專利名稱：：一種利用釀酒酵母表達北非蝎毒素的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬生物
技術領域：
，特別是涉及釀酒酵母表達北非蝎毒素的方法。
背景技術：
：黏蟲(Mythimnas印erataWalker)是鱗翅目昆蟲，又稱剃枝蟲、行軍蟲，是我國糧食作物的重要害蟲，每年南北往返遷飛，大發(fā)生時可把作物葉片食光，造成大面積減產(chǎn)或絕收，且其沒有滯育、繁殖率高、體形較大，具有一定的代表性。在國內(nèi)，許多農(nóng)藥研究機構將其作為新農(nóng)藥篩選的靶標。目前，黏蟲的防治措施主要是施用化學農(nóng)藥。然而化學農(nóng)藥的大量生產(chǎn)和使用又引出三大難題(1)環(huán)境污染，殘毒上升，人畜均遭毒害；(2)害蟲抗藥性直線上升，用藥濃度不斷提高；(3)殺傷天敵，破壞了生態(tài)平衡。(4)高殘留的傳統(tǒng)化學農(nóng)藥的使用已引起了農(nóng)畜產(chǎn)品殘留嚴重超標，導致出口受阻。這些都給生態(tài)環(huán)境、經(jīng)濟建設、食品安全、人民健康、城市品質(zhì)和面貌帶來了嚴重的危害。生物農(nóng)藥是直接利用生物產(chǎn)生的生物活性次生代謝產(chǎn)物或生物活體開發(fā)而成的農(nóng)藥。生物農(nóng)藥主要包括生物化學農(nóng)藥(生物源農(nóng)藥)、微生物農(nóng)藥、轉基因生物農(nóng)藥和天敵生物農(nóng)藥等四類。由于生物農(nóng)藥來源于自然，多數(shù)具有選擇性強，對人畜等生物比較安全，環(huán)境相容性好，對天敵較安全，不易產(chǎn)生抗性，生產(chǎn)工藝比較簡單，開發(fā)與登記費用較低等特點。北非蝎毒素是從北非蝎子(Androctonusaustralis)中分離出的一種活性成分，是由70個氨基酸組成的多肽。AaHIT1毒素主要毒殺鱗翅目昆蟲，特別對夜蛾科的一些重要的農(nóng)作物害蟲有效。它特異性地作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，使昆蟲產(chǎn)生收縮麻痹,而對甲殼動物、哺乳動物等其他動物均無毒性，具有高效、特異性強、安全性好等優(yōu)點。通過原核表達北非蝎毒素的工作正在進行中，目前存在的問題是表達產(chǎn)物的活性較低，主要原因在于AaHIT1是一段真核基因，真核基因在原核系統(tǒng)中表達容易出現(xiàn)包涵體、產(chǎn)生活性較低的表達產(chǎn)物。釀酒酵母菌是基因工程中常用的一種宿主菌，重組酵母菌能夠穩(wěn)定地表達外源基因所編碼的目的蛋白，并可對目的蛋白進行翻譯后加工和修飾以產(chǎn)生功能性蛋白產(chǎn)物。而且具有比大腸桿菌更完備的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物加工修飾及分泌的能力。釀酒酵母是與人們?nèi)粘Ｉ蠲芮邢嚓P的益生菌，不會構成對環(huán)境的威脅；盡管本領域的研究人員能夠按照現(xiàn)有基因工程原理推測北非蝎毒素基因作為真核生物的基因，應該在真核表達系統(tǒng)里表達時具有較高的活性，但至今還未能夠找到一種利用釀酒酵母高效表達北非蝎毒素及利用其殺滅黏蟲的方法。
發(fā)明內(nèi)容所要解決的技術問題本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種利用釀酒酵母表達北非蝎毒素的方法，以填補現(xiàn)有技術尚無法利用真核細胞高效表達北非蝎毒素的技術空白。技術方案5本發(fā)明的技術方案之一是提供一種利用酵母菌表達北非蝎毒素的方法，依次包括如下步驟a)提供北非蝎毒素基因AaHIT1;b)構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1;c)將重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；d)篩選獲得轉化菌株AINVSC1并鑒定；e)培養(yǎng)轉化菌株AINVSC1，表達北非蝎毒素蛋白。上述的利用酵母菌表達北非蝎毒素方法的優(yōu)選方案之一為，所述的重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1含有GAL1啟動子。上述的利用酵母菌表達北非蝎毒素方法的優(yōu)選方案之二為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)溫度為20°C-37°C。上述的利用酵母菌表達北非蝎毒素方法的優(yōu)選方案之三為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)溫度為28°C。