專利名稱：用rna干涉提高水稻直鏈淀粉含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物技術領域的提高水稻種子中直鏈淀粉含量的方法，尤其涉及一種用
RNA干涉提高水稻種子中直鏈淀粉含量的方法。
背景技術：
淀粉是高等植物中碳水化合物的主要貯藏形式，也是糧食作物產品的最主要成分。植物
的貯藏淀粉主要包含兩種成分直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例決定著淀
粉的用途，支鏈淀粉主要用于食品業(yè)，而直鏈淀粉在工業(yè)上有著廣泛的用途，涉及食品、醫(yī)
療、紡織、造紙、環(huán)保等30多個領域。直鏈淀粉，尤其是經過理化修飾后的直鏈淀粉功能進 一步加強，如將直鏈淀粉進行溶解，與氫鍵結合，可形成剛性不透明膠體，這一特性用于糖 果業(yè)，可以使糖果保持固定的形狀和完整的造型；直鏈淀粉還用于食品業(yè)的增厚劑、固定劑、 炸薯條中阻止過度吸油分的包衣劑；利用直鏈淀粉取代聚苯乙烯生產可降解塑料，這種塑料 具有大量應用于包裝工業(yè)、農用薄膜加工業(yè)和從根本上解決白色污染問題的潛能。
植物淀粉的合成是淀粉合成酶經由一系列復雜的過程產生的。目前認為淀粉的生物合成 主要涉及四類酶——ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和去分支酶。它們分別催化 ADP-葡萄糖的形成、葡聚糖鏈的延伸以及分支鏈的形成。直鏈淀粉是由顆粒結合型淀粉合成 酶I (granule-bound starch synthase I, GBSSI或WAXY)直接催化的；而支鏈淀粉則是 淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SSS)和淀粉去分支酶(debranching enzyme, DBE)共同作用的產物，其中SBE的一個同工 型RBE3被認為在形成支鏈淀粉過程中起到最關鍵的作用。因此，利用基囟工程手段改良淀粉 品質的策略集中在調節(jié)淀粉合成過程中特定酶的含量或是幾種酶之間的協(xié)調關系上。
在禾谷類作物研究上，獲得高水平的直鏈淀粉同時并不明顯減少淀粉總含量的突破是 1952年Vineyard和Bear發(fā)現了位于玉米第5條染色體上的ae (amylose extender)基因。 遺傳研究表明高直鏈淀粉主要是由ae基因控制的，ae基因及其修飾基因的協(xié)同作用可使玉 米淀粉中直鏈淀粉的含量提高到50-80%。位于第五連鎖群上的ae基因目前己被SSR連鎖標 記，已從高淀粉玉米中克隆了 ae基因，該基因共有23449bp,其在Genebank中的接受號為AF072725。這些為該性狀的轉移和利用提供了重要的種質資源和基因資源，但由于該基因較 大，不易操作，同時該基因表達伴隨其它農藝性狀變劣、籽粒產量低，應用受到限制。另外， 由于高直鏈淀粉的遺傳十分復雜，采用常規(guī)雜交、回交轉育和輪回選擇等育種方法，所需群 體要足夠大，且周期長、分析樣品多，因此投入也較多。
基因工程改變淀粉質量集中于GBSS， SSS和SBE三種酶的操作上，主要使用技術-.
