xiàn)。目前最為成功的細(xì)胞內(nèi)部NADH再生系統(tǒng)是利用依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫 氫酶(FDH1)進(jìn)行NADH的再生實(shí)現(xiàn)的(HCOCT+NAD+—NADH+C02) (Riebel B R, Gibbs P R, Wellborn W B, et al. Cofactor regeneration of both NAD+ from NADH and NADP+ from NADPH: NADH oxidase from丄a"06a"〃w sa"戶awc&cem7'51. Adv Synth Catal， 2003， 345)。
以質(zhì)粒pMAL-c2X (購自NEB公司，編號(hào)為N8076)為模板，以P1F和P1R為引物 (具體的引物序列見表l)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到pMAL-c2X上除去氨芐青霉素抗性 (」m/7)的核苷酸序列。具體的PCR反應(yīng)條件為先94"C預(yù)變性5min;然后94。C lmin， 60°C 3min， 72°C 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5 min， 4。C保存。將PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物用XhoI和KpnI進(jìn)行雙酶切，回收5.9kbp的片段，得到產(chǎn)物I。
以質(zhì)粒pACYC184 (購自NEB公司，編號(hào)為E4152S)為模板，以P2F和P2R為引 物(具體的引物序列見表l)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到氯霉素(Cm)的核苷酸序列。 具體的PCR反應(yīng)條件為先94t:預(yù)變性5min;然后94。C lmin， 58°C 1.5min， 72°C 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5min， 4"C保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至l」pMD-18T simple載體上，將連接產(chǎn)物用KpnI和XhoI進(jìn)行雙酶切，回收1.3kbp的片段，得到產(chǎn) 物II。
將產(chǎn)物I和產(chǎn)物II相連接，得到質(zhì)粒pMCL。
依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶(FDH1)的編碼基因(/J/z"主要存在于酵 母細(xì)胞中。提取博伊丁假絲酵母(Ow^^幻^m7)(購自中國工業(yè)微生物菌種保 藏管理中心，編號(hào)為CICC1950)的基因組DNA并以其為模板，以P3F和P3R為 引物(具體的引物序列見表l)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到甲酸脫氫酶編碼基因/JA7。 /"W的脫氧核糖核苷酸序列如GenBank AJ011046所示，其編碼的蛋白的氨基酸序 列如GenBank CAA09466所示。表1質(zhì)粒構(gòu)建需要的引物
名稱用途引物序列(5'—3')酶切位點(diǎn)
P1F去除pMAL-c2X 序列CATCCTCGAGACCAAGTTTACTCATATAXhol
P1R去除pMAL-c2X 序列TAGGTACCATGAGCGGATACATATTTKpnl
P2F復(fù)制pACYC184 Cw序列CGGGGTACCAGGAGGGACAGCTGATAGAAAKpnl
P2R復(fù)制pACYC184 Cw序列CCGCTCGAGGCTGCTGGCTACCCTGXhol
P3F復(fù)制C. 6oW!'w7的/說/序列CGGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTCTTABamHI
P3R復(fù)制C. 6oW"http://的/^/序列AACTGCAGTTATTTCTTATCGTGTTTACCGTAAGCPstl
表1中，下劃線部分代表酶切位點(diǎn)。
將擴(kuò)增得到的甲酸脫氫酶編碼基因/W/用BamHI和Pstl進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn) 物與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒pMCL相連接，得到重組質(zhì)粒pMCL:/^W。將重組質(zhì)粒 pMCL/W/電導(dǎo)入到產(chǎn)氣腸桿菌(f"fero6acferflerage"M) IAM1183中，將得到的 重組產(chǎn)氣腸桿菌命名為IAM1183-1。
產(chǎn)氣腸桿菌的培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、 (NH4)2S042g/L、 KH2P0414g/L、 K2HP043H20 6 g/L、 MgSO40.2g/L。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.0。
