專利名稱：：一種抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種粘帚霉菌菌株。
背景技術(shù)：
：番茄灰霉病是一種世界性番茄病害，也是番茄的主要病害。番茄灰霉病主要為害花果，亦可為害葉片與莖；幼果染病較重，柱頭和花瓣多先被侵染，后向果實(shí)轉(zhuǎn)移；果實(shí)多從果柄處向果面擴(kuò)展；致病果皮呈灰白色、軟腐，病部長(zhǎng)出大量灰綠色霉層，嚴(yán)重時(shí)果實(shí)脫落，失水后僵化；葉片染病，多從葉尖開始，病斑呈"V"字形向內(nèi)擴(kuò)展，初水漬狀，淺褐色，有不明顯的深淺相間輪紋，潮濕時(shí)，病斑表面可產(chǎn)生灰霉，葉片枯死；莖染病，產(chǎn)生水漬狀小點(diǎn)，后迅速擴(kuò)展成長(zhǎng)楠圓形，潮濕時(shí)，表面生灰褐色霉層，嚴(yán)重時(shí)可引起病部以上植株枯死。遭受番茄灰霉病侵染的番茄一般減產(chǎn)20%30%，有時(shí)減產(chǎn)高達(dá)50%左右，嚴(yán)重時(shí)甚至造成番茄絕產(chǎn)。番茄灰霉病病原菌是灰葡萄孢(^o/o^sc/M^e力，該病原菌寄主范圍極廣，不僅危害番燕，還危害侵染黃瓜、葡萄、玫瑰等幾十科數(shù)百種植物，同時(shí)該菌還有極強(qiáng)的腐生能力，可以在離體的組織上或土壤中旺盛生長(zhǎng)。由于缺乏抗番茄灰霉病的番茄抗源材料，所以通過常規(guī)方法很難育成番茄灰霉病的抗性品種。長(zhǎng)期以來(lái)，灰霉病防治主要依賴多菌靈、速克靈等化學(xué)藥劑的使用；但由于病菌抗藥性迅速產(chǎn)生，其防治效果大大下降，并且嚴(yán)重污染農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境，危及人畜安全健康。隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)蔬菜產(chǎn)品的質(zhì)量要求也越來(lái)越高，無(wú)公害、綠色食品甚至有機(jī)食品逐漸成為蔬菜消費(fèi)市場(chǎng)的主流，因此，采用生物防治技術(shù)得到了廣泛的認(rèn)可。目前，利用粘帚霉(所o"ec/r/aoc/zro/ewra)菌防治、拮抗農(nóng)作物病害被視為最有效的手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了粘帚霉屬(所o"e"n'aocAra/ewc力的一個(gè)菌株，可用于抑制番茄灰霉病，并對(duì)其它多種農(nóng)作物病害具有抑制效果，為生物防治番茄灰霉病和3利用生物技術(shù)培育番茄灰霉病抗性品種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌菌株為粉紅粘帚菌WY-1(所o"ecfr/aoc/zra/ewcaWY-1)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.1977。本發(fā)明中的粉紅粘帚菌WY-1(5/o"ecfr/aoc/zra/ewcaWY-1)屬于半知菌亞門CDe^eramyc"/"")絲f包纟岡(/fyp/7。m;^efes)叢梗孢目Ofom7/a/as)叢梗孢禾斗(M蘭〖aceae)粘帚霉屬(腸"e"WaocW/ewca)，對(duì)灰葡萄孢-艮卩番茄灰霉病的主要病原具有明顯的拮抗作用。本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1由中國(guó)吉林省吉林市郊草炭土中分離、純化得到。將本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1接種到PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落由分枝狀菌絲組成，菌絲較粗而長(zhǎng)呈絨毛狀。菌落表面平滑呈扁平狀，有同心圓環(huán)和輕微的輻射狀溝紋(如圖1所示)。暗培養(yǎng)下該菌可產(chǎn)生黃色水溶性色素，在光照培養(yǎng)條件下，則為粉紅色或橘紅色。在顯微鏡下觀察，本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1菌絲分枝較多，無(wú)色具隔，菌絲較粗。本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1分生孢子(5fim7nm)x(3.0|im~5.0|im)，表面光滑、帚狀枝常輪狀分枝3~4次；分枝末端產(chǎn)生分生孢子，無(wú)性孢子是單細(xì)胞的，長(zhǎng)卵形或圓柱形(如圖2和圖3所示)。本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1芽管無(wú)色，多數(shù)從分生孢子的一端長(zhǎng)出。本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1可在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、玉米粉蛋白胨培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基或孢子形成培養(yǎng)基上可以很好的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，其中最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基?？