專(zhuān)利名稱(chēng)：一種合浦珠母貝組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體地說(shuō)是一種珍珠貝…合浦珠母貝的組織細(xì)胞的體外 培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
合浦珠母貝(戶(hù)/"cto^r/wcatoMartenssi)，又稱(chēng)馬氏珠母貝，屬于軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)， 瓣鰓綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，珍珠貝科(Pteriidae)，珠母貝屬(Pinctada)，主 要分布在口本和我國(guó)南海，是目前世界上用于海水珍珠生產(chǎn)的主要貝類(lèi)，其育珠產(chǎn)量占世界 海水珍珠產(chǎn)量的85%以上，也是我國(guó)主要的海水珍珠養(yǎng)殖貝。但是，隨著貝殼養(yǎng)殖歷史的延 長(zhǎng)和高密度、集約化、工廠化生產(chǎn)的發(fā)展，以及養(yǎng)殖條件環(huán)境的日益惡化，養(yǎng)殖病害已成為 全世界，特別是我國(guó)海洋貝類(lèi)生殖生產(chǎn)發(fā)展的重要制約因素。近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)殖的合浦珠母 貝等重要經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)發(fā)生大規(guī)模的爆發(fā)性死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究合浦珠母貝的組織 培養(yǎng)對(duì)于珍珠貝類(lèi)的疾病控制、改進(jìn)珠母貝的插核技術(shù)、提高珍珠的產(chǎn)量和質(zhì)量有重要意義。
由于無(wú)脊椎動(dòng)物培養(yǎng)條件與哺乳動(dòng)物有較大差異，所以組織細(xì)胞培養(yǎng)較之哺乳動(dòng)物難度 大。 一方面，合浦珠母貝組織表面有大量的細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等，組織培養(yǎng)過(guò)程中極易 造成污染；另一方面，現(xiàn)有的珍珠貝組織培養(yǎng)技術(shù)，存在細(xì)胞貼壁效果差、生K:緩慢、遷出 數(shù)量較少等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種適合海洋珍珠貝類(lèi)的合浦珠母貝組織培養(yǎng)的方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采取的方案包括如下步驟
(1) 組織塊取材取合浦珠母貝，用吸水紙將貝殼表面吸干，用醫(yī)用酒精擦拭貝殼表面 消毒，剪去閉殼肌側(cè)的貝殼邊緣，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將閉殼肌割開(kāi)，取目的組織，將取出的組 織浸潤(rùn)在組織平衡鹽溶液中；
(2) 消毒和清洗用紙片將組織表面的粘液沾去，將組織放入組織消毒液中浸泡，期間 搖動(dòng)，再將組織轉(zhuǎn)移到組織平衡鹽溶液中，換液，清洗組織表面粘液以及殘余的抗生素；
(3) 組織培養(yǎng)將絢織塊剪成小塊，置于預(yù)先鋪有鼠尾膠原的組織培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng) 基，培養(yǎng)72h后，吸棄0.5ml培養(yǎng)液，補(bǔ)加2ml新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
在上述的培養(yǎng)方法，歩驟(1)所述組織平衡鹽溶液，其配方是NaCl 26.22 g/L,KCl 1.08 g/L， MgS04 2.94 g/L， MgCl2 2.0 g/L, CaCl2 0.664 g/L, NaHC03 0.3 gZL， NaII2P04 0.044g/L， glucose 0.30 mg/ml， MilliQ水，pH為7.2-7.4，無(wú)菌濾膜過(guò)濾后使用。在上述的培養(yǎng)方法，步驟(2)所述消毒液，其配方是青霉素100萬(wàn)IU/L，鏈霉素1 g/L, 慶大霉素80萬(wàn)IU/L,甲硝唑15mg/L，制霉菌素2 mg/L溶解于組織平衡鹽溶液中，無(wú)菌濾 膜過(guò)濾后。
在上述的培養(yǎng)方法，步驟(3)所述培養(yǎng)基，其配方是199培養(yǎng)基(Medium 199)和 L-15培養(yǎng)基(Leibovitz-15 medium)粉末分別溶于500 ml滅過(guò)菌的MilliQ水中，室溫?cái)嚢柚?完全溶解，再將兩種培養(yǎng)基l: 1混合，加入10.22 g/L NaCl， 40昭/ml抗壞血酸維生素C, 128.9 (ig/ml?；撬?，10 pg/ml ATP, 400嗎/ml乳蛋白水解物，67 mg/ml HEPES，再加入以下抗 生素100IU/ml青霉素，100嗎/ml鏈霉素，50嗎/ml卡那霉素和1嗎/ml制霉菌素，攪拌， pH調(diào)至7.0，無(wú)菌條件下過(guò)濾，加入10%胎牛血清和10%雞胚浸液。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1. 適用范圍廣，易于操作適用于合浦珠母貝的外套膜、內(nèi)臟、心肌、腮等各個(gè)組織。 設(shè)備要求簡(jiǎn)單，在一般的無(wú)菌培養(yǎng)室內(nèi)就可以完成。
