專利名稱：一株海球菌及其在降解咪唑乙煙酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株海球菌及其在降解咪唑乙煙酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
咪唑乙煙酸(imazethapyr)具有殺草譜廣、選擇性強(qiáng)、活性高等優(yōu)點(diǎn)，是大豆 田優(yōu)良的除草劑，自從1993年德國巴斯夫公司普施特申請專利被中國駁回后，咪唑 乙煙酸國產(chǎn)化，成本下降，用量大幅增加，在我國大豆產(chǎn)區(qū)得到大面積的推廣和應(yīng) 用，年總用量平均在4000噸左右，應(yīng)用面積達(dá)到4000多萬畝以上，占大豆田除草 劑面積的75%以上，至今因品種競爭和政策限制等因素田間用量有所下降，但它仍 然是導(dǎo)致作物頻頻產(chǎn)生藥害主要長殘留性除草劑品種之一。
但隨著這一產(chǎn)品的在大豆田化學(xué)除草中的廣泛應(yīng)用，也暴露出一些問題和不足， 如對惡性雜草的防除效果、土壤處理藥效受環(huán)境條件制約、長殘效對后作的安全性 等問題(Jourdan SW， Majek BA， Ayeni AO. Imazethapyr bioactivity and movement in soil. Weed Science, 1998， 46(5) :608-613;黃春燕，陳鐵寶，王宇等.咪唑啉 酮除草劑對后茬作物安全性研究初報(bào).農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001， 3 (2) : 29-34)。
咪唑乙煙酸活性極高，且在土壤及水中降解緩慢，故微量殘留可能傷害后茬敏 感作物，世界各地有很多關(guān)于咪唑乙煙酸不同程度地對后茬敏感作物如高粱、水稻、 甜菜、馬鈴薯及蔬菜等傷害的報(bào)道(竇玉敏，高衛(wèi)東.土壤中殘存咪唑乙煙酸對水 稻生長影響.稻田植保，2000， 3: 22-23)。施藥后12個(gè)月可以種植玉米、小麥， 施藥后24個(gè)月正常用量可以種植油菜、馬鈴薯，對甜菜和白菜仍有藥害，36個(gè)月可 種甜菜、油菜、亞麻、白瓜(樸英，傅迎春，胡凡等.金豆和普施特施藥后對后作 安全性的實(shí)驗(yàn)研究.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2002， 18 (6) : 52-54)。
咪唑乙煙酸，通常不易揮發(fā)和水解，光解作用輕微，土壤對其吸附性差(Gentile JM， Roneker KR， Crowe SE， Pond WG， Lei XG. Effectiveness of an experimental consensus phytase in improving dietary phytate-phosphorus utilization by weanling pigs. J Anim Science, 2008， 81 (11) : 2751-2757)。我國北方地區(qū) 的寒冷氣候條件使土壤中長殘效除草劑咪唑乙煙酸很難在短時(shí)間內(nèi)降解，南方多季 種植結(jié)構(gòu)仍會(huì)造成除草劑的殘留藥害，不但影響農(nóng)作物的耕作、換茬，而且嚴(yán)重影 響種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整。因此如何解決長殘效除草劑殘留危害的問題，已成為當(dāng)前保護(hù) 土地資源與農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的重要課題。
目前解決長殘留除草劑危害的途徑主要有開發(fā)除草劑新品種以代替現(xiàn)有長殘 留性除草劑，但由于對靶標(biāo)酶的了解程度不夠，加之開發(fā)一個(gè)農(nóng)藥新品種要投入資金數(shù)億美元，所以難度很大；抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物品種的選育，需要投入大量的研 究經(jīng)費(fèi)和人力，要經(jīng)歷較長的研究過程，距離實(shí)際應(yīng)用還很遙遠(yuǎn)；利用一些化學(xué)物 質(zhì)即除草劑的解毒劑(保護(hù)劑)解除除草劑對作物產(chǎn)生的藥害，但涉及到另外一種化
