一種白黃鏈霉菌在番茄灰霉病防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種白黃鏈霉菌（Streptomyces albofIavus)在番前灰霉病害防治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 灰霉病是一種世界性的真菌病害，灰霉病原菌寄主范圍廣、繁殖快、遺傳變異大、 容易產(chǎn)生抗藥性，可侵染番茄、葡萄、黃瓜、草莓等多種作物的葉片、果實(shí)及果柄等部位?；?霉病的危害是歐洲、亞洲、美洲、地中海沿岸等國家面臨的一個(gè)普遍性問題。番茄灰霉病是 番前生產(chǎn)中影響番前產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一。目前，主要利用多菌靈、喃霉胺和腐霉利 等化學(xué)農(nóng)藥防治番茄灰霉病。但化學(xué)藥劑的長期使用容易造成環(huán)境污染、殘毒積累，甚至危 及人畜健康。生物防治由于具有高效、廣譜、對人畜安全及與生態(tài)環(huán)境兼容等特點(diǎn)，越來越 受到人們的關(guān)注和重視。
[0003] 生物防治，即在各種條件下或者利用各種措施，通過其它生物的自然控制作用，降 低植物病原物的生存和活動(dòng)能力從而達(dá)到減輕病害發(fā)生和危害的目的的病害控制策略。微 生物由于易于大量培養(yǎng)，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物豐富，抑菌作用強(qiáng)，在植物病害的生物防治方面具 有很大的商業(yè)價(jià)值。目前，國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了許多能控制番茄生長及采后灰霉病害的拮抗 細(xì)菌、真菌、放線菌以及商品化的生防制劑。
[0004] 鏈霉菌的分類地位為細(xì)菌域，放線桿菌綱，放線菌亞綱，放線菌目，鏈霉菌科，鏈霉 菌屬。鏈霉菌主要分布在土壤中，種類繁多，產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是一類具有較 大開發(fā)潛力的微生物資源。鏈霉菌作為抗生素等一些價(jià)值較高的生理活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌， 在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等多方面有著廣泛應(yīng)用，它所產(chǎn)生的抗生素不僅能有效地防治人類和牲畜的 傳染性疾病，在農(nóng)業(yè)病害的生物防治方面也有重要應(yīng)用。篩選拮抗鏈霉菌用以防治番茄灰 霉病，是利用自然間天然存在的微生物之間的拮抗效應(yīng)進(jìn)行的生物防治措施，不易產(chǎn)生抗 性，安全性高，符合我國農(nóng)業(yè)和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的要求，是解決番茄灰霉病害發(fā)生和蔓延的 重要途徑之一。
[0005] 通過檢索，發(fā)現(xiàn)如下兩篇與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)：
[0006] 1. 一株微白黃鏈霉菌及其在防治黃瓜霜霉病方面的應(yīng)用（CN103468620A)，公開 了一株微白黃鏈霉菌及其在防治黃瓜霜霉病方面的應(yīng)用，屬于生物防治植物病害領(lǐng)域。該 菌株為微白黃鏈霉菌（Streptomycesalbidoflavus)ACT033,保藏編號(hào)CGMCCNo. 8125。本 發(fā)明還公開了一種采用該新的微白黃鏈霉菌菌株ACT033制備的能夠高效防治黃瓜霜霉病 的生物防治制劑及其制備方法。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的微白黃鏈霉菌菌株ACT033具有生長速 度快、產(chǎn)孢量大、作用譜廣、抗逆性強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點(diǎn)，因此具有良好 的應(yīng)用前景。由該微白黃鏈霉菌菌株ACT033制備的生物防治制劑，不僅能夠防治黃瓜霜霉 病，還能有效提高作物產(chǎn)量。
