專利名稱：中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列、構(gòu)建方法及其氨基酸序列和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種中國林蛙功能序列及其編碼的蛋白序列，具體地說是一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列及其編碼的氨基酸序列和其用途。
背景技術(shù)：
全世界每年新診斷的癌癥病例達1億，每10萬人中250人死于癌癥，因此戰(zhàn)勝癌癥是現(xiàn)代醫(yī)藥最重大的挑戰(zhàn)之一。盡管外科手術(shù)可以治愈可切除的癌癥，不可切除的癌癥只能采用化學治療或放射治療。常規(guī)藥物用于治療存在的主要問題是，缺乏選擇性，毒性強烈及外來蛋白的免疫原性，經(jīng)常會導致副反應，如暫時性腹瀉、惡心、脫發(fā)、易感染。有時會對心、肺、腎、骨髓產(chǎn)生長期影響。 大多數(shù)降解DNA的藥物所導致的凋亡與野生型p53腫瘤遏制物的存在與否關(guān)系密切，在p53缺失的情況下，降解DNA的藥物對腫瘤無效。目前人類的大部分腫瘤(尤其是實質(zhì)性腫瘤)都能通過變異使p53失活，或產(chǎn)生p53抗體。而且，導致DNA損傷的藥物往往能夠使正常細胞產(chǎn)生基因變異。 因此需要開發(fā)毒性適度的、人類具有免疫耐受性的藥物來解決這些問題。 RNases能夠降解RNA引起細胞死亡，被認為是一種毒素?；罴毎蠹s含有20種外
切和內(nèi)切核糖核酸酶，把RNA處理為成熟形式并調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄。RNase參與RNA代謝、細胞
成熟、細胞生理死亡、促進血管生成，而且發(fā)揮抵御RNA病毒的宿主防御功能。 當外源RNases進入細胞，它們可能通過降解RNA、削弱蛋白生物合成、引起凋亡而
殺死細胞。 實際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種核糖核酸酶在體外實驗中具有細胞毒性，但在體內(nèi)實驗中卻毫無毒性。該家族的典型代表是牛胰腺核糖核酸酶(RNase A)，由于受到哺乳動物體內(nèi)普遍存在的核糖核酸酶抑制劑(RI)的作用，不具備抗腫瘤作用。而從牛精液中發(fā)現(xiàn)的天然二聚體形式的核糖核酸酶(BS-RNase)，盡管與RNase A的氨基酸序列相似性高達80% ，但是不受RI的抑制作用，在體內(nèi)外實驗中均顯示出強大的選擇性地抗腫瘤作用。BS-RNase不僅作用于腫瘤細胞，還具有胚胎毒性，精子生成抑制，免疫抑制活性。EDN和ECP是來源于嗜酸性粒細胞的核糖核酸酶A超家族成員，盡管序列相似，但是具有不同的功能。EDN具有抗病毒功能，而ECP主要表現(xiàn)出強大的殺菌、殺寄生蟲的功能。從家雞(Gallus gallus)白細胞中分離到兩種核糖核酸酶RNases A-1和A-2，二者具有81 %氨基酸序列相同，二者都與人血漿核糖核酸酶抑制劑(hRI)相互作用。RNases A_2同時具有血管生成活性和殺菌作用，RNases A_l沒有這兩種活性。目前的研究發(fā)現(xiàn)，核糖核酸酶A超家族成員是一組快速進化的蛋白家族，不同的物種中核糖核酸酶序列的微小差異導致功能的顯著變化。
目前文獻報道的蛙類核糖核酸酶抗腫瘤的研究，僅局限于豹蛙、牛蛙和日本稻田蛙。不同蛙物種核糖核酸酶的氨基酸序列不同，結(jié)構(gòu)的差異導致功能不同。
在兩棲動物蛙屬中，最早被鑒定的核糖核酸酶是Onconase，是1991年Ardelt等從R. pipiens卵中基于其抗腫瘤作用而分離的蛋白。0nconase完整氨基酸順序的闡明，揭 示出其屬于核糖核酸酶A超家族。另外三種核糖核酸酶從蛙的卵和肝被鑒定牛蛙Rana catesbeiana(娃卵rc—RNase，娃肝rc—Ll)日本禾舀田娃Ranajaponica (娃卵rj—lec)。 1998年Huang等首先分離出編碼蛙核糖核酸酶的cDNA，發(fā)現(xiàn)mRNA僅在雌蛙的肝臟表達， 最終合成的蛋白定位于蛙卵細胞中。2000年Liao等從蛙卵黃顆粒提取物和肝中分離出 5個編碼牛蛙R. catesbeiana核糖核酸酶的cDNA序列(rc-01編碼rc-Ll， rc_02， rc_03， rc-04， rc-06) ，2000年Chen等從R. pipiens中發(fā)現(xiàn)了性別特異性的細胞毒性核糖核酸酶 (rp-rap) 。 2001年Rosenberg等以牛蛙Rana catesbeiana基因組DNA為模板，采用PCR得 到了五個新的蛙核糖核酸酶基因順序(rc-203， rc-204， rc-208， rc_212， rc-218)。表明來 源于蛙屬的核糖核酸酶基因通過正向選擇快速分化的方式進化，暗示了這個獨特的蛋白家 族可能具有新的生理功能。 以核糖核酸酶A為代表的大多數(shù)嘧啶堿基特異性核糖核酸酶具有四個分子內(nèi)的 二硫鍵，而且其位置非常保守。蛙蛋白保留了核糖核酸酶A四個二硫鍵中的三個，在靠近C 端出現(xiàn)一個新的二硫鍵。盡管與RNase A具有相似的三維結(jié)構(gòu)，來源于兩棲動物的RNases 在體外實驗中不受人RI抑制，這歸因于其與RNase A的序列相似性低。進化地位更低的魚 類卻受到RI抑制。 從豹蛙中分離出的核糖核酸酶Onconase是通過內(nèi)化進入細胞引起細胞毒性。已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)Onconase能減小動物體內(nèi)腫瘤的大小，能增強幾種化學治療劑的細胞毒功效。但 是，Onconase還具有胚胎毒性，抑制精子生成、免疫抑制活性及腎毒性。Onconase作為治療 不能手術(shù)的惡性間皮瘤的抗腫瘤藥進入臨床三期實驗。 從日本稻田蛙的卵中分離出一種具有凝集活性的核糖核酸酶jSBL，可優(yōu)先凝集大 量的各種人類和動物的腫瘤細胞，而不是正常的紅細胞，淋巴細胞，或成纖維細胞。從牛蛙 卵中也分離出具有凝集各種腫瘤細胞作用的核糖核酸酶cSBL。具有凝集活性的核糖核酸酶 可識別大量的各種腫瘤細胞的細胞表面糖蛋白特征的具體組織結(jié)構(gòu)和方向，這無疑對于人 類癌癥提供了 一個重要的基礎診斷和治療。 cSBL和jSBL蛋白對體內(nèi)的多種癌細胞均表現(xiàn)出細胞毒性，其中cSBL已被證明是 一種在體外也非常有效用的化療藥物。在一項有關(guān)的實驗研究中，研究人員將腫瘤細胞注 入小鼠腹膜內(nèi)腔，24小時后開始每天按一定劑量對其中部分小鼠進行治療。研究結(jié)果表明， 被治療小鼠的存活時間顯著高于未被治療小鼠的存活時間。 對cSBL進行的研究顯示，cSBL的酶活性不受人類RNase酶抑制因子的抑制，它們 一旦進入細胞中，其降解腫瘤細胞RNA、殺死癌細胞的作用能很好地發(fā)揮，有利于作為抗癌 藥物應用。 蛙具有獨特的嘧啶堿基特異性的核糖核酸酶，結(jié)構(gòu)相似于烏龜、蜥蜴、雞的核糖核 酸酶。但是來源于蜥蜴的核糖核酸酶沒有發(fā)現(xiàn)細胞毒性。盡管進行了大量的研究，然而，并 非所有的實驗結(jié)果都一致?？鼓[瘤主要問題免疫原性、細胞毒性的選擇性、穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于補充現(xiàn)有技術(shù)的不足而提出一種中國林蛙Onconase樣功能基 因Rd-RNase3序列。
