專利名稱：鏈球菌m蛋白,免疫原性片段,核酸和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具體的蛋白和核酸。更具體地，本發(fā)明涉及海豚鏈球菌 (Streptococcus iniae)的分離的蛋白和核酸，以及它們?cè)谠\斷和/或治療動(dòng)物尤其是魚 中的海豚鏈球菌感染的用途。
背景技術(shù)：
最近十多年來，海豚鏈球菌已變成最嚴(yán)重的水生病原體，在較溫暖地區(qū)給養(yǎng)殖的 海水和淡水水族(farmed marine and freshwater finfish)帶來非常大的損失。海豚鏈 球菌首先是在1976年從一只被囚禁的亞馬遜淡水海豚中發(fā)現(xiàn)的，并因此而以海豚命名該 菌，它遍及全球的暖水水族養(yǎng)殖場。迄今為止發(fā)現(xiàn)的易感于海豚鏈球菌感染的魚類參見 Agnew&Barnes, 2007, Vet. Microbiol. 1221 白勺胃 $。海豚鏈球菌還具有人畜共患潛質(zhì)，已在美國、加拿大和整個(gè)亞洲都發(fā)現(xiàn)了人類感 染。人類的感染明顯是機(jī)會(huì)性的，迄今發(fā)現(xiàn)的所有病例都與制備已被污染的魚期間穿刺傷 的直接感染有關(guān)，一般以老人或免疫力低下的個(gè)體好發(fā)(Agnew&Barnes，2007，同上)。已知抗體能有效治療一些魚的感染。還發(fā)現(xiàn)恩諾沙星(Enrofloxacin)、土霉素 (oxytetracycline)、呋喃唑酮(furazolidone)和阿莫西林(amoxicillin)能用于治療魚 的海豚鏈球菌感染，只是它們的效力在不同物種之間有差異。然而，養(yǎng)殖場使用抗微生物制 劑受到一些限制，也有一些擔(dān)心。首先是密集群體間的耐藥性選擇。其次引起注意的是人 用養(yǎng)殖魚中藥物的殘留。最近發(fā)展出的一種控制海豚鏈球菌的方法是疫苗接種。以色列在1995至1997年 已成功開始一項(xiàng)針對(duì)養(yǎng)殖的虹鱒的計(jì)劃，用由全細(xì)胞福爾馬林滅活的海豚鏈球菌組成的自 體疫苗進(jìn)行腹腔注身寸(Bercovier et al. , 1996, Immunization with Bacterial Antigens infections with streptococci and relatedorganisms. Second International Symposium in Fish Vaccinology ppl53-60 ；Eldar et al. ,1997, Vet.Immunol. Immunpathol. 56 175)。魚群受到4個(gè)月的保護(hù)，這覆蓋了虹鱒在以色列的短短繁殖周期的 絕大部分時(shí)間段(Bercovier etal.，1996，同上)。上加利利(Upper Galilee)地區(qū)的大 規(guī)模接種項(xiàng)目使每年因海豚鏈球菌導(dǎo)致的死亡率從50%降低到5%以下(Eldar et al., 1997，同上)。有證據(jù)表明，保護(hù)作用的基本機(jī)制是由抗體介導(dǎo)的，可能是對(duì)基于熱穩(wěn)定蛋白 的抗原決定簇起反應(yīng)而產(chǎn)生的(Bercovier et al.，1996，同上)。抗體在提供保護(hù)作用方面所起的作用的證據(jù)還得到以下支持有數(shù)據(jù)顯示，用 抗海豚鏈球菌血清對(duì)羅非魚(tilapia)進(jìn)行被動(dòng)免疫也有保護(hù)(Shelbyet al. ,2002, J. Fish. Dis. 251)。但是，該接種計(jì)劃的成功是短暫的。1997年，由于這種細(xì)菌產(chǎn)生新的變 體，引起非常多次的新爆發(fā)流行。與之前的分離物不同，這種變體是精氨酸雙水解酶和核 糖陰性，似乎改變了它的莢膜組成(Bachrach et al. ,2001, Appl. Environ. Microbiol. 67 3756 ；Zlotkin et al.，1998，Appl. Environ. Microbiol. 64 4065)。已顯示，以色列的接種 計(jì)劃使一些病原體殘存在魚體內(nèi)或環(huán)境中，有足夠的選擇壓力使得一種明顯不同的血清型 占據(jù)了主導(dǎo)地位(Bachrach et al.，2001，同上)。
最近，在亞洲部分地區(qū)出現(xiàn)了兩種新疫苗能針對(duì)海豚鏈球菌感染提供保護(hù)。一種 是單價(jià)滅活疫苗(Norvaxl Strep Si)，可以以浸沒制劑(immersion)或注射制劑的形式使 用。先靈葆雅(Schering-Plough)開發(fā)了 AquaVac^Garvetil ，它提供針對(duì)海豚鏈球菌和 格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的聯(lián)合保護(hù)作用，可以以浸沒制劑的形式給予，或者 加在食物中口服。盡管已有海豚鏈球菌疫苗，這種病原體仍然是魚類和其它動(dòng)物中的主要問題。因 此，仍需要鑒定和分離海豚鏈球菌中能用于診斷和/或治療動(dòng)物的海豚鏈球菌感染的分子 成分。發(fā)明概述本發(fā)明涉及海豚鏈球菌的分離的M蛋白或M樣蛋白，以及編碼所述M蛋白或M 樣蛋白的分離的核酸，所述蛋白在具體的非限制形式中，可表現(xiàn)出相對(duì)減少的血纖蛋白原 (fibrinogen)結(jié)合。本發(fā)明還涉及用于診斷和/或治療動(dòng)物的海豚鏈球菌感染的組合物和方法。一方面，本發(fā)明提供海豚鏈球菌的分離的M蛋白或M樣蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的M蛋白或M樣蛋白可包含選自下組的氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT(SEQ ID NO 1)和 KMAEIQEEANKKIAA(SEQ ID NO :2)。在具體實(shí)施方案中，所述海豚鏈球菌的分離的M蛋白或M樣蛋白可包含氨基酸序 列 SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO :4。另一方面，本發(fā)明提供比含有氨基酸序列SEQ ID NO :3或SEQ IDNO :4的分離的 蛋白對(duì)血纖蛋白原的結(jié)合減少或降低的分離的蛋白，所述分離的蛋白包含海豚鏈球菌M 蛋白或M樣蛋白的氨基酸序列，但不含有選自下組的氨基酸序列RLTLEEKMEALRKVVT (SEQ ID NO 1) ；KMAEIQEEANKKIAA (SEQ ID NO 2)；以及 SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 的殘基 190-220中的一或多個(gè)殘基。所述與血纖蛋白原的結(jié)合減少的分離的蛋白可包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 禾口 SEQ ID NO :7。另一方面，本發(fā)明提供分離的蛋白，其包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 1 ； SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3 ；SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 ；禾口 SEQ ID NO :7。另一方面，本發(fā)明提供上述任一方面的分離的蛋白的片段、變體或衍生物。另一方面，本發(fā)明提供編碼上述任一方面的分離的蛋白、其片段、變體或衍生物的 分離的核酸。所述分離的核酸可包含SEQ ID NOS :8_11和39任一所示的核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明提供遺傳構(gòu)建體，其包含上述任一方面的分離的核酸。另一方面，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，其包含上述方面的遺傳構(gòu)建體。另一方面，本發(fā)明提供與海豚鏈球菌的分離的M蛋白或M樣蛋白、或其片段、變體 或衍生物結(jié)合的抗體。另一方面，本發(fā)明提供組合物，其包含上述任一方面所述的海豚鏈球菌的分離的M 蛋白或M樣蛋白、或其片段、變體或衍生物、或其抗體，以及合適的載體，稀釋劑或賦形劑。所述組合物可以是能激發(fā)抗海豚鏈球菌的免疫應(yīng)答的免疫治療性組合物。所述組合物可以是能激發(fā)抗海豚鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗。
5
另一方面，本發(fā)明提供了治療動(dòng)物的海豚鏈球菌感染的方法，所述方法包括對(duì)感 染了海豚鏈球菌的動(dòng)物施用組合物、從而治療所述感染的步驟，所述組合物包含海豚鏈球 菌的分離的M蛋白或M樣蛋白、或其片段、變體或衍生物、或其抗體，以及合適的載體，稀釋 劑或賦形劑。另一方面，本發(fā)明提供了免疫動(dòng)物以抵抗海豚鏈球菌的方法，所述方法包括對(duì)感 染了海豚鏈球菌的動(dòng)物施用組合物、從而免疫所述動(dòng)物的步驟，所述組合物包含海豚鏈球 菌的分離的M蛋白或M樣蛋白、或其片段、變體或衍生物、或其抗體，以及合適的載體，稀釋 劑或賦形劑。另一方面，本發(fā)明提供了確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成 分的方法，所述方法包括，確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含分離的蛋白或其片 段、變體或衍生物的步驟，它們的存在表示所述動(dòng)物正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌或其成 分。另一方面，本發(fā)明提供確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分 的方法，所述方法包括，確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含上述任一方面所述的 分離的核酸的步驟，所述分離的核酸的存在表示所述動(dòng)物正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌或 其成分。另一方面，本發(fā)明提供確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分 的方法，所述方法包括，確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含與海豚鏈球菌的分離 的M蛋白或M樣蛋白結(jié)合的抗體或抗體片段的步驟，所述抗體或抗體片段的存在表明所述 動(dòng)物正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌或其成分。另一方面，本發(fā)明提供診斷試劑盒和/或診斷組合物，其包含一或多種用于檢測 海豚鏈球菌、其分子成分或其抗體的檢測試劑。診斷試劑盒和/或組合物可包含一或多種適合基于核酸或基于蛋白的檢測的檢 測試劑，并包含一或多種抗體、探針和/或引物以便于檢測海豚鏈球菌M蛋白或M樣蛋白， 其編碼核酸和/或片段。在本說明書全文中，除非另外指明，“包含”和“含有”表示包含而非排除，因此所提 到的一個(gè)或一組整數(shù)可包括一或多個(gè)未提及的整數(shù)或整數(shù)組。


圖1.海豚鏈球菌QMA72菌株編碼M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 8)。圖2.海豚鏈球菌QMA76菌株編碼M蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO 9)。圖3.海豚鏈球菌QMA141菌株編碼M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 10)。圖4A.海豚鏈球菌QMA136菌株編碼M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 11)。該核苷 酸序列包括分別編碼QMA136的M蛋白N-端氨基酸序列(SEQ ID NO 6)和QMA136的M蛋 白C-端氨基酸序列(SEQ ID NO 7)的分隔開的開放讀框(殘基1-609和殘基677-1606)。圖4B.海豚鏈球菌QMA136菌株的M蛋白N-端氨基酸序列(SEQ IDNO 6)。圖4C.海豚鏈球菌QMA136菌株的M蛋白C-端氨基酸序列(SEQ IDNO 7)。圖5.海豚鏈球菌M蛋白氨基酸序列SEQ ID NOS :3_7)的氨基酸比對(duì)。圖 6 來自分離物 QMA0072(SEQ ID NO 3), QMA0076 (SEQ ID NO :4)禾口 QMAO141 (SEQ
