專利名稱：一種人17號染色體計數(shù)探針的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及一種人17號染色體計數(shù)探針的制備方法，還涉及利用人17號染色 體計數(shù)探針制備一種人17號染色體計數(shù)試劑盒，應(yīng)用本發(fā)明的人17號染色體計數(shù)探針及 相應(yīng)的試劑盒可以對人17號染色體進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的計數(shù)。
背景技術(shù)：
人類第17號染色體由大約8100萬個堿基對構(gòu)成，含1500多個基因，基因密度 在人類染色體中列第二位。第17號染色體有許多與疾病相關(guān)的基因，如乳腺癌基因、 神經(jīng)纖維瘤基因、遺傳性神經(jīng)紊亂基因等。在這條染色體上，大段DNA編碼重復(fù)也廣泛 存在。有研究表明，在成神經(jīng)細(xì)胞瘤[Plantaz D, Mohapatra G, Matthay KK, etc. Gain of chromosome 17is the most frequent abnormality detected in neuroblastoma by comparative genomic hybridization. Am J Pathol. 1997Jan ； 150(1) 81~9] > 腎癌 [Brown JA,Anderl KL,Borell TJ, etc. Simultaneous chromosome 7and 17gain and sex chromosome loss provide evidence that renal metanephric adenoma is related to papillary renal cell carcinoma. J Urol. 1997 Aug ； 158 (2) :370_4.]中經(jīng)常觀察到多 倍體情況；有研究者認(rèn)為17號染色體多倍體的出現(xiàn)是腎上腺皮質(zhì)腫瘤發(fā)生的早期事件 [Jianming Zhao,Ernst J. M. Speel,Seraina Muletta-Feurer,etc.Analysis of genomic alterations in sporadic adrenocortical lesions. Gain of chromosome 17is an early event in adrenocortical tumorigenesis. American Journal of Pathology. 1999 ； 155 1039-1045. ] ；17號染色體數(shù)畸變與胃癌發(fā)展和預(yù)后不良相關(guān)[Ryusuke Terada, Toru Yasutake，Shirou Nakamura，etc. Clinical significance of nm23 expression and chromosome 17numerical aberrations in primary gastric cancer. Med Oncol. 2002 ； 19(4) :239-48].。因此，進(jìn)行該染色體計數(shù)有重要意義。目前常用的染色體組型分析可以確定染色體的非整倍異常，但這需要進(jìn)行細(xì)胞培 養(yǎng)和制備高質(zhì)量的中期染色體片，而這對于腫瘤細(xì)胞來說是極其困難和耗時的。為了解決 這個技術(shù)難題，其中一個思路是篩選并制備相應(yīng)的染色體計數(shù)探針，但目前染色體計數(shù)探 針制備缺乏一個系統(tǒng)和成熟的方法。本發(fā)明人在長期研究的基礎(chǔ)上設(shè)計及篩選人17號染色體計數(shù)探針，并利用熒光 原位雜交技術(shù)檢測中期或間期細(xì)胞中17號染色體數(shù)目。它應(yīng)用熒光物質(zhì)標(biāo)記的雙鏈DNA 核酸探針與染色體DNA互補序列雜交，在核中或染色體上顯示DNA序列的位置。在此基礎(chǔ) 上本發(fā)明人還開發(fā)人17號染色體計數(shù)試劑盒，該試劑盒具有快速、無創(chuàng)性、敏感度高和特 異性強等優(yōu)點，無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，就能夠在中期和間期細(xì)胞中檢測17號染色體的數(shù)量。由于本發(fā)明提供了這種17號染色體計數(shù)探針的制備方法，并在此基礎(chǔ)上自主研 制開發(fā)17號染色體計數(shù)試劑盒，對擺脫對進(jìn)口試劑的依賴，填補國內(nèi)該檢測領(lǐng)域的空白具 有十分重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種人17號染色體計數(shù)探針的制備方法。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案人17號染色體計數(shù)探針的制備步驟包括(1)引物設(shè)計人17號染色體著絲粒區(qū)域PCR擴(kuò)增引物設(shè)計和驗證。(2)克隆質(zhì)粒制備配制PCR反應(yīng)體系，以人基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化 后的目的產(chǎn)物與載體PMD18-T連接，制備出包含目的片段的克隆質(zhì)粒PMD18-T-C17。(3)C17探針制備可采用以下兩種方法進(jìn)行制備。