在上述培養(yǎng)基中接入活化后的重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-1，使培養(yǎng)基中重組產(chǎn) 氣腸桿菌IAM1183-1的初始含量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養(yǎng)15h。同時(shí) 以出發(fā)菌產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183作為對照。用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)氣腸桿菌中/J/z/基因的 表達(dá)，通過依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶FDH1的過量表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)部引入 NADH再生路徑。
培養(yǎng)過程中采用厭氧條件，通過氮?dú)獯祾叩姆绞饺コ諝庵械难鯕狻Ｊ占a(chǎn)生 的氣體，培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)算生成的氫氣總量，同時(shí)檢測培養(yǎng)基中剩余的葡萄糖含量。 氫氣的測量采用氣相色譜法(上海精密科學(xué)儀器有限公司GC112A型號(hào)氣相色譜儀； TCD檢測器；TDX-01不銹鋼填充柱；進(jìn)樣器、檢測器和柱箱溫度分別為12(TC、 120'C和8(TC;以氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為10ml/min)。葡萄糖的測定采用常規(guī)的3,5-二硝基水楊酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31(3):426-428)。
試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。結(jié)果表明，培養(yǎng)結(jié)束后， 出發(fā)菌株產(chǎn)氣腸桿菌(五"fera^"waerage"^) IAM1183每利用1摩爾葡萄糖可以 產(chǎn)生0.911士0. 144摩爾(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)氫氣。通過將重組質(zhì)粒pMCL-々/W導(dǎo) 入到產(chǎn)氣腸桿菌(五"&ro6acto"fleroge"w) IAM1183中得到的重組菌IAM1183-1 ，由于過量表達(dá)依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶FDH1而引入NADH再生路徑，因 此，每利用1摩爾葡萄糖可以產(chǎn)生1.488士0.026摩爾(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)氫氣，氫 氣的得率增加了 63.3%。
實(shí)施例2、通過NADH再生調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的NADH水平，以提高細(xì)菌產(chǎn)氫率
NADH產(chǎn)氫路徑是類腐敗梭菌(C/o^Www/ ara;^ny cMm)重要的產(chǎn)氫路徑， 要通過調(diào)控NADH代謝路徑提高細(xì)胞的產(chǎn)氫率，可通過使細(xì)胞產(chǎn)生更多的NADH實(shí) 現(xiàn)。目前最為成功的細(xì)胞內(nèi)部NADH再生系統(tǒng)是利用依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫 氫酶(FDH1)進(jìn)行NADH的再生實(shí)現(xiàn)的(HCOCT+NAD+—NADH+C02) (Riebel B R， Gibbs P R, Wellborn W B, et al. Cofactor regeneration of both NAD+ from NADH and NADP+ from NADPH: NADH oxidase from Z^"o6a".〃ws sa"戶awc/sce服'51. Adv Synth Catal, 2003, 345)。
以質(zhì)粒pMAL-c2X (購自NEB公司，編號(hào)為N8076)為模板，以P4F和P4R為引物 (具體的引物序列見表2)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到pMAL-c2X上除去氨節(jié)青霉素抗性 G4m/ )的核苷酸序列。具體的PCR反應(yīng)條件為先94"預(yù)變性5min;然后94。C lmin， 60°C3min， 72°C 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5 min， 4。C保存。將PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物用XhoI和KpnI進(jìn)行雙酶切，回收5.7kbp的片段，得到產(chǎn)物III。