扇苄缘矸蹫榉奂t粘帚菌WY-1生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最佳碳源、適宜培養(yǎng)溫度為22"C28'C、適宜培養(yǎng)pH值為56。黑暗條件有利于粉紅粘帚菌WY-1菌絲的生長(zhǎng)，而在光照條件下有利于粉紅粘帚菌WY-1產(chǎn)生分生孢子。溫度高于38'C或低于4。C環(huán)境中粉紅粘帚菌WY-1孢子均不能萌發(fā)，粉紅粘帚菌WY-1孢子的致死溫度為54°C，54r處理10分鐘粉紅粘帚菌WY-1孢子的致死率達(dá)96.1%以上。本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，安全性高，加熱至56匸處理5分鐘致死率達(dá)100%。在溫度為22"C、pH值為5、以可溶性淀粉為碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)粉紅粘帚菌WY-110天，然后將液體培養(yǎng)基接種到滅菌的麥粒上，光照培養(yǎng)12天，晾干制成粉紅粘帚菌WY-1粉劑。本發(fā)明制成的粉紅粘帚菌WY-1粉劑性質(zhì)穩(wěn)定，制作簡(jiǎn)單，成本低廉，易于保存。本發(fā)明私、紅茅占帚菌WY-1(5z'o"ecfr/aoc/zra/e"caWY-1)屬于禾占帚霉屬(&o"ec加'aocAra/wca)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2007年03月19日，保藏號(hào)為CGMCCNo.1977。圖1是本發(fā)明教""紅粘帚菌WY-1(歷o"ecWaoc/zra/e"c"WY-1)菌株在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。圖2是本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1(5/w^cfr/aoc/2ra/ewc"WY-1)菌絲與分生孢子形態(tài)圖。圖3是本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1(&owec的'aoc/2ro/ewcaWY-1)分生孢子形態(tài)圖。圖4是具體實(shí)施方式一中粉紅粘帚菌WY-1對(duì)灰葡萄孢的抑菌試驗(yàn)結(jié)果圖。圖5是具體實(shí)施方式一中粉紅粘帚菌WY-1與Genbank中收錄的相近菌株的5.8SrDNA所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖6是具體實(shí)施方式一中粉紅粘帚菌WY-1與Genbank中收錄的相近菌株的18SrDNA所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖7是具體實(shí)施方式一第一種對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中粉紅粘帚菌WY-1與番茄灰霉病對(duì)峙培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果圖。.圖8是具體實(shí)施方式一第二種對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中接種方式(2)中番茄長(zhǎng)勢(shì)圖。圖9是具體實(shí)施方式一第二種對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中接種方式(6)中番茄長(zhǎng)勢(shì)圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌菌株為粉紅粘帚菌WY-1(所o"ec^7'aoc/zra/ewcaWY-1)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.1977。本發(fā)明粉紅粘帝菌WY-1可在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、玉米粉蛋白胨培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基或孢子形成培養(yǎng)基上可以很好的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，其中最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。其中玉米粉蛋白胨培養(yǎng)基(1000ml)由30g玉米粉、20g蛋白胨、20g蔗糖、18g瓊脂和余量的蒸餾水組成。胡蘿卜培養(yǎng)基(1000ml)由200g胡蘿卜、20g葡萄糖、18g瓊脂和余量的蒸餾水組成。孢子形成培養(yǎng)基(1000ml)由1.0g酵母膏、1.0g牛肉膏、2.0g胰蛋白胨、10.0g葡萄糖、O.lg硫酸亞鐵(FeS04'7H20)、18g瓊脂和余量的蒸餾水組成。本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1由中國(guó)吉林省吉林市郊草炭土中分離、純化得到。本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1在可溶性淀粉為碳源生長(zhǎng)最快且產(chǎn)孢量最高。最適培養(yǎng)溫度為22-C，最適培養(yǎng)pH值為5。