方法以包含目的片段的質(zhì)粒pMD18-T-C17DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過PCR反 應(yīng)將氨基修飾的dUTP摻入到目的產(chǎn)物中，然后經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化、濃縮、定量；對純化后的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記、純化、計算標(biāo)記效率、定量，而獲得C17探針，避光、-20°C儲存。方法二 以包含目的片段的質(zhì)粒pMD18-T-C17DNA為模板，使用熒光素標(biāo)記的dUTP 直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物標(biāo)記熒光，然后進(jìn)行純化、計算標(biāo)記效率、定量，定量，而獲得 C17探針，避光、-20°C儲存。(4)C17探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗證。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，設(shè)計的PCR擴(kuò)增引物序列分別為上游引物 5，-AATTTCAGCTGACTAAACA-3，和下游引物 5，-TTTAGTTAGGTGCAGTTAT-3，。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，克隆質(zhì)粒制備步驟和C17探針制備步驟中PCR 擴(kuò)增條件均為為95°C 5分鐘；(94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒)X40循環(huán)；72°C 10分 鐘。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，C17探針制備步驟中純化可使用市售的DNA純 化試劑盒，優(yōu)選 Qiagen 公司的 MinElute PCR Purification Kit。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，C17探針制備步驟中濃縮方法為乙醇沉淀濃縮。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，C17探針制備步驟中PCR產(chǎn)物的定量是將PCR產(chǎn) 物稀釋后分別測定260nm和280nm下的吸光度，計算產(chǎn)物濃度。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，C17探針制備步驟中PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記使 用市售的DNA標(biāo)記試劑盒，優(yōu)選Invitrogen公司的ARES DNA Labeling Kit。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，C17探針標(biāo)記的熒光素包括活化的熒光染料和 /或熒光素標(biāo)記的dUTP，并優(yōu)選Alexa Fluor系列、Spectrum dUTP。本發(fā)明的另一個目的是利用人17號染色體計數(shù)探針制備一種人17號染色體計數(shù) 試齊U盒。為了實現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案(1)樣本處理和制片按照原位雜交方法對各類型樣本進(jìn)行處理。(2)雜交配制雜交液，主要包括標(biāo)記探針和雜交緩沖液。合適溫度下進(jìn)行8 16 小時的雜交，然后以合適的洗液洗去未結(jié)合上的和非特異結(jié)合的探針；DAPI復(fù)染劑復(fù)染。(3)通過熒光顯微鏡相應(yīng)濾塊觀察熒光信號，對17號染色體進(jìn)行計數(shù)?；谝陨霞夹g(shù)方案發(fā)明的試劑盒包括1)雜交液、DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中 包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，由雜交緩沖液、熒光標(biāo)記的C17探針、未標(biāo)記的 競爭性DNA和H20配制成雜交液，其中每人份雜交液中使用C17探針的量為5 20ng，雜交緩沖液為7ul，未標(biāo)記的競爭性DNA為1. 5ug，用H20補至10ul。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫 酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50% 70%，硫酸葡聚糖濃度為0. lg/ml。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中DAPI復(fù)染劑配制方法為50 250ng DAPI 溶于1ml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS，甘油混合液)。利用本發(fā)明的試劑盒，依照常規(guī)的熒光原位雜交方法對人的中期和間期細(xì)胞進(jìn)行 17號染色體計數(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(1)可以對人17號染色體進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的計數(shù)、且結(jié)果重復(fù)性好；(2)無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和制備高質(zhì)量的中期染色體片，可用于中期或間期細(xì)胞17 號染色體計數(shù)，操作相對簡單；(3)通過制備成試劑盒，可以實現(xiàn)在腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域的 應(yīng)用，了解17號染色體與腫瘤發(fā)生等的聯(lián)系。


