專利名稱：一種降壓肽活性的體外檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬功能食品的檢測方法領(lǐng)域，涉及降壓肽活性檢測的方法，尤其涉及利用高效液相色譜與熒光 檢測器聯(lián)用對蛋清降壓肽的檢測。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定成人血壓》160/95mmHg為高血壓，據(jù)統(tǒng)計,世界上約有IO億人患有高血壓， 每年約有4百萬人死于高血壓，平均每8個死亡個體中有1個死于高血壓，目前，高血壓已經(jīng)嚴(yán)重威脅著 人類的健康。研究表明某些肽類化合物具有降低血壓的功能，稱之為降壓肽。目前，針對降壓肽較為普遍 應(yīng)用的體外檢測方法是紫外分光光度計檢測，在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的作用下水解馬尿酰組氨酰亮 氨酸(HHL)，經(jīng)過萃取分離等操作將產(chǎn)物馬尿酸(Hip)分離出，通過對比完全反應(yīng)(ACE催化HHL水 解)、存在抑制劑的反應(yīng)(ACE在抑制劑存在條件下催化HHL水解)、空白反應(yīng)(將ACE滅活后在抑制劑 存在條件下催化HHL水解)三個反應(yīng)來確定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性，進(jìn)而確定降壓肽的活性。 因此，體外降血壓活性也用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率來表示。
但是，采用紫外分光光度計檢測方法存在操作步驟復(fù)雜、使用有毒有害有機(jī)溶劑、檢測藥品費用高等 缺點；近年有報道高效液相色譜與紫外分光光度計聯(lián)用來檢測水解產(chǎn)物馬尿酸(ffip)，但也存在成本高等 弊端；而傳統(tǒng)的熒光分光光度計檢測法由于存在肽與鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)的千擾使得檢測不穩(wěn)定，同 時也存在藥品用量大的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的檢測方法操作步驟復(fù)雜、操作人員直接接觸有害溶劑、檢測藥品用量高等技術(shù)缺點。本發(fā)明提供了一種運用鄰苯二甲醛(OPA)與組胺酰亮氨酸(HL)反應(yīng)生成熒光 物質(zhì)，經(jīng)高效液相色譜分離，通過熒光檢測器進(jìn)行定量的檢測方法。本方法方便，靈敏，藥品用量少。 本方法的技術(shù)方案如下
本方法需要對比兩組反應(yīng)，要求這兩組反應(yīng)在同樣外界條件下單獨進(jìn)行，其中，有一組中存在抑制劑 (用B表示)，另一組不存在抑制劑(用A表示)。兩組反應(yīng)按如下步驟進(jìn)行
1、 組胺酰亮氨酸(HL)生成反應(yīng)首先在30。C 4(TC條件下將反應(yīng)容器預(yù)熱5 15min， A、 B反應(yīng)分 別加入相同劑量(10 50nL0.05U/ml 0.5U/ml)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)， A反應(yīng)中加入10pL的硼酸 鹽緩沖溶液(0.1mol/LpH=8.3含0.3 mol/L NaCl)， B反應(yīng)中加入與A相同體積一定濃度的降壓肽硼酸鹽 緩沖溶液。兩組反應(yīng)同時加入10 30nL3 5mmol/L的馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL),在30。C 40'C條件下 反應(yīng)2(K50min，反應(yīng)過程中要保持溫度恒定。
2、 組胺酰亮氨酸(HL)生成反應(yīng)的終止及堿性條件的建立通過改變pH值，使酶的活性降低至幾 乎不再催化水解反應(yīng)。加入300 400nL0.2""0.4mol/LNaOH溶液終止反應(yīng)。保證pH值為10.5~14.0
3、 熒光物質(zhì)生成在3(TC 4(TC條件下加入鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)5 15min。此反應(yīng)要求在堿性條 件下進(jìn)行，在稀酸性或中性條件下逆反應(yīng)反應(yīng)速率較快，影響檢測準(zhǔn)確性。
4、 熒光物質(zhì)生成反應(yīng)的終止通過調(diào)節(jié)pH值來終止反應(yīng)，加入30~40pL 2~4mol/L的HC1來終止反 應(yīng)。最終整個反應(yīng)體系為中性或偏酸性。注本反應(yīng)終止后應(yīng)盡快稀釋檢測。
5、 液相色譜的分離采用高效液相色譜法來分離熒光物質(zhì)，將反應(yīng)液稀釋10 200倍，在流動相水與 乙腈比例在3: 1~5: 1，流速在0.5 0.8ml/min條件下進(jìn)樣l~10pL，通過高效液相色譜法將組胺酰亮氨酸