本發(fā)明另一目的在于提出一種上述中國林蛙Onconase樣功能基因Rd-RNase3序 列的構(gòu)建方法。 本發(fā)明的又一目的在于提出上述中國林蛙Onconase樣功能基因Rd-RNase3序列 的氨基酸序列及由該氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸的且與該氨基酸序 列功能相同的氨基酸衍生序列。 本發(fā)明的再一目的在于提出一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的用途。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明思路為 0nconase的抗腫瘤作用機制是基于其內(nèi)化進入腫瘤細胞，降解RNA，抑制蛋白質(zhì) 的合成，誘導腫瘤細胞凋亡。處于對數(shù)生長期的細胞在0nconase藥物作用24h后，細胞 增殖停止，而對處于停滯期的細胞沒有作用。這可能與細胞識別有關(guān)，在藥物作用劑量下， 0nconase只作用于腫瘤細胞，而對正常生長細胞沒有影響。除了與化學藥物不同的作用靶 點外，提高腫瘤細胞氧壓、使抗性細胞恢復對藥物的敏感性是0nconase使實體瘤減小的另 一因素，也是與其它藥物協(xié)同作用原因。在實體瘤中，細胞間流體壓力的增大往往導致抗 腫瘤藥物的輸送障礙Onconase誘導腫瘤微血管壓力升高，血液流動加快，使腫瘤血管氧 化壓力顯著增高。因此它可能成為新的放射增強劑，關(guān)于它輻射反應的體內(nèi)研究已獲得許 可。本發(fā)明從中國林蛙的基因組中克隆編碼Onconase樣核糖核酸酶成熟蛋白的基因，找到 具有0nconase樣抗腫瘤活性的核糖核酸酶，作為制備治療腫瘤生物藥物的應用。本發(fā)明是 以中國林蛙DNA中制備一種新的0nconase樣基因序列Rd-RNase3，以其為基礎作為制備新 型、高效的抗腫瘤功能生物藥物的應用，具有重要的醫(yī)藥開發(fā)應用價值。本發(fā)明采用的具體 技術(shù)方案為 —種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列，其為序列表中SEQ ID No. 1所示的核苷 酸序列，具體如下成熟蛋白編碼區(qū)基因序列c皿g3ctgga 3皿ratttc3 g皿g皿3C3c ctg3c皿3C3 cccgg皿tet te皿tgtgat60aaaatcatgc caateaactt gttccactgc aagtecagga acacatttet ctettcacgt120cctcgtggag tgg皿皿cct ctgtegagg3皿皿te皿tg cc3ca皿tgt gtc皿gtegt180tcaaagtttg ctctctttga gtgcattgaa aaatccaggc cttgcaagte teaatteaag2403皿c皿3cte atgteatttg teteacatgt gagrate皿g ttccagtera ttttgtcggt300gtcgg皿gtt gc312一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列氨基酸序列，其為序列表中SEQ IDNo.2所
示的氨基酸序列，具體如下由基因序列推導得到成熟蛋白編碼區(qū)蛋白序列Gin Asp Trp Lys Thr Phe Gin Lys Lys His Leu Thr Asn Thr Arg Asn15 10 15lie Lys Cys Asp Lys lie Met Pro lie Asn Leu Phe His Cys Lys Tyr2025 30Arg Asn Thr Phe lie Tyr Ser Arg Pro Arg Gly Val Glu Asn Leu Cys3540 45Arg Gly Lys lie Asn Ala Thr Asn Val Ser Ser Ser Ser Lys Phe Ala
50 55 60 Leu Phe Glu Cys lie Glu Lys Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys
65 70 75 80 Lys Gin Thr Asn Val lie Cys lie Thr Cys Glu His Lys Val Pro Val
85 90 95 His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 上述的一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列氨基酸序列的衍生序列，其是由序 列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸的且與序列 表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。 上述的一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的構(gòu)建方法，其具體步驟為提取 出中國林蛙的基因組DNA，設計基因特異性引物，進行PCR擴增，產(chǎn)物電泳，所述的基因特異 性引物為序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，為正反引物對
正向引物N275 :TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C
反向引物C715 :CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC 從電泳膠中回收目標DNA片段，與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)移到細胞，提取質(zhì)粒，PCR初步鑒定 目標基因后，測序。 上述的一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列氨基酸序列的構(gòu)建方法，其中，所 述PCR反應體系及參數(shù) 基因組模板100ng、d證s(10mM) 1 ii L、10XTaq Buffer 5 ii 1、Taq DNAPolymerase 3U和引物(N275， C715)各30pmol、補無菌超純水至總體積為50iU，混合均勻;
擴增條件為94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s， 35個循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
上述的一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列氨基酸序列的構(gòu)建方法，其中，所 述與質(zhì)粒連接的具體步驟為 (1)目標DNA片斷(20ng) 、 pGM-T載體(50ng) 、 T4DNA Ligase 3U、10XT4DNA
Ligase Buffer 1 iU，補無菌超純水至總體積10 iU ; (2) 16t:連接10 12小時制備成連接好載體的基因； (3)對步驟(2)連接好的樣品進行PCR檢測；連接產(chǎn)物1 yl、 dNTPs (10mM) 1 y L、 lOXTaq Buffer 5 ii 1、Taq DNA Polymerase 3U和質(zhì)粒通用引物(T7，SP6)各10pmol，補無 菌超純水至總體積50iU，混合均勻；PCR擴增條件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35個循 環(huán)，72t:延伸7min結(jié)束； (4)2. 5% TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測，紫外分析儀中，觀察DNA條帶。 上述的一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列構(gòu)建方法，其中，所述轉(zhuǎn)移到細胞