上述的利用酵母菌表達北非蝎毒素方法的優(yōu)選方案之四為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)時間為14-28小時。上述的利用酵母菌表達北非蝎毒素方法的優(yōu)選方案之五為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)時間為20小時。本發(fā)明的技術方案之二是提供一種北非蝎毒素，采用釀酒酵母菌表達，其制備方法依次包括如下步驟a)提供北非蝎毒素基因AaHIT1;b)構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質(zhì)粒p丫ES2/AaHIT1;c)將重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；d)篩選獲得轉化菌株AINVSC1并鑒定；e)培養(yǎng)轉化菌株AINVSC1，表達北非蝎毒素蛋白。上述的北非蝎毒素的優(yōu)選方案之一為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)溫度為20°C-37°C。上述的北非蝎毒素的優(yōu)選方案之二為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)溫度為28"。上述的北非蝎毒素的優(yōu)選方案之三為，所述的北非蝎毒素蛋白存在于培養(yǎng)酵母菌AINVSC1的菌液上清。本發(fā)明是通過以下方式實現(xiàn)的1)將AaHIT1與質(zhì)粒載體PYES2連接，構建得到PYES2/AaHIT1重組質(zhì)粒。2)轉化釀酒酵母菌INVSC1，用特定的篩選培養(yǎng)基進行篩選，得到基因工程菌INVSC1-AaHIT1。3)通過SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測，證明北非蝎毒素AaHIT1在釀酒酵母菌INVSC1中表達。4)表達北非蝎毒素的釀酒酵母菌INVSC1菌株在YPD培養(yǎng)基上進行液體培養(yǎng)，達到一定的O.D.值后離心取上清，與飼料混合喂養(yǎng)黏蟲。有益效果表達北非蝎毒素的釀酒酵母菌INVSC1菌液有比較好的殺蟲效果(表1)。從表1可以看出，該菌液對黏蟲的生長發(fā)育有抑制作用，72小時的致死率在43.8%左右，說明對農(nóng)業(yè)害蟲，黏蟲有較高的毒殺作用。圖1AINVSC1和INVSC1菌株生長曲線圖2pYES2/AaHIT1重組質(zhì)粒電泳圖譜(Maker:DNAMakerDL2000用入-HindIII酶切；1-5:pYES2/AaHIT1重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物)圖3pYES2/AaHIT1重組質(zhì)粒PCR分析(Maker:DL2000用A-HindIII酶切；1-2:pYES2/AaHIT1質(zhì)粒PCR產(chǎn)物)圖4陽性克隆pYES2/AaHIT1質(zhì)粒PCR分析(Maker:DL2000;1-2:pYES2/AaHIT1質(zhì)粒PCR產(chǎn)物)圖5工程菌AINVSC1表達AaHIT1SDS-PAGE電泳圖(1-2:INVSC1產(chǎn)物3:AINVSC1產(chǎn)物)圖6AINVSC1在不同培養(yǎng)溫度中表達AaHIT1圖7AINVSC1在不同培養(yǎng)時間中表達AaHIT1(Maker:蛋白質(zhì)(低)分子量標準；INVSC1:INVSC1菌液提取液；16小時、18小時、20小時、22小時、24小時分別表示在這些培養(yǎng)時間中的工程菌AINVSC1的菌液提取液。)圖8AINVSC1用不同接種量中表達AaHIT1(Maker:蛋白質(zhì)(低)分子量標準；INVSC1:INVSC1菌液提取液；1%、3%、5%、7%、10%:分別表示用這些接種量的工程菌AINVSC1的菌液提取液)圖9pYES2/AaHIT1重組質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。帶有AaHIT1基因的質(zhì)粒pMD18-T/AaHIT1由本實驗室保存。AaHIT1基因序列的GeneBank號為P01497。酵母菌株INVSC1來自上海師范大學生環(huán)學院。結合劑SolutionSN和SolutionB、3S柱(3Scolumn吸附材料是玻璃基質(zhì)，柱離心式)均購自博彩公司。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，以及實際的制備都是按照傳統(tǒng)的方法進行，如質(zhì)粒的抽提、目標基因的獲得、以及試劑的配制都是按照現(xiàn)代分子生物學實驗原理與技術(科學出版社，2006年02月，陳喜文主編，作者陳德富)。