圖1顯示人基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。目的產(chǎn)物300bp。圖2顯示人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞17號染色體計數(shù)結(jié)果。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1 人17號染色體計數(shù)探針的制備方法(1)引物設(shè)計和合成人17號染色體著絲粒區(qū)域PCR擴(kuò)增引物設(shè)計和驗證弓| 物對分另ij 為，F(xiàn) :5，-AATTTCAGCTGACTAAACA-3，禾口 R: 5’ -TTTAGTTAGGTGCAGTTAT-3’，由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司合成。配制反應(yīng)體系10X Buffer5ul
MgCl2(25mmol/L)2ul
人基因組DNA(5pg/ul)2ul
F(10umol/L)2ul
R(10umol/L)2ul
d3TPs(10mmol/L)lul
dTTP(lmmol/L)2ul
aa-dUTP(lmmol/L)16ulTaKaRa Taq Hot Start Version (5U/ul) 0. 5ulH2017. 5ul總體積為50ul。使用ABI9700PCR儀或類似反應(yīng)儀器，設(shè)置循環(huán)參數(shù)為95°C 5分 鐘；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 45 秒)X40 循環(huán)；72°C 10 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul產(chǎn)物2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果在300bp左右具有明亮 的條帶(參見附圖1)。(2)克隆質(zhì)粒制備
將純化后的目的產(chǎn)物與載體pMDIS-T連接，制備出包含目的片段的克隆質(zhì)粒 PMD18-T-C17。(3)C17探針制備C17F1克隆培養(yǎng)、DNA提取按照《分子克隆實驗指南》所述經(jīng)典方法，加有氨芐青 霉素的LB培養(yǎng)基中添加克隆質(zhì)粒PMD18-T-C17的大腸桿菌菌種，37°C搖床中搖菌過夜；使 用 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0或類似試劑盒，按照說明書要求 的操作方法進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取。計算0D260/0D280，要求結(jié)果在在1. 6 2. 2之間，計算質(zhì) 粒DNA濃度。C17擴(kuò)增以包含目的片段的質(zhì)粒PMD18-T-C17DNA為模板，設(shè)置循環(huán)參數(shù)為 95°C 5 分鐘；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 45 秒)X40 循環(huán)；72°C 10 分鐘。10X Buffer5ul
MgCl2(25mmol/L)2ul
PMD18-T-C17 質(zhì)粒 DNA(5pg/ul)2ul
F(10umol/L)2ul
R(10umol/L)2ul
d3TPs(10mmol/L)lul
dTTP(lmmol/L)2ul
aa-dUTP(lmmol/L)16ul
TaKaRa Taq Hot Start Version (5U/ul)0. 5ul
H2017. 5ul
總體積為50ul。
通過PCR反應(yīng)將氨基修飾的dUTP摻入到目的產(chǎn)物中，然后經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化、
濃縮、定量后，稀釋為 lug/ul ；采用 Invitrogen 的 ARES Alexa Fluor 546DNA Labeling Kit，按照說明書要求進(jìn)行探針標(biāo)記，活化的熒光素會與氨基修飾的dUTP發(fā)生反應(yīng)從而 將產(chǎn)物標(biāo)記熒光，盡量在干燥避光的環(huán)境下操作。按照說明書所述方法采用Qiagen的 MinElute PCR Purification Kit試劑盒進(jìn)行純化。分別測定260和555nm處的吸收峰值， 采用公式(660000X0D555)/(0D260X 104000)計算熒光標(biāo)記率，要求標(biāo)記率在1 9/100 堿基范圍內(nèi)。按探針濃度(ng/ul) = 0D260X50計算熒光探針濃度，避光、-20°C儲存。(4)C17探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗證，包含中期或間期染色體DNA， 熒光原位雜交時，染色體DNA表現(xiàn)為形態(tài)上可識別的染色體或是細(xì)胞核。實施例2 人17號染色體計數(shù)試劑盒制備以10人份/盒為例。(1)雜交液配制取少量C17探針稀釋成lOng/ul，按下表配制雜交液成份_每人份_10人份_
C17(10ng/ul) lul10ulHuman Cot-1 DNA 1.5 ul (1. 5ug) 15ul 雜交緩沖液7ul70ul