1、 正義和反義RNA轉基因技術，即是通過導入某個酶基因的正義結構或反義結構，影響 細胞內酶的含量或活性，引起目的基因的過量表達或使其表達受抑制，從而達到對淀粉結構 的控制。Visser等人(1991)利用反義RNA技術，向馬鈴薯中導入反向連接的GBSS基因， 導致GBSS基因含量和活性下降，進而導致馬鈴薯塊莖中直鏈淀粉含量銳減(減少70鬼一100W。 同樣地利用反義RNA技術，在木薯(Salehuzzman, 1993)、水稻等植物中，也獲得了低(或無) 直鏈淀粉的轉化體。國際專利W09722703A2報道了應用反義RNA技術將玉米sbe2b基因的全 長cDNA轉化玉米的研究，結果獲得了籽粒淀粉中直鏈淀粉含量較高的轉基因玉米。然而反義 技術的應用存在一定的局限性，其對內源性基因表達的抑制較弱，往往產生過渡性的表型， 會妨礙對目的基因功能的準確判斷。其抑制效應遺傳穩(wěn)定性較差，不能穩(wěn)定可靠地降低目的 基因的表達。
2、 基因敲除技術和DNA/RNA嵌合分子介導的基因轉變技術，但該方法一次只能研究一個 基因，不能有效地對多基因家族進行敲除。 一些在動植物發(fā)育過程中有關鍵作用的基因，如 果在DNA水平采用基因敲除或突變進行可遺傳的修飾，則會過早地基因沉默，產生致死表型， 因而無法深入研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明所解決的技術問題是提供一種客服目前常規(guī)育種過程中難以提高水稻籽粒直鏈淀 粉的含量，通過采用RNA干涉的方法提高水稻直鏈淀粉的含量，使其用RNA千涉方法抑制水 稻淀粉合成關鍵酶5^fllb基因在種子胚乳中的表達，從而提高水稻種子中直鏈淀粉含量的方 法。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的 一種用RNA干涉提高水稻直鏈淀粉含量的方法，從 水稻中克隆^SM基因片段作為RNA干擾片段，以胚乳特異性啟動子啟動表達，構建含y^^ 基因正反片段的表達載體，用根癌農桿菌介導，將vKffi^基因的正反結構轉入水稻中，RT-PCR 和Southern雜交檢驗目的基因的整合和表達情況，對轉基因水稻植株胚乳直鏈淀粉含量采用 碘顯色法測定，篩選后獲得籽粒直鏈淀粉含量顯著提高的轉基因水稻植株。具體包括以下主要步驟
(1) 根據水稻淀粉合成關鍵酶RBE3基因的序列，通過序列比對，確定水稻直鏈淀粉酶 基因的特異性RNA干涉序列，根據干涉序列設計引物，進行水稻淀粉合成關鍵酶RBE3基因的 千涉片段的特異性擴增；
(2) 以胚乳特異性啟動子啟動表達，構建含RBE3基因正反片段的植物表達載體；
(3) 轉化含有目的干涉片段的載體，并將目的干涉片段整合到水稻基因組中；
(4) 通過RT-PCR和Southern雜交等分子檢測方法鑒定轉基因水稻；
(5) 利用碘顯色法檢測籽粒直鏈淀粉含量，篩選獲得直鏈淀粉含量提高的轉基因水稻。 在所述步驟(1)中，通過同源性搜索和序列比對，確定該RNA干涉特異片段位于水稻基
因組的66197 66391位置，長195bp，包含RBE3基因的第12個外顯子(135bp)序列，并 有60bp的內含子序列。
在所述步驟(2)中，以高分子量麥谷蛋白(HMW)啟動子作為胚乳特異性啟動子，把RBE3 基因正反片段置于特異啟動子之后，特異性的在胚乳里抑制RBE3基因的表達。
在所述步驟(4)中，所述的分子檢測分別為以篩選標記bar基因的特異性引物的PCR擴 增片段作探針，采用Southern雜交準確驗證目的干涉片段整合到水稻基因組中及其拷貝數； 和設計RBE3基因的RT-PCR專用引物和水稻actin基因的特異引物，然后轉基因水稻和對照 分別進行RT-PCR，采用半定量PCR分析RBE3基因的表達差異。
與已有技術相比，本發(fā)明的有益效果體現在
1、 本發(fā)明是利用RNA干涉技術進行水稻淀粉品質改良。這是RNA干涉技術首次在該領域 進行研究與運用，也是本發(fā)明的獨創(chuàng)之處。RNA干涉技術具有高效性、特異性、可遺傳性、 操作簡單等特點，這是傳統(tǒng)的基因敲除技術和反義RNA技術所無法比擬的。