2. 滅菌效果較佳，能在一定限度內(nèi)保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷，又能達(dá)到比較理想的滅菌效
果由于珠母貝的組織上附生的細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物較多。本發(fā)明的消毒液的消毒滅菌效
果佳，有效降低了組織塊染菌的可能性。
3. 組織塊培養(yǎng)過(guò)程中貼壁效果很好，細(xì)胞遷出旺盛本方法培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)后既有細(xì)胞從
組織塊中遷出，培養(yǎng)2天后就能形成致密的單層細(xì)胞。
4. 體外存活期較長(zhǎng) 一般在不斷補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基的條件下，組織塊在90天后仍有細(xì)胞遷出。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩詳細(xì)說(shuō)明。
(1) 組織塊取材取合浦珠母貝，用吸水紙將貝殼表面吸千，用醫(yī)用酒精擦拭貝殼衷面
消毒，剪去閉殼肌側(cè)的貝殼邊緣。在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用手術(shù)刀伸進(jìn)貝休內(nèi)將閉殼肌割開(kāi)，取目 的組織。在收集足夠多的組織之前，將取出的組織浸潤(rùn)在組織平衡鹽溶液中。
(2) 消毒和清洗用滅菌濾紙片將組織表面的粘液沾去。將組織放入組織消毒液中浸泡
20 min，間斷地?fù)u動(dòng)，再將組織轉(zhuǎn)移到組織平衡鹽溶液中，換液8次，淸洗組織表面粘液以 及殘余的抗生素。
(3) 組織培養(yǎng)用眼科剪將組織塊剪成l-2cmS的小塊，置于預(yù)先鋪有鼠尾膠原的組織 培養(yǎng)皿中，室溫放置15-20 min后，讓組織塊貼附在皿底。加入1.5 ml的培養(yǎng)基，24'C靜置 培養(yǎng)，不補(bǔ)充C02。 72h后，吸棄0.5ml培養(yǎng)液，補(bǔ)加2ml新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
上述操作均在超凈間內(nèi)的超凈臺(tái)內(nèi)完成。歩驟(1)所述組織平衡鹽溶液，其配方是 NaCl 26.22 g/L, KC1 1.08 g/L, MgS04 2.94 g/L， MgCl2 2.0 g/L, CaCl2 0.664 g/L, NaHC03 0.3 g/L, NaH2P04 0.044g/L， glucose 0.30 mg/ml, MilliQ水，pH為7.2-7.4，無(wú)菌濾膜過(guò)濾后使用。
4步驟(2)所述消毒液，其配方是青霉素100萬(wàn)IU/L，鏈霉素l g/L，慶大霉素80萬(wàn) IU/L，甲硝唑15mg/L，制霉菌素2mg/L溶解于組織平衡鹽溶液中，無(wú)菌濾膜過(guò)濾。
步驟(3)所述培養(yǎng)基，其配方是199培養(yǎng)基(Medium 199)和L-15培養(yǎng)基(Leibovitz-15 medium)粉末分別溶于500 ml滅過(guò)菌的MilliQ水中，室溫?cái)嚢枞芙?-4 h，再將兩種培養(yǎng)基 1:1混合，加入10.22 g/LNaCl，40 (ig/ml抗壞血酸維生素C， 128.9 ng/ml?；撬幔?0昭/ml ATP, 400(ig/ml乳蛋白水解物，67mg/mlHEPES，再加入以下抗生素100IU/ml青霉素，100 |ag/ml 鏈霉素，50 pg/mi卡那霉素和1 pg/ml制霉菌素，攪拌1 h， pH調(diào)至7.0,無(wú)菌條件下過(guò)濾， 加入胎牛血清和雞胚浸液。
實(shí)施例1外套膜組織細(xì)胞的培養(yǎng)
(1) 外套膜取材取合浦珠母貝，用吸水紙將貝殼表面吸干，用醫(yī)用酒精擦拭貝殼表面 消毒，剪去閉殼肌側(cè)的貝殼邊緣。在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用手術(shù)刀伸進(jìn)貝體內(nèi)將閉殼肌割開(kāi)，取外 套膜組織。在收集足夠多的組織之前，將取出的組織浸潤(rùn)在組織平衡鹽溶液中。
(2) 消毒和清洗用滅菌濾紙片將外套膜組織表面的粘液沾去。將外套膜組織放入組織 消毒液中浸泡20min，期間搖動(dòng)數(shù)次，再將外套膜組織轉(zhuǎn)移到組織平衡鹽溶液中，換液8次， 清洗外套膜組織表面粘液以及殘余的抗生素。
(3) 組織培養(yǎng)用眼科剪將外套膜組織塊剪成l-2cm3的小塊，置于預(yù)先鋪有鼠尾膠原、 直徑為6cm的組織培養(yǎng)皿中，室溫放置15-20 min后，讓外套膜組織塊貼附在皿底。加入1.5 ml的培養(yǎng)基，24'C靜置培養(yǎng)，不補(bǔ)充C02。 72 h后，吸棄0.5 ml培養(yǎng)液，補(bǔ)加2 ml新鮮的培 養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
實(shí)施例2珍珠囊組織細(xì)胞的培養(yǎng)
(1) 珍珠囊取材取合浦珠母貝，用吸水紙將貝殼表面吸千，用醫(yī)用酒精擦拭貝殼表面 消毒，剪去閉殼肌側(cè)的貝殼邊緣。在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用手術(shù)刀伸進(jìn)貝體內(nèi)將閉殼肌割開(kāi)(要沿 著貝殼表面將閉殼肌割開(kāi)，避免內(nèi)臟組織細(xì)胞污染)，取出珍珠囊。在收集足夠多的珍珠囊之 前，將取出的組織浸潤(rùn)在組織平衡鹽溶液中。