的具體步驟為 (1)將5 ill (50ng)目標基因與質(zhì)粒連接的產(chǎn)物(重組質(zhì)粒pGM-RNase3)加入到
100 ii 1感受態(tài)細胞DH5 a中，混勻，冰浴30min ; (2)42"水浴中熱激90s ;取出后立即置于冰浴2min ; (3)加入500iil提前37t:預熱好的不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37t:，150rpm搖床 培養(yǎng)45min ;
(4)4000rpm離心2min，棄部分上清液，濃縮后取100 yl涂轉(zhuǎn)化平板，涂勻，干燥， 倒置平板，37t:恒溫箱培養(yǎng)12 16h ; (5)挑取分離良好、中等大小的白色菌落接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中， 搖床37°C 、 180rpm培養(yǎng)12 16h。 上述的一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的構(gòu)建方法中，所述提取質(zhì)粒PCR 鑒定的PCR反應體系及參數(shù)為 提取的重組質(zhì)粒(pGM-RNase3) 1 ii 1、 dNTPs (10mM) 0. 5 ii L、 10 X Taq Buf f er2 ii 1、 Taq DNA Polymerase 1. 5U和質(zhì)粒通用引物(T7， SP6)各5pmo1，補無菌超純水至總體積 20iU，混合均勻;PCR擴增條件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35個循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
—種所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的擴增引物為序列表中SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，為正反引物對。 上述中國林蛙上述的一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列在制備治療抗腫瘤 藥物中的應用。 本發(fā)明的優(yōu)點與效益 本發(fā)明首先提取中國林蛙的基因組DNA，設計特異性引物，PCR擴增基因，測定基 因順序。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，確定為中國林蛙Onconase樣新功能基因Rd-RNase3。
本發(fā)明林蛙功能基因Rd-RNase3序列經(jīng)核糖核酸酶介導的腫瘤細胞凝集和對腫 瘤細胞的選擇性殺傷作用與野生型p53腫瘤遏制物的存在與否無關(guān)，并且該基因的穩(wěn)定性 較之現(xiàn)有技術(shù)更好。該基因表達研究顯示該基因編碼的蛋白質(zhì)具有細胞毒性，能抑制腫瘤 細胞的生長，符合制備抗腫瘤藥物的條件。在抑瘤實驗中可以看出，本發(fā)明Rd-RNase3基因 重組融合蛋白在極低濃度下對腫瘤細胞具有很強大的殺傷作用，但對正常細胞無殺傷性， 因此在制備抗腫瘤藥物方面較之現(xiàn)有基因藥物存在很大的優(yōu)勢。并且重組蛋白Rd-RNase3 具有很好的抗氧化功能，這是其對腫瘤細胞抗增殖、細胞毒活性的重要影響因素。因為細胞 的氧化還原狀態(tài)影響細胞功能的各個方面。許多藥物的細胞毒效果是由活性氧調(diào)節(jié)的。氧 化應激可以干擾癌癥化學藥物治療，包括阿霉素等化學治療藥物引起B(yǎng)urkitt淋巴瘤細胞 凋亡可以被過氧化氫酶抑制。重組蛋白Rd-RNase3在腫瘤治療方面具有很好的功效，并且 其在與氧化應激有關(guān)的病理條件，如炎癥、自身免疫疾病、動脈粥樣硬化、敗血癥休克、肌萎 縮性(脊髓)側(cè)索硬化等疾病的治療方面具有應用的潛能。 本發(fā)明中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的構(gòu)建對進一步研究RNases有很大的 啟示性作用。氨基酸序列與現(xiàn)有序列的差異顯著，功能性更強，可作為一種有選擇性的細胞 毒素，具有重要的醫(yī)藥開發(fā)應用價值。 下面結(jié)合附圖及最佳實施方式對本發(fā)明做進一步說明，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容有整 體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開了本發(fā)明可以 實施的保護范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容進行的任何本領域公知的等同替換，均屬于 對本發(fā)明的侵犯。


圖1為目的基因PCR擴增結(jié)果 圖2為載體連接檢測結(jié)果圖； 圖3為轉(zhuǎn)移到細胞的轉(zhuǎn)化結(jié)果圖； 圖4為質(zhì)粒PCR擴增檢測結(jié)果圖； 圖5為空載體誘導表達對宿主菌生長無影響圖； 圖6為Rd-RNase3經(jīng)IPIG誘導表達后對宿主菌生長有抑制作用圖； 圖7為大腸桿菌裂解液的SDS-PAGE圖； 圖8為SDS-PAGE檢測親和膠純化后重組蛋白的純度圖； 圖9為大腸桿菌裂解液總蛋白與純化的重組蛋白Western blotting檢測圖；
圖10為重組融合蛋白對人卵巢癌CoCl細胞和中國倉鼠卵巢CH0-K1細胞的生長 抑制作用圖； 圖11重組蛋白Rd-RNase3對小鼠肝組織丙二醛含量的影響。
具體實施例方式
本發(fā)明具體實施方式
所用材料及設備來源 1、實驗動物中國林蛙(Rana dybowskii)來源吉林省樺甸市；選擇標準識別特 征皮色多為深褐色，肚黃色，嘴端略鈍圓，耳膜邊有羊角黑瘢，頸背處有〃 A〃形黑斑，四 肢有環(huán)行黑斑。 2、所用菌種和載體大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 a ， pGM_T載體(均購于TIANGEN生
物技術(shù)有限公司)。 3、工具酶與生化試劑 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，硅膠膜型PCR產(chǎn)物(DNA片斷)純化試劑盒，普通 質(zhì)粒小提試劑盒，Tryptone， Yeast Extract, Agarose,氨節(jié)青霉素，X_Gal， IPTG等(均 購于TIANGEN生物技術(shù)有限公司)，dNTPs， T4 DNA Ligase， A DNA/HindIII， Taq DNA Polymerase, EcoR I， HindIII，lkb DNA Ladder, DNA Marker I (均購于TaKaRa公司)，基 因組DNA提取試劑盒、核酸染料GoldView， 50bp DNALadder (購于北京賽百盛生物技術(shù)有限 公司)，其它試劑均為市售分析純。