2、 在受體選擇上，傳統(tǒng)的基因敲除技術和反義RNA技術所要研究的受體一般是完整的基 因序列，對于基因序列不明確的受體，具有明顯的局限性。而利用RNA干涉技術，只需要知 道與受體同源的基因片段，就可對受體進行研究，因此，研究范圍較為廣泛。
3、 在操作方法上，反義RNA技術一般要構建的是含數千個堿基對的大片段，操作起來較 為困難，而RNA干涉技術中所要構建的載體僅僅是含有幾十到幾百個堿基對的小片段，操作 簡單、方便，易于運用。另外， 一個基因可選擇一到多個干涉片段，可對這些片段或組合進 行干涉效果的分析、優(yōu)化，以獲得最有效的片段。
4、 在遺傳穩(wěn)定性上，利用傳統(tǒng)的反義RNA技術，因全基因轉化對受體影響大，會導致受 體產生較大變異，且遺傳穩(wěn)定性較差，難以得到優(yōu)良的轉基因作物，但采用該技術轉^f七的RNA干涉片段小，對受體其它農藝性狀影響小，遺傳穩(wěn)定性高，便于獲得對目的基因干涉而其它 農藝性狀優(yōu)良的轉基因植株。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施方式予以具體說明。
1、 基因特異性RNAi片段的獲得
(1) 、利用CTAB法進行水稻基因組DNA的提取。
取0.5g水稻幼嫩葉片，加入液氮粉碎，加入2mL2呢65'C保溫的2XCTAB抽提液，混勻， 65。C保溫30 60min。加入等體積的氯仿/異戊醇(24: 1)，輕緩顛倒混勻，10000r/min，離 心5min。取上清，加入1/10體積(約0.2mL)的65。C的CTAB/NaCl溶液，顛倒混勻。用等 體積的氯仿/異戊醇(24: 1)抽提，10000r/min，離心5min。取上清，加入(正好)等體積 的CTAB沉淀液，顛倒混勻，如沉淀可見，繼續(xù)做下步，否則，65'C保溫30inin。4'C， 2700 r/min, 離心5min。去上清，用高鹽的TE buffer重懸(0. 25 0. 5mL)。(可65。C保溫30min，至大 部分溶解)。加入0. 6體積的異丙醇沉淀核酸，充分混勻，4'C， 10000 r/min，離心15min。 去上清，80%乙醇洗滌沉淀，干燥，用盡可能少的TE buffer重懸(0. 025 0. 05mL)。
(2) 、 W5E 基因片段的PCR擴增。
參考已發(fā)表的水稻淀粉分支酶基因^^3 (登錄號D16201)和水稻基因組的核苷酸序列， 選擇適于RNAi的/ ^3基因片段用于載體的構建，該片段位于水稻基因組的66197~66391位 置，長195bp，包含A^a基因的第12個外顯子(135bp)序列，并有60bp的內含子序列。 在引物的5'端分別添加了fe/必I和6^I酶切位點，設計引物5'端引物為 5， -GCGGATCCGGGAAGTAGCGATTAACGTGTT-3' ， 3，端引物RBE3i-R為
5， -GCGTCGACATAGCTTTACCTTTGCCCCTT-3，。
反應體系(50 u L)為dNTP(10mM) l.OuL，引物 (10pmol/uL)各l.OuL，水稻基因組DNA模板(Ug/uL) l.OwL， 10Xpfu Buffer (+Mg2+) 5.0uL， pfu DNA polymase(5U/uL)1.0iiL，用滅菌雙蒸水補足至50 u L。 PCR反應條件:95 。C預變性5min; 95。C變性lmin, 56'C退火45sec， 72"延伸30sec，共35個循環(huán)；最后在 72。C延伸10min。
2、 朋烈基因siRNA表達載體的建立 (1) 、 RNAi (2RBE3i)中間載體構建。