6ID NO 5)的M蛋白與停乳鏈球菌(S. dysgalactiae)demA基因產(chǎn)物(CAB65411 ；SEQ ID NO 12)的氨基酸序列比對(duì)。圖7.海豚鏈球菌simA基因(SEQ ID NO 39)和M蛋白(SEQ ID NO 4)的核苷酸 序列和氨基酸序列。推定的Mgx蛋白結(jié)合位點(diǎn)用粗體表示，推定的啟動(dòng)子序列(-10和-35 序列盒和核糖體結(jié)合位點(diǎn)-RBS-序列)用框表示，反向重復(fù)序列用三角重點(diǎn)標(biāo)示，膜錨 (membrane anchor)為斜體，終止子為粗體并帶星號(hào)。圖8. M蛋白的表達(dá)和Western印跡。圖A 來自大腸桿菌表達(dá)裂解物的蛋白考馬 斯亮藍(lán)染色。泳道1-分子量標(biāo)志，泳道2-對(duì)照裂解物，泳道3-QMA0072，泳道4-QMA0076， 泳道5-QMA0141。圖B :M蛋白用生物素化血纖蛋白原進(jìn)行Western印跡檢測。泳道1_5對(duì) 應(yīng)于考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠。圖9.血纖蛋白原結(jié)合對(duì)海豚鏈球菌對(duì)尖吻鱸(barramundi)巨噬細(xì)胞活化作用的 影響。海豚鏈球菌分離物QMA0072在指數(shù)期收獲，與血纖蛋白原、BSA或HBSS —起保溫，呼吸 爆發(fā)(respiratory burst)通過魯米諾(luminal)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence) 檢測。圖10.海豚鏈球菌疫苗試驗(yàn)的Kaplan-Meyer存活曲線。圖11.兩種疫苗基于2個(gè)平行試驗(yàn)(BL21simA)或單個(gè)試驗(yàn)(pUK21simA)的相對(duì) 百分比存活。RPS參照合適的對(duì)照(E.coli BL21或空的pUK21載體)進(jìn)行計(jì)算。優(yōu)選實(shí)施方式詳述本發(fā)明涉及分離和鑒定海豚鏈球菌M蛋白同工型(isoform)，其可用于診斷和/或 治療動(dòng)物的海豚鏈球菌感染，所述動(dòng)物包括但不限于魚和哺乳動(dòng)物，后者如人類和海豚。
一方面，本發(fā)明提供海豚鏈球菌的分離的M蛋白或M樣蛋白。為了本發(fā)明的目的，“分離的”是指物質(zhì)脫離其天然狀態(tài)或經(jīng)歷了人為操作。分 離的物質(zhì)可以實(shí)質(zhì)上或基本上不含在其天然狀態(tài)中正常與其相伴的成分，或者可以經(jīng)過操 作，與在其天然狀態(tài)中正常與其相伴的成分一起成為人工狀態(tài)。分離的物質(zhì)可以是天然的、 化學(xué)合成的或重組形成的。本文中，“海豚鏈球菌M蛋白”或“海豚鏈球菌M樣蛋白”是可從海豚鏈球菌獲得的 蛋白，和/或包含可從海豚鏈球菌獲得的蛋白的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白當(dāng)為M樣蛋白 時(shí)在結(jié)構(gòu)和功能上與另一種A族鏈球菌的M蛋白為直系同源(orthologous)或至少是相關(guān) 的?！癕蛋白”是A族鏈球菌的蛋白，常見于外延至外周莢膜的細(xì)菌細(xì)胞壁上。M蛋白可 以在不同血清型之間有差異。M蛋白也可以通過保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受胞吞作用而給鏈球菌提 {共母力O“蛋白”是指氨基酸聚合物。所述氨基酸可以是本領(lǐng)域眾所周知的天然或非天然的 氨基酸，D-或L-氨基酸?！半摹笔巧儆?0個(gè)氨基酸的蛋白?！岸嚯摹笔怯?0個(gè)以上的氨基酸的蛋白。本發(fā)明各個(gè)方面提供了海豚鏈球菌的分離的M蛋白，包括所述M蛋白的片段、變體 或衍生物。在具體方面，所述海豚鏈球菌的分離的M蛋白包含氨基酸序列SEQ IDNO 3或SEQID NO :4。本發(fā)明還提供了海豚鏈球菌M蛋白的同工型，推定其在M蛋白的基因中插入40個(gè) 核苷酸，其不包含氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT(SEQID NO 1)和 KMAEIQEEANKKIAA(SEQ ID NO 2)中的至少一個(gè)序列。這些蛋白的實(shí)例在本文中見SEQ ID N0S:6和7。后文提供的數(shù)據(jù)表明，這些M蛋 白顯示出對(duì)血纖蛋白原的結(jié)合減少。而且，含氨基酸序列SEQ ID NO :5的M蛋白不包含氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT(SEQ ID NO :1)和KMAEIQEEANKKIAA(SEQ IDNO :2)，但顯示與血纖蛋白原 的結(jié)合減少。此外，或備選地，缺少SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4的殘基190-220中的一或多個(gè)
殘基的M蛋白可結(jié)合減少量或降低水平的血纖蛋白原。雖然缺乏RLTLEEKMEALRKVVT (SEQ ID NO 1), KMAEIQEEANKKIAA (SEQ ID NO 2)和 /或缺乏SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 4的殘基190-220中的一或多個(gè)殘基是結(jié)合減少量或 降低水平的血纖蛋白原的M蛋白或M樣蛋白的特征，但并不是說，這些氨基酸序列構(gòu)成了血 纖蛋白原結(jié)合位點(diǎn)，或?qū)ρw蛋白原結(jié)合作出貢獻(xiàn)。合適地，血纖蛋白原結(jié)合比含有選自SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的氨基酸序列 的分離的M蛋白減少。“減少或降低”在上下文中是指，被具有氨基酸序列SEQ ID NO :3或SEQID NO 4 的M蛋白結(jié)合的血纖蛋白原的量少于99 %，在一個(gè)方面少于95 %，在一個(gè)方面少于90 %，在 一個(gè)方面少于75%，在另一方面少于50%或少于40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、 3%、2%或1%，“分子比分子”。不希望受任何具體理論束縛，我們認(rèn)為，血纖蛋白原可能掩蓋對(duì)海豚鏈球菌M蛋 白的免疫應(yīng)答，在這種情況下，與血纖蛋白原的結(jié)合減少的分離的蛋白可能是對(duì)動(dòng)物給藥 的特別有用的免疫原。本文中，“動(dòng)物”包括且涵蓋易感于海豚鏈球菌感染的動(dòng)物，包括但不限于魚和哺 乳動(dòng)物，如人類和海豚?！棒~”在本文中的范圍包括無頌魚(Agnatha)，沒有頌的魚如粘盲鰻(hagfish) 和七鰓鰻(lampreys)；軟骨魚(Chrondrichthyes)，骨骼由軟骨構(gòu)成的魚；以及，硬骨魚 (Osteichthyes)，骨骼大都由硬骨構(gòu)成的魚。硬骨魚主要包含兩大類線鰭魚(ray-firmed fish)和葉鰭魚(lobe-finned fish)。本發(fā)明一個(gè)方面，所述魚是線鰭魚。易感于海豚鏈球菌感染、可應(yīng)用本發(fā)明的魚的非限制性實(shí)例包括市場上很重要的 魚，如大馬哈魚(salmon)，尖吻鱸，花鱸(seabass)，鲆鰈(flounder)，鱒魚(trout)，鯛魚 (bream)，嚙魚(snapper)，尼羅河巨鱸(Nile perch)，羅非魚，鯔魚(mullet)，鱈魚(cod)和 有黃尾的魚(yellowtail)。更多易感于海豚鏈球菌感染的魚見Agnew&Barnes，2007，同上。另一方面，本發(fā)明提供海豚鏈球菌的分離的M蛋白的片段、變體或衍生物，包括具 有減少的血纖蛋白原結(jié)合的分離的蛋白?！暗鞍灼巍笔堑鞍椎纳儆?00%氨基酸序列的節(jié)段、域、部分或區(qū)。例如，蛋白片段可包含最多該蛋白的99%，95%，90%，85%，80%，75%，70%，
865%,60%,55%,50%,45%,40%,35%,30%,25%,20%, 15%, 10%,5%,3%,2%^ 1% 在具體方面，所述蛋白片段可包含例如海豚鏈球菌M蛋白的至少5，10，20，30，40， 50 60，70，80，90，100，120，140，150，200，250，300，350，400，450 或 500 個(gè)連續(xù)氨基酸。肽可以是蛋白片段，例如，包含至少6，10，12，15，20，30，40個(gè)，最多50個(gè)連續(xù)氨基酸。蛋白片段，包括肽片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)的重組核酸技術(shù)獲得，或用常規(guī)液相或固相 合成技術(shù)合成得到。例如，溶液合成或固相合成可參見CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE，第 18 章，Coligan 等編(JohnWiley&Sons，1995-2000)?；蛘?，肽可通過用蛋白酶 如endoLys-C，endoArg-C, endoGlu-C和V8-蛋白酶消化本發(fā)明的多肽來產(chǎn)生。被消化的片 段可通過層析純化，就像本領(lǐng)域眾所周知的那樣。在本發(fā)明各個(gè)方面，蛋白片段可以是“生物活性蛋白片段”，其展示全長海豚鏈球 菌M蛋白的生物活性的至少25 %，更優(yōu)選至少50 %，還更優(yōu)選至少70 %，75 %，80 %，85 %， 90%，95%或 最多100%。生物活性可以是免疫原性，抗原性和/或血纖蛋白原結(jié)合，但不限 于這些。所述蛋白片段的非限制性實(shí)例包括，不含氨基酸序列RLTLEEKMEALRKVVT(SEQ ID NO 1)和KMAEIQEEANKKIAA(SEQ IDNO 2)、或者缺乏這兩個(gè)序列中的一個(gè)或另一個(gè)的分離 的M蛋白。所述片段的具體實(shí)例分別包含氨基酸序列SEQ ID NOS 6和7，其展示相對(duì)減少的
血纖蛋白原結(jié)合。備選地，生物活性蛋白片段可展示比全長海豚鏈球菌M蛋白增強(qiáng)的活性。分別含有氨基酸序列SEQ ID NOS :6和7的蛋白片段可展示比全長海豚鏈球菌M 蛋白增加的或增強(qiáng)的免疫原性。在其它實(shí)施方案中，生物活性片段可包括本發(fā)明M蛋白的成熟加工形式。例如，生物活性片段可缺乏N-端信號(hào)序列。非限制性實(shí)例包括，缺乏氨基酸1-41 的N-端加工的M蛋白。本發(fā)明還提供本發(fā)明分離的蛋白的變體?！白凅w”在其范圍內(nèi)包括，天然變體如等位基因變體，直系同源物(ortholog)和同 系物和人工創(chuàng)建的突變體，等等。術(shù)語"突變"用在本文中一般涵蓋在分離的蛋白或其片段中的保守或非保守的 氨基酸取代、缺失和/或插入。一般地，蛋白變體具有與本發(fā)明分離的蛋白，例如SEQ ID NOS 1_7任一所示的蛋 白，至少80%的氨基酸序列同一性。在本發(fā)明一些方面，蛋白變體具有與本發(fā)明分離的蛋 白，例如 SEQ ID NOS :1-7 任一所示的蛋白，至少 85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%， 96 %，97 %，98 %或99 %的氨基酸序列同一性。本文用于描述核酸或蛋白的序列關(guān)系的術(shù)語包括，“對(duì)比窗口(comparison window) ”，“序列同一性”，“序列同一性百分比”和“實(shí)質(zhì)同一性(substantial identity)，，。 由于核苷酸或氨基酸序列各自可能包含(1)完整序列上為這些核酸或蛋白共有的僅一個(gè) 或多個(gè)部分，和(2)在這些核酸或蛋白上有差異的一或多個(gè)部分，序列比較通常是在“比對(duì) 窗口 ”中比較序列、以便鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性。“比對(duì)窗口 ”是指與參考序列相比較的通常至少6，10，12，20或更多個(gè)連續(xù)殘基的概念性節(jié)段。比對(duì)窗口可包含與參考序 列相比而言的約20%或更少(例如5，10或15%)的插入或缺失(即空隙)，以便于各個(gè)序 列的最佳比對(duì)。在比對(duì)窗口中進(jìn)行序列最佳比對(duì)可用計(jì)算機(jī)中運(yùn)行的算法(如ECLUSTALW 和BESTFIT，由WebAngis GCG，2D Angis,GCG and GeneDoc項(xiàng)目提供，將其引入本文作參考) 來進(jìn)行，或通過目測進(jìn)行，最佳比對(duì)(即，導(dǎo)致在該比對(duì)窗口中出現(xiàn)最高百分比同源性)通 過多種方法中所選的任一種方法產(chǎn)生。本文中，“蛋白衍生物”是指在海豚鏈球菌的天然M蛋白的氨基酸序列中含有一或 多個(gè)化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)修飾或改變。僅為舉例的目的，蛋白衍生物可包含一或多個(gè)修飾，包括氨基酸側(cè)鏈修飾，非天然 氨基酸，糖基化氨基酸殘基，交聯(lián)的氨基酸殘基，和/或其它氨基酸殘基。本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基酸側(cè)鏈修飾的例子包括，用乙酸酐?；?；用琥珀酸酐和 四氫苯二甲酸酐(tetrahydrophthalic anhydride)使氨基酰化；用乙酰亞氨酸甲酯 (methylacetimidate)進(jìn)行脒基化(amidination)；用氰酸根(cyanate)對(duì)氨基進(jìn)行甲氨酰 化(carbamoylation)；用吡哆醛_5_磷酸使賴氨酸發(fā)生吡哆醛化(pyridoxylation)，再用 NaBH4還原；通過與醛反應(yīng)而發(fā)生還原性烷基化，再用NaBH4還原；和用2，4，6-三硝基苯磺 酸(TNBS)使氨基發(fā)生三硝基苯甲基化。羧基的修飾可以是，經(jīng)過0-酰基異脲(Ο-acylisourea)形成，進(jìn)行碳二亞胺活化 作用，隨后對(duì)例如相應(yīng)酰胺進(jìn)行衍生化。精氨酸的胍基可通過與諸如2，3- 丁二酮(butanedione)，苯甲酰甲醛 (phenylglyoxal)和乙二醛(glyoxal)等試劑形成雜環(huán)縮合物而修飾。巰基的修飾方法例如，對(duì)半胱磺酸(cysteic acid)進(jìn)行過甲酸(performicacid) 氧化；用4-氯汞苯磺酸，4-氯汞苯甲酸酯(鹽)，2_氯汞(Chl0r0merCuri)-4-硝基苯 酚(nitrophenol)，苯基汞氯化物，和其它汞劑形成汞(mercurial)衍生物；與其它硫 代化合物形成混合型二硫鍵；與馬來酰亞胺，馬來酸酐或其它取代的馬來酰亞胺反應(yīng)； 與碘乙酸或碘乙酰胺發(fā)生羧甲基化；以及與氰酸酯(鹽)在堿性pH發(fā)生氨基甲?；?(carbamoylation)0色氨酸殘基的修飾方法例如，將吲哚環(huán)用2-羥基-5-硝基苯溴化物或磺酰鹵化物 進(jìn)行烷基化，或用N-溴琥珀酰亞胺進(jìn)行氧化。酪氨酸殘基的修飾可以是，用四硝基甲烷硝化，形成3-硝基酪氨酸衍生物。組氨酸殘基的咪唑環(huán)的修飾可以是，用二乙基焦碳酸酯(diethylpyrocarbonate) 進(jìn)行N-乙酯基化，或用碘乙酸衍生物烷化。在肽合成期間摻入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于，使用4-氨基丁 酸，6-氨基己酸，4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸，4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，叔丁基甘 氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥氨酸，肌氨酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的 D-異構(gòu)體。衍生物還包括分離的融合蛋白，其包含額外的氨基酸序列如N-或C-端融合配偶 序列。融合配偶幫助鑒定和/或純化含有該融合配偶的融合蛋白。融合配偶的眾所周知的例子包括但不限于，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，F(xiàn)c和人 IgG鉸鏈區(qū)，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和六聚組氨酸(HIS6),它們都特別有用于通過親和純化