4、設備和器材 TGL-16C型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠； HQ-60型旋渦混合器，北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司； PCR擴增儀9700型，Gene Amp公司； THZ-D型臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠； UV-IV型紫外分析儀，北京市新科技應用研究所； SPN202F型電子天平，梅特勒-托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司； DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠； DYCP-31DN型電泳槽，北京六一儀器廠； LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司； LS-835L型立式壓力蒸汽滅菌鍋江陰江濱醫(yī)療設備廠； SWCJ-B型凈化工作臺，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司； DZKW型電子恒溫水浴鍋，光明牌。
實施例1 :本發(fā)明中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的具體構(gòu)建方法
1、引物設計
基因特異性引物 正向引物N275 :TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C
反向引物C715 :CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC
2 、目標基因的PCR擴增 (1)使用血液基因組提取試劑盒，從林蛙新鮮血液中提取基因組DNA，1X瓊脂糖 電泳檢測分子量及濃度。 (2)向無菌PCR管中力B入基因組模板100ng、 dNTPs(10mM)liiL、10XTaq Buffer5ii 1、Taq DNA Polymerase 3U和引物(N275，C715)各30pmol、補無菌超純水至總體 積為50iU，混合均勻； (3)將加入樣品的PCR管放入已經(jīng)預熱好的PCR儀中進行PCR反應。PCR擴增條 件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35個循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。 (4) PCR結(jié)束后，在2. 5 % TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測并切膠純化目標基因。紫 外分析儀中，觀察DNA條帶。 經(jīng)PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，以Marker I為參照標準，在紫外分析 儀中，可看到約在400bp位置(包括部分信號序列，準確值為387bp)出現(xiàn)明亮的熒光條帶， 證明目的基因擴增成功，可用于接下來的載體連接。
3、pGM-T載體連接 (1)向無菌PCR管中加入目標基因片斷(20ng)、pGM-T載體(50ng) 、T4 DNALigase 3U、10XT4 DNA Ligase Buffer 1 ii l，補無菌超純水至總體積10 ii 1 ;
(2)16t:連接10 12小時制備成連接好目標基因的載體； (3)對連接好的樣品進行PCR檢測。向無菌PCR管中加入連接產(chǎn)物liU、 dNTPs(10mM) 1 ii L、10XTaq Buffer 5iU、Taq DNA Polymerase3U和質(zhì)粒通用引物(T7， SP6)各10pmol，補無菌超純水至總體積50iil，混合均勻。 (4)將加入樣品的PCR管放入已經(jīng)預熱好的PCR儀中進行PCR反應。PCR擴增條 件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35個循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。 (5)PCR結(jié)束后，在2.5X TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測。紫外分析儀中，觀察 DNA條帶。 對16t:連接過夜的結(jié)果進行PCR及瓊脂糖電泳檢測如圖2所示，在紫外分析儀中，
以Marker I為參照標準，可看到在600bp位置出現(xiàn)明亮的熒光條帶，與預期結(jié)果基本一致，
證明載體連接成功，可進行后續(xù)實驗。 4、制備轉(zhuǎn)化平板 (1)配制LB及LB/Agar培養(yǎng)基 ①LB液體培養(yǎng)基配制(500ml) :Tryptone 5g、 Yeast Extract 2. 5g、 NaCl 5g， 加入400ml水，充分攪拌溶解，滴加5N NaOH(約0. 2ml)，調(diào)pH值到7. 0，再加水定容至 500ml(取出200ml用于配制固體培養(yǎng)基，300ml分裝兩瓶，各150ml) 。 121°C，0. lMPa，高壓 滅菌20min。 4。C存放。 ②LB/Agar/Amp固體培養(yǎng)基配制按LB液體培養(yǎng)基準備好，高壓滅菌前加入Agar 3g/200ml，高壓滅菌，冷卻至50 6(TC，在超凈臺上向其中加入抗生素(氨芐青霉 素)0. 2ml，混勻，倒平板(20ml/板)，4。C存放。 (2)在超凈臺上，向鋪好含有相應抗生素的LB/Agar/Amp固體培養(yǎng)基表面加入
16iU IPTG(50mg/ml)、40ii1 X-Gal (20mg/ml)，使用無菌涂棒涂勻，避光37。C恒溫箱中放
置1 3小時后使用。 5、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a (1)5iil(50ng)連接產(chǎn)物加入到100 iU感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴30min。
(2)42t:水浴中熱激90s。取出后立即置于冰浴2min。 (3)加入500iil提前37t:預熱好的LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C ， 150rpm搖床 培養(yǎng)45min。 (4)4000rpm離心2min，棄部分上清液，濃縮后取100 yl涂轉(zhuǎn)化平板，涂勻，干燥， 倒置平板，37t:恒溫箱培養(yǎng)16h。 轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖3所示，16h培養(yǎng)后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化的目的基因在培養(yǎng)基上長出藍色
和白色兩種菌落，其中白色菌落為所需目的菌，在經(jīng)過菌落檢測后，若結(jié)果正確，則可用于
液體培養(yǎng)及質(zhì)粒提取。 6、提取質(zhì)粒、擴增及測序 (1)挑取分離良好、中等大小的白色菌落接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中， 搖床37°C 、 180rpm培養(yǎng)12h。 (2)用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒。 (3)PCR檢測重組質(zhì)粒中的插入DNA片段。向無菌PCR管中加入提取的重組質(zhì)粒
(pGM-RNase3) 1 ii 1 、 d證s (10mM) 0. 5 ii L、 10 X Taq Buffer 2 ii 1 、 Taq DNAPolymerase 1. 5U
和質(zhì)粒通用引物(T7，SP6)各5pmol，補無菌超純水至總體積20iil，混合均勻。PCR擴增條
件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35個循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。2. 5%瓊脂糖凝膠檢測。