將用PCR擴增得到并克隆于pGM-T載體上的^5^ 干涉片段RBE3i用^a/rfi I和&7 I酶切下來，與用相同酶切的pUCCRNAi載體連接，先用菌落PCR方法初步篩選重組子(RNAi (RBE3i) 鑒定引物5'端引物pUCCl為5' - GGACCGTACTACTCTATTCGTTTC-3， ，3'端引物為RBE3i-R), 再用尸"I酶切驗證，得到重組質粒RNAi(RBE3i);接著用J力o I和5 711酶切重組質粒 RNAi (RBE3i)，再與RBE3i的fez/H I /S^ I酶切片段進行連接反應，形成約600bp的含內含 子的反向重復結構，先用菌落PCR方法初步篩選重組子(RNAi(2RBE3i)鑒定引物5'端引物 為RBE3i-F， 3,端引物pUCC2為5， - GAAACGAATAGAGTAGTACGGTCC-3，)，用尸"I酶切驗證 重組子，構建成克隆載體RNAi (2RBE3i)。
(2)、 siRNA表達載體pl300(2RBE3i)的構建。
RNAi (2RBE3i)載體用尸st I和&7 I酶切，回收酶切產物中約600bp的DNA片段，然后與 用At I和I酶切的HMW GUS載體進行連接，用/^t I和&7 I酶切驗證重組子，構建成 HMW(2RBE3i)載體。根據HMW GUS啟動子至終止子的全序列設計引物，在引物的5'端分別 添加酶切位點 5"sc I 和 J力a I ， 5' 端引物 HMW-F 為 5' -CCGGAGCTCGCAAATATGCAACATAATTTCC-3' ， 3， 端 引 物 H1W-R 為 5' -CCCTCTAGATGATCTTGAAAGATCTTT-3'。在50u L反應體系中有dNTP(10mM) l.OuL，引物 (10pmol/wL)各l.OuL， DNA模板(HMW(2RBE3i)質粒lug/uL) l.OiiL, 10Xpfu Buffer (+Mg2*) 5. OuL， pyrobest歸polymase(5U/wL)1.0y L，用滅菌雙蒸水補足至50u L。 PCR 反應條件95。C預變性5min; 95。C變性lmin， 61。C退火45sec, 72'C延伸3min，共35個循 環(huán)；最后在72'C延伸10min。得到約2. 6kb的目的基因DNA片段。將該目的片段純化回收并 克隆至pGM-T，測序正確后用5"sc I和忠a I酶切下來，與用&c I和J6a I酶切的pCAMBIA1300 進行連接反應，得到siRNA表達載體p1300 (2RBE3i)，使用fee I和Wa I酶切驗證重組子。
本實施例利用載體構建常用的基因工程方法，將基因片段正反向連接于馬鈴薯 GA20-氧化酶J'/7&o" 7片段兩側，以小麥HMW麥谷蛋白Glu-1D-1基因的啟動子啟動。構建的 pl300(2RBE3i)表達載體，該表達載體可利用基因工程方法提高水稻直鏈淀粉含量。 3、根癌農桿菌轉化獲得候選轉基因水稻 (1)、表達載體導入農桿菌。
挑取LBA4404或者EHA105單菌落接種5ml含利福平100ug/ml的YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C、200r/min震蕩培養(yǎng)48小時左右。取2ml菌液轉入50mlYEB液體培養(yǎng)棊，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600 至1.0左右。轉入無菌離心管，冰浴30min。 5000r/min離心5min，去上清。加入2ml新配 制的20mmol/L預冷CaCL2重懸菌體。取滅菌后的離心管，每管在冰上分裝200ul。取2ug的pl300(2RBE3i)質粒，加入到200ul的農桿菌感受態(tài)中。)冰浴5min，轉入液氮中冷凍lmin， 然后37。C水浴5min。加入800ul的YEB液體培養(yǎng)，28'C、 200r/min震蕩培養(yǎng)5小吋左右。 吸取菌液300ul涂布在YEB固體培養(yǎng)基上(含lOOug/ml的利福平和卡那霉素)。挑取陽性克 隆進行菌落PCR和提取質粒鑒定。
(2)、農桿菌介導的水稻遺傳轉化。