學(xué)物質(zhì)的投放于環(huán)境中，會(huì)造成二次污染的問題；利用源于土壤的微生物降解，才 是真正能消除長殘留除草劑污染的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一株海球菌及其在降解咪唑乙煙酸中的應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的海球菌為海球菌(MaW"ococc^ sp.) LPYCGMCC処.2774。 所述海球菌(MflWwococcws sp.) LPYCGMCC 黑龍江省哈爾濱地區(qū)長期
施用長殘留性除草劑咪唑乙煙酸的土壤中分離得到。其菌落表面光滑、邊緣有褶皺、
隆起，不透明，平面生長，培養(yǎng)基乳黃色，菌株細(xì)胞呈球狀。
所述海球菌(iWaW"ococcws sp.) LPY CGMCC W2.2774，已于2008年11月27
曰保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為
中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCCW2.2774。
本發(fā)明的海球菌(Marinococcus sp.) LPY CGMCC W2.2774來源于土樣采自黑龍
江省哈爾濱市長期施用長殘留性除草劑咪唑乙煙酸的土壤，可以在高濃度咪唑乙煙
酸環(huán)境下生長，并且可以高效降解咪唑乙煙酸，為微生物降解長殘留除草劑咪唑乙
煙酸的研究提供了重要的基礎(chǔ)，可用于受咪唑乙煙酸污染的水體、土壤的生物凈化。


圖1為海球菌(Afon'/wcoccMsp.) LPY在不同溫度下對土壤中咪唑乙煙酸的降 解效果
圖2為在不同溫度下海球菌(Afor/"ococcwsp.) LPY降解土壤中咪唑乙煙酸的 半衰期
圖3為海球菌(JWaWwococcussp.) LPY在不同土壤濕度下對咪唑乙煙酸的降解
效果
圖4為在不同土壤濕度下海球菌(Afan'wococcRS sp.) LPY降解咪唑乙煙酸的半
衰期
圖5為海球菌(7kfan'"ococcwssp.) LPY在不同類型土壤中對咪唑乙煙酸的降解
效果
圖6為在不同類型土壤中海球菌(MflW朋cocc^sp.) LPY降解咪唑乙煙酸的半
衰期
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例l、海球菌(Mfln'"ococc^ sp.) LPYCGMCC W2.2774的分離、純化及其
鑒定
1、 海球菌(Ma〃'"ococcwsp.) LPYCGMCC W2.2774的分離及純化
1) 采集樣品
土樣采自黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地內(nèi)長期施用長殘留性除 草劑咪唑乙煙酸的土壤。
2) 菌體的富集和分離
將長期施用長殘留性除草劑咪唑乙煙酸的土壤樣品混合均勻，稱取10g加入到 含有100mg'i;'咪唑乙煙酸的100mL富集培養(yǎng)液中，置于3(TC， 150r min 1的搖床 培養(yǎng)。7d后按10X的接種量取培養(yǎng)液將其移入含咪唑乙煙酸濃度為200mgl^新鮮 富集培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)7d;以后每隔一周均從上次的培養(yǎng)液中取出10mL加入到 lOOmL新鮮富集培養(yǎng)液中，咪唑乙煙酸的濃度每次增加lOOmg丄-1，直至增加到600 mg，L—1，共富集培養(yǎng)6次；然后轉(zhuǎn)入到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，共進(jìn)行3次，培養(yǎng) 基中咪唑乙煙酸的濃度分別為800、 1000、 1200mg丄"。最后取樣，在牛肉膏蛋白胨 瓊脂培養(yǎng)基上按孢子形態(tài)、顏色進(jìn)行單孢分離，挑出單菌株分別進(jìn)行純化培養(yǎng)并保 存。