將本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1在PDA培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)10天后用無(wú)菌水將孢子洗下，用三層cheesecloth(紗布)過濾，得到孢子懸浮液，用無(wú)菌水稀釋為lxl(/孢子/ml備用。將灰葡萄孢接種于PDA固體培養(yǎng)基中央，在培養(yǎng)基邊緣處放置直徑為8mm的濾紙盤，并在濾紙盤上接種60pl的粉紅粘帚菌WY-1孢子懸浮液，置于22'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)初期粉紅粘帚菌WY-1和灰葡萄孢均正常生長(zhǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)兩菌接觸，灰葡萄孢的生長(zhǎng)受到明顯抑制，抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，粉紅粘帚菌WY-1的抑制圈明顯擴(kuò)大，灰葡萄孢無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)并逐漸被粉紅粘帚菌WY-1覆蓋，由此說明本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1對(duì)灰葡萄孢有抑菌作用。本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)選擇番莉灰霄病cz'"gr6a)，番莉卩十毒病(C7fl(ias/or/M附^/vw附)，番莉綿疫病(尸/y^o//^/zon3/an2s/"ca),番茄黃萎病(P^r/Z〃z'w附，番茄枯萎病(i^san.ww)，楊樹爛皮病(Fa/MsoW/(^M./)，楊樹枯萎病"temw/a),黑穗醋栗葉斑病(/^^fop^'加A7eZO8個(gè)病原真菌菌株進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng)，將本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1和所選擇的病原菌分別接種于相同組分的PDA培養(yǎng)基上活化，然后分別從各活化菌落邊緣用打孔器打成10mm直徑的菌絲餅，再分兩種不同的處理方式進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)第一種、本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1菌絲餅與病原菌菌絲餅間距離為4cm，并以單獨(dú)培養(yǎng)的病原菌菌絲餅為對(duì)照；第二種、本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1菌絲餅與病原菌菌絲餅的菌絲面相對(duì)貼在一起培養(yǎng)；對(duì)峙培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均為直徑為9cm的PDA固體培養(yǎng)基，并且每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)培養(yǎng)皿在22x:恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。第一種對(duì)峙培養(yǎng)中抑菌率計(jì)算公式為抑菌率(％)=[(對(duì)照平均直徑-處理平均直徑)/對(duì)照平均直徑]><100%表1對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)^^^^音養(yǎng)天數(shù)粉紅粘帚菌WY-1抑菌率(％)4天8天番茄灰霉病病原菌62.587.5番茄葉霉病病原菌2562.8番茄綿疫病病原菌8087.5番茄黃萎病病原菌2080番茄枯萎病病原菌2575楊樹爛皮病病原菌12.562.5楊樹枯萎病病原菌42.878黑穗醋栗斑枯病病原菌4087.5第一種對(duì)峙培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。根據(jù)表1列舉的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明粉紅粘帚菌WY-1對(duì)病原菌的抑菌效果均是隨著時(shí)間的推移逐漸提高，粉紅粘帚菌WY-1與病原菌接觸后病原菌菌落直徑不再增加，而粉紅粘帚菌WY-1逐漸侵入病原菌生長(zhǎng)圈。從粉紅粘帚菌WY-1對(duì)8種病原菌的抑制作用效果來(lái)看，粉紅粘帚菌WY-1在培養(yǎng)第4天時(shí)的平均抑制作用為38.48%，在培養(yǎng)第8天時(shí)抑制效果平均達(dá)77.6%。延長(zhǎng)對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)間，在對(duì)峙培養(yǎng)30天后粉紅粘帚菌WY-1與病原菌成為一個(gè)整體，從中挑取菌絲繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)的40個(gè)培養(yǎng)皿中沒有發(fā)現(xiàn)病原菌，說明粉紅粘帚菌WY-1對(duì)番茄灰霉病(對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示)、番茄葉霉病、番茄綿疫病、番茄黃萎病、番茄枯萎病、楊樹爛皮病、楊樹枯萎病和黑穗醋栗葉斑病病原菌都有明顯的抑制作用。第二種對(duì)峙培養(yǎng)過程中后沒有看見病原菌菌落的出現(xiàn)，但在接種中心點(diǎn)位置粉紅粘帚菌WY-1的菌絲明顯增長(zhǎng)，表明粉紅粘帚菌WY-1抑制了病原菌菌絲的生長(zhǎng)。