測序由上海鼎安生物科技有限公司完成。實施例1以帶有AaHIT1基因的質(zhì)粒pMD18-T/AaHIT1為模板，以P1(SEQNo.1:5'GCGAAGCTTATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGC3')、P2(SEQNo.2:5'GGCGGATCCTTAGTTGATGATGGTGGTGTCGCAGT3')為引物，PCR擴增AaHIT1基因，PCR反應循環(huán)為94°C2分鐘，94°C30秒-62°C30秒-72°C30秒35個循環(huán)，72°C5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收待用。電泳回收PCR產(chǎn)物，主要的步驟為1)用Agarose膠對PCR產(chǎn)物進行電泳分離。將目的DNA片段與其DNA盡可能分開，然后用干凈的手術刀割下含所要回收DNA的瓊脂塊，放入1.5mL離心管中。2)按每100mgAgarose膠加入400SolutionSN，置于55-65。C水浴中5分鐘，中途混勻幾次，至膠完全融化。膠融化后每400mLSolutionSN力口入100|jLSolutionB，混勻。3)將3S柱放入2mL收集管中，將融化的膠溶液轉移到3S柱中，開蓋，室溫放置2分鐘。蓋上離心管蓋，10,000rpmx1分鐘室溫離心。4)取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，加入600|jL洗滌緩沖液，10,000rpm"分鐘室溫離心。5)重復步驟4)一次。6)取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，10,000rpmx2分鐘室溫離心。7)將3S柱放入一根新的1.5mL離心管中，在3S柱子膜中央加30|jLTE緩沖液，不要蓋上離心管蓋，室溫放置2分鐘。8)蓋上離心管蓋，10,000rpmx1分鐘室溫離心，離心管中的液體即為回收的DNA片段，保存于-2(TC備用。p丫ES2質(zhì)粒和pMD18-T/AaHIT1質(zhì)粒分別用BamHI、HindIII雙酶切，電泳檢測回收。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收pMD18-T/AaHIT1質(zhì)粒的小片段(即AaHIT1片段)以及p丫ES2質(zhì)粒大片段，將回收的AaHIT1片段和pYES2載體通過T4連接酶連接，獲得pYES2/AaHIT1重組表達載體質(zhì)粒。pYES2/AaHIT1質(zhì)粒測序結果顯示上述連接正確。將重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞制備大量重組質(zhì)粒。DH5a感受態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒轉化方法如下1)挑取DH5a單克隆置于5mLLB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)過夜。2)以1。/。接種量接入新鮮5mLLB液體培養(yǎng)基中，37"搖床至O.D.6000.5。3)將菌液分裝至無菌預冷的1.5mLEp管，冰浴10分鐘，5000rpmx5分鐘，4"C離心。4)棄上清，加入1mL預冷100mMCaCI2，冰浴30分鐘，5000rpmx5分鐘，4'C離心。5)棄上清，加入100iJL預冷100mMCaCl2，重懸，存于4。C待用。按照常規(guī)方法抽提大量pYES2/AaHIT1重組質(zhì)粒。將pYES2/AaHIT1重組質(zhì)粒轉化酵母菌INVSC1得到基因工程菌AINVSC1。方法如下一、酵母菌INVSC1感受態(tài)制備1)INVSC1酵母菌50mLYPD培養(yǎng)基中，3CTC，200rpm搖床至OD600(1.0—1.5)。4°C，3000rpm離心5分鐘，棄上清收集菌體。2)用20mL1倍的TE/LiAC(0.1M/0.1MPh7.5)溶液重懸離心好的菌體，在3CTC搖床45分鐘。3)加入0.5mLDTT溶液，3(TC搖床15分鐘。4)《C離心機中3500rpm離心5分鐘，棄去上清。5)加入20mLddH2〇，4°C3000rpm離心5分種，棄去上清。6)加入1mL預冷的山梨醇重懸細胞。二、pYES2/AaHIT1電轉化酵母菌INVSC11)將3pL上述連接產(chǎn)物加入40mLinvsc1感受態(tài)細胞中。2)在電轉儀上電轉，電轉條件是1.5kv，20mF，200Q。3)將電轉好的細胞加入300|jL山梨醇混勻，在28—3CTC復蘇1一2小時后涂布于SC-U(Cm+)培養(yǎng)基平板上。