(HL)與鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)產(chǎn)物充分分離，避免因肽與鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)以及肽本身在該條 件下發(fā)射熒光干擾。使得檢測準(zhǔn)確。通過如下公式計算血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率
抑制率/(%) =x 100%
注A為抑制劑不存在條件下的峰面積；B為抑制劑存在條件下的峰面積。
熒光檢測方法學(xué)驗證本發(fā)明的檢測方法在0.0016nmol^0.128nmol線性范圍時其線性關(guān)系良好，反應(yīng) 的回收率為99.26%~403鄰％，反應(yīng)的靈敏度較高，反應(yīng)的重現(xiàn)性較好。
本發(fā)明的有益效果在于簡化操作的整體步驟，尤其是分離操作的步驟；采用高效液相色譜法提高分 離效率，分離效果好；減少藥品的使用量，使檢測成本降低；避免與有害溶劑的接觸，保證操作人員的身 體健康。
具體實施例方式
實施例1
在30'C條件下，將反應(yīng)容器預(yù)熱15min， A、 B反應(yīng)同時加入50pL0.05U/ml血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE), A反應(yīng)中加入10nL的硼酸鹽緩沖體系(0.1mol/LpH=8.3含0.3 mol/LNaCl)， B反應(yīng)中加入與A相同體積 一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液。A、B反應(yīng)同時加入40)iL4mmol/L的HHL，在3(TC條件下反應(yīng)50min， 加入400nL 0.2mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)，加入20|_iL的鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)15min，加入40|iL2mol/L 的HC1，終止反應(yīng)，將反應(yīng)液稀釋200倍，流動相水與乙腈比例在3: 1流速0.5ml/nun條件下進(jìn)樣5nL, 記錄出峰面積，出峰時間為5 15rmn。
實施例2
在37。C條件下將反應(yīng)容器預(yù)熱10min， A、 B反應(yīng)同時加入20nL0.2 U/ml血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)， A反應(yīng)中加入10nL的硼酸鹽緩沖體系(0.1mol/LpH=8.3含0.3 mol/LNaCl)， B反應(yīng)中加入與A相同體積 一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液。A、 B反應(yīng)同時加入30|aL底物5mmo1/ L的HHL，在37'C條件下反應(yīng)30min，加入360nL0.3mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)，加入lOpL的鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)lOmin，加入 36nL3mol/L的HCl，終止反應(yīng)，將反應(yīng)液稀釋10倍，在流動相水與乙腈比例在4: 1,流速0.8ml/min條 件下進(jìn)樣1HL，記錄出峰面積。 實施例3
在40'C條件下將反應(yīng)容器預(yù)熱15rmn， A、 B反應(yīng)同時加入10nL0.5 U/ml血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)， A反應(yīng)中加入10nL的硼酸鹽緩沖體系(0.1mol/LpH=8.3含0.3 mol/LNaCl) B反應(yīng)中加入與A相同體積 一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液。A、 B反應(yīng)同時加入10(aL底物5mmol/L的HHL，在4(TC條件下反應(yīng) 20min，加入300nL 0.4mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)，加入50jiL的鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)5mm，加入 30nL4mol/L的HCl，終止反應(yīng)，將反應(yīng)液稀釋100倍，在流動相水與乙腈比例在5: 1，流速在0.6ml/min 條件下進(jìn)樣10nL，記錄出峰面積。
權(quán)利要求