[0007] 2.具有新代謝特性的微白黃鏈霉菌及其在生物降解中的應(yīng)用（CN101250491)，本 發(fā)明分離篩選出一株具有新代謝特性的微白黃鏈霉菌。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是微白黃鏈霉菌通過 部分還原途徑降解硝基苯，并礦化降解過程中的副產(chǎn)物吡啶甲酸，從而實(shí)現(xiàn)硝基苯的徹底 降解，解決了硝基苯部分還原降解中的瓶頸；微白黃鏈霉菌能夠在高鹽度以及多種有機(jī)物 質(zhì)共存的條件下有效降解硝基苯；微白黃鏈霉菌能夠以吡啶甲酸為唯一碳、氮、能源進(jìn)行生 長，吡啶甲酸最終被礦化為無害的二氧化碳和水；微白黃鏈霉菌能夠作為生物強(qiáng)化制劑應(yīng) 用于鹽度高、成分復(fù)雜的硝基苯廢水和吡啶甲酸廢水的生物治理中。
[0008] 通過對比，本發(fā)明專利申請與上述專利公開文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種長期使用不會(huì)造成環(huán)境污 染、殘毒積累、不會(huì)危及人畜健康、具有較強(qiáng)的抑制效果的白黃鏈霉菌在番茄灰霉病害防治 中的應(yīng)用，提供了一種防治番茄灰霉病的新菌株和新方法。
[0010] 本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0011] -種白黃鏈霉菌在番前灰霉病防治中的應(yīng)用，所述白黃鏈霉菌（Streptomyces alboflavus)為白黃鏈霉菌TD-I，該白黃鏈霉菌TD-I保藏在中國微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4666,所述白黃鏈霉菌TD-I的活菌體、發(fā)酵液、 麥麩培養(yǎng)物、麥麩培養(yǎng)物的固態(tài)菌劑或麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)（VOCs)在番茄灰霉 病防治中的應(yīng)用。
[0012] 而且，所述白黃鏈霉菌TD-I的發(fā)酵液的制備步驟如下：
[0013] ⑴菌種的活化培養(yǎng)：
[0014] 將分離保存的白黃鏈霉菌TD-I菌株轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，30°C條件下培養(yǎng) 5-6d，保存?zhèn)溆茫?br>[0015] ⑵菌株ID-I孢子懸浮液的制備：
[0016] 取PDA平板上活化的白黃鏈霉菌TD-I，用無菌水洗下平板表面的孢子，配成孢子 懸浮液，并調(diào)整孢子濃度為1. 〇XIO6個(gè)/mL;
[0017] ⑶菌株TD-1種子培養(yǎng)液的制備：
[0018] 種子液培養(yǎng)基為每1000 mL水中含有可溶性淀粉，20.Og;黃豆粉，10.Og;KN03， I.Og;K2HP04,0. 5g;NaCl，0. 5g;MgS04.7H20,0. 5g;FeS04.7H20,0.Olg，每 250mL三角瓶裝培 養(yǎng)基IOOmL;配制后121°C滅菌20min，待冷卻后在無菌條件下按1%的接種量將TD-I孢子 懸浮液接種于培養(yǎng)基內(nèi)，30°C，180r/min搖床培養(yǎng)48h，得到菌株TD-I種子液；
[0019] ⑷TD-I菌株發(fā)酵液的制備：
[0020]TD-I菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與⑶中種子液培養(yǎng)基配方一致，121°C滅菌20min，待 冷卻后在無菌條件下按10%的比例接種TD-I種子液，30°C、180r/min搖床培養(yǎng)6d，5000r/ min離心15min，取上清液備用，即得可用于對灰霉菌抑菌的白黃鏈霉菌TD-I的發(fā)酵液。
[0021] 而且，所述白黃鏈霉菌TD-I的麥麩培養(yǎng)物的制備步驟如下：
[0022] 稱取20_30g的干燥麥麩，按照料水比的質(zhì)量比為1:1的比例添加蒸餾水，121°C滅 菌20min，冷卻后按20%的比例接種鏈霉菌TD-I的種子培養(yǎng)液，在30°C條件下培養(yǎng)8d，即 得可用于對灰霉菌抑菌的白黃鏈霉菌TD-I的麥麩培養(yǎng)物。
