專利名稱：一種建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化
體系的方法。
背景技術(shù)：
蘭州百合(Lilium davidii var. unicolor)是百合科百合屬川百合的一個變種， 又稱大王百合、天百合和平陸百合，是一種多年生鱗莖類草本植物。蘭州百合的栽種始于清 代同治年間，距今約130多年，由于獨特的土壤條件和多年積累的栽培技術(shù)，其鱗莖碩大， 顏色潔白，鱗片豐滿白嫩，質(zhì)地細(xì)膩，營養(yǎng)豐富，口味甜美而幽香；其花單生，大而美麗，香味 濃郁，有很高的食用、藥用、保健和觀賞價值，它不僅是中國百合中的上品，而且是中國唯一 的甜百合。我國著名的植物分類學(xué)家孔憲武教授曾評價"蘭州百合味極甜美，纖維很少，又 毫無苦味，不但聞名全國，亦可稱世界第一。" 近年來對蘭州百合的研究主要集中在種植栽培、貯存保鮮、化學(xué)成分、細(xì)胞學(xué)、分 子學(xué)、保健食品開發(fā)、雜交育種、組織培養(yǎng)、離體快繁等方面。百合已被國家衛(wèi)生部確定為 "既是食品又是藥品"的植物之一，蘭州百合的營養(yǎng)成分豐富，包括各種蛋白質(zhì)、脂肪和維生 素等。不僅在營養(yǎng)方面具有重要的價值，而且蘭州百合還具有重要藥用價值和觀賞價值。
我國是百合屬植物的故鄉(xiāng)，觀賞、食用或藥用百合的栽培歷史十分悠久，具備良好 的種質(zhì)資源基礎(chǔ)。但目前我國的百合育種工作十分落后，現(xiàn)有的百合種質(zhì)資源不僅沒有得 到充分利用，而且破壞、流失現(xiàn)象十分嚴(yán)重。百合通常采用分球、鱗莖等繁殖，易造成種性退 化，品質(zhì)下降，甚至凝聚病毒。在傳統(tǒng)育種手段的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代生物技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用 到蘭州百合的育種工作中。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)目前廣泛應(yīng)用于植物基因工程研究。根癌農(nóng)桿菌 中含Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒的部分DNA片斷可整合到宿主細(xì)胞中，從而整合到植物的基因組中，農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法同其它方法相比具有以下優(yōu)點轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化效果好，可轉(zhuǎn)移大片 斷DNA ;轉(zhuǎn)移的外源基因成為單拷貝；遺傳穩(wěn)定，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳定律；價格廉價。
但由于蘭州百合屬于單子葉植物，單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，單子葉植 物不能或很少能產(chǎn)生激活Ti質(zhì)粒Vir區(qū)基因的信號分子，無明顯的創(chuàng)傷反應(yīng)，不能形成瘤 狀物，至今以百合鱗片為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化體系仍停留在實驗室研究階段。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種建立蘭州百 合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法。該方法有效的克服現(xiàn)有的農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)難以應(yīng)用于 禾本科植物遺傳轉(zhuǎn)化的缺陷。 實現(xiàn)上述發(fā)明目的技術(shù)產(chǎn)方案是一種建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的 方法，具體包括如下步驟 1)切取組培苗鱗片在分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天作為受體材料；
2)將供體菌株接種到加有卡那霉素、鏈霉素和利福平的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集
菌液，離心，倒去上清，沉淀用液體MS溶解并稀釋至濃度0D600為0. 4 0. 6 ; 3)將步驟2)制備的菌液加入液體MS中，放入受體材料進(jìn)行侵染，把侵染過的鱗片
放到濾紙上吸干，接種到含有20mg/L AS和200mg/L頭孢霉素(cef)的分化培養(yǎng)基上暗培
養(yǎng)3d，而后接種到含有2mg/L代表潮霉素(hyg)的分化培養(yǎng)上，26°C暗培養(yǎng)直至長出抗性