10分離融合蛋白。為了通過親和純化分離融合蛋白，相關(guān)的親和層析基質(zhì)分別是谷胱甘肽_， 直鏈淀粉_，和鎳-或鈷-偶聯(lián)的樹脂。多種這類基質(zhì)以試劑盒(“kit”)的形式提供， QIAexpress 系統(tǒng)(Qiagen)可用于(HIS6)融合配偶，還有Pharmacia GST純化系統(tǒng)。在有些例子中，融合配偶還有蛋白酶裂解位點(diǎn)，如凝血因子Xa或凝血酶，其允許相 關(guān)蛋白酶對(duì)本文所述融合蛋白進(jìn)行部分消化，并因此釋放本發(fā)明的蛋白。所釋放的蛋白然 后可提供層析分離技術(shù)與融合配偶分離。融合配偶還包括“表位標(biāo)簽”，它們常常是短肽序列，有它們各自的特異性抗體。有 相應(yīng)的特異性單克隆抗體的表位標(biāo)簽的熟知例子包括c-myc，流感病毒血凝素和FLAG標(biāo)簽。本發(fā)明的分離的海豚鏈球菌M蛋白，包括其片段、變體和衍生物，可制成重組形式 或化學(xué)合成形式。通常，重組蛋白可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法方便地制備。不超過60-80個(gè)連續(xù)氨基酸的肽和其它蛋白片段最好用化學(xué)合成法制備。這類方 法是本領(lǐng)域眾所周知的。海豚鏈球菌的M蛋白可被誘導(dǎo)表達(dá)，并且，在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基的正常培養(yǎng)條件 下表達(dá)時(shí)至少部分地難以控制(reftactory)。因此，M蛋白的表達(dá)可通過在細(xì)菌培養(yǎng)期間 包含誘導(dǎo)劑來促進(jìn)。非限制性實(shí)例有，金屬，螯合劑，血清蛋白和/或其它誘導(dǎo)海豚鏈球菌 M蛋白的細(xì)菌表達(dá)或使其最大化的添加劑。本發(fā)明一個(gè)方面還包括結(jié)合、識(shí)別和/或抗本發(fā)明的分離的蛋白，其片段、變體或 衍生物的抗體?？贵w也包括抗體片段，如Fc片段，F(xiàn)ab和Fab，2片段，雙抗體(diabodies)， Fv和scFv片段。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。抗體可以在合適的生成動(dòng)物如小 鼠、大鼠、兔、綿羊、小雞或山羊中產(chǎn)生。備選地，抗體可以從已天然暴露于海豚鏈球菌或其M蛋白的魚或其它動(dòng)物分離。單克隆抗體可以用諸如CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Eds. Coligan et al.John Wiley&Sons. 1995-2000)禾口 Harlow, Ε·&Lane, D. Antibodies :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour, Cold Spring HarbourLaboratory, 1988)等描述的標(biāo)準(zhǔn)方 法制備。這類方法通常涉及，從如上述免疫的動(dòng)物獲得抗體生成細(xì)胞，如脾細(xì)胞，使所述細(xì) 胞永生化，如通過與永生化的融合配偶細(xì)胞融合來實(shí)現(xiàn)。單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段也可以重組產(chǎn)生。這樣的重組方法是本領(lǐng)域已知 的，有多種商業(yè)來源可以制備重組抗體。如本領(lǐng)域已知，抗體可與選自下組的標(biāo)記物偶聯(lián)，所述組包括酶、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā) 光分子、生物素、放射性同位素或其它標(biāo)記。可用于本發(fā)明的合適的酶標(biāo)記的例子包括，堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，螢光素 酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，溶菌酶，蘋果酸脫氫酶，等等。酶標(biāo)記可單獨(dú)使用，或者 與第二種酶一起在溶液中使用，或者與合適的色原性底物或化學(xué)發(fā)光底物一起使用。色原的例子包括，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，永固紅(permanent red)，3-乙基苯并噻 唑啉磺酸(ABTS)，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)，氮藍(lán)四唑(NBT)，3，3' ,5,5'-四 甲基聯(lián)苯胺(TNB)和4-氯-1-萘酚(4-CN)，但不限于此?；瘜W(xué)發(fā)光底物的非限制性例子是魯米諾(Luminol) ，在有辣根過氧化物酶和過氧化氫存在的條件下氧化形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物(3_氨基鄰苯二甲酸酯)。熒光團(tuán)可以是異硫氰酸熒光素(FITC)，異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)，別 藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)，德克薩斯紅(Texas Red, TR)，Cy5或R-藻紅蛋白 (R-Phycoerythrin, RPE)，但不限于此。放射性同位素標(biāo)記可包括125I，131I，51Cr和"Tc，但不限于此。其它可用的抗體標(biāo)記包括膠體金顆粒和洋地黃毒苷(digoxigenin)。本發(fā)明還提供分離的核酸，其編碼本文所述分離的M蛋白，包括所述分離的M蛋白 的片段、變體和衍生物。在具體方面，所述本發(fā)明提供分離的核酸，其含有SEQ ID NOS :8_11和39任一所 示的核苷酸序列。尤其對(duì)于SEQ ID NO :11而言，所示核苷酸序列包含由殘基1-609和殘基 677-1606定義的分隔開的開放讀框。 術(shù)語“核酸”在本文中表示單鏈或雙鏈mRNA，RNA, cRNA, RNAi，siRNA和DNA，包括 cDNA,線粒體DNA (mtDNA)和基因組DNA?！岸嗪塑账帷笔蔷哂?0個(gè)以上連續(xù)核苷酸的核酸，“寡核苷酸”則具有不到80個(gè)連
續(xù)核苷酸。寡核苷酸的非限制性實(shí)例見表1和3 (SEQ ID NOS 18-38)。本發(fā)明還提供核酸變體，包括同源的、直系同源的、以及突變的核苷酸序列。一方面，本發(fā)明提供變體核酸，其具有與本發(fā)明分離的核酸至少70 %，75 %，80 %， 85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，96%，98%或 99%的核苷酸序列同一性。本發(fā)明的變體核酸可與本發(fā)明的分離的核酸在高度嚴(yán)格條件下雜交。嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域眾所周知的，如參見Ausubel et al. CURRENTPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY (John ffiley&Sons NY, 1995-2006)的章節(jié) 2. 9 和 2. 10，尤其第 2. 9. 1 至 2. 9. 20 頁。通常，嚴(yán)格程度根據(jù)雜交和/或洗滌期間一或多個(gè)因子的濃度而有不同。所述因 子可包括，離子強(qiáng)度，表面活性劑類型和/或濃度，溫度，變性劑類型和/或濃度，本領(lǐng)域?qū)?此眾所周知。適于獲得本發(fā)明分離的核酸的高度嚴(yán)格雜交條件包括但不限于_(i)至少約31% ν/ν至至少約50% ν/ν甲酰胺和至少約0. OlM至至少約0. 15Μ 鹽，在42°C雜交，以及至少約0. OlM至至少約0. 15M鹽在42V洗浲；(ii) 1% BSA, ImM EDTA，0.5M NaHPO4 (pH 7. 2)，7% SDS，在 65°C 雜交，和(a) 0. Ix SSC，0. SDS ；或(b)0. 5% BSA，ImM EDTA,40mM NaHPO4 (pH 7. 2)，1 % SDS，在超過 65°C洗 滌約1小時(shí)；和(iii)0. 2x SSC，0. SDS 在 68°C或以上洗滌約 20 分鐘。一般地，洗滌在Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) % _12°C進(jìn)行。一般地，錯(cuò)配堿基的數(shù)量每 增加1 %，雙鏈DNA的Tm降低約1V。因此可以理解，變體、同系物和直系同源物的具體例子包括但不限于與SEQ ID NOS 8-11和39中任一個(gè)互補(bǔ)或至少部分互補(bǔ)的核酸；含有因考慮密碼子序列豐度而有差 異的核苷酸序列的核酸，包括SEQ ID NOS :8-11和39任一的密碼子優(yōu)化變體；以及SEQ ID NOS 8-11和39任一的天然變體或等位基因變體。
12
本發(fā)明還涉及本發(fā)明分離的核酸的片段?！昂怂崞巍笔侵副景l(fā)明分離的核酸的單鏈或雙鏈核酸部分或亞序列。所述片段 可包含由本發(fā)明分離的核酸的至少1%，2%，5%，7%，10%，20%，30%，40%，50%，60%， 70 %，80 %，90 %，95 %或99 %連續(xù)核苷酸序列組成的連續(xù)核苷酸序列。所述片段可包含 由本發(fā)明分離的核酸的至少 6，10，15,20,30,50,80,100，200，300，400，500，600，700，800， 900，1000，1100，1200，1300，1400或1500個(gè)連續(xù)核苷酸組成的連續(xù)核苷酸序列。核酸片段的非限制性例子是SEQ ID NO :11的殘基1-609和殘基677-1606定義的 開放讀框。在一些方面，核酸片段可以是弓I物或探針。“引物”常常為單鏈寡核苷酸，優(yōu)選有9-60個(gè)連續(xù)核苷酸，能與互補(bǔ)的核酸“靶”退 火，而且能在DNA聚合酶如Taq聚合酶，RNA-依賴性DNA聚合酶或SEQuenase 的作用下以 模板依賴方式延伸。在具體實(shí)施方案中，引物可包含至少10，12，15，18，20，25，30，35，40，45或50個(gè)連