三、p丫ES2/AaHIT1質(zhì)粒轉入后細胞的培養(yǎng)及鑒定1)轉化后長出的克隆加入3mLSC-U(Cm+)液體培養(yǎng)基中，28'C搖床培養(yǎng)過夜。2)取1.5mL對數(shù)生長期晚期的菌體培養(yǎng)液，在4。C離心機中13000rpm離心1分鐘棄上清。3)加入100口LTE緩沖液使細胞懸浮。4)加入200jjL裂解液，200iJL苯酚氯仿異戊醇，輕輕振蕩，在4。C離心機中13000rpm離心5分鐘。5)取上清，加等體積的無水乙醇沉淀DNA，在-2CTC存放0.5小時。6)4。C離心機中12000rpm離10分鐘，棄上清，加入600|j70%乙醇清洗。7)4。C離心機中12000rpm離10分鐘，棄上清，烘干37。C，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。毒素蛋白在工程菌株中表達的檢驗方法挑取工程菌AINVSC1的菌落，置2mLSC-U(Cm+)中，28°C，200rpm搖床培養(yǎng)過夜，從中取出100ML菌液加入SC-U(Cm+)中，28°C，200rpm搖床培養(yǎng)，將取出的菌液4°C，5000rpmx10分鐘離心，棄上清后加入100|jL蛋白加樣緩沖液，混勻，沸水浴處理10分鐘使細胞充分裂解，以INVSC1菌體提取液作為對照，通過SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測，電泳結束后用考馬斯亮蘭染色。采用噴葉喂養(yǎng)法噴灑玉米葉喂養(yǎng)黏蟲(MythJmnaseperataWalker)，檢測酵母工程菌AINVSC1表達的蝎昆蟲毒素AaHIT1所具有的殺蟲活性。采用工程菌菌液及菌液上清噴灑喂養(yǎng)黏蟲的方法。第一組，采用樣品1，即工程菌AINVSC1菌液噴灑玉米葉，喂養(yǎng)黏蟲。樣品1的處理是將AINVSC1菌28。C搖床培養(yǎng)24小時。黏蟲共20只，分別裝在20個塑料管中，用藥前先饑餓喂養(yǎng)12小時，之后每12小時噴灑用藥一次，喂養(yǎng)72小時，處理溫度室溫約25。C，觀察黏蟲死亡情況。實驗重復3第二組，采用樣品2，即工程菌AINVSC1菌液的上清噴灑玉米葉，喂養(yǎng)黏蟲。樣品2的處理是將AINVSC1菌28t:搖床培養(yǎng)24小時，菌液4°C，12000rpmx20分鐘離心，取上清噴灑玉米葉喂養(yǎng)黏蟲。黏蟲喂養(yǎng)同上。上述兩組實驗中，對照為INVSC1菌液(CK1)和清水對照(CK2)，即INVSC1菌液28'C搖床培養(yǎng)24小時后用菌液噴灑玉米葉喂養(yǎng)黏蟲和清水噴灑玉米葉喂養(yǎng)黏蟲。噴葉喂養(yǎng)法的殺蟲實驗結果表明，AINVSC1酵母菌液以及菌體高速離心破碎后的菌液上清對黏蟲都具有觸殺活性，并且菌液上清的觸殺活性明顯高于菌液的觸殺活性(結果見表1)。由表中數(shù)據(jù)可得出AINVSC1菌液對黏蟲的觸殺作用較弱，校正死亡率為43.8%，然而樣品2即AINVSC1菌液上清對黏蟲的觸殺活性卻明顯高于樣品1的觸殺活性，其校正死亡率達到64.8%，比樣品1的校正死亡率提高了很多。表1黏蟲毒性試驗結果平均重量*平均重量(mg)增加凈重量~致死率S(mg)0小時72小時(mg)(%)(小時)CK112.3537.825.650CK210.9537.626.655樣品113.115.3682.26843.860-72樣品210.2511.7621.51264.848-60*平均重量是以20只實驗幼蟲計算；CK1:清水對照組；CK2:NVSC1菌液；樣品1:轉化有pYES2/AaHIT1的INVSC1的菌液上清；樣品2:轉化有pYES2/AaHIT1的INVSC1的菌液進一步通過用不同的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量培養(yǎng)AINVSC1比較AaHIT1的黏蟲觸殺活性。培養(yǎng)時間對表達量及活性的影響測定方法分別用16小時、18小時、20小時、22小時、24小時培養(yǎng)工程菌AINVSC1，檢測出工程菌表達AaHIT1的最大表達量的時間。在所選擇的16小時、18小時、20小時、22小時、24小時各種培養(yǎng)時間中，只有在18小時、20小時、22小時、24小時的培養(yǎng)基中AaHIT1表達，而在16小時的培養(yǎng)基中AaHIT1不表達。圖7顯示從表達的條帶中看，18小時、20小時、22小時、24小時培養(yǎng)時間中AaHITI表達量差別不大。因此我們采用噴葉喂養(yǎng)黏蟲的方法進一步比較各培養(yǎng)基中AaHIT1對黏蟲的觸殺活性。表2不同培養(yǎng)時間的表達產(chǎn)物對黏蟲觸殺作用1平均重~平均重"l""""增加凈重致死率(％)LT5。