至總體積20iU，混合均勻。 PCR擴增檢測質(zhì)粒上目標基因片段插入如圖4所示，經(jīng)12h培養(yǎng)所得菌液進行質(zhì) 粒提取，對所得質(zhì)粒進行PCR反應及瓊脂糖電泳檢測，以Marker I為參照標準，可看到在 600bp位置出現(xiàn)明亮的熒光條帶，與預期結(jié)果基本一致，證明質(zhì)粒提取結(jié)果正確。
(4)將提取的質(zhì)粒測序。 質(zhì)粒樣品由北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司測序。得到成熟蛋白編碼區(qū)基因 序列為SEQ ID No. 1所示，具體為 c朋gactgg3 3朋catttc3 g朋g朋3cac ctgac朋3C3 cccgg朋tet te朋tgtgat 60
aaaatcatgc caateaactt gttccactgc aagtecagga acacatttet ctettcacgt 120
cctcgtggag tgg朋朋cct ctgtegagg3朋朋te朋tg ccac朋3tgt gtc朋gtegt 180
tcaaagtttg ctctctttga gtgcattgaa aaatccaggc cttgcaagte teaatteaag 240
aaacaaacte atgteatttg teteacatgt gagcateaag ttccagteca ttttgtcggt 300
gtcggaagtt gc 312
由基因序列推導得到成熟蛋白編碼區(qū)蛋白序列如SEQ ID No. 2所示，具體為
Gin Asp Trp Lys Thr Phe Gin Lys Lys His Leu Thr Asn Thr Arg Asn
15 10 15
lie Lys Cys Asp Lys lie Met Pro lie
20 25Arg Asn Thr Phe lie Tyr Ser Arg Pro
35 40 Arg Gly Lys lie Asn Ala Thr Asn Val
50 55 Leu Phe Glu Cys lie Glu Lys Ser Arg
65 70
Lys Gin Thr Asn Val lie Cys lie Thr
85
His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100
將上述測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫進行序列比對，結(jié)果表明，本發(fā)明所述的中國 林蛙功能基因Rd-RNase3序列為新的基因。 實施例2 :本發(fā)明構(gòu)建的中國林功能基因Rd-RNase3序列及氨基酸序列的生物學 實驗 —、材料和方法 1、材料 (1)菌種和載體 大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞購于TIANGEN生物技術(shù)有限公司，pFLAG-CTS載
體購于sigma-aldrich。 (2)工具酶與生化試劑 Tryptone，Yeast Extract, Agarose,氨節(jié)青霉素，X-Gal， IPTG等(均購于TIANGEN 生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為市售分析純。
(3)設備和器材
設備 THZ-D型臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠； SPN202F型電子天平，梅特勒-托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司； LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司； LS-835L型立式壓力蒸汽滅菌鍋江陰江濱醫(yī)療設備廠； SWCJ-B型凈化工作臺，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司； 2、實驗方法 將攜帶有空質(zhì)粒pFLAG-CTS或攜帶有中國林蛙Rd-RNase3基因的重組質(zhì)粒 pFLAG-RNase3的大腸桿菌BL21 (DE3)涂布于LB/agar/Amp平板上活化，挑取LB/agar/Amp 平板上過夜生長的單菌落，接種于20ml LB/Amp培養(yǎng)基中，37t:，180rpm搖菌過夜。次日在 20ml菌液中再加入新鮮LB/Amp培養(yǎng)基20ml， 37°C ， 180rpm搖菌至對數(shù)生長中期(0D6。。= 0. 8)，分出20ml菌液于已滅菌并預熱至37t:的三角瓶中，加入終濃度為20uM的IPTG誘導 表達，剩余的20ml菌液中不加IPTG，作為非誘導對照，定時檢測0D6。。，記錄IPTG誘導重組 蛋白表達過程中對宿主菌生長的抑制情況。
Asn Leu Phe His Cys Lys Tyr 30
Arg Gly Val Glu Asn Leu Cys 45
Ser Ser Ser Ser Lys Phe Ala 60
Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys
75 80 Cys Glu His Lys Val Pro Val 90 95
3、實驗結(jié)果 (1)空載體誘導表達對宿主菌生長無影響，如圖5所示，用20uM IPTG誘導攜帶有 空質(zhì)粒pFLAG-CTS的Escherichia Coli BL21(DE3)表達后，宿主菌的生長情況與未誘導相 比，沒有差別?？梢娍蛰d體的誘導表達不影響宿主菌的生長。 (2)重組質(zhì)粒pFLAG-RNase3誘導表達過程中對宿主菌生長具有明顯抑制作用，如 圖6所示，用20uM IPTG誘導攜帶有重組質(zhì)粒pFLAG-RNase3的EscherichiaColi BL21 (DE3) 表達重組蛋白30min后，明顯可見宿主菌的生長受到抑制，60min后抑制率達到23%，誘導 120min后抑制率可達到58%。
4、結(jié)論 攜帶有本發(fā)明所述抗腫瘤功能基因Rd-RNase3的重組質(zhì)粒pFLAG-RNase3的大腸 桿菌BL21 (DE3)，在加入誘導劑IPTG以后開始轉(zhuǎn)錄和表達Rd-RNase3基因，重組蛋白分泌至 大腸桿菌的周質(zhì)腔中儲存。 實驗結(jié)果表明，誘導劑IPTG對帶有空載體的大腸桿菌沒有抑制作用，說明空載體 本身的誘導表達對大腸桿菌沒有細胞毒作用。 誘導劑IPTG對帶有Rd-RNase3重組質(zhì)粒pFLAG-RNase3的大腸桿菌具有顯著的抑 制作用，說明重組蛋白的誘導表達對大腸桿菌具有顯著的細胞毒作用。尤其值得注意的是 攜帶有pFLAG-CTS質(zhì)粒的宿主菌都是耐受Amp抗生素的耐藥菌，說明了重組蛋白的細胞毒 性較強，這些重組蛋白有可能在治療耐藥病原菌引起的感染性疾病方面具有應用價值，同 樣也說明了這些重組蛋白在治療腫瘤細胞中具有應用價值。 實施例3 :本發(fā)明中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的重組融合蛋白的制備
—、材料與設備
1、菌種和載體 大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞購于TIANGEN生物技術(shù)有限公司，pFLAG-CTS載 體購于sigma-aldrich。