本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1溫室防治番茄灰霉病試驗(yàn)在溫度為22'C、pH值為5、以可溶性淀粉為碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)粉紅粘帚菌WY-110天，然后將液體培養(yǎng)基接種到滅菌的麥粒上，光照培養(yǎng)12天，晾干制成粉紅粘帚菌WY-1粉劑(4'C保存)。將粉紅粘帚菌WY-1粉劑配制成濃度為1"06孢子/1111的懸浮液備用；番茄灰霉病病原菌(及d"we")用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)10天后加入含有0.05%(w/v)tween20和1%(w/w)KH2P04的無(wú)菌水中配制成濃度為lxl(^孢子/ml的孢子懸浮液。溫室內(nèi)種植番茄品種佳人和L402，于6葉期進(jìn)行接種，試一驗(yàn)分為8個(gè)處理，每個(gè)處理選用番茄苗60株，采用葉面噴施，直到處理液從頁(yè)面流下。番茄苗接種后保持溫度為22±1°C、相對(duì)空氣濕度90%以上。8種接種方式為(1)同時(shí)接種番茄灰霉病孢子懸浮液和粉紅粘帚菌WY-1懸浮液；(2)先接種番茄灰霉病孢子懸浮液發(fā)病后噴施粉紅粘帚菌WY-1懸浮液；(3)先噴施粉紅粘帶菌WY-1懸浮液7天后接種番茄灰霉病孢子懸浮液；(4)先噴施粉紅粘帚菌WY-1懸浮液7天后接種番茄灰霉病孢子懸浮液，此后每7天噴施一次粉紅粘帚菌WY-1懸浮液；(5)先接種番茄灰霉病孢子懸浮液發(fā)病后噴施化學(xué)藥劑"灰霉大夫"；(6)只接種番茄灰霉病孢子懸浮液；(7)只噴施粉紅粘帚菌WY-1懸浮液；(8)只噴水對(duì)照。接種番茄灰霉病孢子懸浮液第10天開始統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，每隔5天調(diào)査一次，病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)0級(jí)——無(wú)??；1級(jí)——1/4以下葉片發(fā)?。?級(jí)——1/41/2葉片發(fā)?。?級(jí)——1/23/4葉片發(fā)??；84級(jí)——3/4以上葉片發(fā)病。發(fā)病率和防治效果計(jì)算公式為發(fā)病率-P(各級(jí)病葉x該病級(jí)值)/(調(diào)查總?cè)~x最高極值)]x100防治效果(％)=[(對(duì)照區(qū)發(fā)病率-發(fā)病率)/對(duì)照區(qū)發(fā)病率]"00本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1溫室防治番茄灰霉病的試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示。表2溫室防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)中所設(shè)置的環(huán)境條件最適合番茄灰霉病發(fā)病，由表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表2中發(fā)病率由病害級(jí)別準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)分析而來(lái))可看出粉紅粘帚菌WY-1能夠起到防治番茄灰霉病的效果，其防治效果與化學(xué)藥劑(灰霉大夫)相當(dāng)，可以在實(shí)際環(huán)境中用于番茄灰霉病的防治。施用WY-1粉劑和"灰霉大夫"的防治效果分別為58.37%和52.44%。說明本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1對(duì)番茄灰霉病具有優(yōu)異的防治效果。接種方式(2)中番茄長(zhǎng)勢(shì)如圖8所示，接種方式(6)中番茄長(zhǎng)勢(shì)如圖9所示。采用CTAB法提取本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1的總DNA，分別對(duì)粉紅粘帚菌WY-15.8SrDNA和18SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))回收純化PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化和5.8SrDNA、18SrDNA測(cè)序。粉紅粘帚菌WY-118SrDNA如SEQIDNO:3所示，粉紅粘帚菌WY-15.8SrDNA如SEQIDNO:2所示。采用TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。粉紅粘帚菌WY-118SrDNAPCR擴(kuò)增上游引物NS1:5，-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3，，粉紅粘帚菌WY-118SrDNAPCR擴(kuò)增下游引物NS8:5，-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3，。PCR反應(yīng)體系50pl:ddH2035pl、10xbuffer5.0jil、dNTP4.0pl、引物NS12.0jil、弓l物NS82.0ul、Taq酶lpl、粉紅粘帚菌WY-1總DNAlpl。PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min，變性94°Clmin、退火60。