上述的富集培養(yǎng)液組分及配比為牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L; NaCl， 5g/L; K2HP04， 5g/L; PH7.0-7.2。
上述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基組分及配比為KH2P04， 1. 70g/L; K2HP04， 5. 17g/L; (NH4)2SOo 2.6g/L;鹽溶液，10mL/L; PH7. 0-7. 2。其中鹽溶液為含MgS04， 19. 5g/L; MnS04， 5g/L; FeS04， 5g/L; CaCl2， 0. 3g/L的溶液。
上述的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基組分及配比為牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L;
瓊脂，18g/L， PH7.0-7.2。
結(jié)果得到一株可在高濃度咪唑乙煙酸環(huán)境下生長的菌株，其在上述牛肉膏蛋白 胨瓊脂培養(yǎng)基上，3(TC條件下生長的菌落表面光滑、邊緣有褶皺、隆起，不透明， 平面生長，培養(yǎng)基乳黃色，菌株細(xì)胞呈球狀。
2、 將上述得到的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果其生理生化特征如表1所示。 _表l LPY菌株的生理生化特征_
項(xiàng)目 結(jié)果 項(xiàng)目 結(jié)果一乙酰甲基醇試驗(yàn)(V-P)一
芽孢的有無無明膠液化—
運(yùn)動(dòng)性+檸檬酸鹽利用+
需氧性需氧葡萄糖分解代謝形式氧化
最適溫度rc)33 36熒光色素+
接觸酶一硝酸鹽還原+
淀粉水解一反硝化+
甲基紅(M.R)+乙醇氧化+
注"+ "表示生長或反應(yīng)陽性；"-"表示不生長或反應(yīng)陰性。
經(jīng)上述鑒定表明該菌株為海球菌(7kfar/"woccMsp.),將其命名為LPY。該海 球菌(似aW"ococc^sp.) LPY,己于2008年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保 藏號為CGMCC N2. 2774。
實(shí)施例2、海球菌(A^WwococcMsp.) LPY對土壤中咪唑乙煙酸的降解 1、海球菌(7kfohwococc^sp.) LPY在不同溫度下對咪唑乙煙酸的降解效果 將海球菌(M^"ococcz^sp.) LPY CGMCC Ns. 2774用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液(含 牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L; PH7.0-7.2的培養(yǎng)液)在3(TC的條件下進(jìn)行增值培 養(yǎng)，用于下述效果檢測實(shí)驗(yàn)。
在黑土 (有機(jī)質(zhì)含量3. 557%，田間最大持水量37. 5%，全氮0. 195%， pH值7. 12) 中加入終濃度為10(Htg'kg—'的咪唑乙煙酸，分成6份每份24kg，其中三份分別按照 5Xl()8cfu/kg黑土的量接種海球菌(Mfln'"oco"船sp.) LPY CGMCC Na. 2774，將該菌 株與土壤混勻，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間最大持水量的50%，然后分別置于2(TC、 25 °C、 3(TC恒溫培養(yǎng)箱中放置作為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組；另外三份土壤不接種任何菌，調(diào)節(jié)土 壤含水量為田間最大持水量的50%，分別置于2(TC、 25°C、 3(TC恒溫培養(yǎng)箱中放 置作為三個(gè)空白對照組。各組分別在培養(yǎng)后的第l， 7， 15， 30， 45， 60天后，測定 土壤中各處理咪唑乙煙酸的殘留量，計(jì)算各組處理咪唑乙煙酸的半衰期。