2、工具酶與生化試劑 Tryptone，Yeast Extract, Agarose,氨節(jié)青霉素，X-Gal， IPTG等(均購于TIANGEN 生物技術(shù)有限公司)，小鼠抗FLAG單克隆抗體(購于Sigma公司)，連接有堿性磷酸酶的羊 抗小鼠二抗，BCIP/NBT顯色試劑盒(購于北京中杉金橋生物公司)，其它試劑均為市售分析純。 3、設備 THZ-D型臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠； LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司； LS-835L型立式壓力蒸汽滅菌鍋江陰江濱醫(yī)療設備廠； 超凈工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司； YC-1層析柜，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司； 高速冷凍離心機(SORVALL RC6PLUS) ， THERMO ; 冷凍干燥機(FD-1B-50)，北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心； 超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司； 萬分之一電子天平(AR2140)，奧豪斯公司；
PH儀(raSJ-3F)，上海雷磁 可見-紫外分光光度計(UV-1700) ， SHIMADZU ; 垂直電泳槽(DYC2-24D)，北京六一儀器廠； 電泳儀(DYY-8C)，北京六一儀器廠 二、實驗方法 1 、菌體的培養(yǎng)及超聲裂解 將攜帶重組質(zhì)粒的菌體，在LB/Agar/Amp培養(yǎng)基的平板上劃線，37。C恒溫箱中培 養(yǎng)過夜。次日用接種針挑取分離良好的單菌落，接入LB/Amp液體培養(yǎng)基中，置于搖床，于 37°C， 180rpm，培養(yǎng)12小時。按照5%接種量接種于預熱好的LB/Amp培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)6L 菌液。使菌生長至對數(shù)期(0D600 = 0. 6 0. 8)時加入終濃度為20uM的IPTG誘導4h。
離心收集菌體，PBS洗滌三次。加入破碎緩沖液，冰浴超聲，裂解菌體。離心收集 上清液。分離膠濃度為12%的SDS-PAGE及western blot檢測裂解液中的目標蛋白。
2、親和膠純化重組融合蛋白 在重組蛋白的C端帶有FLAG標簽(其氨基酸序列為EFPGTRSVDYKDDDDK) ， FLAG不 會影響目標蛋白質(zhì)正確折疊成三維結(jié)構(gòu)，也不會影響目標蛋白質(zhì)的活性?？煞奖愕乩眯?鼠抗FLAG單克隆抗體偶聯(lián)的瓊脂糖親和膠(購于sigma公司)進行純化。具體方法是將 細胞裂解液高速冷凍離心(4°C，20000rpm，30min)后，取上清，與親和膠孵育，4°C ，過夜。離 心(4°C ， 1500rpm， 2min)，收集親和膠。用TBS洗膠，五次。向親和膠中加入lml甘氨酸洗脫 液，輕搖lmin，離心(4。C，1500rpm，2min)，取上清，放入一支有l(wèi)Oul中和液的離心管內(nèi)，分 批共洗脫親和膠5次，收集5管洗脫蛋白。
3、檢測樣品純度 將得到的洗脫蛋白合并，對水充分透析后凍干。將凍干粉用100ul TBS溶解后，用 Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，進行SDS-PAGE，檢測產(chǎn)品純度，westernblotting鑒定重組蛋 白。 三、實驗結(jié)果 1 、大腸桿菌裂解液中重組融合蛋白的檢測 攜帶有Rd-RNase3基因的重組質(zhì)粒pFLAG-RNase3的大腸桿菌在LB/Amp培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至對數(shù)中后期(0D600 = 0. 6 0. 8)，加入終濃度為20uM的IPTG誘導4h后，離心 收集菌體，洗滌菌體后冰浴超聲裂解細胞，將得到的裂解液進行SDS-PAGE(分離膠濃度為 12% )，檢測到裂解液中在預期分子量位置有重組融合蛋白的條帶。如圖7所示，為大腸桿 菌裂解液的SDS-PAGE圖，圖中最左邊泳道為大腸桿菌裂解液，中間泳道為核糖核酸酶A， 最右側(cè)為低分子量蛋白標準。由圖可見，在分子量約13.7kDa處有目標蛋白表達。
2、親和膠純化重組融合蛋白Rd-RNase3 將細胞裂解液高速冷凍離心(4°C，20000rpm，30min)后，取上清，與連接有抗FLAG 抗體的親和膠一起孵育過夜，使目標蛋白吸附于親和膠上。經(jīng)過多次洗滌親和膠去除雜蛋 白后，采用分部酸洗脫，使目標蛋白Rd-RNase3從親和膠上解析下來。洗脫后的Rd-RNase3 重組蛋白立即用中和液中和至中性pH值。電泳檢測重組蛋白Rd-RNase3的純度。結(jié)果如圖 8示，為SDS-PAGE檢測親和膠純化后重組蛋白的純度圖，由圖可見，在分子量約為13. 7kDa 處重組蛋白為均一條帶。采用親和膠純化得到了重組蛋白的單一組分。
分別將大腸桿菌裂解液和純化的重組蛋白經(jīng)12%分離膠濃度的SDS-PAGE分離 后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，分別用抗FLAG小鼠單克隆抗體(Sigma， 300倍稀釋)、二抗——堿 性磷酸酶連接的羊抗小鼠抗體(中杉金橋生物公司，20倍稀釋)與抗原反應，BCIP/NBT 顯色鑒定重組蛋白，如圖9所示，為大腸桿菌裂解液總蛋白與純化的重組蛋白Western
blotting檢測圖，泳道1 :大腸桿菌裂解液總蛋白；泳道2 :純化的重組蛋白。圖中，左邊為
大腸桿菌裂解液，右邊為Rd-RNase3純品。由此可鑒定大腸桿菌裂解液總蛋白中有重組蛋
白表達，經(jīng)過親和膠純化后得到了重組蛋白的純品。 4、結(jié)論 本實驗將導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌進行培養(yǎng)，制備核糖核酸酶Rd-RNase3重組融 合蛋白。由于核糖核酸酶為胞內(nèi)酶，首先進行細胞破碎，上清液即為粗酶液。采用親和膠 分離純化，得到林蛙Rd-RNase3重組融合蛋白，SDS-PAGE電泳檢測到分子量約在13. 7kDa 左右的均一條帶。Western blotting法鑒定了 Rd-RNase3重組融合蛋白。建立了有效的 Rd-RNase3重組融合蛋白的制備方法。 實施例4 :中國林蛙Rd-RNase3基因的重組融合蛋白的體外抗腫瘤作用研究 —、材料與設備 1、細胞株、培養(yǎng)基與生化試劑 人卵巢癌CoCl細胞和中國倉鼠卵巢CHO-Kl細胞購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保 藏中心。RPMI 1640培養(yǎng)基購于Gibco，小牛血清、青霉素、鏈霉素、MTT、臺盼藍、匿S0購于
鼎國生物技術(shù)有限公司，其它試劑均為市售分析純。
2、設備 二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Forma); 酶標儀(Lab systems Dragon well scan MK3); 倒置顯微鏡(Nikon 808434); 立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-835L型)江陰江濱醫(yī)療設備廠；
凈化工作臺(SWCJ-B型)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。
二、實驗方法