續(xù)核苷酸。“探針”可以是單鏈或雙鏈寡核苷酸或多核苷酸，能與靶核酸上述至少部分互補(bǔ)于 該探針的核苷酸序列退火。探針和引物可被標(biāo)記以便于檢測。標(biāo)記物包括放射性同位素，熒光團(tuán)包括熒光供 體和受體分子，以及用于比色檢測或化學(xué)發(fā)光檢測的酶，如本領(lǐng)域熟知的那樣。“靶”核酸可以是任何能被檢測、被結(jié)合、或能與本發(fā)明的引物或探針退火的核酸。本發(fā)明還提供“遺傳構(gòu)建體”，其包含本發(fā)明的一或多種分離的核酸，片段或變體。本文中，“遺傳構(gòu)建體"是人工制得的核酸，其插入并且/或者有利于應(yīng)用編碼 本發(fā)明分離的M蛋白、其片段、變體或衍生物的分離的核酸。在具體實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體可用于重組操作，繁殖，擴(kuò)增，同源重組和/或表 達(dá)所述分離的核酸。本文中，用于蛋白表達(dá)的遺傳構(gòu)建體稱為"表達(dá)構(gòu)建體"，其中，待表達(dá)的分離的 核酸在表達(dá)載體中與一或多個(gè)調(diào)控序列可操作地相連。“表達(dá)載體”可以是自我復(fù)制的染色體外載體如質(zhì)粒，或者是整合到宿主基因組中 的載體。在本發(fā)明一個(gè)方面，表達(dá)載體是質(zhì)粒載體。“可操作地相連”是指，所述調(diào)控核苷酸序列相對(duì)于所述核酸所處的位置能啟動(dòng)、 調(diào)節(jié)或控制該核酸的表達(dá)。調(diào)控核苷酸序列一般適于表達(dá)所用到的宿主細(xì)胞。針對(duì)多種宿主細(xì)胞合適的表達(dá) 載體和合適的調(diào)控序列本領(lǐng)域已知有多種類型。一或多種調(diào)控核苷酸序列可包括但不限于，啟動(dòng)子序列，前導(dǎo)序列或信號(hào)序列，核 糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始和終止序列，翻譯起始和終止序列，剪接供體/受體序列，以及增 強(qiáng)子或激活劑序列。本領(lǐng)域已知的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子都可以用，包括例如四環(huán)素阻遏型、IPTG-誘 導(dǎo)型、醇(alcohol)-誘導(dǎo)型、酸-誘導(dǎo)型和/或金屬_誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。一方面，表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記可用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如bla，kanR和tetR)或用于選擇轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如潮霉素，G418和嘌呤霉素)。適于表達(dá)的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，如海豚鏈球菌，大腸桿菌(例 如DH5)，酵母細(xì)胞，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中使用的SF9細(xì)胞，或多種哺乳動(dòng)物或其它動(dòng)物宿 主細(xì)胞中的任一種，但不限于此。將表達(dá)構(gòu)建體引入合適的宿主細(xì)胞的技術(shù)包括但不限于，電穿孔，熱休克，磷酸鈣 沉淀，DEAE葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染(如lipofectin，lipofectamine)，原 生質(zhì)體融合，顯微注射或顯微粒子轟擊，象本領(lǐng)域已知的那樣。在具體方面，本發(fā)明提供治療動(dòng)物的海豚鏈球菌感染的組合物和/或方法。在一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供治療感染了海豚鏈球菌的動(dòng)物的方法，所述方法包 括對(duì)所述動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物以預(yù)防性或治療性處理所述海豚鏈球菌感染。在另一具體方面，本發(fā)明提供免疫動(dòng)物使其抵抗海豚鏈球菌的方法，所述方法包 括對(duì)所述動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物以提供抗海豚鏈球菌的免疫。本發(fā)明海豚鏈球菌M蛋白或M樣蛋白的一個(gè)特別的特性是，測試了 50個(gè)分離物， 所觀察到的序列變異相對(duì)有限。因此，海豚鏈球菌M蛋白或M樣蛋白可用于激發(fā)抗多種海 豚鏈球菌菌株的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明的組合物和方法可用在各種易感于海豚鏈球菌感染的動(dòng)物，包括海豚和魚 中，但不限于此。組合物可包括分離的海豚鏈球菌M蛋白或其片段；結(jié)合海豚鏈球菌M蛋白或其片 段的抗體；編碼海豚鏈球菌M蛋白或其片段的分離的核酸；和/或誘導(dǎo)表達(dá)海豚鏈球菌M蛋 白的減毒或滅活的海豚鏈球菌細(xì)菌。本發(fā)明的組合物可以用于獸醫(yī)用途或醫(yī)療用途，并包括合適的載體，稀釋劑或賦 形劑。在本發(fā)明一個(gè)方面，提供了“免疫治療性組合物”，其給予動(dòng)物后，提供、幫組或激 發(fā)動(dòng)物抗海豚鏈球菌的免疫應(yīng)答。所述組合物可以是疫苗的形式。任何合適的方法都可以用于制備免疫治療性組合物和疫苗。一方面，本發(fā)明給動(dòng)物提供抗海豚鏈球菌感染的被動(dòng)或主動(dòng)免疫。被動(dòng)免疫通過給予有效量的本文所述抗體或抗體片段來提供。主動(dòng)免疫通過給予有效量的M蛋白或其免疫原性片段來實(shí)現(xiàn)。分離的M蛋白及其 免疫原性片段可以為重組蛋白或化學(xué)合成肽的形式。減毒的細(xì)菌性疫苗可以給予動(dòng)物，包括魚和人類。例如，減毒的細(xì)菌可表達(dá)一或多種重組海豚鏈球菌M蛋白或其片段，或?yàn)闇p毒的、 誘導(dǎo)表達(dá)一或多種內(nèi)源性海豚鏈球菌M蛋白的海豚鏈球菌細(xì)菌。細(xì)菌的減毒或滅活，例如通過熱、化學(xué)處理等方法，是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明還提供核酸疫苗，其編碼一或多種分離的海豚鏈球菌M蛋白或其片段。本文中，術(shù)語"核酸疫苗”包括"質(zhì)粒疫苗"和“病毒疫苗”。—方面，核酸是質(zhì)粒DNA疫苗。一般而言，“載體，稀釋劑或賦形劑”是指，能安全地用于給予動(dòng)物如魚或人類的固 體或液體的填充劑、稀釋劑或膠囊化物質(zhì)。根據(jù)具體的施用途徑，可以采用本領(lǐng)域已知的多 種載體。這些載體可選自下組，包括糖(sugar)，淀粉(starch)，纖維素及其衍生物，麥芽，
14明膠，滑石粉，硫酸鈣，植物油，合成的油，多元醇，藻酸，磷酸鹽緩沖液，等滲鹽水，無熱原的 水，三卡因(tricaine)，增濕或乳化劑，膨脹劑(bulking agent)，包衣，粘合劑(binder)， 填充劑，崩解劑(disintegrant)，稀釋劑，潤滑劑，pH緩沖劑。在核酸疫苗的情況下，DNA表達(dá)載體可以裸露著運(yùn)送，或者可以以陽離子脂 質(zhì)-DNA復(fù)合體、脂質(zhì)體、磷酸鈣共沉淀物、吸附在微粒子上的形式提供，但不限于此。因施用本發(fā)明的核酸疫苗而激發(fā)的免疫應(yīng)答可以用其它核苷酸序列增強(qiáng)。所述其它核苷酸序列的非限制性例子包括，具有非甲基化CpG 二核苷酸的免疫刺 激性寡核苷酸，或編碼其它抗原性蛋白或佐劑性細(xì)胞因子的核苷酸序列。所述DNA可以為 裸露形式，或可以與細(xì)胞攝取促進(jìn)劑(如脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì))一起施用。免疫治療性組合物和疫苗可包括佐劑。合適的佐劑包括但不限于，表面活性物質(zhì)如十六烷胺，十八烷胺，，十八烷基氨基 酸酯，溶血卵磷脂，雙二十八烷基二甲基溴化銨，N，N-雙十八烷基-N' , N'雙(2-羥乙 基_丙二胺)，甲氧基十六烷基甘油，和pluronic polyols ；聚胺如吡喃，硫酸葡聚糖，多聚 IC carbopol ；肽如胞壁酰二肽及其衍生物，二甲基甘氨酸，tuftsin ；油乳液；和礦物膠如 磷酸鋁，氫氧化鋁或明礬；淋巴因子，QuilA和免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)。組合物或疫苗的有效劑量可根據(jù)受試者的個(gè)體大小、物種歸屬，以及根據(jù)給藥模 式而有不同。最佳劑量可以由醫(yī)生、獸醫(yī)、或水產(chǎn)專家(aquaculture specialist)經(jīng)過試 驗(yàn)和錯(cuò)誤來確定。對(duì)于魚類而言，疫苗可在單個(gè)劑量中包含0. 01-0. 5mg，優(yōu)選0. 025-0. 25mg或更優(yōu) 選約0. 05-0. 2mg蛋白。核酸疫苗的合適劑量可以低至皮克(pictogram)或高至mg級(jí)別，但通常為 約0.01-10(^8，優(yōu)選0.148-5(^8/單位劑量，更優(yōu)選約lyg_25yg，最優(yōu)選5yg to 10 μ g/單位劑量。由于魚可能因接種疫苗而遭受壓力(stress)，優(yōu)選疫苗為只單次注射的疫苗，是 單個(gè)劑量形式。對(duì)于注射性疫苗而言，單個(gè)劑量單位以0. 025-0. 5ml，優(yōu)選0. 04-0. 2ml，約 0. 05-0. Iml體積為宜。在與魚有關(guān)的多個(gè)方面，組合物和疫苗可制成液態(tài)溶液，減毒的細(xì)菌，注射用的乳 液或懸浮液，或浸沒在水中運(yùn)送。也可以制成適于分散在或懸浮于液態(tài)載劑中、或與固態(tài)食 物混合后再施用的固態(tài)形式(如粉末)。所述組合物或疫苗可凍干(lyophilized)，任選地 冷凍干燥(freeze-dried)，成為用無菌稀釋劑很容易重建的應(yīng)用形式。例如，凍干的疫苗可 以在0.9%鹽水(任選地作為包裝好的疫苗產(chǎn)品的一個(gè)部分來提供)中重建。核酸因其分子的穩(wěn)定性和長貨架期而特別適于凍干。備選地，組合物或疫苗可以 作為鹽水溶液來提供。疫苗的液態(tài)或重建形式可進(jìn)一步稀釋在少量水(如1-10個(gè)體積) 中，然后添加到圍欄(pen)，水池(tank)或水浴(bath)中，通過浸沒給予魚。本發(fā)明的疫苗 組合物可以以立即釋放或延遲釋放的形式給予。為了在魚中進(jìn)行基于核酸的治療或接種，可選用待接種的魚的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄調(diào)控序 列。例如，可考慮內(nèi)源細(xì)胞因子或肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子，或者其它調(diào)控序列可從魚DNA病毒 衍生得到。應(yīng)用于魚的DNA接種的非限制性實(shí)例參見美國專利5，780，448，美國專利公開號(hào)20050163795，美國專利公開號(hào)20060073167和美國專利公開號(hào)20050261227。在與治療和/或免疫魚有關(guān)的實(shí)施方案中，組合物還可口服給予，或者將魚浸沒 在含有免疫原性M蛋白或其免疫原性片段的稀釋組合物中來給予。魚用口服組合物包括魚飼料和/或添加劑，可以為顆粒(pellet)，碎屑 (granule)，液體，薄片(flake)或粉末形式，含有分離的海豚鏈球菌M蛋白或其免疫原性片 段。與魚有關(guān)的組合物、疫苗、治療和/或免疫方法特別有用于養(yǎng)魚場 (fishfarming)、孵魚場(fish hatcheries)和其它商業(yè)化漁業(yè)應(yīng)用。但也可理解，本發(fā)明 可在海豚鏈球菌感染對(duì)天然或其它野生魚群有副作用的地區(qū)用于保護(hù)野生魚群。在一些方面，本發(fā)明提供用于治療除魚以外的其它動(dòng)物的海豚鏈球菌感染的組合 物和/或方法。在一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供治療人的海豚鏈球菌感染的組合物和/或方法。人用劑量可以根據(jù)該人的年齡、體重、性別和總體健康狀況憑經(jīng)驗(yàn)算出。僅為舉例目的，蛋白劑量為0. l_lmg/70kg體重，或優(yōu)選約0. 3-0. 5mg/70kg體重可 以是有效的。任何合適的給藥途徑都可根據(jù)本發(fā)明用于人類患者。例如，口服、直腸、胃腸外、舌 下、經(jīng)頰(buccal)、靜脈、關(guān)節(jié)、肌肉、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹腔(intraperitoneal)、腦 室內(nèi)(intracerebroventricular)、經(jīng)皮等等途徑都可以采用。劑型可以包括，片劑、分散劑、懸浮劑、注射劑、溶液、糖漿、錠劑(troches)、膠囊、 栓劑、氣溶膠、透皮貼劑等等。這些劑型還可包括注射或植入特別為此目的設(shè)計(jì)的控制釋放 裝置或其它經(jīng)改良后在這種形式中起額外作用的植入形式?？刂漆尫趴梢酝ㄟ^，例如，用疏 水聚合物包裹藥物來實(shí)現(xiàn)，所述聚合物包括，丙烯酸樹脂，蠟，高級(jí)脂肪醇，聚乳酸和聚乙醇 酸和一些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素。此外，控制釋放可通過采用其它聚合物基質(zhì)、 脂質(zhì)體和/或微球體來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明適于口服或胃腸外給藥的組合物可以呈現(xiàn)為離散的單位如膠囊、小袋 (sachet)或片劑，它們每一個(gè)都含有預(yù)定量的一或多種本發(fā)明治療劑，為粉末或碎屑，或?yàn)?水性液體、非水性液體、水包油乳液或油包水乳液中的溶液或懸浮液。適于對(duì)人給藥的組合物和疫苗可按照例如New Generation Vaccines (1997， Levine et al. , Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong)所述制備，該文獻(xiàn)僅為 舉例。本發(fā)明的疫苗和組合物可以以減毒細(xì)菌疫苗的形式對(duì)人施用，其中所述細(xì)菌表 達(dá)一或多種重組海豚鏈球菌M蛋白或其片段。減毒細(xì)菌的非限制性實(shí)例包括，沙門氏 菌(Salmonella species),例如腸沙門氏菌鼠傷寒變種(Salmonella enterica var. Typhimurium)或傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)。備選地，其它腸道致病菌如志賀氏菌 (Shigella species)或大腸桿菌(E. coli)都可以以減毒形式使用。減毒的沙門氏菌菌株 通過滅活芳香族氨基酸生物合成途徑中的基因來構(gòu)建(Alderton et al. ,Avian Diseases 35 435)，通過將突變引入芳香族氨基酸生物合成途徑的兩個(gè)基因中(見例如美國專利 5，770,214)或引入其它基因如htrA中(見例如美國專利5，980，907)或引入編碼外膜蛋白 的基因如ompR中(見例如美國專利5，851，519)來構(gòu)建。
16