以質(zhì)粒pET-28a(+)(購自Novagen公司，編號(hào)為69337-3)為模板，以P5F和P5R 為引物(具體的引物序列見表2)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到卡那霉素(《m)的核苷酸 序列。具體的PCR反應(yīng)條件為先94'C預(yù)變性5min;然后94。C lmin， 58°C 1.5min， 72。Clmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5 min， 4。C保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到 pMD-18Tsimple載體上，將連接產(chǎn)物用KpnI和XhoI進(jìn)行雙酶切，回收1.5kbp的片段， 得到產(chǎn)物IV。
將產(chǎn)物III和產(chǎn)物IV相連接，得到質(zhì)粒pMKL。
依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶(FDH1)的編碼基因(/t/W)主要存在于酵 母細(xì)胞中。提取博伊丁假絲酵母(Ca^fcfo6o^m7)(購自中國工業(yè)微生物菌種保 藏管理中心，編號(hào)為CICC1950)的基因組DNA并以其為模板，以P6F和P6R為 引物(具體的引物序列見表2)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到甲酸脫氫酶編碼基因/c/W。 /函/的脫氧核糖核苷酸序列如GenBank AJ011046所示，其編碼的蛋白的氨基酸序 列如GenBank CAA09466所示。
_表2質(zhì)粒構(gòu)建需要的引物_
名稱 用途 引物序列(5'—3，) 酶切位點(diǎn)P4F去除pMAL-c2X ^wp序列CATCCTCGAGACCAAGTTTACTCATATAXhol
P4R去除pMAL-c2X 序列TAGGTACCATGAGCGGATACATATTTKpnl
P5F復(fù)制pET-28a(+) Kot序列TACGGTACCAAGCTGGGCTGTGTGCAKpnl
P5R復(fù)制pET-28a(+) Xw序列AGCACTCGAGAACAACACTCAACCCTATCXhol
P6F復(fù)制C. ZwW/w7的/c/W序列CGGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTCTTABamffl
P6R復(fù)制C. 6ozWw'/的/c W序列AACTGCAGTTATTTCTTATCGTGTTTACCGTAAGCPstl
表2中，下劃線部分代表酶切位點(diǎn)。
將擴(kuò)增得到的甲酸脫氫酶編碼基因/"W用BamHI和Pstl進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn) 物與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒pMKL相連接，得到重組質(zhì)粒pMKL-^W。將重組質(zhì)粒 pMKL-/dW電導(dǎo)入到類腐敗梭菌(C/a^Wwm/wra; w^/ cMw) ATCC17796中，將得 到的重組類腐敗梭菌命名為ATCC17796-1。
類腐敗梭菌的培養(yǎng)基組成為葡萄糖15.0g/L、胰蛋白胨2.0g/L、酵母提取物 4.5g/L、碳酸鈉4.0g/L、半胱氨酸鹽酸鹽3.0g/L。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.0。
在上述培養(yǎng)基中接入活化后的重組類腐敗梭菌ATCC17796-1，使培養(yǎng)基中重組 類腐敗梭菌ATCC17796-1的初始含量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養(yǎng)15h。同 時(shí)以出發(fā)菌類腐敗梭菌ATCC17796作為對照。用正辛垸誘導(dǎo)類腐敗梭菌中基因 的表達(dá)，通過依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶FDH1的過量表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)部引 入NADH再生路徑。
培養(yǎng)過程中采用厭氧條件，通過氮?dú)獯祾叩姆绞饺コ諝庵械难鯕狻Ｊ占a(chǎn)生 的氣體，培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)算生成的氫氣總量，同時(shí)檢測培養(yǎng)基中剩余的葡萄糖含量。 氫氣的測量采用氣相色譜法(上海精密科學(xué)儀器有限公司GC112A型號(hào)氣相色譜儀； TCD檢測器；TDX-01不銹鋼填充柱；進(jìn)樣器、檢測器和柱箱溫度分別為120°C、 12(TC和80°C;以氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為10ml/min)。葡萄糖的測定采用常規(guī)的3,5-二硝基水楊酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31(3》426-428)。