H20_0. 5 ul_5ul_(2)DAPI復(fù)染劑配制抗褪色液全程操作必須避光，10mg的對苯二胺溶于1ml的PBS中，加入9ml甘油， 反復(fù)震蕩混勻，調(diào)節(jié)PH為9.0，-20°C儲存。終溶液應(yīng)該為無色或者略帶淡黃色，假如呈現(xiàn) 黃色或者橙色則需廢棄并重新配制。用去離子水配制lmg/ml DAPI儲存液。取2. 5ul的DAPI溶液(lmg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光條件下反復(fù)震蕩混 勻，-20°C避光密閉保存。(3)成品組裝 實施例3 人17號染色體計數(shù)試劑盒的使用方法以人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞為例。(1)人外周血培養(yǎng)及染色體制備采血用肝素潤濕注射針筒(0. 2ml)后，常規(guī)取靜脈血1 2ml，轉(zhuǎn)動針筒混勻肝 素。接種(在超凈工作臺中無菌操作)在每個培養(yǎng)瓶中(含20%血清的1640培養(yǎng)液5ml， pH7. 2)，加入全血0.25 0.30ml (7號針頭13 15滴)、PHA 5mg，蓋緊膠塞，輕輕搖勻。培 養(yǎng)將培養(yǎng)瓶放在37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h。終止培養(yǎng)前2 4h，加入0. 01%秋水仙素 溶液(100 u g/ml) 1 2滴(7號針頭)，使終濃度為0. 2 u g/ml培養(yǎng)液。輕輕搖勻后，放回 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 4h。收獲將培養(yǎng)后的血細(xì)胞收集在離心管中，平衡后lOOOr/min離 心8min，棄去上清。(2)樣品處理低滲向離心管中加入37°C 0.075mol/L KC1溶液至8ml，用吸管輕輕吹打混勻細(xì) 胞，置于37°C水浴箱溫育15min。預(yù)固定向離心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液 1 2ml，用吸管輕輕吹打混勻后lOOOr/min離心8min，棄去上清。固定加入新配制的固 定液至8ml，室溫靜置30min。3000r/min離心8min，棄去上清?？稍僦貜?fù)固定1次。制片 根據(jù)沉淀細(xì)胞的多少，加入適量新鮮固定液(0. 5 1ml)，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液。用滴管 吸取少量細(xì)胞懸液，滴至載玻片上，鏡檢。(3)制片取干凈載玻片，重懸細(xì)胞后分別取3ul，10ul和30ul懸液滴加到載玻片上的不同位置，注意不要重疊；室溫下晾干；用20X物鏡在相差顯微鏡下觀察三個區(qū)域的細(xì)胞密度， 記錄細(xì)胞沒有明顯重疊，且數(shù)量在100 200個以上所加的細(xì)胞懸液量；如果細(xì)胞密度及數(shù) 目合適，另取一張干凈的載玻片，滴加適量的細(xì)胞懸液；如果滴加30ul懸液的區(qū)域仍然細(xì) 胞數(shù)目太少，另取30ul懸液重復(fù)滴到該區(qū)域，晾干，觀察；如果滴加3ul懸液的區(qū)域仍然細(xì) 胞數(shù)目太多，用新鮮固定液稀釋細(xì)胞懸液，重復(fù)步驟滴片觀察。(4)玻片乙醇老化將熱臺加熱到95度；取出蓋玻片，擦干備用；一塊折疊為方形的4 8層紗布，浸 透無水乙醇；在載玻片的雜交區(qū)域上各滴加160ul的無水乙醇；輕輕蓋上24 X 24mm的蓋玻 片，輕壓緊；將載玻片置于95度預(yù)熱的熱臺上，蓋上浸透了無水乙醇的紗布(完全覆蓋載玻 片)，再蓋上事先準(zhǔn)備好的方形蓋子(完全覆蓋載玻片)，計時2分鐘；從熱臺上去除蓋子、 紗布，取下載玻片，輕輕去除蓋玻片，繼續(xù)預(yù)處理步驟。(5)玻片預(yù)處理玻片放入37士 1°C的1XPBS中孵育5分鐘，胃蛋白酶溶液中消化15分鐘；1XPBS 室溫洗滌3分鐘；多聚甲醛/PBS室溫固定10分鐘；1XPBS室溫洗滌3分鐘；70%、85%、 100%梯度乙醇脫水各3分鐘；室溫晾干玻片；繼續(xù)雜交過程。(6)樣品和探針同時變性從試劑盒中取出雜交液，震蕩混勻，瞬時離心；加8ul的雜交液到雜交區(qū)域，迅速 蓋上蓋玻片，輕壓使雜交液均勻分布，避免產(chǎn)生氣泡；橡皮膠水沿蓋玻片邊緣封片，完全覆 蓋蓋玻片與載玻片接觸的邊緣；78士 1°C的熱臺上變性2分鐘30秒；將玻片放入預(yù)熱的雜 交盒中，避光，37士 1°C孵育過夜(約16小時)；繼續(xù)雜交后洗滌步驟。(7)雜交后洗滌及復(fù)染一般洗滌方法(推薦使用)取出孵育過夜的雜交盒，小心去除橡皮膠水和蓋玻 片；將玻片放入37 士 1°C的50%甲酰胺/2XSSC洗滌15分鐘；再將其放入2 X SSC的染色缸 中，37 士 1°C洗滌15分鐘；再將其放入盛有0. 1% NP40/2XSSC的染色缸中，37 士 1°C洗滌5 分鐘；室溫70%、85%、100%梯度乙醇依次脫水各3分鐘；暗處晾干?？煜捶椒ㄈ〕龇跤^夜的雜交盒，小心去除橡皮膠水和蓋玻片；將玻片放入 73 士 1°C的0. 3 % NP40/0. 4 X SSC中，洗滌2分鐘；再將其放入0. 1 % NP40/2 X SSC中，室溫 洗滌2分鐘；室溫70%、85%、100%梯度乙醇依次脫水各3分鐘；暗處晾干。復(fù)染滴加10ul DAPI到載玻片目標(biāo)區(qū)域，蓋上蓋玻片，輕壓，避免產(chǎn)生氣泡，在暗 處存放，待觀察。(8)結(jié)果分析在Olympus BX60熒光顯微鏡下，用WU、WG濾鏡組分別觀察DAPI復(fù)染的分裂相和 雜交的熒光信號，用C⑶照相記錄。在40X物鏡下尋找，在100X物鏡下計數(shù)；調(diào)整合適的 焦距，對信號和背景有明確的概念；信號點因位于細(xì)胞內(nèi)；當(dāng)細(xì)胞外存在熒光信號點時，要 注意與細(xì)胞內(nèi)信號點區(qū)分，最好能避開該區(qū)域進(jìn)行計數(shù)；調(diào)整焦距，在核的不同層次找到信 號點；記錄觀察的細(xì)胞總數(shù)和17號染色體數(shù)。(9)結(jié)果判定按處理方法要求進(jìn)行操作，記錄17號染色體數(shù)(參見附圖2)。熒光原位雜交結(jié)果 顯示，中期染色體上可見兩個信號點，未見其它熒光信號；間期細(xì)胞核中僅見兩個信號點，術(shù)見其它熒光信號。 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的