1、一種檢測降壓肽體外活性，即檢測血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率的方法，采用高效液相色譜與熒光檢測器聯(lián)用的方法對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制率進(jìn)行測定；其特征在于檢測過程主要包括組氨酰亮氨酸(HL)生成、組胺酰亮氨酸(HL)生成反應(yīng)的終止及堿性條件的建立、熒光物質(zhì)生成、熒光物質(zhì)生成反應(yīng)的終止、熒光物質(zhì)的檢測五部分。
2、 根據(jù)權(quán)利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的組氨酰亮氨酸(HL)生成過程 包括對比兩組獨立的反應(yīng)A、 B，其中A為沒有降壓肽存在下馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)水解生成組 胺酰亮氨酸(HL), B為有降壓肽存在條件下馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)水解生成組胺酰亮氨酸(HL)。 具體步驟為在30。C 40'C條件下將反應(yīng)容器預(yù)熱5 15min， A、 B反應(yīng)分別加入相同劑量(10 50& 0.05U/ml~0.5 U/ml)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)， A反應(yīng)中加入lO^L的硼酸鹽緩沖溶液(0.1mol/LpH=8.3 含0.3 mol/LNaCl), B反應(yīng)中加入與A相同體積一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液；A、 B反應(yīng)同時加入 1(K30nL底物3 5mmol/L的馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL),在30'C 4(TC條件下反應(yīng)20 50min。
3、 根據(jù)權(quán)利1所述的降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的組胺酰亮氨酸(HL)生成反應(yīng)的終 止及堿性條件的建立過程為加入300~400nL0.2~0.4mol/L的NaOH溶液終止組胺酰亮氨酸(HL)生成反 應(yīng)，同時提供堿性反應(yīng)條件(pH值10.5~14.0)。
4、 根據(jù)權(quán)利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質(zhì)生成過程為在 3(TC 40。C條件下加入10~50pL的鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)5 15min。
5、 根據(jù)權(quán)利l.所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質(zhì)生成反應(yīng)的終止過程 為加入30~40nL 2~4mol/L的HC1。
6.根據(jù)權(quán)利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質(zhì)檢測為將反應(yīng)液稀釋 10~200倍，在流動相水與乙腈比例在3: 1~5: 1,流速在0.5 0.8ml/min條件下進(jìn)樣1 10pL，通過熒光檢測器檢測，記錄出峰面積。
7、根據(jù)權(quán)利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，通過方法學(xué)檢驗得到本發(fā)明的檢測方法線性范圍 在0.0016nmol 0.128nmo1時其線性關(guān)系良好，回收率為99.26%~103.98%，反應(yīng)的靈敏度較高，反應(yīng)的重 現(xiàn)性較好。
全文摘要
本發(fā)明屬于功能食品的檢測方法領(lǐng)域，涉及降壓肽活性檢測的方法，尤其涉及利用高效液相色譜與熒光檢測器聯(lián)用對蛋清降壓肽的檢測。采用高效液相色譜與熒光分光光度計聯(lián)用技術(shù)，通過生成的熒光物質(zhì)來檢測血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性，進(jìn)而確定降壓肽的體外活性。本發(fā)明主要步驟包括組氨酰亮氨酸(HL)生成，組氨酰亮氨酸(HL)生成反應(yīng)終止，熒光物質(zhì)生成，熒光物質(zhì)生成反應(yīng)終止，熒光物質(zhì)的檢測五部分。經(jīng)方法學(xué)驗證該方法線性關(guān)系良好，回收率為99.26％～103.98％，反應(yīng)的靈敏度較高，重現(xiàn)性較好。本發(fā)明操作簡單易行，藥品用量少，更加經(jīng)濟(jì)節(jié)約。
文檔編號C12Q1/37GK101638682SQ20091006748
公開日2010年2月3日 申請日期2009年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月2日
發(fā)明者劉博群, 劉靜波 申請人:吉林大學(xué)