試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。結(jié)果表明，培養(yǎng)結(jié)束后， 出發(fā)菌株類腐敗梭菌(C/o^^/Mm/ ara/7"fr訴cww) ATCC17796每利用1摩爾葡萄糖 可以產(chǎn)生1.115±0. 021摩爾(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)氫氣。通過將重組質(zhì)粒pComlO-》/W 導(dǎo)入到類腐敗梭菌(C/a^rWMm;7"ra/^n:/ c"m) ATCC17796中得到的重組菌 ATCC17796-1，由于過量表達(dá)依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶FDHl而引入NADH 再生路徑，因此，每利用1摩爾葡萄糖可以產(chǎn)生1.390士0.037摩爾(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)氫氣，氫氣的得率增加了24.6%。
實(shí)施例3、通過敲除消耗NADH最多的乳酸路徑調(diào)控胞內(nèi)NADH水平，以提
高細(xì)菌產(chǎn)氫率
NADH產(chǎn)氫路徑是產(chǎn)氣腸桿菌(五"/ero6a"eraerage"M)重要的產(chǎn)氫路徑之一， 要通過調(diào)控NADH代謝路徑提高細(xì)胞的產(chǎn)氫率，可以通過調(diào)控細(xì)胞代謝使更多的 NADH流向氫氣生成路徑。在細(xì)胞有機(jī)物生成代謝中，消耗NADH的路徑有乳酸 生成路徑、乙醇生成路徑、琥珀酸生成路徑、2,3-丁二醇生成路徑。其中，乳酸生 成路徑在細(xì)胞有機(jī)代物謝物中所占的比重最大，乳酸是細(xì)胞厭氧代謝的主要產(chǎn)物之 一，消耗最多的NADH?？梢酝ㄟ^敲除乳酸生成路徑，將更多的NADH流向其他 代謝路徑(包括氫氣產(chǎn)生路徑)，從而提高氫氣的產(chǎn)率。
通過自殺載體pGP704 (自殺載體pGP704的構(gòu)建過程見參考文獻(xiàn)Kolter， R. Inuzuka, M. and Helinski, D. (1978). Cell 15: 1199-1208; Miller, V. and Mekalanos, J. (1988). J. Bact. 170:2575-2583.清華大學(xué))，利用同源重組，敲除掉產(chǎn)氣腸桿菌
(Ew/era6""er^rage"^) IAM1183中的乳酸脫氫酶編碼基因，從而得到乳酸生成 路徑敲除的重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-zy^ (H)。
為了鑒定重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-A/W (H)中自殺載體pGP704是否與染色 體上的乳酸脫氫酶編碼基因發(fā)生了同源重組，提取重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-zAW/z (H)的基因組DNA并以其為模板，根據(jù)自殺載體pGP704設(shè)計(jì)引物P7F (5' -CAT GCGCTCCATCAAGAAGA-3')禾口P7R(5' -GTGGGTCTCGCGGTATCATT-3'); 并根據(jù)乳酸脫氫酶基因設(shè)計(jì)引物P8F (5' -CGGAATTCCCCCGCTTACCAGCGTAC CC-3')禾口P8R (5' -CGGAATTCGTCAGGAATGCCTGATGCCC-3');禾U用弓I 物P7F和P8F、 P7R和P8R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，獲得了一個(gè)1.5kb p和4.0kbp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，因此確定得到的重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-A/ W (H)中的自殺載體pGP704與染色體上的乳酸脫氫酶編碼基因發(fā)生了同源重組。 重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-zAWA (H)中被敲除的乳酸脫氫酶的氨基酸序列如序列表 中序列1所示，其編碼基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。
產(chǎn)氣腸桿菌的培養(yǎng)基組成為葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、 (NH4)2S042g/L、 KH2P04 14 g/L、 K2HP043H20 6 g/L、 MgS04 0.2 g/L。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.0。
在上述培養(yǎng)基中接入活化后的重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-AW/z (H)，使培養(yǎng) 基中重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-AW/z(H)的初始含量為5X 108CFU/ml， 37°C 、 170rpm培養(yǎng)15h。同時(shí)以出發(fā)菌產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183作為對照。