(2) 消毒和清洗用滅菌濾紙片將珍珠囊組織表面的粘液沾去。將珍珠囊組織放入組織 消毒液中浸泡20min，期間搖動(dòng)數(shù)次，再將珍珠囊組織轉(zhuǎn)移到組織平衡鹽溶液中，換液8次，
清洗珍珠囊組織表面粘液以及殘余的抗生素。
(3) 組織培養(yǎng)用眼科剪將珍珠囊組織塊剪成l-2ci^的小塊，置于預(yù)先鋪有鼠尾膠原、 直徑為6cm的組織培養(yǎng)皿中，室溫放置15-20 min后，讓珍珠囊組織塊貼附在皿底。加入1.5 ml的培養(yǎng)基，24。C靜置培養(yǎng)，不補(bǔ)充(202。 72h后，吸棄0.5ml培養(yǎng)液，補(bǔ)加2ml新鮮的培 養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1、一種合浦珠母貝組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)組織塊取材取合浦珠母貝，用吸水紙將貝殼表面吸干，用醫(yī)用酒精擦拭貝殼表面消毒，剪去閉殼肌側(cè)的貝殼邊緣，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將閉殼肌割開(kāi)，取目的組織，將取出的組織浸潤(rùn)在組織平衡鹽溶液中；(2)消毒和清洗用紙片將組織表面的粘液沾去，將組織放入組織消毒液中浸泡，再將組織轉(zhuǎn)移到組織平衡鹽溶液中，換液，清洗組織表面粘液以及殘余的抗生素；(3)組織培養(yǎng)將組織塊剪成小塊，置于預(yù)先鋪有鼠尾膠原的組織培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后，吸棄0.5ml培養(yǎng)液，補(bǔ)加2ml新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、 按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)所述組織平衡鹽溶液，其 配方是NaCl 26.22 g/L， KC1 1.08 g/L, MgS04 2.94 g/L, MgCl2 2.0 g/L, CaCl2 0.664 g/L, NaHC03 0.3 g/L, NaH2P04 0.044g/L, glucose 0.30 mg/ml， MUUQ水，pH為7.2-7.4，無(wú)菌濾膜過(guò)濾后使 用。
3、 按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于歩驟(2)所述消毒液，其配方是青霉素100萬(wàn)IU/L，鏈ll素1 g/L，慶大霉素80力'IU/L，甲硝唑15 mg/L，制霉菌素2 mg/L 溶解于組織平衡鹽溶液中，無(wú)菌濾膜過(guò)濾后。
4、 按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于歩驟(3)所述培養(yǎng)基，其配方是199培養(yǎng)基(Medium 199)和L-15培養(yǎng)基(Leibovitz-15 medium)粉末分別溶于500 ml滅過(guò) 菌的MilliQ水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?，再將兩種培養(yǎng)基l: l混合，加入10.22 gZLNaCl， 40嗎/ml抗壞血酸維牛.素C， 128.9 ng/ml?；撬?10卩ig/ml ATP, 400 |_ig,/ml乳蛋白水解物，67 mg/mlHEPES，再加入以下抗生素100 lU/ml青霉素，100叱/ml鏈霉素，50 (ag/ml卡那霉素 和l嗎/ml制霉菌素，攪拌，pH調(diào)至7.0，無(wú)菌條件下過(guò)濾，加入10%胎牛血清和10%雞肝 浸液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種合浦珠母貝組織培養(yǎng)方法，屬于是關(guān)于合浦珠母貝組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。所述方法主要含有(1)組織塊取材將合浦珠母貝表面消毒，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將閉殼肌割開(kāi)，取目的組織；(2)消毒和清洗用紙片將組織表面的粘液沾去，消毒后再將組織轉(zhuǎn)移到組織平衡鹽溶液中，清洗表面粘液及殘余抗生素；(3)組織培養(yǎng)將組織塊剪成小塊，置于組織培養(yǎng)皿中。加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)。本發(fā)明適用范圍廣，滅菌效果較佳，能保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷，組織塊培養(yǎng)過(guò)程中貼壁效果很好，細(xì)胞遷出旺盛，體外存活期較長(zhǎng)，易于操作。本發(fā)明所用培養(yǎng)基更適合于海洋貝類(lèi)組織細(xì)胞的培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101591639SQ20091008769
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者上官俊龍, 劉曉軍, 周玉娟, 張榮慶, 琪 李, 謝莉萍 申請(qǐng)人:清華大學(xué)