保護(hù)范圍。
序列表
<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
<120> 一種人17號染色體計數(shù)探針的制備方法及其應(yīng)用
<140>
<141>
<160>2
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>1
aatttcagctgactaaaca
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>2
tttagttaggtgcagttat
權(quán)利要求
一種人17號染色體計數(shù)探針的制備方法，其特征在于制備步驟包括(1)引物設(shè)計人17號染色體著絲粒區(qū)域PCR擴(kuò)增引物設(shè)計和驗證；(2)克隆質(zhì)粒制備配制PCR反應(yīng)體系，以人基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化后的目的產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，制備出包含目的片段的克隆質(zhì)粒pMD18-T-C17；(3)C17探針制備可采用以下兩種方法進(jìn)行制備方法一以包含目的片段的質(zhì)粒pMD18-T-C17DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過PCR反應(yīng)將氨基修飾的dUTP摻入到目的產(chǎn)物中，然后經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化、濃縮、定量；對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記、純化、計算標(biāo)記效率、定量，而獲得C17探針，避光、-20℃儲存；方法二以包含目的片段的質(zhì)粒pMD18-T-C17DNA為模板，使用熒光素標(biāo)記的dUTP直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物標(biāo)記熒光，然后進(jìn)行純化、計算標(biāo)記效率、定量，定量，而獲得C17探針，避光、-20℃儲存；(4)C17探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗證。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于其中PCR擴(kuò)增引物序列分別為上游引物 5，-AATTTCAGCTGACTAAACA-3，和下游引物 5，-TTTAGTTAGGTGCAGFTAT-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于克隆質(zhì)粒制備步驟和C17探針制備步驟中 PCR擴(kuò)增條件均為為95°C 5分鐘；(94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒)X 40循環(huán)；72°C 10 分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于C17探針標(biāo)記的熒光素包括活化的熒光染料 和/或熒光素標(biāo)記的dUTP。
5.一種人17號染色體計數(shù)試劑盒，包括1)雜交液、DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中包 裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于其中雜交液由雜交緩沖液、熒光標(biāo)記的C17探針、 未標(biāo)記的競爭性DNA和H2O配制而成，其特征在于每人份雜交液中使用C17探針的量為5 20ng，雜交緩沖液為7ul，未標(biāo)記的競爭性DNA為1. 5ug。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度為50% 70%。
全文摘要
本發(fā)明所涉及一種人17號染色體計數(shù)探針的制備方法，還涉及利用人17號染色體計數(shù)探針制備一種人17號染色體計數(shù)試劑盒，應(yīng)用本發(fā)明的人17號染色體計數(shù)探針及相應(yīng)的試劑盒可以對人17號染色體進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的計數(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK101886103SQ200910039410
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者何瑰, 李明, 陳娟 申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司