培養(yǎng)過程中采用厭氧條件，通過氮?dú)獯祾叩姆绞饺コ諝庵械难鯕?。收集產(chǎn)生 的氣體，培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)算生成的氫氣總量，同時(shí)檢測培養(yǎng)基中剩余的葡萄糖含量。 氫氣的測量采用氣相色譜法(上海精密科學(xué)儀器有限公司GC112A型號(hào)氣相色譜儀; TCD檢測器；TDX-01不銹鋼填充柱；進(jìn)樣器、檢測器和柱箱溫度分別為120°C、 12(TC和8(TC;以氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為10ml/min)。葡萄糖的測定釆用常規(guī)的3,5-二硝基水楊酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31 。》426-428 )。
試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。結(jié)果表明，培養(yǎng)結(jié)束后， 出發(fā)菌株產(chǎn)氣腸桿菌(五wfera6ac^aeragew^) IAM1183每利用1摩爾葡萄糖可以 產(chǎn)生0.911土0. 144摩爾(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)氫氣。將乳酸生成路徑敲除后得到的重 組菌IAM1183-AW/z (H)每利用1摩爾葡萄糖可以產(chǎn)生1.015士0.013摩爾(平均 值士標(biāo)準(zhǔn)差)氫氣，氫氣的得率增加了 11.4%;并且乳酸生成路徑的敲除，使得重 組菌IAM1183-Z!W/z (H)的葡萄糖消耗率由出發(fā)菌株產(chǎn)氣腸桿菌(五"/m^acfer aerage"^) IAM1183的56.4%增加到98.3%，大大加強(qiáng)了對葡萄糖的利用，原始菌 株每升培養(yǎng)基的產(chǎn)氫量為0.938±0.013升氫氣，重組菌株IAM1183-zy^z (H)每 升培養(yǎng)基的產(chǎn)氫量為2.038±0.024升氫氣，單位體積的氫氣產(chǎn)量是出發(fā)菌株的2.2 倍。
實(shí)施例4、通過敲除消耗NADH最多的乳酸路徑結(jié)合NADH再生調(diào)控細(xì)胞內(nèi) 的NADH水平，以提高細(xì)菌產(chǎn)氫率
NADH產(chǎn)氫路徑是產(chǎn)氣腸桿菌(^&7tero6ac^"fleragewe5)重要的產(chǎn)氫路徑之一， 要通過調(diào)控NADH代謝路徑提高細(xì)胞的產(chǎn)氫率，可以通過調(diào)控細(xì)胞代謝使更多的 NADH流向氫氣生成路徑。在細(xì)胞有機(jī)物生成代謝中，消耗NADH的路徑有乳酸生 成路徑、乙醇生成路徑、琥珀酸生成路徑、2,3-丁二醇生成路徑。其中，乳酸生成 路徑在細(xì)胞有機(jī)代物謝物中所占的比重最大，乳酸是細(xì)胞厭氧代謝的主要產(chǎn)物之 一，消耗最多的NADH?？梢酝ㄟ^敲除乳酸生成路徑，將更多的NADH流向其他代 謝路徑(包括氫氣產(chǎn)生路徑)，從而提高氫氣的產(chǎn)率。在此基礎(chǔ)上，在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn) 一步引入NADH再生路徑，使細(xì)胞產(chǎn)生更多的NADH，以進(jìn)一步提高氫氣的產(chǎn)率。 目前最為成功的細(xì)胞內(nèi)部NADH再生系統(tǒng)是利用依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶 (FDH1)進(jìn)行NADH的再生實(shí)現(xiàn)的(HCOCT+NAD+—NADH+C02) (Riebel B R,Gibbs P R, Wellborn W B, et al. Cofactor regeneration of both NAD from NADH and NADP+ from NADPH: NADH oxidase from Z^"oZja"7/w sa"戶朋c&ce腦i. Adv Synth Catal, 2003, 345)。
依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶(FDH1)的編碼基因(/^W)主要存在于酵 母細(xì)胞中。提取博伊丁假絲酵母(Caw^^6oW/m7)(購自中國工業(yè)微生物菌種保 藏管理中心，編號(hào)為CICC1950)的基因組DNA并以其為模板，以P6F和P6R為 引物(具體的引物序列見表2)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到甲酸脫氫酶編碼基因y^w。
的脫氧核糖核苷酸序列如GenBank AJ011046所示，其編碼的蛋白的氨基酸序 列如GenBank CAA09466所示0