芽； 4)將抗性芽移植到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步的篩選培養(yǎng)，待生長至4 5片葉子 時，進(jìn)行生根培養(yǎng)，而后進(jìn)行移栽。 所述的組培苗鱗片是按照以下步驟制備的洗去百合鱗莖表面泥土，剝?nèi)ネ鈱佑?病斑或機(jī)械損傷的鱗片，取中外層無病斑健壯的鱗片，用洗潔精浸泡清洗，然后在自來水下 沖洗12h左右，滅菌前再用蒸餾水清洗3次，在超凈臺上用70%乙醇消毒40s，投入0. 1 %升 汞溶液中消毒15min，無菌水沖洗5次，滅菌后的鱗片切成1. 0 2. OcmX 1. 0 2. Ocm方 塊，倒置接種于分化培養(yǎng)基上，在26°C、20001x、16h每天、光照培養(yǎng)30 60天得組培苗鱗 片。 所述的蘭州百合組培苗鱗片在26t:暗培養(yǎng)2天。
所述的供體菌株是農(nóng)桿菌EHA105。 所述的液體LB培養(yǎng)基加入的卡那霉素50 150mg/L、鏈霉素30 70mg/L和利福 平40 800mg/L。所述的供體菌株在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)條件為28 °C ， 200rpm恒溫?fù)u床上24。
所述的離心條件為5000rpm常溫離心10分鐘。
所述的侵染條件為28t:，200rpm搖床上搖動20min。
所述的侵染時還加入20mM的乙酰丁香酮(AS)。所述的分化培養(yǎng)基為1/2MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂。
所述的繼代培養(yǎng)基為MS+1. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂。
所述的液體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基。 本發(fā)明蘭州百合高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法，通過優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時所涉及到 的各項影響條件，包括菌液濃度、侵染時間、侵染條件、共培養(yǎng)時間、抑菌素濃度等，提供了 一套適合蘭州百合的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系?？朔爽F(xiàn)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)難以應(yīng)用于禾本科 植物遺傳轉(zhuǎn)化的缺陷，建立起一鱗片為受體材料的高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點 通過本發(fā)明獲得轉(zhuǎn)基因植株蘭州百合可以明顯提高Vc含量2 5倍，植株的抗逆 性明顯增強。


圖1為轉(zhuǎn)基因植株蘭州百合的抗性篩選。
圖2為轉(zhuǎn)基因植株GUS染色。
圖3為轉(zhuǎn)基因植株的DHAR基因的PCR檢測。
圖4為為轉(zhuǎn)基因植株的hyg基因的PCR檢測。
具體實施例方式
下面結(jié)合發(fā)明人給的具體實施例和試驗列對本發(fā)明的方法和使用效果做進(jìn)一步 闡明。 實施例1組培苗鱗片制備 洗去百合鱗莖表面泥土，剝?nèi)ネ鈱佑胁“呋驒C(jī)械損傷的鱗片，取中外層無病斑健 壯的鱗片，用洗潔精浸泡清洗，然后在自來水下沖洗12h左右，滅菌前再用蒸餾水清洗3 次，在超凈臺上用70%乙醇消毒40s，投入0. 1%升汞溶液中消毒15min，無菌水沖洗5次， 滅菌后的鱗片切成1. 0 2. OcmXl. 0 2. Ocm方塊，倒置接種于分化培養(yǎng)基上，在26°C 、 20001x、16h每天、光照培養(yǎng)30 60天得組培苗鱗片。
實施例2 1)切取組培苗鱗片在分化培養(yǎng)基1/2MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/ L瓊脂上暗培養(yǎng)2天作為受體材料，培養(yǎng)條件為26°C ; 2)將供體菌株農(nóng)桿菌EHA105接種到加有卡那霉素50mg/L、鏈霉素30mg/L和利福 平40mg/L中，28°C ， 200rpm恒溫?fù)u床上過夜，將菌液收集到10ml離心管中，5000rpm常溫離 心10分鐘，倒去上清，沉淀用液體MS溶解并稀釋，濃度0D600為0. 4時進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，同時 加入20mM的乙酰丁香酮(AS); 3)將預(yù)培養(yǎng)兩天的鱗片放入盛放菌液的液體MS中，28t:，200rpm搖床上搖動
20min，將侵染過的鱗片放到濾紙上吸干，而后接種到含有20mg/L AS和200mg/L頭孢霉素
(cef)的分化培養(yǎng)基MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂上暗培養(yǎng)3d，而后
接種到含有2mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)上，26t:暗培養(yǎng)直至長出抗性芽； 4)將抗性芽移植含有5mg/L的潮霉素和50mg/L的cef的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一