愈傷組織誘導采用中花ll幼胚，取授粉10d左右的幼胚在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導培養(yǎng) 基20d左右；取誘導出的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)30d左右，繼代培養(yǎng)基同誘導培養(yǎng)基；然后 準備農桿菌與愈傷組織進行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)溫度21°C ， 3d固體共培養(yǎng)基:NB基本培養(yǎng)基+2, 4-D 2. 0 mg/L+肌醇2. Og/L+AS 100nM/L (液體共培養(yǎng)不加2， 4-D和瓊脂粉)；然后無菌水洗菌， 轉入篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)40d: NB基本培養(yǎng)基+2,4-D 2.0 mg/L+cef. 500mg/L+Hyg 50mg/L (或 20mg/LPPT);挑取篩選后的抗性愈傷光照培養(yǎng)1個月左右，分化培養(yǎng)基NB基本培養(yǎng)基+NAA 0. 25mg/L+6-BA 2mg/L+KT 0. 5mg/L+ cef. 500mg/L+Hyg 50rag/L (或20mg/L PPT);挑取分 分化小苗進行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基NB基本培養(yǎng)基(N6大量及蔗糖減半)+MET lmg/L+NAA lmg/L。N6大量+MS-Fe鹽+B5有機+proline 500mg/L+glutamine 500mg/L+水解酪蛋白300mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂粉2. 6g/L。
本實施例采用農桿菌介導的遺傳轉化，利用水稻10d左右的幼胚誘導愈傷組織，通過共 培養(yǎng)和PPT篩選，獲得了抗性植株。該植株將進行分子鑒定和檢測，為轉基因提高水稻直鏈 淀粉含量提供了材料。
4、轉基因水稻的鑒定
(1)、候選轉基因抗性植株的分子檢測 Southern雜交檢測
取轉基因抗性植株的幼葉，用CTAB法提取DNA。按fer基因序列設計引物，5'端引物 bar-F為5， -ATGAGCCCAGAAGACG-3， ， 3，端引物bar-R為5， -TCAGATCTCGGTGACGG-3，。用 標準反應體系。擴增條件為94。C預變性5min; 94'C變性30sec、 70'C退火30sec、 72'C延 伸lmin，共35個循環(huán)；最后72。C延伸10min。 PCR檢測呈陽性的植株再進行Southern雜交 檢測。Southern雜交所用探針為用上述特異性引物(bar-F和bar-R)進行PCR擴增后回收 的6ar基因(550bp)。探針標記、雜交和洗摸等均按Promega公司Prime-a-Gene Labeling System試劑盒提供的方法進行。通過Southern雜交條帶是否出現判斷是否是轉基因水稻。
RT-PCR檢測候選轉基因抗性植株
分別提取野生型和轉基因植株未成熟種子(花后2周)中的總RNA，根據己發(fā)表的水稻 Ki/ 7基因序列(登錄號AY212324 )設計引物，5'端引物Act-F為5， -CCCTTGTGTGTGACAATGGMCT-3， ， 3， 端 引 物 Act-R 為 5，-GACACGGAGCTCGTTGTAGMGG-3 ，；根據水稻朋^ 基因序列設計RT-PCR引物，5 ，端引物RBE3-F 為 5， - ATGAGTTCGGACATCCTGAATGG-3' ， 3， 端引物 RBE3-R 為 5，-CATTCCGCTGGAGCATAGACAAC-3 ，。反轉錄試劑盒使用上海申能博彩生物科技有限公司 First-Strand cDNA Synthesis Kit。以^ct/y 7基因作為內參，PCR反應程序為94 'C預變 性2min ; 94 'C變性30s 、 60。C退火30s 、 72 。C延伸30s，共25個循環(huán)，最后72 。C延伸 10min，用凝膠成像定量分析系統(tǒng)對擴增產物瓊脂糖電泳譜帶進行定量分析。經過Southern 雜交分析和RT-PCR檢測獲得轉基因水稻。轉基因植株的分子檢測。 (2)、轉基因株的遺傳分析。