將擴(kuò)增得到的甲酸脫氫酶編碼基因/"W用BamHI和Pstl進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn) 物與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒pMKL相連接，得到重組質(zhì)粒pMKL-y^/。將重組質(zhì)粒 pMKL-y說7電導(dǎo)入到上述實(shí)施例3獲得的重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-AW/z (H)中， 將得到的重組產(chǎn)氣腸桿菌命名為IAM1183-zy^7 (H) -1。
產(chǎn)氣腸桿菌的培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 g/L、蛋白胨5 g/L、 (NH4)2S04 2 g/L、 KH2P0414g/L、 K2HP043H20 6 g/L、 MgSO40.2g/L。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.0。
在上述培養(yǎng)基中接入活化后的重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-A/W (H) -1，使培 養(yǎng)基中重組產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183-ZW^ (H) -1的初始含量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養(yǎng)15h。同時(shí)以出發(fā)菌產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183作為對照。用正辛烷誘導(dǎo)產(chǎn) 氣腸桿菌中/"W基因的表達(dá)，通過依賴于甲酸和NAD+的甲酸脫氫酶FDH1的過量 表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)部引入NADH再生路徑。
培養(yǎng)過程中采用厭氧條件，通過氮?dú)獯祾叩姆绞饺コ諝庵械难鯕?。收集產(chǎn)生 的氣體，培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)算生成的氫氣總量，同時(shí)檢測培養(yǎng)基中剩余的葡萄糖含量。 氫氣的測量采用氣相色譜法(上海精密科學(xué)儀器有限公司GC112A型號(hào)氣相色譜儀； TCD檢測器；TDX-01不銹鋼填充柱；進(jìn)樣器、檢測器和柱箱溫度分別為12(TC、 12(TC和80°C;以氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為10ml/min)。葡萄糖的測定采用常規(guī)的3,5-二硝基水楊酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31(3):426-428 )。
試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。結(jié)果表明，培養(yǎng)結(jié)束后， 出發(fā)菌株產(chǎn)氣腸桿菌(五"fera^"wflerage"^) IAM1183每利用1摩爾葡萄糖可以 產(chǎn)生0.911士0. 144摩爾(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)氫氣。在乳酸生成路徑敲除后得到的重組菌IAM1183-Z\W/z (H)內(nèi)引入NADH再生路徑得到的重組菌IAM1183-^W/KH) -1，每利用1摩爾葡萄糖可以產(chǎn)生1.702土0.026摩爾(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)氫氣，比 出發(fā)菌株產(chǎn)氣腸桿菌(」&2tera6ac&raerage"^) IAM1183增加了 86.8%。序列表
<110〉清華大學(xué)
<120〉產(chǎn)氫工程菌及其應(yīng)用
<130> CGGNARZ92370
〈160〉 2
〈210〉 1 <211〉 329 <212〉 PRT
〈213〉 產(chǎn)氣腸桿菌aarag朋e5") 〈400〉 1
Met Lys lie Ala Val Tyr Ser Thr Lys Gin Tyr Asp Lys Lys Tyr Leu 15 10 15
Gin His Val Asn Asp Thr Tyr Gly Phe Glu Leu Glu Phe Phe Asp Phe 20 25 30
Leu Leu Thr Glu Lys Thr Ala Lys Thr Ala Asn Gly Cys Glu Ala Val 35 40 45
Cys lie Phe Val Asn Asp Asp Gly Ser Arg Pro Val Leu Glu Glu Leu 50 55 60Lys Ala Tyr Gly Val Lys Tyr lie Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn 65 70 75 80
Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Lys Glu Leu Gly Leu Arg Val Val Arg 85 90 95