備選地，減毒細(xì)菌疫苗可包括經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)一或多種內(nèi)源海豚鏈球菌M蛋白或其片 段的海豚鏈球菌細(xì)菌。人用組合物和疫苗還可包含載體。載體的非限制性實(shí)例包括，甲狀腺球蛋白；清蛋白如人血清清蛋白，毒素，類毒素 或來自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌、大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌的毒素的任何突變的 交叉反應(yīng)性物質(zhì)(CRM)，聚氨基酸如聚(賴氨酸谷氨酸)，流感病毒；輪狀病毒VP6，細(xì)小 病毒(Parvovirus) VPl和VP2，乙肝病毒核心蛋白，乙肝病毒重組疫苗等等。備選地，可以使 用載體蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可以使用細(xì)菌來源的毒素，類毒素或 CRM的T細(xì)胞表位。在人類中，本發(fā)明的組合物和/或疫苗可以以多價(jià)形式與生物的抗原組合施用， 所述生物包括病原性細(xì)菌流感嗜血桿菌(H. influenzae)和其它嗜血桿菌(Haemophilus species),粘膜炎微球菌(Μ. catarrhal is),淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhoeae),大腸桿菌,月市 炎鏈球菌(S. pneumoniae)，等等。在其它具體方面，本發(fā)明提供檢測動(dòng)物中海豚鏈球菌感染的診斷方法。一方面，本發(fā)明提供確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分的 方法，所述方法包括，確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含分離的蛋白或其片段、變 體或衍生物的步驟，所述分離的海豚鏈球菌M蛋白或其片段、變體或衍生物的存在，表示所 述動(dòng)物正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌或其分子成分。另一方面，本發(fā)明提供確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分 的方法，所述方法包括，確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含本發(fā)明分離的核酸的 步驟，所述分離的核酸的存在表示所述動(dòng)物正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌或其分子成分。另一方面，本發(fā)明提供確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分 的方法，所述方法包括確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含與分離的海豚鏈球菌M 蛋白或片段結(jié)合的抗體或抗體片段的步驟，所述抗體或抗體片段的存在表示所述動(dòng)物正在 或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌或其分子成分。本發(fā)明還提供診斷試劑盒和/或診斷組合物用于檢測海豚鏈球菌細(xì)菌，其分子成 分，或與本發(fā)明的M蛋白或其片段結(jié)合的抗體。診斷試劑盒和/或組合物可適合基于核酸或基于蛋白的檢測，并包含一或多種檢 測試劑，如一或多種抗體、M蛋白或其片段、核酸探針和/或引物，以便于檢測生物樣品中的 抗海豚鏈球菌M蛋白的抗體，海豚鏈球菌M蛋白，其編碼核酸和/或片段。核酸檢測可以采用本領(lǐng)域已知技術(shù)，包括但不限于，Northern雜交，Southern雜 交，核苷酸序列擴(kuò)增，核酸陣列雜交，引物延伸產(chǎn)物的質(zhì)譜分析，DNA測序等。檢測方法還可包括對(duì)編碼海豚鏈球菌M蛋白的核酸或其片段進(jìn)行核苷酸序列擴(kuò) 增的步驟。本文中，“核酸序列擴(kuò)增技術(shù)"包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鏈置換擴(kuò)增 (SDA)；滾環(huán)復(fù)制(RCR)；基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，參見例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)； Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增和依賴于解旋酶的擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸序列擴(kuò)增技術(shù)是PCR。相應(yīng)地，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供核酸序列擴(kuò)增方法，包括用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶以及一或多種引物，對(duì)存在于得自動(dòng)物的核酸樣品中的編碼海豚鏈球菌M蛋白 的核酸或其片段進(jìn)行擴(kuò)增?？捎糜谠\斷的PCR引物的非限制性實(shí)例見表1。但很容易理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以基于SEQ ID NOS :8-11任一所示的一或多個(gè)核苷酸序列設(shè)計(jì)并制得其它PCR引物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以方便地用與SEQ ID NOS :8_11任一互補(bǔ)的帶標(biāo)記的DNA探針來 檢測。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，其包含(a) 一或多個(gè)單鏈DNA引物，其能與編碼海豚鏈球菌M蛋白的核酸或其片段退火； 以及(b) DNA探針，其能與從編碼海豚鏈球菌M蛋白的核酸或其片段經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的 一或多種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。所述試劑盒還包含熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。本發(fā)明還涉及對(duì)分離的海豚鏈球菌M蛋白進(jìn)行基于蛋白的檢測?；诘鞍椎臋z測可以用本文所述抗體或抗體片段進(jìn)行?？梢圆捎煤线m的方法，免疫印跡，ELISA，蛋白陣列，蛋白圖譜(proteinprofling)， 2D電泳，質(zhì)譜，蛋白測序，放射免疫分析和放射性配體結(jié)合，但不限于此。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，其包含(a)抗體或抗體片段，其能與分離的海豚鏈球菌M蛋白或其片段結(jié)合；以及(b) 一或多種檢測試劑，其促進(jìn)所述與分離的海豚鏈球菌M蛋白或其片段結(jié)合的 抗體或抗體片段的檢測。檢測試劑可包括帶有標(biāo)記的第二抗體和合適的底物，以便于比色檢測、熒光檢測 或化學(xué)發(fā)光檢測。備選地，所述能與分離的海豚鏈球菌M蛋白或其片段結(jié)合的抗體或抗體片段可以 直接標(biāo)記。抗體標(biāo)記的非限制性實(shí)例已在前文描述。本發(fā)明還涉及檢測動(dòng)物對(duì)海豚鏈球菌感染產(chǎn)生反應(yīng)而生成的抗體，以所述抗體作 為指示劑，指示動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其分子成分。這類抗體的存在可以用上述任一種蛋白檢測方法來檢測，例如用ELISA和免疫印 跡方法檢測。為了診斷的目的，來自魚或其它動(dòng)物的生物樣品宜為血液或活檢樣品如來自腎 臟、脾、心臟、腦、肌肉或其它組織。為了本發(fā)明更容易理解和付諸實(shí)施，請(qǐng)本領(lǐng)域技術(shù)人員參考以下非限制性實(shí)施 例。
實(shí)施例分離和鑒定海豚鏈球菌M蛋白實(shí)驗(yàn)方案海豚鏈球菌菌株和培養(yǎng)條件本研究使用得自受感染的魚的海豚鏈球菌的獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離物(Lates
18calcarifer)。_80°C貯存的菌株-20%甘油液在含5%脫纖維蛋白的綿羊血的Columbia瓊 脂基上37 °C過夜培養(yǎng)。重組DNA技術(shù)海豚鏈球菌基因組DNA用酶裂解法(Pruksakorn et al.，2000, J. Clin. Microbiol. 38 125)從新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞提取。海豚鏈球菌emm-樣(sim)基因的PCR擴(kuò)增和克隆每個(gè)50 μ L PCR 試管含 5 μ L IOx Tth plus 緩沖液，1 μ L dNTP' s (dATP, dCTP, dGTP 禾口 dTTP 各 4x2. 5mM ;Biotech International Ltd. ,Australia), 200ng ALL MF禾口 ALL MR 引物(表 1)，0. 5U Tth plus DNA 聚合酶(Biotechlnternational Ltd. , Australia), 3μ L 25mM itUi美，M Milli-Q。 $ Eppendorf Mastercycler Gradient EPS (Eppendorf，Hamburg, Germany)中的熱循環(huán)參數(shù)為，94 °C變性2分鐘，接著按照 500C lmin、72°C 2min、和 94°C 15s 進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，最后按照 50°C Imin 和 72°C IOmin 進(jìn)行 延伸循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物在含0.5yL 10mg/mL溴化乙錠溶液的w/v瓊脂糖凝膠上以 Ix TAE作為電泳緩沖液進(jìn)行電泳后，目測觀察。所需電泳帶從 疑膠上切下，用 MegaSpin Agarose Gel Extraction Kit(Intron biotechnology, Korea)從凝膠中提取出來。純化的PCR產(chǎn)物用購買的試劑盒(Invitrogen， Melbourne,Australia)通過TA克隆法連接至PCR4-T0P0?？寺?shí)驗(yàn)中用的感受態(tài)細(xì)胞(TOP 10 ；Invitrogen, Melbourne, Australia)在補(bǔ)力口了 100 μ g/mL氛節(jié)青霄素的 Luria-Bertani 瓊月旨(LB Agar ；Sigma, Castle Hill, Australia)上培養(yǎng)。將 X_gal (40 μ l，20mg/ml)涂布 在LB瓊脂板上進(jìn)行蘭-白區(qū)分。將克隆都在37°C培養(yǎng)過夜。用拋棄型無菌環(huán)挑取克隆，將 其鋪在LB瓊脂上。這些經(jīng)證實(shí)的白色克隆還用于通過直接裂解PCR進(jìn)行篩選并用于貯存。對(duì)克隆進(jìn)行直接裂解PCR和測序反應(yīng)體積減至25 μ L，反應(yīng)條件同上。質(zhì)粒特異性引物SP6和Τ7(表1)的應(yīng)用使 得能擴(kuò)增sim基因插入序列。瓊脂糖凝膠電泳能測出帶有插入序列的克隆，再用購買的試 劑盒按說明書(Invitrogen，Melbourne, Australia)從這些克隆提取質(zhì)粒，以便用質(zhì)粒引 物SP6和T7(表1)測序。全長sim基因的測序最開始用引物SIM F(表1)促進(jìn)?；蚪M步移(Genome Walking)和sim基因多樣化sim基因上游和下游的序列按照廠家建議(Genome Walker Kit, Clontech, Mountain View，Ca.)通過基因組步移獲得。sim基因上游的基因組步移所用的基因特異性 引物是SIM WR和SIM W2R(表1)和SIM WF和SIM W3F (表1)。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化， 連接至 Τ0Ρ0 載體 PCRII (Invitrogen,Melbourne, Australia)。測序用 SP6 和 T7 引物在重 組克隆上進(jìn)行。這允許將引物(PRE SIM和POST SIM;表1)設(shè)計(jì)為從其它菌株擴(kuò)增sim基 因和周圍間隔區(qū)(反應(yīng)成分濃度同上，但退火溫度為65°C，且使用校對(duì)引物STAR DNA聚合 酶(Takara，Shiga，Japan)以減少插入錯(cuò)誤的概率)，從而檢查sim基因的多樣性。PRE SIM 引物位于多基因調(diào)節(jié)基因(multigene regulator gene，mgrX)中、并在擴(kuò)增子中包括mgrX 基因的頭36個(gè)核苷酸，POST SIM則擴(kuò)增推定的亞碲酸鹽(tellurite)/毒性陰離子耐受基 因(telX)的最后75個(gè)核苷酸。這些PCR產(chǎn)物直接用以下引物測序PRE SIM, SIM R，SIM 2R, SIM F, SIM 2F, SIM 3F, SIM W2R，和 POST SIM(表 1)。此外，用引物 M141F 和 SIM3F RC 從分離物QMA0141生成序列信息。
19