從所有水稻轉基因株系中隨機選取若干種子及對照未轉化水稻中花11的種子，在清水中 萌發(fā)。待小苗長至2-3cm后，換去清水，改用20mg/L PPT水溶液澆灌篩選，篩選出的抗性苗 栽種于大田，并觀察檢驗其性狀分離情況，篩選出復合孟德爾遺傳規(guī)律3:1分離的株系。
5、轉基因水稻的直鏈淀粉含量測定
種子的胚乳部分用于直鏈淀粉含量的測定，每株隨機選取30粒透明度變化的種子，并隨 機分為三組，對照組未轉化水稻中花11的種子也隨機選取30粒并隨機分為三組。采用碘顯 色法，樣品中直鏈淀粉的測定樣品粉碎過60目篩，用乙醚脫脂，稱取脫脂樣品O.lg左 右(精確至1 mg ),置于50ml容量瓶中。加0.5 mo1/ L KOH溶液10ml,在沸水浴中加 熱10min，取出，以蒸餾水定容至50ml若有泡沫采用乙醇消除，靜置。吸取樣品液2. 5ml兩 份(即樣品測定液和空白液)，均加蒸餾水30ml,以0. lmol/LHCI溶液調至pH 3. 5左右， 樣品中加入碘試劑0.5ml,空白液不加碘試劑，然后均定容至50ml 。靜置20min ,以樣品 空白液為對照，用lcm比色杯，分別測得各自的吸光度，并由回歸方程得到相應的直鏈淀粉 含量，取平均值作為該株的胚乳直鏈淀粉含量。結果是轉基因植株直鏈淀粉含量較非轉基因 株平均提高幅度為140%，最高達到238%，篩選后即可獲得籽粒直鏈淀粉含量顯著提高的轉基 因水稻植株。
本發(fā)明從水稻中克隆淀粉分支酶V^^^基因的195bp特異片段作為RNA干擾片段，以高分 子量麥谷蛋白啟動子作為胚乳特異性啟動子，反向重復連接于植物表達載體pCAMBIA1300中， 構建了 )W^3基因的siRNA表達載體，利用農桿菌介導的方法轉化水稻未成熟胚誘導出的愈傷 組織，獲得了干涉^8^ 基因的轉基因水稻。通過PCR和Southern雜交鑒定后，對其半定量 RT-PCR檢測表明y^fJ基因的表達量明顯低于對照。對轉基因水稻植株胚乳直鏈淀粉含量碘顯色法測定表明，轉基因植株直鏈淀粉含量較非轉基因株平均提高幅度為140%'最高達到 238%。從而提供了一種提高水稻中直鏈淀粉含量的方法，為利用轉基因水稻大規(guī)模生產直鏈 淀粉奠定了基礎。序列表
〈110>安徽農業(yè)大學
〈120〉用RNA干涉提高水稻直鏈淀粉含量的方法
〈130〉 ahnydx20090331
<160〉 1
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 589
〈212〉 DNA 〈213〉前序列
〈220〉
<221>所克隆的RBE3基因片段正向序列
<222> (l).. (195)
<220>
<221> PUCRNAi載體中的GA20內含子
<222> (196).. (394)
<220>
<221>所克隆的RBE3基因片段反向序列
〈222〉 (395).. (589)〈400〉 1
gggaagtagc gattaacgtg ttccttactt cccaattccc atagttgaaa aggcgagaat 60
cccacatcca atgatggccg cgtgaaccac tatgaaagta atgcgtatct gtaccatcaa 120
aaccgttcaa cccatctagg gtattatttg acgcatggct gcaaaaggaa aa犯aagggg 180
caaaggtaaa gctatgtacg gaccgtacta ctctattcgt ttcaatatat ttatttgttt 240
cagctgactg caagattcaa aaatttcttt attattttaa attttgtgtc actcaaaacc 300
agataaacaa tttgatatag aggcactata tatatacata ttctcgatta tatatgtaaa 360