Val Pro Ala Tyr Ser Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Val Gly Met 100 105 110
Met Met Ser Leu Asn Arg Arg lie His Arg Ala Tyr Gin Arg Thr Arg 115 120 125
Asp Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Thr Gly Phe Thr Met His Gly 130 135 140
Lys Thr Ala Gly Val lie Gly Thr Gly Lys lie Gly Val Ala Thr Leu 145 150 155 160
Arg lie Leu Lys Gly Phe Gly Met Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Tyr 165 170 175
Pro Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Gly Val Glu Tyr Val Asp Leu Pro 180 185 190Thr Leu Tyr Ala Gin Ser Asp Val lie Ser Leu His Cys Pro Leu Thr 195 200 205
Glu Glu Asn Tyr His Leu Leu Asn His Ala Ala Phe Glu Gin Met Lys 210 215 220
Asp Gly Val Met Val lie Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu lie Asp Ser 225 230 235 240
Gin Ala Ala lie Asp Ala Leu Lys His Gin Lys lie Gly Ala Leu Gly 245 250 255
Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Arg Asp Leu Phe Phe Glu Asp Lys Ser 260 265 270
Asn Asp Val lie Gin Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala Cys His 275 280 285
Asn Val Leu Phe Thr Gly His Gin Ala Phe Leu Thr Ala Glu Ala Leu 290 295 300lie Ser lie Ser Gin Thr Thr Leu Asp Asn Leu Arg Gin Val Asp Ala 305 310 315 320
Gly Glu Thr Cys Pro Asn Ala lie Val 325
〈210〉 2 <211〉 990 <212〉 腿
〈213〉 產(chǎn)氣腸桿菌3e/Y^e77es) <400〉 2
atgaaaatcg ccgtttatag tacgaagcag tacgataaaa agtaccttca gcatgttaat 60 gatacatatg gctttgaact cgaatttttc gacttcctgt taaccgaaaa aaccgcgaaa 120 acggccaacg gctgtgaagc cgtgtgcata tttgtcaacg atgacggcag ccgtccggtg 180 ctggaagagc tg肌agcata cggggtgaag tacatcgccc tgcgctgcgc cgggtttaac 240 aacgtcgatc tggatgcggc aaaagagctg ggtctgcgcg ttgtccgcgt tcccgcctat 300 tcgccggaag ccgtggctga acatgccgtc ggcatgatga tgtcgttgaa ccgccgcatc 360 caccgcgctt accagcgtac ccgcgatgct aacttctcgc tggaaggctt aaccggcttt 420 accatgcacg gta肌accgc cggggtgatc gggaccggca aaatcggcgt cgccacgctg 480 cgtattctga aagggtttgg catgcgcctg ctggcgttcg atccctatcc aagcgccgca 540gcgctggatc tcggcgtcga gtatgttgat ttgccgacgc tgtatgcaca gtccgatgtg 600
atctccctgc actgtccgct gacggaagag aactaccatc tgctgaatca tgcggcgttt 660
gagcaaatga aagacggcgt gatggtgatc aacaccagcc gcggggcgct gattgattct 720
caggcggcga tcgatgcgct gaaacaccag aaaatcgggg cgctgggcat ggacgtgtat 780
gagaacgaac gcgacctgtt cttcgaagat aagtccaatg acgtgattca ggatgacgtc 840
ttccgtcgcc tgtctgcctg tcataacgtg ttgttcaccg ggcatcaggc tttcctgacc 900
gccgaagcgc tgatcagcat ttcacaaacg accctggata acctgcgcca ggtcgatgct 960