[0023] 而且，所述白黃鏈霉菌TD-I麥麩培養(yǎng)物的固態(tài)菌劑的制備步驟如下：
[0024]而且，稱取20_30g的無菌麥麩，按20%的接種量，接種鏈霉菌TD-I種子液，30°C發(fā) 酵2d，待菌種適應(yīng)生長環(huán)境后，將發(fā)酵物置于30°C烘箱中干燥24h，再按2% (mL/g)的比例 添加司盤60:吐溫80(1:1)乳化劑到干燥后的固態(tài)發(fā)酵物中，分裝于自封袋中，4°C條件下 保存兩個(gè)月后，即得白黃鏈霉菌TD-I麥麩培養(yǎng)物的固態(tài)菌劑。
[0025] 而且，所述白黃鏈霉菌TD-I的麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)在番茄灰霉病防治 中的應(yīng)用的檢測方法的步驟如下：
[0026] ⑴抑菌活性測定方法
[0027] 采用雙皿對扣法測定揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性，根據(jù)測量得到的菌落直徑，用以下 公式計(jì)算揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的抑菌率；
[0028] 抑菌率=[(空白組菌落直徑一實(shí)驗(yàn)組菌落直徑）/空白組菌落直徑]X100%
[0029] ⑵揮發(fā)性物質(zhì)對菌絲生長和產(chǎn)孢能力的影響
[0030] 取發(fā)酵8d的TD-I麥麩培養(yǎng)物，置于直徑90mm的皿底，取活化好的灰霉孢菌菌餅， 直徑6mm，接種于另一PDA皿底中央，兩皿對扣，封□膜密封，25°C培養(yǎng)，以加入相應(yīng)質(zhì)量的 無菌麥麩作為空白對照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次，5d后，采用十字交叉法測量菌落直 徑，按上述公式計(jì)算抑菌率，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)各組灰霉病菌的產(chǎn)孢量；
[0031] ⑶揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉病菌細(xì)胞膜通透性的影響
[0032] 雙層平皿培養(yǎng)如步驟⑵所述，下層皿底為發(fā)酵8d的TD-I麥麩培養(yǎng)物，上層皿底 倒入PDA培養(yǎng)基，冷卻后平鋪滅菌玻璃紙，I. 5XI. 5cm2,將灰霉病菌孢子懸浮液濃度調(diào)整至 0. 5 - 5X106CFU/mL，取0. 5mL均勻涂布于玻璃紙上，以加入相應(yīng)質(zhì)量的無菌麥麩作為空白 對照，封口膜密封，25 °C培養(yǎng)，分別于12h、24h、36h、48h和60h時(shí)取出，5mL無菌水洗下菌體， 離心，取上清，分光光度計(jì)測定OD26tl值；每個(gè)樣品做3次平行，重復(fù)3次；
[0033] ⑷揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉病菌細(xì)胞形態(tài)的影響
[0034] 挑取培養(yǎng)5d的菌落邊緣菌絲，在生物顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)及變化；從PDA培養(yǎng) 基上取大小為3-5mm3灰霉病菌菌塊，用掃描電子顯微鏡觀察揮發(fā)性物質(zhì)對菌絲微觀形態(tài)的 影響；
[0035] (5)揮發(fā)性物質(zhì)的對番茄果實(shí)上灰霉病菌的防治
[0036] 取大小一致的番前果實(shí)，每個(gè)果實(shí)用打孔器打一直徑6mm的傷口，接種濃度為 0. 5 - 5XIO6CFUAiL的灰霉孢菌孢子懸浮液IyL，將果實(shí)放入帶隔板保鮮盒，盒底部放入 20gID-I麥麩培養(yǎng)物，放少量無菌水保濕，保鮮膜封住保鮮盒口，以加入相應(yīng)質(zhì)量的無菌麥 麩作為空白對照，30°C培養(yǎng)4d后觀察灰霉病菌對番茄果實(shí)的侵染情況；
[0037] (6)揮發(fā)性物質(zhì)的GC/MS分析鑒定
[0038] 取樣品于頂空瓶中，45°C水浴30min，用經(jīng)老化處理的DVB/CAR/PDMS固相微萃