各處理土壤中咪唑乙煙酸的殘留量測量結(jié)果如圖1所示，當(dāng)溫度為20°C、 25°C、 3(TC時(shí)，三個(gè)空白對照組于第60天測定各對照土壤中咪唑乙煙酸的殘留量(圖1中 20°C CK、 25°C CK、 30°C CK)，分別為85.79iag.kg-1， 81.35fig.kg-1和79.76ng.kg"，而添加海球菌(Mfl〃'"ococcw"p.) LPY CGMCC Na. 2774后的三個(gè)處理組(圖1中20 °C處理、25°C處理、30°C處理)殘留量分別為9.79， 7.48和6.24嗎'kg"，殘留率 分別為9.79%、 7.48%、 6.24%， i兌明海球菌(Man.彥o固sp.) LPY CGMCC Mi. 2774 對黑土中咪唑乙煙酸具有很強(qiáng)的降解能力，并且溫度為2(TC 3(TC的范圍內(nèi)降解效 果好。
各組處理咪唑乙煙酸的半衰期結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明在2(TC、 25°C、 30°C 條件下，咪唑乙煙酸在黑土中自然降解的半衰期(圖2中CK)分別為301. 37天，223. 60 天和203.87天，而在LPY菌的作用下，20°C、 25°C、 30。C條件下(圖2中處理)， 其降解半衰期分別為17. 91天、16. 31天和15. 13天。結(jié)果表明LPY菌能大幅度降低 土壤中咪唑乙煙酸的半衰期，使土壤中咪唑乙煙酸快速降解，大大提高了咪唑乙煙 酸的降解效率。
2、海球菌(^faW朋cocc^sp.) LPY在不同土壤濕度下對咪唑乙煙酸的降解效果 在黑土(有機(jī)質(zhì)含量3.557%，田間最大持水量37.5%，全氮0. 195%, pH值7. 12) 中加入終濃度為100^*kg—^勺咪唑乙煙酸，分成6份每份24kg，其中三份分別按照 5Xl()8cfu/kg黑土的量接種海球菌(Man'"ococcwssp.) LPY CGMCC NQ. 2774，將該菌 株與土壤混勻，分別調(diào)節(jié)土壤含水量為田間最大持水量的37. 5%、 50%、 62.5%,然后 分別置于25。C恒溫培養(yǎng)箱中放置作為3個(gè)菌處理組；另外3份土壤不接種任何菌， 分別調(diào)節(jié)土壤含水量為田間最大持水量的37.5%、 50%、 62.5%,分別置于25°C恒溫 培養(yǎng)箱中放置作為3個(gè)空白對照組，分別在培養(yǎng)后的第l， 7， 15， 30， 45， 60天后， 測定各處理土壤中咪唑乙煙酸的殘留量，并計(jì)算各組處理咪唑乙煙酸的半衰期。
各處理土壤中咪唑乙煙酸的殘留量測量結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明于第60天測 定含水量為田間最大持水量的37. 5%、50%、62. 5%時(shí)的空白對照組土壤(圖3中37. 5% CK、 50%CK、 62. 5°/。CK)中咪唑乙煙酸的殘留量，分別為ST.^iLig'kg-1, SGJSjug'kg-1 和8U8ng'kg"，而添加LPY菌后含水量為田間最大持水量的37.5%、 50%、 62. 5%時(shí) 的菌處理組土壤(圖3中37. 5%處理、50%處理、62. 5%處理)中咪唑乙煙酸的殘 留量，分別為殘留量分別為15.42， 6.76禾口 8.53嗎'kg"說明海球菌(M^'"ococc^sp.) LPY CGMCC N2. 2774在土壤濕度為50% 62.5%的范圍內(nèi)，對黑土中咪唑乙煙酸具有 很強(qiáng)的降解能力。各組處理咪唑乙煙酸的半衰期結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明添加海球菌 (Man'"ococc^ sp.) LPY cgmcc Nq, 2774的含水量為田間最大持水量的37.5%、 50%、 62.5%的菌處理組土壤(圖4中處理)中咪唑乙煙酸的降解半衰期分別為21.39天， 15.00天和16.66天，而未加菌處理(空白對照組)(圖4中CK)相應(yīng)含水量的土 壤中咪唑乙煙酸的降解半衰期分別為346.57天，330.07天和239.02天，說明海球菌 (M腦'"ococcm sp.) LPY CGMCC他.2774菌株在較高土壤濕度的情況下降解效率較 顯著。