步的篩選培養(yǎng)，待生長至4-5片葉子時，進(jìn)行生根培養(yǎng)，而后進(jìn)行移栽。 實施例3 1)切取組培苗鱗片在分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天作為受體材料，培養(yǎng)條件為26°C ;
2)將供體菌株農(nóng)桿菌EHA105接種到加有150mg/L、鏈霉素70mg/L和利福平 800mg/L中，28°C ， 200rpm恒溫?fù)u床上過夜，將菌液收集到10ml離心管中，5000rpm常溫離心 10分鐘，倒去上清，沉淀用液體MS溶解并稀釋，濃度0D600為0. 6時進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，同時加 入20mM的乙酰丁香酮； 3)將預(yù)培養(yǎng)兩天的鱗片放入盛放菌液的液體MS中，28t:，200rpm搖床上搖動 20min，將侵染過的鱗片放到濾紙上吸干，而后接種到含有20mg/L AS和200mg/L頭孢霉素 的分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3d，而后接種到含有2mg/L hyg的分化培養(yǎng)上，26。C暗培養(yǎng)直至長 出抗性芽； 4)將抗性芽移植含有5mg/L的潮霉素和50mg/L的cef的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一 步的篩選培養(yǎng)，待生長至4-5片葉子時，進(jìn)行生根培養(yǎng)，而后進(jìn)行移栽。
試驗例1轉(zhuǎn)基因植株蘭州百合的抗性篩選 獲得再生芽后，轉(zhuǎn)移至含有hyg的分化培養(yǎng)基上，若是轉(zhuǎn)基因植株在抗生素培養(yǎng)
基上生長良好，若為非轉(zhuǎn)基因植株，在抗生素培養(yǎng)基上死亡，如圖l所示，圖中所反應(yīng)的內(nèi)
容是再生芽的抗性篩選。 試驗例2轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色
將材料浸泡于GUS染色液(50mmol/L磷酸緩沖液pH 7. 0， lmmol/LEDTA， 0. 05 % Triton 100， lmmol/L鐵氰化鉀，lmmol/L亞鐵氰化鉀，甲醇20%，0. 5mg/ml X Gluc)， 37。C染色12 24h后，用70 95X乙醇脫色。每個樣本重復(fù)3次，用Olympus optics顯 微鏡觀察，結(jié)果如圖2所示左為非轉(zhuǎn)基因植株，右為轉(zhuǎn)基因植株。
試驗例3轉(zhuǎn)基因植株DHAR基因的PCR檢測 用于蘭州百合遺傳轉(zhuǎn)化的基因含有DHAR基因，采用CTAB法提取葉片的DNA進(jìn)行 檢測，擴(kuò)增片斷長度為500bp，如圖3所示，圖中1代表mark，2代表陽性對照，3代表陰性對 照，4 6代表轉(zhuǎn)基因植株。 25ii L的反應(yīng)體系包括2. 5ii L 10XPCR Bufer，1.5iiL 25mmol/L MgCl2，2iiL 2.5mmol/L dN TPs, 1 ii L 10mmol/L DHARs弓|物，1 ii L 10mmol/LDHARa引物，0. 25 ii L 5U/ ii L的Taq DNA聚合酶，2 ii L模板DNA，用滅菌雙蒸水補齊至25 ii L。PCR的反應(yīng)條件為1)94。C預(yù)變性5分鐘后，2)94。C變性45秒，3)55。C退火45秒， 4)72t:延伸1分，步驟2至4循環(huán)38次。5)最后72。C延伸10分鐘。
DHAR檢測引物上游引物5 ， CTAATGGCTCTCGAGGTCGCTG 3'
下游引物5 ， AGGAGCGGTCTTCACGAAGG 3'
試驗例4轉(zhuǎn)基因植株潮霉素基因的PCR檢測 用于蘭州百合遺傳轉(zhuǎn)化的基因含有hyg基因，采用CTAB法提取葉片的DNA進(jìn)行檢 測，擴(kuò)增片斷長度約為850bp。 25ii L的反應(yīng)體系包括2. 5ii L 10XPCR Bufer，1.5iiL 25mmol/L MgCl2，2iiL 2.5mmol/L dN TPs, 1 ii L lOmmol/L DHARs弓|物，1 ii L 10mmol/LDHARa引物，0. 25 ii L5U/ii L 的Taq DNA聚合酶，2 ii L模板DNA，用滅菌雙蒸水補齊至25 ii L。PCR的反應(yīng)條件為1)94。C預(yù)變性5分鐘后，2)94。C變性45秒，3)60。C退火45秒， 4)72t:延伸1分，步驟2至4循環(huán)35次。5)最后72。C延伸10分鐘。
HYG檢測引物上游引物5 ， GTCGACCTATTTCTTTGCCCTCGGAC 3'
下游引物5 ， GGATCCCCTGACCTATTGCATCTCCC 3' 如圖4所示，1代表mark，2代表陽性對照，3代表陰性對照，4 6代表轉(zhuǎn)基因植 株。
權(quán)利要求