表達(dá)M樣蛋白M# 胃白 M Champion pET % 統(tǒng)(pET101/D-T0P0 ； Invitrogen, Melbourne, Australia), 在大腸 If 菌 BL21Star(DE3)One Shot chemically competent cells (Invitrogen,Melbourne, Australia)中按廠家建議進(jìn)行表達(dá)。有記錄的不同sim序 列變種(sequevars)的代表按廠家建議進(jìn)行表達(dá)。不同sim基因的代表性分離物QMA0072， QMA0076，和QMA0141表達(dá)為蛋白。血纖蛋白原結(jié)合實(shí)驗(yàn)Λ .S S HC (Sigma, Castle Hill, Australia) M EZ-Link Sulfo-NHSBiotinylation Kit (Pierce, Rockford, II.)標(biāo)記。未摻入的生物素用 Micro-SpinG-25 柱(GE Healthcare Biosciences, North Ryde, Australia)除去。將 IPTG-誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解物的SDS-PAGE分離結(jié)果印跡到PVDF膜上，用鏈親和素-堿性磷酸酶 (Pierce, Rockford, II.)檢測，用 I-St印 NBT-BCIP(Pierce, Rockford II.)顯色。分離前腎(head kidney)和腹膜細(xì)胞從受酪蛋白刺激的腹腔收獲巨噬細(xì)胞，如前文所述進(jìn)行純化并維持(DoVale et al.，2002)。簡言之，為刺激腹膜，將尖吻鱸(Lates calcarifer) (300g)用 Aqui-S (Aquatic Diagnostic Services, ffilston, Australia)按廠家建議麻醉，在其腹腔中注射 Iml 12% 酪蛋白(無菌，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中)，24小時(shí)后收集巨噬細(xì)胞。在分離腹腔巨噬細(xì)胞 之前，魚用過量Aqui-S實(shí)施安樂死，再切斷腹部大動(dòng)脈進(jìn)行放血。將含2%胎牛血清(FBS， Invitrogen, Melbourne, Australia)、1%青霉素 / 鏈霉素(P/S) (Invitrogen, Melbourne, Australia)、和 10 μ g. πιΓ1 肝素(Sigma，Castle Hill, Australia)的一份(5ml)L_15 培養(yǎng) 基用配有25G針頭的注射器準(zhǔn)確注射到腹腔中。之后按摩體腔30秒，使培養(yǎng)基散開，用19G 注射器非常小心地抽取含有白細(xì)胞的灌洗液，防止出血。再將腹膜細(xì)胞懸浮液層疊在不連 續(xù)的(34%/51%)Percoll密度梯度上，4°C 450g離心25min。收集界面處的帶，用含 FBS和青霉素/鏈霉素(P/S)的L-15培養(yǎng)基洗兩次。活細(xì)胞濃度用臺(tái)盼藍(lán)排除法確 定。將細(xì)胞以IO7細(xì)胞πιΓ1在含F(xiàn)BS和P/S的L-15培養(yǎng)基中的濃度接種到微滴板 上。使細(xì)胞群體在28°C貼壁2小時(shí)，再用L-15培養(yǎng)基洗去未貼壁的細(xì)胞。貼壁細(xì)胞在含
FBS和P/S的L-15中28°C維持。本實(shí)驗(yàn)使用24小時(shí)的培養(yǎng)物。誘導(dǎo)經(jīng)魯米諾放大的化學(xué)發(fā)光本實(shí)驗(yàn)使用海豚鏈球菌菌株QMA0072、QMA0076、和QMA0141。每種菌株在0D_ 1. 5 時(shí)與 PBS,5 μ g mUSA-PBS、或 5 μ g πιΓ1 血纖蛋白原-PBS 37°C 預(yù)保溫 30 分鐘(Welch, 1980)。這些細(xì)胞然后用HBSS洗兩次，重懸于HBSS中。胞吞后前腎細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性用前文所述方法作一些改良后測定 (Nikoskelainen et al.，2005)。簡言之，1日齡前腎細(xì)胞用未經(jīng)處理或經(jīng)過處理的海豚鏈 球菌以感染復(fù)數(shù)(MOI) 100 (細(xì)菌/巨噬細(xì)胞比1 100)進(jìn)行刺激。呼吸爆發(fā)活性通過將 30 μ 1所需細(xì)菌懸液添加到微滴板上的巨噬細(xì)胞中(IxlO5細(xì)胞/孔)來啟動(dòng)。還向每孔中 添加10 μ 1 IOmM魯米諾的0. 2Μ硼酸緩沖液ρΗ 9. O和280 μ 1 HBSS ρΗ 7. 4，使終體積為 300 μ 1。吞噬細(xì)胞發(fā)出的化學(xué)發(fā)光(CL)在冷光儀(Iuminometer)/熒光計(jì)(fluorometer) (BMG Fluostar Optima, BMG Labtech, Offenberg, Germany)中測量，在 27°C，每 3 分鐘測 一次，共測3小時(shí)。
結(jié)果圖1顯示編碼海豚鏈球菌菌株QMA72的M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 8)。圖2顯示編碼海豚鏈球菌菌株QMA76的M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 9)。圖3顯示編碼海豚鏈球菌菌株QMA141的M蛋白的核苷酸序列(SEQID NO 10)。圖4顯示編碼海豚鏈球菌菌株QMA136的M蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO=Il), N-端片段氨基酸序列(SEQ ID NO 6)和C-端片段氨基酸序列(SEQ ID NO :7)。QMA72的M蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO 3), QMA76的M蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO 4)和QMA141的M蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO 5)的比對(duì)見圖5。與demA基因產(chǎn)物的比對(duì)見圖6。圖7顯示海豚鏈球菌SimA基因序列(SEQ ID NO 39)，包括5’和3’非翻譯核苷 酸序列和編碼的M蛋白。用ALL M引物對(duì)(表1)使得能夠全長測序simA(Sti^ptococcus iniaeemm-樣)基 因。設(shè)計(jì)基因組步移引物以確定最5’和3’端核苷酸的真正基因序列，因?yàn)锳LL M引物對(duì)在 最初推導(dǎo)的序列中引入了人工核苷酸(間隔區(qū)和5 ’端的編碼氨基酸MA和3 ’的KRKEEN (SEQ ID NO :13))。在多數(shù)菌株中，全長simA基因?yàn)?566bp，編碼一種有521個(gè)氨基酸的蛋白(圖 4)，但分離物QMA0072的該蛋白有一個(gè)氨基酸插入，而分離物QMAOHlsim基因(由simB編 碼)有579個(gè)氨基酸(表2)。分離物QMA0072、QMA0076、和QMA0141的所述蛋白(帶信號(hào) 肽)的分子量分別為57589、57467、和63667Da。成熟蛋白的分子量分別為53416，53303、和 59446Da。編碼KRKEEE (SEQ IDNO 14)的核苷酸序列3，的氨基酸序列發(fā)生改變。在SimA基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游11個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)可能的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，序列為 AAGGAG(SEQ ID NO 15)(圖7)。長度為45核苷酸的推定的Mgx結(jié)合位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)有識(shí)別位 點(diǎn)非常類似于GAS的emm和scpA基因的啟動(dòng)子區(qū)中發(fā)現(xiàn)的識(shí)別位點(diǎn)(圖7)。海豚鏈球菌Sim基因的多樣性測序QMA0076菌株的sim基因，發(fā)現(xiàn)它不同于來自釀膿鏈球菌(S. pyogenes)、 豬鏈球菌(S. suis)、馬鏈球菌馬亞種(S. equi subsp. Equi)、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌 (S. uberis)的其它已知M和M樣蛋白類型。將不同類型的海豚鏈球菌sim基因產(chǎn)物與它們 的最匹配的配對(duì)物停乳鏈球菌demA基因產(chǎn)物進(jìn)行序列比對(duì)，見圖6。用PRE SIM和POST SIM引物對(duì)產(chǎn)生預(yù)期的2048bp PCR產(chǎn)物。這是所測試的50 個(gè)分離物中絕大多數(shù)都有的最常見PCR產(chǎn)物。分離物QMA0072在simA基因中有插入，從 該分離物得到2051bp的PCR產(chǎn)物。QMA0141得到更大的2180bp產(chǎn)物。分離物QMA0076和 QMA0072的核苷酸序列和氨基酸序列除了插入三個(gè)核苷酸(1個(gè)氨基酸殘基)以外都相同。 所有分離物中，位于simA基因任一側(cè)的基因間間隔區(qū)的長度都相同。分離物QMA0141的基 因序列最具多樣性，頭35個(gè)殘基有100%的氨基酸殘基同一性，頭41個(gè)殘基有100%相似 性。這也證實(shí)了理論推測的切割信號(hào)序列產(chǎn)生成熟M蛋白的位置(圖7)。該基因比simA 基因大10%，因此稱simB。如此一來，所測試的所有分離物都表現(xiàn)出同樣的基因排列。M蛋白序列分析分離物QMA0076的主要M蛋白類型的N-端在氨基酸41和42之間有一個(gè)可能的 信號(hào)序列切割位點(diǎn)，其產(chǎn)生480個(gè)氨基酸的成熟蛋白，分子量為 53kDa(圖6)。分離物 QMA0141的信號(hào)肽切割位點(diǎn)也位于殘基41和42之間，其產(chǎn)生538個(gè)殘基的成熟蛋白，分子量 59kDa(圖6)。所有M蛋白的C末端是保守的革蘭氏陽性細(xì)胞壁錨著基序LPSTG(SEQ ID NO 16 ；Vasiet al.，2000，Infect. Immun. 68 294)。所述 M 蛋白類型的 N-端區(qū)域有非 常相似的信號(hào)肽，但成熟蛋白的第一個(gè)殘基明顯不同，而這些蛋白的C末端高度保守。這表 明，該蛋白暴露的N端承受了選擇壓力。用Garnier 算法(Garnier et al.，1978，J Mol Biol 120 97)分析分離物 QMA0076,預(yù)測該蛋白的77. 2%為alpha-螺旋。分離物QMA0072和QMA0141的M蛋白的預(yù) 測值分別為77. 和77.4%。用 COIL 程序(Lupas et al. , 1991, Science 252 1162 ；Lupas, 1996, MethodsEnzymol 266 513)以窗口長度28來分析，預(yù)測分離物QMA0076的蛋白(帶信號(hào)序 列)在殘基79-174和181-454處有兩個(gè)卷曲螺旋節(jié)段，每個(gè)節(jié)段的概率為1. 00。這與Vasi et al.，同上的結(jié)果相似，后者鑒定出停乳鏈球菌的M樣蛋白。將七殘基重復(fù)序列(h印tad repeats)中的第一和第四個(gè)殘基加權(quán)，得到殘基91-449的概率為1. 00。同樣，預(yù)測分離物 QMA0072在殘基79-174和196-455有兩個(gè)卷曲螺旋節(jié)段，每個(gè)節(jié)段的概率為1. 00。將七殘基重復(fù)序列中的第一和第四個(gè)殘基加權(quán)，預(yù)測殘基91-186和213-450兩個(gè) 節(jié)段的概率為1.00。分離物MA0141的M蛋白顯示概率1. 00，在殘基154-512有帶加權(quán)七殘基 (weighted heptad)的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)使用未加權(quán)的七殘基時(shí)，在殘基151-231和 238-512處有卷曲螺旋。表達(dá)的M蛋白和M蛋白片段的PAGE分析非還原的表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析(圖8)顯示，有不同于對(duì)照大腸桿菌裂解物 的電泳帶。分離物QMA072和QMA076的主要蛋白帶出現(xiàn)在 230kDa，但分離物QMA0141的 不是。用Western印跡法檢測這些裂解物的血纖蛋白原結(jié)合蛋白。表達(dá)的M蛋白的血纖蛋白原結(jié)合將大腸桿菌裂解物中表達(dá)蛋白的Western印跡先結(jié)合生物素化血纖蛋白原，再用 鏈親和素檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離物QMA0072和QMA0076的M蛋白象預(yù)計(jì)的那樣，在 230kDa 和 57kDa表現(xiàn)為單體和四聚物(僅QMA0072和QMA0076)。四聚物的形成已見于其它物種 的 M 蛋白(Meehanet al. , 1998,Microbiology 144 993)。分離物 QMA0141 在 64kDa 的 M 蛋白看來并不象分離物QMA0072和QMA0076的蛋白一樣強(qiáng)有力地結(jié)合血纖蛋白原(圖8)。分離物QMA0136表達(dá)的兩種肽(202氨基酸SEQ ID NO :6和309氨基酸SEQ ID NO 7)不結(jié)合血纖蛋白原(數(shù)據(jù)未顯示)?？赡芙Y(jié)合血纖蛋白原的區(qū)位于兩種基因型(72 和136)與分離物QMA76相比具有它們各自的插入序列的區(qū)域(見圖5)。這些插入出現(xiàn)在 該蛋白的氨基酸殘基190-220之間。血纖蛋白原結(jié)合對(duì)活化尖吻鱸腹腔白細(xì)胞的影響為研究海豚鏈球菌M蛋白的血纖蛋白原結(jié)合的作用，調(diào)查了將海豚鏈球菌 QMA0072與血纖蛋白原一起預(yù)保溫對(duì)腹腔白細(xì)胞(peritonealleucocytes)的胞吞作用和 呼吸爆發(fā)的影響。QMA0072的血纖蛋白原結(jié)合顯著降低隨后尖吻鱸腹腔白細(xì)胞經(jīng)胞吞作 用誘導(dǎo)的呼吸爆發(fā)，與之相比的對(duì)照是用相同濃度的BSA預(yù)保溫或在單獨(dú)的PBS中預(yù)保溫 (圖 9)。討論