tgagttaacc tttttttcca cttaaattat atagtatcga aatggaaacg gggaaaaaaa 420
aggaaaacgt cggtacgcag tttattatgg gatctaccca acttgccaaa actaccat'gt 480
ctatgcgtaa tgaaagtatc accaagtgcg ccggtagtaa cctacaccct aagagcggaa 540
aagttgatac ccttaaccct tcattccttg tgcaattagc gatgaaggg 589
權利要求
1、一種用RNA干涉提高水稻直鏈淀粉含量的方法，其特征在于從水稻中克隆RBE3基因片段作為RNA干擾片段，以胚乳特異性啟動子啟動表達，構建含RBE3基因正反片段的表達載體，用根癌農桿菌介導，將RBE3基因的正反結構轉入水稻中，RT-PCR和Southern雜交檢驗目的基因的整合和表達情況，對轉基因水稻植株胚乳直鏈淀粉含量采用碘顯色法測定，篩選后獲得籽粒直鏈淀粉含量顯著提高的轉基因水稻植株。
2、 根據權利要求1所述的用RNA干涉提高水稻直鏈淀粉含量的方法，其特征在于包括以下主要步驟(1) 根據水稻淀粉合成關鍵酶RBE3基因的序列，通過序列比對，確定水稻直鏈淀粉酶基因的特異性RNA干涉序列，根據干涉序列設計引物，進行水稻淀粉合成關鍵酶RBE3基因的干涉片段的特異性擴增；(2) 以胚乳特異性啟動子啟動表達，構建含RBE3基因正反片段的植物表達載體；(3) 轉化含有目的干涉片段的載體，并將目的干涉片段整合到水稻基因組中；(4) 通過RT-PCR和Southern雜交等分子檢測方法鑒定轉基因水稻；(5) 利用碘顯色法檢測籽粒直鏈淀粉含量，篩選獲得直鏈淀粉含量提高的轉基因水稻。
3、 根據權利要求2所述的用RNA干涉提高水稻直鏈淀粉含量的方法，其特征在于在所述步驟(1)中，通過同源性搜索和序列比對，確定該RNA千涉特異片段位于水稻基因組的66197 66391位置，長195bp，包含RBE3基因的第12個外顯子(135bp)序列，并有60bp的內含子序列。
4、 根據權利要求2所述的用RNA干涉提高水稻直鏈淀粉含量的方法，其特征在于在所述步驟(2)中，以高分子量麥谷蛋白(HMW)啟動子作為胚乳特異性啟動子，把RBE3基因正反片段置于特異啟動子之后，特異性的在胚乳里抑制RBE3基因的表達。
5、 根據權利要求4所述的用RNA干涉提高水稻直鏈淀粉含量的方法，其特征在于在所述步驟(4)中，所述的分子檢測分別為以篩選標記bar基因的特異性引物的PCR擴增片段作探針，采用Southern雜交準確驗證目的干涉片段整合到水稻基因組中及其拷貝數；和設計RBE3基因的RT-PCR專用引物和水稻actin基因的特異引物，然后轉基因水稻和對照分別進行RT-PCR，采用半定量PCR分析RBE3基因的表達差異。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物技術領域的利用RNA干涉提高水稻中直鏈淀粉的含量的方法。本發(fā)明從水稻中克隆淀粉分支酶RBE3基因片段作為RNA干擾片段，以胚乳特異性啟動子啟動表達，構建了RBE3基因的siRNA表達載體，利用農桿菌介導的方法，獲得了干涉RBE3基因的轉基因水稻。RT-PCR和Southern雜交檢驗目的基因的整合和表達情況，對轉基因水稻植株胚乳直鏈淀粉含量碘顯色法測定表明，轉基因植株直鏈淀粉含量較非轉基因株平均提高幅度為140％，最高達到238％，篩選后獲得籽粒直鏈淀粉含量顯著提高的轉基因水稻植株。從而提供了一種提高水稻中直鏈淀粉含量的方法，為利用轉基因水稻大規(guī)模生產直鏈淀粉奠定了基礎。
文檔編號C12N15/82GK101519660SQ20091002925
公開日2009年9月2日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權日2009年4月3日
發(fā)明者眠 夏, 建 張, 朱蘇文, 江海洋, 汪潔明, 程備久 申請人:安徽農業(yè)大學