(小時量#(mg)0小時(mg)72小時量(mg)CK112.3537.825.650CK210.9537.626.65518小時13.32414.7971.47347.560-7220小時12.23114.9622.73150.136-4822小時13.12314.401.27745.836-4824小時".95113.2761.32544.648-60#平均重量是以20只實驗幼蟲計算，上述實驗數(shù)據(jù)均為3次重復實驗相近值的平均值)CK1:INVSC1菌液對照喂養(yǎng)黏蟲；CK2:清水對照喂養(yǎng)黏蟲。表2結果顯示20小時培養(yǎng)的AINVSC1菌液上清對黏蟲的觸殺效果最好(校正死亡率達50.1%)，18小時次之(校正死亡率47.5。/。)，最后是24小時(校正死亡率44.6。/。)。由此工程菌AINVSC1表達AaHIT1觸殺黏蟲的最優(yōu)條件為，20小時培養(yǎng)，并且AaHIT1在對數(shù)生長期開始表達。接種量對毒素蛋白的表達量及活性的影響測定方法分別用1%、3%、5%、7%、10。/。的接種量培養(yǎng)工程菌AINVSC1，檢出表達毒素蛋白的最適合的接種量。圖8顯示在所選擇的1%、3%、5%、7%、10。/。各種接種量對毒素蛋白的表達量及活性的影響。只有在3%、5%、7。/。的培養(yǎng)基中AaHIT1表達，而在1%、10%的培養(yǎng)基中AaHIT1不表達。從表達的條帶中看，3%、5%、7%接種量中AaHIT1表達量差別不大。因此我們采用噴葉喂養(yǎng)黏蟲的方法進一步比較各培養(yǎng)基中AaHIT1對黏蟲的觸殺活性。表3不同接種量表達產(chǎn)物對黏蟲觸殺作用組平均重量(mg)O小時平均重量(mg)72小時增加凈重量(mg)致死率(%)LT50(小時)CK112.3537.825.650CK210.9537.626.6553%13.54915細2.43533.660-725%10.68912.1491.4649.836-487%12.30914.8122.50340.848-60CK1:INVSC1菌液對照喂養(yǎng)黏蟲；CK2:清水對照喂養(yǎng)黏蟲。平均重量是以20只實驗幼蟲計算，上述實驗數(shù)據(jù)均為3次重復實驗相近值的平均值表3顯示5%接種量培養(yǎng)的AINVSC1菌液上清對黏蟲的觸殺效果最好(校正死亡率達49.8%)，7。/。次之(校正死亡率40.8%)，最后是3。/。(校正死亡率33.6%)。由此工程菌AINVSC1表達AaHIT1觸殺黏蟲的最優(yōu)條件為，5%接種量培養(yǎng)，并且AaHIT1在對數(shù)生長期開始表達。溫度毒素蛋白的表達量及活性的影響測定方法分別用12°C、2CTC、28°C、37°C、4rC培養(yǎng)工程菌AINVSC1，檢出最適合培養(yǎng)工程菌的溫度。我們發(fā)現(xiàn)28"最好。圖6所示在所選擇的12°C、2CTC、28°C、37°C、4TC各種培養(yǎng)溫度中，只有在20°C、28°C、37°C的培養(yǎng)基中AaHIT1表達，而在12°C、4rC的培養(yǎng)基中AaHIT1不表達。從表達的條帶中看，2CTC、28°C、37'C培養(yǎng)溫度中AaHIT1表達量差別不大。因此我們采用噴葉喂養(yǎng)黏蟲的方法進一步比較各培養(yǎng)基中AaHIT1對黏蟲的觸殺活性。表4不同培養(yǎng)溫度表達產(chǎn)物對黏蟲觸殺作用組平均重量(mg)O小時平均重量(mg)72小時增加凈重量(mg)致死率(％)L丁50(小時)CK112.3537.825.650CK210.9537.626.65520。C12.2914.4532.16336.560-7228。C13.5415.401.8645.736-4837。C11.9113.3641.45442,148-60表4結果顯示28"C培養(yǎng)的AINVSC1菌液上清對黏蟲的觸殺效果最好(校正死亡率達45.7%)，37。C次之(校正死亡率42.1。/。)，最后是20。C(校正死亡率36.5%)。以YPD液體培養(yǎng)基，分別測定AINVSC1和INVSC1菌種的生長曲線。挑取AINVSC1和INVSC1菌株單克隆，分別接種于SC-U培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基，28°C，200rpm搖床培養(yǎng)。當OD6000.5時，以1%的接種量分別接入新鮮培養(yǎng)基，28°C，200rpm搖床培養(yǎng)，8小時后每隔2小時取一次樣，測OD600[76]。結果如表5和圖1所示。