ggcgaaacct gtccgaacgc catcgtctaa 990
權(quán)利要求
1、產(chǎn)氫工程菌，是在氫氣產(chǎn)生菌中過量表達(dá)與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸再生相關(guān)的基因和/或敲除氫氣產(chǎn)生菌中消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的代謝路徑得到的重組菌。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于所述與煙酰胺腺嘌呤二核苷 酸再生相關(guān)的基因?yàn)榧姿崦摎涿富颉?br> 3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于所述甲酸脫氫酶基因的脫氧 核糖核苷酸序列如GenBank AJ011046所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如GenBank CAA09466所示。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的工程菌，其特征在于所述敲除氫氣產(chǎn)生菌 中消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的代謝路徑是通過敲除氫氣產(chǎn)生菌中的乳酸生成路 徑實(shí)現(xiàn)的。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的工程菌，其特征在于所述敲除氫氣產(chǎn)生菌中的乳 酸生成路徑是通過滅活氫氣產(chǎn)生菌中的乳酸脫氫酶實(shí)現(xiàn)的，所述滅活是通過同源重 組實(shí)現(xiàn)的。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于所述乳酸脫氫酶的氨基酸序 列如序列表中序列1所示，其編碼基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所 示。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的工程菌，其特征在于所述氫氣產(chǎn)生菌為 下述細(xì)菌中的任意一種腸桿菌(五"ferak "en力ceae)、梭菌(C/oWrWww)、巨型球 菌(她g，/zaera)、韋榮氏球菌(Fe,〃o"e〃fl)、互養(yǎng)球菌(5y"frop/zococc—、線形酉昔 菌(y4cWq/ /awe"&m)、酉昔3斂球菌(Jcetom/cro6/w附)、酉昔弧菌(yicC/v/6r/o)、擬桿菌 (5fl!"e/"o/(ie力、閃爍桿菌(T^rv油6(7"eW廳)、瘤胃球菌(7 mw/"ococcws)、 真桿菌 CEw6acten'wm)禾口糞球菌(Copracoccws)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的工程菌，其特征在于所述氫氣產(chǎn)生菌為腸桿菌 (￡>zfero6"c/en'aceae)，所述腸桿菌(^V teroZ "cte廠/flceae)為產(chǎn)氣腸桿菌(五."en9ge"es)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的工程菌，其特征在于所述氫氣產(chǎn)生菌為梭菌 (C7tw^/t//wm)， 所述梭菌(C7a^n'tZ/ww)為類腐敗梭菌(G;7fln3pM^7y cwm)。
10、 權(quán)利要求1-9中任一所述的工程菌在制備氫氣中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)氫工程菌。該工程菌是在氫氣產(chǎn)生菌中過量表達(dá)與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)再生相關(guān)的基因和/或敲除氫氣產(chǎn)生菌中消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的代謝路徑實(shí)現(xiàn)的。通過對產(chǎn)氫細(xì)菌的NADH產(chǎn)氫路徑進(jìn)行代謝操作，敲除消耗NADH的代謝路徑和使細(xì)胞產(chǎn)生更多的NADH，從而使細(xì)胞內(nèi)最重要的輔因子之一NADH重新分布，進(jìn)而促進(jìn)更多的代謝流進(jìn)入產(chǎn)氫路徑，提高細(xì)胞的氫氣產(chǎn)生率。培養(yǎng)本發(fā)明的工程菌，可以大大提高氫氣的產(chǎn)生速率，單位體積的氫氣產(chǎn)量是原始菌的2.2倍，而且消耗單位質(zhì)量的葡萄糖的產(chǎn)氫率提高了86.8％，基本上接近微生物產(chǎn)氫的理論得率。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101613671SQ20091008834
公開日2009年12月30日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者元 盧, 希 吳, 翀 張, 來奇恒, 邢新會(huì) 申請人:清華大學(xué)