Clmin、延伸72°C2min，共35個(gè)循環(huán)，延伸72°ClOmin。粉紅粘帚菌WY-15.8SrDNAPCR擴(kuò)增上游引物ITS4:5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，粉紅粘帚菌WY-118SrDNAPCR擴(kuò)增下游引物ITS5:5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，。PCR反應(yīng)體系50nl:ddH2035pl、10xbuffer5.0|il、dNTP4.0|xl、引物ITS42.0jil、引物ITS52.0ul、Taq酶ljil、粉紅粘帚菌WY-1總DNAljil。PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2min，變性94"C40s、退火52。Clmin、延伸72°Clmin，共40個(gè)循環(huán)，延伸72°C5min。本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1接種到PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落由分枝狀菌絲組成，菌絲較粗而長(zhǎng)呈絨毛狀。菌落表面平滑呈扁平狀，有同心圓環(huán)和輕微的輻射狀溝紋。暗培養(yǎng)下該菌可產(chǎn)生黃色水溶性色素，在光照培養(yǎng)條件下，則為粉紅色或橘紅色。在顯微鏡下觀察，本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1菌絲分枝較多，無(wú)色具隔，菌絲較粗。本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1分生孢子(5|iim7jim)x(3.0nm~5.0nm)，表面光滑、帚狀枝常輪狀分枝34次；分枝末端產(chǎn)生分生孢子，無(wú)性孢子是單細(xì)胞的，長(zhǎng)卵形或圓柱形，芽管無(wú)色，多數(shù)從分生孢子的一端長(zhǎng)出。對(duì)本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1同源進(jìn)行比對(duì)(粉紅粘帚菌WY-1與Genbank中收錄的相近菌株的5.8SrDNA所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示)，粉紅粘帚菌WY-15.8SrDNA與所o"ec/〃'(3oc/zra/e"caxsd08089最為接近，其相似性達(dá)93%。因此，通過菌落形態(tài)、菌株生化性能以及5.8SrDNA比對(duì)結(jié)果可以確定本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1屬于粘帚霉屬(歷o"ec^7'aoAra/ewc")。對(duì)粉紅粘帚菌WY-118SrDNA進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)與粉紅粘帚菌WY-118SrDNA最為接近的是M少raAec/ww平(漆斑霉屬)而不是粘帚霉，所以斷定本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1為粘帝霉屬新菌株。本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得，若無(wú)特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式中的操作步驟參見試劑盒使用操作手冊(cè)。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌菌株——粉紅粘帚菌WY-1中(3-l,3-葡聚糖酶基因片段如SEQIDNO:1所示。本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1用PDA固體培養(yǎng)基活化，然后轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取lOOmg粉紅粘帚菌WY-1菌絲體提取RNA并轉(zhuǎn)錄為cDNA，并通過GenBank與已知其它真菌的(3-l，3-葡聚糖酶基因進(jìn)行比對(duì)，用Clustalw方法分別比較同源性，再找出最保守的氨基酸序列，并根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對(duì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR擴(kuò)增(3-l,3-葡聚糖酶基因片段并測(cè)序，GenBank登陸號(hào)(accessionnumber)為DQ975304。得出本實(shí)施方式粉紅粘帚菌WY-1含有P-l,3-葡聚糖酶基因。其中100ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基由3g昆布多糖、0.3gNaN03、O.lgK2HP04、0.05gKCl、0.05gMgS04*7H20、0.001gFeSCV7H2O、2g瓊脂和余量的蒸餾水制成，無(wú)需調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。卩-l,3-葡聚糖酶具有溶菌作用，可以在粉紅粘帚菌WY-1不直接接觸病原菌的情況下引起病原菌菌絲解體、消失。