一種建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于，包括如下步驟1)切取組培苗鱗片在分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天作為受體材料；2)將供體菌株接種到加有卡那霉素、鏈霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集菌液，離心，倒去上清，沉淀用液體MS溶解并稀釋至濃度OD600為0.4～0.6；3)將步驟2)制備的菌液加入液體MS中，放入受體材料進(jìn)行侵染，把侵染過的鱗片放到濾紙上吸干，接種到含有20mg/L AS和200mg/L頭孢霉素的分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3d，而后接種到含有2mg/L代表潮霉素的分化培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)直至長出抗性芽；4)將抗性芽移植到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步的篩選培養(yǎng)，待生長至4～5片葉子時，進(jìn)行生根培養(yǎng)，而后進(jìn)行移栽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在 于，所述的組培苗鱗片是按照以下步驟制備的洗去百合鱗莖表面泥土，剝?nèi)ネ鈱佑胁“呋驒C(jī)械損傷的鱗片，取中外層無病斑健壯的 鱗片，用洗潔精浸泡清洗，然后在自來水下沖洗12h左右，滅菌前再用蒸餾水清洗3次，在超 凈臺上用70%乙醇消毒40s，投入0. 1 %升汞溶液中消毒15min，無菌水沖洗5次，滅菌后的 鱗片切成1. 0 2. OcmX 1. 0 2. Ocm方塊，倒置接種于分化培養(yǎng)基上，在26°C 、20001x、 16h 每天、光照培養(yǎng)30 60天得組培苗鱗片。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在 于，所述的蘭州百合組培苗鱗片在26t:暗培養(yǎng)2天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在 于，所述的供體菌株是農(nóng)桿菌EHA105。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在 于，所述的液體LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素50 150mg/L、鏈霉素30 70mg/L和利福平 40 800mg/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在 于，所述的供體菌株在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)條件為28t:，200rpm恒溫?fù)u床上24。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在 于，所述的離心條件為5000rpm常溫離心10分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在 于，在28°C ， 200rpm搖床上搖動20min進(jìn)行侵染。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方 法，其特征在于，在進(jìn)行侵染時加入20mM的乙酰丁香酮。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項所述的建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法， 其特征在于，所述的繼代培養(yǎng)基中含有5mg/L的潮霉素和50mg/L的頭孢霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建立蘭州百合農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，以切取組培苗鱗片分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天作為受體材料；將供體菌株接種到加有卡那霉素、鏈霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集菌液，離心，倒去上清，沉淀用液體MS溶解并稀釋至濃度OD600為0.4～0.6加入液體MS中，放入受體材料進(jìn)行侵染，把侵染過的鱗片放到濾紙上吸干，接種到含有20mg/LAS和200mg/L頭孢霉素的分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3d，而后接種到含有2mg/L代表潮霉素的分化培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)直至長出抗性芽；將抗性芽行進(jìn)一步的篩選培養(yǎng)，待生長至4～5片葉子時，進(jìn)行生根培養(yǎng)，而后進(jìn)行移栽。為培育優(yōu)良水稻品種開辟了新的途徑。
文檔編號C12N15/82GK101748146SQ20091002336
公開日2010年6月23日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者馮鳳娟, 師守國, 李善菊, 李永紅, 梁東, 王愛蓮, 馬鋒旺 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)