1、細胞培養(yǎng) 人卵巢癌CoCl細胞和中國倉鼠卵巢CHO-Kl細胞生長于RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco 公司)，內(nèi)含體積分數(shù)為10%小牛血清(56t:滅活30min) 、100U/ml青霉素、100 y g/ml鏈霉 素，于37t:、體積分數(shù)為5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 3d傳代一次，取對數(shù)生長期細胞 用于實驗。 2、 MTT實驗檢測重組融合蛋白Rd-RNase3對細胞生長的抑制作用
收集對數(shù)生長期細胞，用0. 25%胰酶消化，配制成細胞懸液，于顯微鏡下用血球計 數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞初始濃度為1Xl(^細胞/ml。于96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔接種lOOiU(每 孔含1000個細胞)。培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液，按實驗設計分別加入含不同藥物濃度的培 養(yǎng)液，用培養(yǎng)基配制重組融合蛋白Rd-RNase3，設5個濃度50 y g/l、25 y g/1、12. 5 y g/1、 6. 25 ii g/1、3. 12 ii g/1，空白對照組加入不含藥物的等體積培養(yǎng)液，每組設3個平行孔，每 孔加樣100 iU。置37t:、體積分數(shù)為5% C02孵育箱中培養(yǎng)48h后棄去培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液洗 2次，以去除藥液，每孔加入0. 5% MTT溶液(RPMI 1640配制)20 yl。 37。C保溫4h，棄上清液，每孔加入DMSO 200 ii 1溶解Formazan顆粒，平板振蕩儀振蕩10min，在酶標儀上490nm
波長檢測各孔吸光度值，繪制細胞存活率曲線。 三、實驗結(jié)果 1、 MTT實驗檢測重組融合蛋白對細胞的生長抑制作用，實驗結(jié)果如圖10所示，為重組融合蛋白對人卵巢癌CoCl細胞和中國倉鼠卵巢CH0-K1細胞的生長抑制作用圖，由圖可見，重組融合蛋白對人卵巢癌CoCl細胞細胞的生長具有顯著抑制作用，對CHO-Kl細胞無
抑制作用。
四、結(jié)論 卵巢癌由于其發(fā)病初期癥狀、體征較為隱蔽而難以發(fā)現(xiàn)，70%的卵巢癌患者在就診時已為晚期，而目前中晚期惡性腫瘤缺乏有效的治療手段，且治療后出現(xiàn)不同克隆的新生腫瘤，故5年生存率僅為20% 30%。 本發(fā)明的重組融合蛋白Rd-RNase3在極低濃度下對于受試的人卵巢癌CoCl細胞具有強大的體外細胞毒性，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應。對CH0-K1細胞無抑制作用?？梢?，重組融合蛋白具有選擇性殺傷腫瘤細胞的細胞毒性。對于腫瘤的臨床治療具有重要的開發(fā)應用價值。 實施例5 :中國林蛙Rd-RNase3基因的重組融合蛋白抗氧化作用
—、材料與設備
1、實驗動物與試劑 ICR小鼠，體重18 22g，雌雄兼用。北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。
硫代巴比妥酸、三氯乙酸、硫酸亞鐵、過氧化氫等試劑均為市售分析純。 2、設備 萬分之一電子天平(AR2140)，奧豪斯公司；
高速冷凍離心機(S0RVALL RC6PLUS) ， THERMO ;
TGL-16C型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；
DZKW型電子恒溫水浴鍋，光明牌。
可見-紫外分光光度計(UV-1700) ， SHIMADZU ;
二、實驗方法 檢測重組蛋白對小鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的作用。 肝勻漿液的制備取小鼠肝臟，用冷生理鹽水洗凈后稱重，冰浴下勻漿，制成
0. 5%懸浮液，離心(4。C，5000rpm，20min)后取上清液用于抗氧化性測定。 硫代巴比妥酸法脂質(zhì)過氧化反應的最終產(chǎn)物丙二醛在酸性條件下與硫代巴比妥
酸共熱(IO(TC ， 20min)，生成粉紅色物質(zhì)，于532nm有吸收峰，可計算出丙二醛的量，從而得
出脂質(zhì)過氧化的情況。 小鼠肝組織丙二醛含量的測定各取肝勻漿液lml，加不同濃度的重組蛋白lml，加入6mmol/L的FeS04 100iil，最后加入60mmol/L H202 40 yl， 37。C水浴孵育lh后，加入lml 15%三氯乙酸結(jié)束反應，再加入lml 6. 7X硫代巴比妥酸，于沸水浴中顯色20min，冷卻后離心，取上清于532nm處測定吸光度值。
數(shù)據(jù)處理結(jié)果經(jīng)t檢驗。
三、實驗結(jié)果
由圖11可知，由于Fe2、402體系生成的 OH具有極強的損壞性，導致小鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量增加，加入重組蛋白Rd-RNase3后，丙二醛產(chǎn)生的量減少，說明重組蛋白Rd-RNase3能夠抑制Fe2++H202體系生成的 0H，從而抑制肝微粒體脂質(zhì)過氧化反應的進行。
四、結(jié)論 細胞的氧化還原狀態(tài)影響細胞功能的各個方面。許多藥物的細胞毒效果是由活性氧調(diào)節(jié)的。氧化應激可以干擾癌癥化學藥物治療，包括阿霉素等化學治療藥物引起B(yǎng)urkitt淋巴瘤細胞凋亡可以被過氧化氫酶抑制。重組蛋白Rd-RNase3具有抗氧化功能，這是其對腫瘤細胞抗增殖、細胞毒活性的重要因素。重組蛋白Rd-RNase3在腫瘤治療以及與氧化應激有關(guān)的病理條件，如炎癥、自身免疫疾病、動脈粥樣硬化、敗血癥休克、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化等疾病的治療方面具有應用的潛能。序列表〈110〉北京聯(lián)合大學生物化學工程學院〈120〉中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列、構(gòu)建方法及其氨基酸序列和用途〈130〉〈160>4〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>312〈212>DNA〈213〉中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列〈400>1C朋g3Ctgg3 3朋C3tttC3 g朋g朋3C3Cctg3c皿3C3 cccgg皿tet te皿tgtgat60aaaatcatgc caateaactt gttccactgcaagtecagga acacatttet ctettcacgt120cctcgtggag tggaaaacct ctgtegagga皿皿te皿tg crac皿3tgt gtc皿gtegt180tcaaagtttg ctctctttga gtgcattgaaa皿tcc3ggc cttgc皿gte te皿tte皿g240朋3C3朋cte atgteatttg teteacatgtgagcateaag ttccagteca ttttgtcggt300gtcgg朋gtt gc312〈210>2〈211>104〈212>PRT〈213〉中國林蛙功能基因Rd-RNase3氨基酸序列〈400>2Gin Asp Trp Lys Thr Phe Gin LysLys His Leu Thr Asn Thr Arg Asn1 510 15lie Lys Cys Asp Lys lie Met Prolie Ash Leu Phe His Cys Lys Tyr2025 30Arg Asn Thr Phe lie Tyr Ser ArgPro Arg Gly Val Glu Asn Leu Cys35 4045