這里述及海豚鏈球菌Sim基因和鄰近的基因。根據(jù)大腸桿菌中重組表達(dá)的海豚鏈 球菌M蛋白的Western印跡分析結(jié)果，分離物QMA0076的M蛋白表現(xiàn)出結(jié)合最多的血纖蛋 白原，而分離物QMA0072(有一個(gè)氨基酸插入)結(jié)合略少的血纖蛋白原。分離物QMA0141的 M蛋白在轉(zhuǎn)移到PVDF膜之后結(jié)合非常少的血纖蛋白原。分離物QMA0072表達(dá)的蛋白結(jié)合的 血纖蛋白原比分離物QMA0076略少可能是由于，在螺旋之間的區(qū)域插入一個(gè)殘基(在第二 個(gè)螺旋區(qū))破壞了這些螺旋的最佳結(jié)合。有趣的是，我們注意到，所有海豚鏈球菌M蛋白序 列(除QMA136C-端片段以外)，不管大小如何或多樣性如何，都含有肽序列HEAIRSAGLE (SEQ ID NO :17)將兩個(gè)螺旋連接。因此，血纖蛋白原結(jié)合能力的差異可能是由于該肽序列任一 側(cè)的螺旋區(qū)中的序列差異。該肽的保守表明，其很有可能在對(duì)血液成分如免疫球蛋白的結(jié) 合中起關(guān)鍵作用(Geyer et al.，1999，F(xiàn)EMS Immunol Med Microbiol 26 11)。該肽序列 在血纖蛋白原和其它血液成分的結(jié)合中的作用需要進(jìn)一步研究。形成四聚物的能力也可能是由于螺旋區(qū)彼此相互作用，因?yàn)楸碛^分子量 230kDa 也已見于馬鏈球菌馬亞種的血纖蛋白原結(jié)合蛋白(Meehan et al.，1998，同上)。有趣的是， 我們注意到，分離物QMA0141的M蛋白(分子量大很多)并不象該主要類型一樣有效地結(jié) 合血纖蛋白原或形成聚合物。鑒于其它M和M樣蛋白能結(jié)合其它血液蛋白，這些蛋白結(jié)合 它們的能力也不能被低估。已顯示，M蛋白家族成員負(fù)責(zé)鏈球菌的毒力，能結(jié)合除血纖蛋白原以外的血液成 分，且在耐受胞吞方面起作用(Podbielski et al.，1996，MolMicrobiol 19 429 ；Meehan et al.，1998，同上；Thern et al.，1998，J Immunol 160860 ；Meehan et al.，2000a，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 190 317;· Meehan et al. ,2000b, Microbiology 146 1187 ；Meehan et al.,2001,Microbiology 147 3311 ；Courtney et al.,2006,Mol Microbiol 59 :936)。本 研究支持了這一發(fā)現(xiàn)，表明海豚鏈球菌對(duì)血纖蛋白原的結(jié)合在魚巨噬細(xì)胞中減弱了胞吞作 用和隨后的呼吸爆發(fā)活性。而且，較早期的一項(xiàng)研究表明，具有與本研究報(bào)道相似的表觀分 子量的蛋白能反向結(jié)合(即通過Fc區(qū)結(jié)合)鱒魚免疫球蛋白(Barnes etal.，2003，F(xiàn)ish Shellfish Immunol. 15 425)。M蛋白是GAS中的主要毒力因子和疫苗候選物(Hu et al.， 2002,Infect Immun 702 171 ；Batzloff et al.，2006，Immunol Res 35 233 ；Olive,2007, Curr Opin Mol Ther 9 25 ；Shaila et al.，2007，Vaccine 25 3567)，將來的工作是，基于 這些令人感興趣的蛋白，調(diào)查抗海豚鏈球菌感染的疫苗在養(yǎng)殖的魚中的潛力。用重組海豚鏈球菌M蛋白和DNA疫苗構(gòu)建體接種實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和管理年幼(Juvenile)尖吻鱸平均重12g，得自 Ecofish Pty Ltd, Caloundra, Queensland.將魚放養(yǎng)在5個(gè)300升食品級(jí)環(huán)狀塑料槽(tank)中，每槽80條魚，每槽中 有250L用海鹽(Ocean Nature, Aquasonic, NSW)和RO過濾水制成的有鹽味的(brackish) 水(5ppt)。將8個(gè)槽連起來，組成一個(gè)大的再循環(huán)系統(tǒng)，其有兩個(gè)500L污水池(sumps)，帶 生物過濾裝置(biofiltration)和分隔開的蛋白脫脂裝置(skimmer)。用壓縮機(jī)給每個(gè)槽 通氣，這些壓縮機(jī)的電源與驅(qū)動(dòng)再循環(huán)泵的電源是彼此獨(dú)立的(圖1)。水以1800L/小時(shí) 進(jìn)行再循環(huán)，生物過濾器在放養(yǎng)魚的4周前裝好。在接種的14天前將魚集中，每天在早6 點(diǎn)和晚6點(diǎn)用購買的顆粒飼料喂兩次(尖吻鱸4mm漂浮物，Ridley AquaFeeds, Narangba,
23Qld)。根據(jù)需要換水(200L)，約每周兩次。試驗(yàn)期間維持12小時(shí)白晝周期。每天記錄水 溫，通過水族室空調(diào)將水溫維持在29°C 士 1°C。氨、亞硝酸鹽和硝酸鹽每天用購買的試劑盒 (Aquasonic, NSW)進(jìn)行分析，記錄pH，方法是，取5ml水樣，記錄實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)上的讀數(shù)。制備疫苗考查了兩種疫苗一種重組疫苗，另一種是DNA疫苗。每種疫苗中用的基因都是海 豚鏈球菌simA，其編碼SiM蛋白，是毒力因子，見Baiano etal.，2008。simA從海豚鏈球菌 菌株QMA0076經(jīng)PCR擴(kuò)增，該菌株帶有從海豚鏈球菌全球普查中發(fā)現(xiàn)的顯性sim基因類型， 且用于制備所述兩種疫苗。重組蛋白疫苗制備重組SiM蛋白用于接種尖吻鱸，方法是，用引物ESIM 20F和ESIM1542R(表 3)產(chǎn)生 simA 基因，將其克隆后，用 Champion pET 系統(tǒng)(pET101/D-T0P0 ；Invitrogen, Melbourne, Australia)在大腸桿菌13121 Star(DE3)One Shot chemically competent cells (Invitrogen, Melbourne, Australia)中按廠家建議進(jìn)行表達(dá)。簡言之，含有按正確 方向插入的序列的克隆在IOmL LB肉湯+ΙΟΟμ g/mL氨芐青霉素中37°C過夜培養(yǎng)。取ImL 接種到IOOmL LB肉湯+100 μ g/mL氨芐青霉素中，在37°C以180rpm振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，再用 ImM IPTG(終濃度)在相同條件誘導(dǎo)3h。細(xì)胞在4°C收獲，固定在0. 5% (ν/ν)終濃度福爾 馬林(37% )冰浴中，4°C保溫24h。將細(xì)胞沉淀，在PBS中洗兩次，然后重懸在PBS中以備 IP注射。對(duì)照疫苗用相同方法制備，不同的是用未經(jīng)轉(zhuǎn)化的BL21細(xì)胞。DNA 疫苗將主要類型的sim基因用引物VF和VR插入DNA疫苗載體，所述引物含有用于直接 克隆到該DNA載體中的限制性位點(diǎn)。載體和PCR產(chǎn)物都用BamHI和SalI消化。構(gòu)建體連接 后轉(zhuǎn)化至T0P10細(xì)胞(Invitrogen，Melbourne, Australia)。帶有按正確方向插入的序列 的克隆(經(jīng)測序確定)在400mL LB肉湯+50 μ g/mL卡那霉素中37°C過夜培養(yǎng)，以150rpm 振蕩。收獲細(xì)胞，用QIAGEN HiSpeed Plasmid Maxi Kit提取質(zhì)粒。福爾馬林滅活的菌苗陽性對(duì)照疫苗用菌株QMA0155制備。該分離物從儲(chǔ)藏罐取出，在血瓊脂上25°C 過夜培養(yǎng)。挑一個(gè)單菌落在ImL植物蛋白胨肉湯(vegetabl印印tone broth, VPB, Oxoid, Thebarton, Vic)中乳化，取 500 μ L 接種 250mLErlenmeyer 燒瓶中的 50mL VPB。將培養(yǎng)物 在25°C振蕩(130rpm)保溫18小時(shí)。所得培養(yǎng)物馬上在冰上冷卻到4°C，接著用福爾馬林 (37% )在0. 5mL/100mL的濃度滅活，使終濃度為0. 2%。培養(yǎng)物在4°C滅活后，取一份樣品 在血瓊脂上培養(yǎng)24h和48h后，檢查滅活情況。魚的接種魚在接種前禁食24小時(shí)。將魚(每次接種80條)在含0. 01 % MS222的干凈養(yǎng) 魚水中麻醉，經(jīng)腹腔注射100 μ L疫苗制劑(重組疫苗和對(duì)照)或尾前肌肉注射5 μ g DNA 疫苗或載體對(duì)照在50 μ L無菌PBS中的溶液進(jìn)行接種。允許魚在回到它們的槽之前恢復(fù)。 疫苗組和對(duì)照組維持在不同的槽中，以便能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。接種的第二天開始恢復(fù)喂食，在 29°C維持4周再進(jìn)行攻擊。接種疫苗的24h和48h后，DNA接種組有2條魚被實(shí)施安樂死， 從注射部位取約5立方毫米肌肉。RNA用購買的試劑盒(Qiagen)分離，DNA通過用DNase 消化而除去。RNA用superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，PCR用針對(duì)emm基因的引物進(jìn)
24行以檢查表達(dá)。用質(zhì)粒引物檢查該RNA被質(zhì)粒DNA污染的情況，以確認(rèn)emm基因被表達(dá)。制備攻擊接種物海豚鏈球菌菌株QMA00155從再循環(huán)的尖吻鱸養(yǎng)殖場，New Southffales, Australia, 2006分離得到，選它進(jìn)行本研究。該分離物從儲(chǔ)存罐(-80°C，20%甘油-VPB) 取出，在含5%脫纖維蛋白的綿羊血的Columbia瓊脂基上25°C過夜培養(yǎng)。按照前述進(jìn)行 乳酸氧化酶基因的PCR來確認(rèn)同一性。為制備攻擊接種物，從經(jīng)過確認(rèn)的瓊脂過夜培養(yǎng)物 選取單菌落，將其懸浮在Iml無菌胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptone soya broth, TSB, Oxoid, Thebarton，Vic)中。用200 μ 1等份試樣接種50mL燒瓶中的20mL TSB，在25°C溫和攪拌 (130rpm) ISh0這些指數(shù)期晚期培養(yǎng)物在無菌PBS中洗過后，重懸直至600nm的光密度為 1.2，之前估計(jì)該光密度等同于約5xl09cfu mL—1。然后將該懸液在PBS中稀釋10倍，馬上用 于攻擊模型。注射攻擊模型用手網(wǎng)(hand net)從槽中撈魚，將它們?cè)诤?. 01% MS222的干凈養(yǎng)魚水中麻醉。 每條魚用配有25G針頭的ImL結(jié)核菌素注射器腹腔注射100 μ L(5x IO7CFU)。用飽和阿辛蘭 (Alcian blue)的無菌PBS溶液經(jīng)PanJet給魚標(biāo)上它們的疫苗或?qū)φ战M(表4)。每個(gè)疫 苗組或?qū)φ战M8條魚被分配至160L塑料槽中，所述槽連接另一隔離水族室中獨(dú)立的EHEIM 泵濾器，從而每個(gè)疫苗/對(duì)照組在每個(gè)槽中都有代表。死亡或垂死的魚一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就除去，前 腎取樣至TSA上。在TSA板上過夜培養(yǎng)，隨后取樣進(jìn)行Iox基因的直接裂解PCR，以證實(shí)死 亡原因。分析結(jié)果死亡率數(shù)據(jù)用Kaplan-Meyer存活分析法進(jìn)行分析，使用Prism第4版， Macintosh(GraphPad Ltd, California)。結(jié)果該試驗(yàn)進(jìn)行到26天，也就是預(yù)計(jì)要攻擊的18小時(shí)之前，由于主電源斷電使再循環(huán) 泵停止工作，不再供氣，導(dǎo)致很多魚因窒息死亡。在電力恢復(fù)前一直給槽中供氧。組1(DNA 疫苗)有8條魚幸存，組2 (B21重組對(duì)照)有18條，組3 (BL2IsimA重組疫苗)有19條，組 4 (NAV載體對(duì)照)有20條。組5即福爾馬林滅活的同源菌苗試驗(yàn)組無一幸存。待幸存的魚 從這種不利條件中恢復(fù)一段時(shí)間并重新開始喂食后，在減小的規(guī)模上進(jìn)行攻擊。疫苗效力每個(gè)幸存組選8條魚接受攻擊，作好標(biāo)記，將它們放入單獨(dú)的槽中。在有可能的情 況下，每組剩余的幸存者也接受攻擊，標(biāo)記，并分配到第二個(gè)槽中，作為平行試驗(yàn)。因此用了 兩個(gè)槽，槽A有32條魚(4個(gè)組每組8條)，槽B有23條魚(組2和4各有8條，組3有7 條)。所有魚從麻醉中恢復(fù)，并在攻擊的12小時(shí)后表現(xiàn)為健康。第1波死亡出現(xiàn)在攻擊后 的24h，多數(shù)病例沿腹部表面有明顯的紅色損傷。死亡持續(xù)直至攻擊后的72小時(shí)。之后未 記錄到進(jìn)一步的死亡。死亡率為0-75%，見圖10。最大死亡率在BL21重組對(duì)照組，最小死 亡率在BL2IsimA重組疫苗組(0% (0/7)和25% (2/8)，在2個(gè)平行試驗(yàn)中)。算出DNA疫 苗 pUK21A2-simA 的相對(duì)百分比存活(Relative percent survival, RPS)為 7. 76%，大腸 桿菌中表達(dá)的重組疫苗的RPS為83. 3% (圖11)。討論