3、海球菌(M—aW"ococc^sp.) LPY在不同類型土壤中對咪唑乙煙酸的降解效果
在黑土(有機(jī)質(zhì)含量3. 557%，田間最大持水量37. 5。/。，全氮0. 195%， pH值7. 12)、 白漿土 (有機(jī)質(zhì)含量3. 145%，田間最大持水量35.6%，全氮0.176%， pH值5.43)、 鹽堿土 (有機(jī)質(zhì)含量2. 984%,田間最大持水量39. 8%，全氮0. 149%， pH值8. 24) 3 種土壤中分別添加咪唑乙煙酸使其終濃度為100ng'kg"，向土壤中按照5X108cfu/kg 土壤的量接種海球菌(M^/"ococcws sp.) LPY cgmcc Ns. 2774，將該菌株與土壤混勻， 調(diào)節(jié)土壤含水量為田間最大持水量的50%，置于25'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，另設(shè)置不 添加降解菌，其他條件均相同的三種土壤處理作為空白對照，記為CK。分別在培養(yǎng) 后的第l， 7， 15， 30， 45， 60天后，測定各處理咪唑乙煙酸的殘留量和半衰期。
各處理土壤中咪唑乙煙酸的殘留量測量結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明第60天黑土、 白漿土、鹽堿土空白對照(圖5中黑土 CK、白漿土 CK、鹽堿土 CK)中咪唑乙煙 酸的殘留量，分別為80.64， 83.39和82.06嗎'kg"，而添力口海球菌(M腦'騰oc面sp.) LPYCGMCCN2.2774后的黑土、白漿土、鹽堿土處理組(圖5中黑土處理、白漿土處 理、鹽堿土處理)咪唑乙煙酸殘留量分別為7.82、 19.48和11.72pg'kg"，說明LPY 菌對三種土壤中的咪唑乙煙酸都具有很強(qiáng)的降解能力，其中對黑土和鹽堿土中咪唑 乙煙酸的降解效果略好于白漿土。
各組處理咪唑乙煙酸的半衰期結(jié)果如圖6所示，咪唑乙煙酸在黑土、白漿土、 鹽堿土中自然降解(圖6中CK)的半衰期分別為210.04天，247.55天和223.60天， 而海球菌(MflW"ococc^ sp.) LPY CGMCC Na.2774對黑土、白漿土、鹽堿土三種土 壤處理組(圖6中處理)中咪唑乙煙酸降解的半衰期分別為16.74天，25.86天和20.27天，表明海球菌(Man'"ococc^sp.) LPY CGMCC Nq. 2774能夠顯著提高土壤咪唑乙 煙酸的降解速度，且LPY菌在不同類型土壤中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力，尤其在黑 土和鹽堿土中表現(xiàn)更佳。
權(quán)利要求
1、海球菌(Marinococcus sp.)LPY CGMCC №.2774。
2、 海球菌(Ma〃'"ococc^ sp.) LPY CGMCC JV2.2774在降解咪唑乙煙酸中的應(yīng)用。
3、 海球菌(MaW"oa ccw sp.) LPY CGMCC Ws.2774在生物凈化受咪唑乙煙酸 污染水體或土壤中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株海球菌及其在降解咪唑乙煙酸中的應(yīng)用。該海球菌為海球菌(Marinococcus sp.)CGMCC №.2774。該菌株可以在高濃度咪唑乙煙酸環(huán)境下生長，并且可以高效降解咪唑乙煙酸，為微生物降解長殘留除草劑咪唑乙煙酸的研究提供了重要的基礎(chǔ)，可用于受咪唑乙煙酸污染的水體、土壤的生物凈化。
文檔編號C12N1/20GK101457213SQ20091007622
公開日2009年6月17日 申請日期2009年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日
發(fā)明者劉亞光, 張金花, 濱 趙 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)