表5AINVSC1和INVSC1菌株生長OD600〇D600時間(小時)INVSC1AINVSC120.1070.06840.1980.11360.3720.18180.7210.407101.2831.021121.6961.356141細1.584161.9271.663182.0311.752<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>SEQUENCELISTING核苷酸序列表<110>上海師范大學<120>—種利用釀酒酵母表達北非蝎毒素的方法<130>—種利用釀酒酵母表達北非蝎毒素的方法<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>39<212>DNA<213>MythimnaseperataWalker<220><221>AaHIT1基因上游引物<222>(1).,(39)<400>1gcgaagctt3tgaaga3ga3cggctacgcggtgg3cagc39<210>2<2">35<212>DNA<213>MythimnaseperataWalker<220><221>AaHIT1基因下游引物<222>("..(35)<400>2ggcggatccttagttgatgatggtggtgtcgcagt3權利要求1、一種利用酵母菌表達北非蝎毒素的方法，依次包括如下步驟a)提供北非蝎毒素基因AaHIT1；b)構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1；c)將重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；d)篩選獲得轉化菌株AINVSC1并鑒定；e)培養(yǎng)轉化菌株AINVSC1，表達北非蝎毒素蛋白。2、根據(jù)權利要求1所述的利用酵母菌表達北非蝎毒素的方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1含有GAL1啟動子。3、根據(jù)權利要求1所述的利用酵母菌表達北非蝎毒素的方法，其特征在于，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)溫度為20°C-37°C。4、根據(jù)權利要求3所述的利用酵母菌表達北非蝎毒素的方法，其特征在于，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)溫度為28°C。5、根據(jù)權利要求1所述的利用酵母菌表達北非蝎毒素的方法，其特征在于，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)時間為14-28小時。6、根據(jù)權利要求1所述的利用酵母菌表達北非蝎毒素的方法，其特征在于,所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)時間為20小時。7、一種北非蝎毒素，采用釀酒酵母菌表達，其制備方法依次包括如下步驟:a)提供北非蝎毒素基因AaHIT1;b)構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1;c)將重組質(zhì)粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；d)篩選獲得轉化菌株AINVSC1并鑒定；e)培養(yǎng)轉化菌株AINVSC1，表達北非蝎毒素蛋白。8、根據(jù)權利要求7所述的北非蝎毒素，其特征在于，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)溫度為20°C-37°C。9、根據(jù)權利要求8所述的北非蝎毒素，其特征在于，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養(yǎng)溫度為28°C。10、根據(jù)權利要求8或9所述的北非蝎毒素，其特征在于，所述的北非蝎毒素蛋白存在于培養(yǎng)酵母菌AINVSC1的菌液上清。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用酵母菌表達北非蝎毒素的方法，依次包括如下步驟提供北非蝎毒素基因AaHIT1；構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質(zhì)粒pYES₂/AaHIT1；將重組質(zhì)粒pYES₂/AaHIT1轉化酵母菌細胞；篩選獲得轉化菌株AINVSC1并鑒定；培養(yǎng)轉化菌株AINVSC1，表達北非蝎毒素蛋白。所獲得的真核表達的北非蝎毒素蛋白對黏蟲具有良好的殺蟲活性，適用于生物農(nóng)藥領域的生產(chǎn)。文檔編號C12N15/81GK101649327SQ20091005599公開日2010年2月17日申請日期2009年8月6日優(yōu)先權日2009年8月6日發(fā)明者付盈盈,明肖,黃晶心申請人:上海師范大學