盡管在攻擊前夜失去了多條魚，但有些魚得救了，因此實(shí)驗(yàn)規(guī)?？s小但得到了數(shù) 據(jù)。DNA疫苗和重組蛋白疫苗經(jīng)證實(shí)都有保護(hù)作用，但重組蛋白疫苗的作用更強(qiáng)。攻擊模型 在對(duì)照組中導(dǎo)致75%的死亡率，可能反映了進(jìn)入指數(shù)期的接種物在25°C的肉湯中制備而 不是在37°C的平板上生長。毒力決定簇，包括莢膜和M蛋白可能都是依賴于溫度的且在不 同生長期有差異。由于疫苗和對(duì)照在同一個(gè)槽中一起接受攻擊，對(duì)照組的再現(xiàn)性很高，重組 疫苗的表現(xiàn)很好，只有非常少的平行實(shí)驗(yàn)中途退出。重組蛋白疫苗的RPS顯示為83.3%。 數(shù)條經(jīng)DNA接種的魚在接種的24h和48h后顯示表達(dá)(圖4)。本發(fā)明已在本文中作相應(yīng)描述，但不應(yīng)理解為限于本文描述的任一方面?？梢詫?duì) 本文描述和舉例的各個(gè)方面進(jìn)行各種改動(dòng)而不背離本發(fā)明的精神和范疇。本文引用的所有專利文獻(xiàn)和科技文獻(xiàn)，計(jì)算機(jī)程序和算法，都以其全部內(nèi)容引入 本文作為參考。表1.引物§ 引
序列(5，-3，)
標(biāo)識(shí)符
ALL MFGGGGGGGGATCCATAAGGAGCATAAAAATGGCT
ALL MRGGGGGGGAATTCAGCTTAGTTTTCTTCTTTGCG
SP6GCTATTTAGGTGACACTATAGAAT
T7GTAATACGACTCACTATAGGG
SIM FAATTAATGAAGCTGGAGTGCTCT
SIM WFGGGAGGCTTCGCTGACATTTATTTCC
SIM W3FTACGGCCGTAAACGCAAAGAGGAAGAA
SIM RGCTTCCACAAGTTTTTCTTTGTCA
SIM 2RGTAGATAGGCTTTGATTTTCACTA
SIM 2FGATACGCTTCAAAGTTCTTACTAT
SIM 3 FGCTGCTAAGATCAACATGCC
SIM WRACCTATAATCAGGTTCTAAATTCGTGGC
SIM W2RGGAAGATGTGTCCATTGTTTGATGAGATG
PRE SIMTTGTTGGGTGGAAAAAAGATC
POST SIMAAACTCAGGGACCAAAAAATTG
SIM3F RCGGCATGTTGATCTTAGCAGC
M141 FC AAA ATGATC AC ATCAGC
ESIM 20FCACCATGGCTAAACAAATCAAAGC
ESIM 1542RTTCTTCCTCTTTGCGTTTACGG
SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID N0:20 SEQIDNO:21 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 SEQ BD NO:25 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID N0:30 SEQIDNO:31 SEQ ID NO:32 SEQEDNO:33 SEQ ID NO:34 SEQIDNO:35 SEQ ID NO:36 表4.疫苗組和攻擊時(shí)的槽分配
組疫苗標(biāo)記槽A槽B
1pUK21A2simA(5y g)喉8 0
2BL21 star前胸(Pre-pectoral)8 8
3BL21 star pET-simA后胸(Post-pectoral)8 7
4pUK21A2(5y g)肛門8 8
5QMAO165 滅活n/a0 0
權(quán)利要求
海豚鏈球菌的分離的M蛋白或M樣蛋白。
2.權(quán)利要求1的分離的M蛋白或M樣蛋白，包含選自下組的氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT(SEQ ID NO 1)和 KMAEIQEEANKKIAA(SEQID NO :2)。
3.權(quán)利要求1的分離的M蛋白或M樣蛋白，包含氨基酸序列SEQIDNO :3或SEQ ID NO4。
4.對(duì)血纖蛋白原的結(jié)合比權(quán)利要求3的分離的蛋白減小或降低的分離的蛋白，其 含有海豚鏈球菌M蛋白或M樣蛋白的氨基酸序列，但不含有選自下組的氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT (SEQ ID NO 1) ；KMAEIQEEANKKIAA (SEQ ID NO 2)；以及，SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO 4的殘基190-220的一或多個(gè)殘基。
5.權(quán)利要求4的分離的蛋白，包含選自下組的氨基酸序列SEQID NO 5 ；SEQ ID NO 6 禾口 SEQ ID NO :7ο
6.分離的蛋白，包含選自下組的氨基酸序列SEQID NO 1 ；SEQ IDNO 2 ;SEQ ID NO: 3 ；SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 ；禾口 SEQ IDNO :7。
7.權(quán)利要求1-6之一的分離的蛋白的片段、變體或衍生物。
8.權(quán)利要求7的片段，其具有免疫原性并包含選自下組的氨基酸序列的20-200個(gè)連 續(xù)氨基酸SEQ ID NO 1 ；SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3 ；SEQ IDNO 4 ；SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 ；和 SEQ ID NO :7。
9.權(quán)利要求7的變體，其包含與選自下組的氨基酸序列至少75%相同的氨基酸序列 SEQ ID NO1 ；SEQ ID NO2 ；SEQ ID NO3 ；SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO5 ；SEQ ID NO 6 ；和 SEQ ID NO :7。
10.抗體或抗體片段，與權(quán)利要求1-6之一的分離的蛋白，或權(quán)利要求7-9之一的片段、 變體或衍生物結(jié)合。
11.分離的核酸，編碼權(quán)利要求1-6之一的分離的蛋白，或權(quán)利要求7-9之一的片段、變 體或衍生物。
12.權(quán)利要求11的分離的核酸，包含選自下組的核苷酸序列SEQIDNO 8 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 11 ；和 SEQ ID NO :39。
13.遺傳構(gòu)建體，包含權(quán)利要求11或12的分離的核酸。
14.權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體，適于進(jìn)行海豚鏈球菌重組M蛋白的細(xì)菌性表達(dá)。
15.權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體，適于進(jìn)行魚的DNA接種。
16.宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求13-15之一的遺傳構(gòu)建體。
17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，是細(xì)菌細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，是魚的細(xì)胞。
19.組合物，含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的分離的蛋白；根據(jù)權(quán)利要求7-9之 一的片段、變體或衍生物；根據(jù)權(quán)利要求10的抗體或抗體片段；根據(jù)權(quán)利要求11或12的分 離的核酸；或根據(jù)權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體；以及可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。
20.權(quán)利要求19的組合物，是能在動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)抗海豚鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫 苗的形式。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述動(dòng)物是魚。
22.權(quán)利要求20的組合物，其中所述動(dòng)物是人。
23.治療動(dòng)物的海豚鏈球菌感染的方法，所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物施用權(quán)利要求19的 組合物、從而治療所述海豚鏈球菌感染的步驟。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述動(dòng)物是魚。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述動(dòng)物是人。
26.免疫動(dòng)物以抵抗海豚鏈球菌感染的方法，所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物施用權(quán)利要求 20的組合物、從而免疫所述動(dòng)物抵抗海豚鏈球菌感染的步驟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述動(dòng)物是魚。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述動(dòng)物是人。
29.至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的分離的蛋白；根據(jù)權(quán)利要求7-9之一的片段、變 體或衍生物；根據(jù)權(quán)利要求10的抗體或抗體片段；根據(jù)權(quán)利要求11或12的分離的核酸； 或者，根據(jù)權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體用于治療動(dòng)物的海豚鏈球菌感染的用途。
30.權(quán)利要求29的用途，其中所述動(dòng)物是魚。
31.權(quán)利要求29的用途，其中所述動(dòng)物是人。
32.確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分的方法，所述方法包括， 確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的分離的蛋白或根據(jù) 權(quán)利要求7-9之一的片段、變體或衍生物的步驟，所述蛋白或其片段、變體或衍生物的存 在，表示所述動(dòng)物正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分。
33.確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分的方法，所述方法包括， 確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含根據(jù)權(quán)利要求11或12的分離的核酸的步驟， 所述核酸的存在表示所述動(dòng)物正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分。
34.確定動(dòng)物是否正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分的方法，所述方法包括 確定從所述動(dòng)物獲得的生物學(xué)樣品是否包含根據(jù)權(quán)利要求10的抗體或抗體片段的步驟， 所述抗體或抗體片段的存在表示所述動(dòng)物正在或已經(jīng)暴露于海豚鏈球菌細(xì)菌或其成分。
35.權(quán)利要求32-34之一的方法，其中所述動(dòng)物是魚。
36.權(quán)利要求32-34之一的方法，其中所述動(dòng)物是人。
37.診斷試劑盒或組合物，用于檢測海豚鏈球菌細(xì)菌、其一或多種分子成分和/或其抗 體，所述試劑盒或組合物包含一或多種選自下組的檢測試劑從動(dòng)物獲得的生物樣品中的 根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的分離的蛋白；根據(jù)權(quán)利要求7-9之一的片段、變體或衍生物；根據(jù) 權(quán)利要求10的抗體或抗體片段；和/或根據(jù)權(quán)利要求11或12的分離的核酸。
38.權(quán)利要求37的診斷試劑盒或組合物，還包含一或多種檢測試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了海豚鏈球菌的分離的M蛋白或M樣蛋白，編碼核酸，遺傳構(gòu)建物以及與分離的M蛋白結(jié)合的抗體。本發(fā)明還提供了所述M蛋白或M樣蛋白的血纖蛋白原結(jié)合減弱的同工型和/或片段。分離的M蛋白、抗體和編碼核酸可用于診斷、免疫和/或治療諸如魚和人等動(dòng)物的海豚鏈球菌感染。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101918435SQ200880113271
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月25日
發(fā)明者安德魯·巴恩斯, 賈斯蒂斯·貝亞諾 申請(qǐng)人:昆士蘭大學(xué)