本實(shí)施方式獲得的粉紅粘帚菌WY-l的j3-l,3-葡聚糖酶基因可用于未來(lái)生物防治工程菌株的改造。序列表〈110〉東北農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>—種抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌菌株<160〉7〈210〉1〈211〉730〈212〉DNA〈213〉粘帚霉屬(歷'o/e""'3ocAr。Je"ca)<220>〈223>粉紅粘帚菌WY-1中1，3-葡聚糖酶基因片段?！?00〉1gg3gCC犯3ggtg3tggagcc卿gg卿cggtattgcagstgacaccgcggctctgcag60gctgctctcgatgccgctgctgctg已cgaagtcgtgtttttcccacacggcgcctaccta120atccacgatactatcgatatccccgcgaac3ttCgC3ttgtcggcg卿tctggcctctc180ttgatggcagctggcgatagcaacttccaagatcagctta8LCcccaaaxxtatgcttcgt240gtaggtcagccaggcgatgttggcaatgtcgagatctccgacttcatgattgagacc犯g300ggtagccagccaggcgcgattctC3tggaatggaacttggagtctacgtccaagggatct360gccggtttgtg卿cgttcacttccgtatcggcggatctgctggtacgcagctacaatcc420gatacctgtaccaagactcc幼atgttcccacgcagcccaaccccgactgCEltCgg8gCt480ttC3tgCtg3tgcatattaccgagactgcctcgatctacatggagaacacatggctttgg540gtttctgaccacgagctcgatcgcaacgactataatcaaatcaacatctacaacggccgt600ggccttctcgtggaatcaacaaagccggtttggctctggggaaccgcatcggagcac犯t660gctctgtacaactatca^tttccagasttgcgcaagt￡itgt￡itacatgacattcatccagacg720gaaaccccat730〈210〉2〈211〉59312〈212〉DNA〈213〉粘帚霉屬Wo"ectr/socAro/euca)<220><223>粉紅粘帚菌WY-15.8SrDNA?！?00〉2ggaagt3aaa^gtcgt犯c犯ggtctccgttggtgaaccagcgg鄉(xiāng)g已tcattaccgeigt60ttacasctcccaaacccatgtg犯catacctactgttgcttcggcgggstttgccccgggc120gcctcgtgtgccccggatcaggcgcccgcctaggetaacttaattcttgttttattttgga180gcctcgtgtgccccggatcaggcgcccgcctaggaaacttaattcttgttttattttgga240gc已tcg3tgssg犯cgcagcg犯atgcga^agLgtaatgtg8L3ttgC￡Lg￡L￡LttCagtg6LSLt300catcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtctgag360cgtcatttcaaccctcatgcccctagggcgtggtgttggggatcggccaaagcccgcgag420ggacggccggcccct犯atctagtggcggacccgtcgtggcctcctctgc卿gtgtgtga480tattccgcatCgg卿gCg3cgagcccctgccgtt犯acccccaactttcc犯ggttgac540ctcagatcaggtaggaatacccgctgaactt犯gc3teitca^taagcggagga593〈210〉3〈211〉1768〈212〉DNA<213>禾占帝霉屬Wo/ectrisocAm/e〃ca)〈220〉〈223〉粉紅粘帚菌WY-l18SrDNA?！?00〉3gtagtcatatgcttgtctcaaagattaagccatgcatgtctaagtataagcaattatacg60gcgaaactgcg幼tggctcatt3t3taagttatcgtttatttgatagtaccttactactt120ggat犯ccgtggtaattctELgagct犯tacatgcttaaaatcccgacttcggaagggatg180tatttattagattaaaaaccaatgcccttcggggctctctggtgattcatgataacttct240cg犯tcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaastttcttccctatcaactttcg300atgtttgggtattggccaa^Lcatggttgcaacgggtaacggagggttagggctcgacccc360gg卿鄉(xiāng)3gcctgagaaacggctactacatccaagga3ggcsgc鄉(xiāng)cgcgcaaattac420ccaatcccgactcggggaggtagtgacaataaatactgatacagggttcttttggatctt480gt^ttgg犯tgagtacaattta犯tccctt￡L￡LCg￡Lgg￡L3caattggagggcaagtctgg540tgccagcagccgcggtaattccagctcc犯tagcgtatattaaagttgtt600agctcgtagttgaaccttgggcctggctggccggtccgcctcaccgcgtgtactggtccg660gccgggcctttccctctgtggaaccctatgcccttcactgggtgtsgcgg720cttttactttgagtgctccaggcaggcctttgctcgaatacattagcatg7803t鄉(xiāng)acgt:gtggttctattttgttggtttCt8gg3CCgCCgta3tg3tt840gtcgggggcatc3gt3ttca3ttgtC3g3ggtg犯attcttggatttatt■gaagact犯ctactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcatt肌tcaggaacga^agt960t鄉(xiāng)ggatcg8Bg￡LCg￡LtC￡lgataccgtcgtagtcttaacgccgact鄉(xiāng)1020gatcggacgatgttaaaaattgactcgttcggcaccttacgagaaatca^3gtgCttggg1080CtCC3ggggg3gta^tggtcgC犯ggCtg33acttaaagaaattgacggaagggcaccacc1140郷ggtgg站cctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacac1200aatg3ggattgaceigBttgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgt1260tcttagttggtggsgtg3tttgtctgcttacg犯cgagaccttaacctgc1320taactagcccgtattgctttggcagtacgctggcttcttag觀ggactatcggctc犯gc1380cgatgg卿tttgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgc1440gcgctacactgacggagccagcgagtactcccttggccga卿gcctgggtaatcttgtt15003犯CtCCgtCgtgctggggstagagcattgcaattattgctcttc肌cgaggaatcccta1560gtaagcgcaagtcatcagcttgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgt1620cgctactaccgattgaacggCtC8gtg郷cgtccggactggCCC3g卿1680caccactcagggccggs鄉(xiāng)ctctccaaactcggtcatttaggggaagtaaaagtcgtaa1740caaggtctccgtaggtgaacctgcggaa1768〈210〉4〈211〉19〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223>粉紅粘帚菌WY-118SrDNAPCR擴(kuò)增上游引物NS1?！?00〉4gtagtcatatgcttgtctc19〈210〉5<211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉粉紅粘帚菌WY-118SrDNAPCR擴(kuò)增下游引物NS8?！?00〉5tccgcaggttcacctacgga20<210〉6〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉粉紅粘帚菌WY-l5.8SrDNAPCR擴(kuò)增上游引物ITS4。<400>6tcctccgcttattgatatgc20〈210〉7<211>22<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉粉紅粘帚菌WY-15.8SrDNAPCR擴(kuò)增下游引物ITS5?！?00>7ggaagtaaaagtcgtaacaagg22。1權(quán)利要求1、一種抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌菌株，其為粉紅粘帚菌WY-1(BionectriaochroleucaWY-1)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.1977。全文摘要一種抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌菌株，它涉及一種粘帚霉菌菌株。本發(fā)明提供了粘帚霉屬的一個(gè)新菌株，可用于抑制番茄灰霉病，并對(duì)其它多種真菌病害具有抑制效果，為生物防治番茄灰霉病和利用生物技術(shù)培育番茄灰霉病抗性品種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌為粉紅粘帚菌WY-1，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.1977。本發(fā)明粉紅粘帚菌WY-1對(duì)番茄灰霉病、番茄葉霉病、番茄綿疫病、番茄黃萎病、番茄枯萎病、楊樹爛皮病、楊樹枯萎病和黑穗醋栗葉斑病病原菌都有明顯的抑制作用，可以抑制了病原菌菌絲的生長(zhǎng)。文檔編號(hào)C12N1/14GK101643705SQ20091007286公開日2010年2月10日申請(qǐng)日期2009年9月11日優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日發(fā)明者張麗莉,李景富,楊依軍,王傲雪,王迎春,陳秀玲申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)