Arg Gly Lys lie Asn Ala Thr Asn Val Ser Ser Ser Ser Lys PheAla5055 60Leu Phe Glu Cys lie Glu Lys Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu6570 7580Lys Gin Thr Asn Val lie Cys lie Thr Cys Glu His Lys Val ProVal8590 95His Phe Val Gly Val Gl y Ser Cys100〈210〉3<211〉25〈212>DNA〈213〉正向引物N275〈400〉3tatttgcagt tgttttgagt ctcac 25<210>4〈211>23〈212〉DNA〈213〉反向引物C715〈400〉4ctgcttatca catccctgtt gtc 2權(quán)利要求
一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列，其特征在于，為序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
2. —種中國林蛙功能基因Rd-RNase3氨基酸序列，其特征在于，為序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3. —種權(quán)利要求2所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase3氨基酸序列的衍生序列，其特 征在于，其是由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨 基酸的且與序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的構(gòu)建方法，其特征在于， 其具體步驟為提取出中國林蛙的基因組DNA，設計基因特異性引物，進行PCR擴增，產(chǎn)物電 泳，所述的基因特異性引物為序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，為 正反引物對正向引物N275 :TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C 反向引物C715 :CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC從電泳膠中回收目標DNA片段，與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)移到細胞，提取質(zhì)粒，PCR初步鑒定目標 基因后，測序。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的構(gòu)建方法，其特征在于， 所述PCR反應體系及參數(shù)基因組DNA、dNTPs、H20、10XTaq Buffer、Taq DNA Polymerase和基因特異性引物至總 體積50iU，混合均勻；擴增條件為94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35個循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的構(gòu)建方法，其特征在于， 其特征在于，所述與質(zhì)粒連接的具體步驟為(1) 目標DNA片斷、載體、T4DNA Ligase、10XT4 DNA Ligase Buffer至總體積10 ii 1 ;(2) 16t:連接10 12小時制備成連接好目標基因的載體；(3) 對步驟(2)連接好的樣品進行PCR檢測；連接產(chǎn)物liU、 dNTPs、10XTaqBuffer 5ii 1、Taq DNA Polymerase3U和質(zhì)粒通用引物各lOpmol，補無菌超純水至總體積50 ii l，混 合均勻；PCR擴增條件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s，35個循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束;(4) 2. 5% TAE瓊脂糖凝膠中上樣電泳檢測，紫外分析儀中，觀察DNA條帶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的構(gòu)建方法，其特征在于， 其特征在于，所述轉(zhuǎn)移到細胞的具體步驟為(1) 將5iU目標基因與質(zhì)粒連接的產(chǎn)物加入到lOOiU感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴 30min ;(2) 42t:水浴中熱激90s ;取出后立即置于冰浴2min ;(3) 加入500 ii 1提前37t:預熱好的不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37°C， 150rpm搖床培養(yǎng) 45min ;(4) 4000rpm離心2min，棄部分上清液，濃縮后取100 yl涂轉(zhuǎn)化平板，涂勻，干燥，倒置 平板，37t:恒溫箱培養(yǎng)16h;(5) 挑取分離良好、中等大小的白色菌落接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床 37。C、180rpm培養(yǎng)12h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的構(gòu)建方法，其特征在于， 其特征在于，所述提取質(zhì)粒PCR鑒定的PCR反應體系及參數(shù)為提取的重組質(zhì)粒、dNTPs、10XTaq Buffer、 H20、 Taq DNA Polymerase和引物至總體積 20iU，混合均勻;PCR擴增條件94。C 30s，48。C 30s，72。C 50s， 35個循環(huán)，72。C延伸7min結(jié)束。
9. 一種權(quán)利要求l所述的中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列的擴增引物，其特征在于， 為序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，為正反引物對。
10. —種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中國林蛙功能基因Rd-RNase3序列，其特征在于，為序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明林蛙核糖核酸酶介導的腫瘤細胞凝集和對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用與野生型p53腫瘤遏制物的存在與否無關(guān)，并且不產(chǎn)生基因的變異，其穩(wěn)定性較之現(xiàn)有技術(shù)更好。在長期的抑瘤實驗中可以看出，本發(fā)明Rd-RNase3基因重組融合蛋白在極低濃度下對腫瘤細胞具有很強大的殺傷作用，但對正常細胞無殺傷性，因此在制備抗腫瘤藥物方面較之現(xiàn)有基因藥物存在很大的優(yōu)勢。
文檔編號C12N15/63GK101775401SQ20091007636
公開日2010年7月14日 申請日期2009年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月14日
發(fā)明者趙偉, 陶鳳云 申請人:北京聯(lián)合大學生物化學工程學院