專利名稱：辣椒疫霉菌果膠甲基酯酶Pcpme1基因分子檢測(cè)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本技術(shù)發(fā)明提供從來(lái)辣椒疫霉菌的果膠甲基酯
酶A:;M/el基因設(shè)計(jì)并合成的一對(duì)特異引物，并提供檢測(cè)辣椒疫霉特異性和靈敏度的證據(jù)。 此外，本發(fā)明主要涉及利用該技術(shù)對(duì)辣椒病田土壤、病莖、病葉、病果中的辣椒疫霉菌進(jìn) 行定性、定量分子檢測(cè)和疫情發(fā)生趨勢(shì)的預(yù)警，對(duì)辣椒疫病適時(shí)進(jìn)行綜合防控和高效治理。
背景技術(shù)：
植物病原卵菌是一類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導(dǎo)致多種植物的毀滅性 病害，如致病疫霉(P/^o; /if/ioraZw/eWa"s)、辣椒疫霉)、大豆疫霉(Pso/fle)、 寄生疫霉(i /7"raw'ft'c)、樟疫霉c/w冊(cè)/w附Z)及冬生疫霉(jR秘e則fo)分另!j引起馬鈴
薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹及柑橘的重要疫病，嚴(yán)重年份乃至絕產(chǎn)。該類病菌主要以菌 絲體或卵孢子在病殘?bào)w或土壤中度過(guò)不良環(huán)境而作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或 卵孢子均可萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊-釋放游動(dòng)孢子，再借助雨水或氣流進(jìn)行傳播、侵染而導(dǎo)致植物 病害。因此，對(duì)該類病菌的初侵源或侵染寄主早期進(jìn)行適時(shí)檢控，利于控制病害的發(fā)生。 傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調(diào)控等防治措施，這些防控措施主 要在病害爆發(fā)乃至產(chǎn)生明顯危害時(shí)才實(shí)施，忽視了對(duì)初侵染源或侵染寄主早期適時(shí)采取綜 合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。
近年來(lái)，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測(cè)技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的分子檢測(cè)與 預(yù)警，其中主要利用核糖體rDNA/ITS序列設(shè)計(jì)特異引物，已針對(duì)性的開展了大豆疫霉、致 病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉的分子檢測(cè)技術(shù)研究，但這些技術(shù)性研發(fā)成果僅 能對(duì)病菌活動(dòng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)與預(yù)警，但不能對(duì)病菌致病特性與發(fā)生趨勢(shì)進(jìn)行檢測(cè)與預(yù)警。 研究標(biāo)明疫霉菌-寄主互作過(guò)程中常分泌多種重要的細(xì)胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛 酸酶(？《)、果膠甲基酯酶(/^e)、果膠裂解酶(/^/)，它們主要通過(guò)降解或軟化植物細(xì)胞壁 的主要成分果膠、中膠層及果膠聚合體，而促使病菌的侵入與定植，對(duì)寄主產(chǎn)生寄生與致 病性。該類致病酶是均由多基因編碼，其中少數(shù)關(guān)鍵基因是重要的致病靶基因，因此分離 鑒定這些重要致病酶的靶標(biāo)基因，利用基因信息學(xué)設(shè)計(jì)并合成乾標(biāo)基因的特異引物，針對(duì) 病菌不同時(shí)期的致病特性進(jìn)行分子檢測(cè)與預(yù)警，以便在病菌初侵染期適時(shí)采取綜合防控措 施，減少藥劑使用次數(shù)與使用量，阻斷病菌的擴(kuò)展與蔓延，控制病害的發(fā)生與蔓延。因此， 開展重要疫霉菌致病酶類靶標(biāo)基因克隆及其特異引物設(shè)計(jì)與合成，研制病菌分子檢測(cè)、預(yù) 警技術(shù)及其試劑盒，對(duì)重要疫霉病的綜合防控具有重要的理論與實(shí)踐意義。本發(fā)明以辣椒 疫霉為參試材料，通過(guò)解析辣椒疫霉果膠甲基酯酶基因簇成員組成，將Pc/Me 1界定為耙 標(biāo)致病基因，設(shè)計(jì)并合成戶c/M/e 1基因的特異引物，驗(yàn)證其特異性和靈敏度，借助PCR技 術(shù)對(duì)辣椒疫霉活動(dòng)動(dòng)態(tài)及致病特性進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)與預(yù)警。在本發(fā)明申請(qǐng)之前， 從世界范圍內(nèi)除利用辣椒疫霉rDNA/ITS序列特異引物對(duì)該病菌進(jìn)行分子檢測(cè)外，無(wú)任何利 用重要致病酶類的靶標(biāo)基因特異引物對(duì)辣椒疫霉消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行分子檢測(cè)與病情預(yù)警的資料寸§ I 。

發(fā)明內(nèi)容
1、 在界定辣椒疫霉菌果膠甲基酯酶靶標(biāo)致病基因1的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因信息比對(duì)，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了 ,c/M;e 1基因的一對(duì)特異性引物，提供了利用該對(duì)特異引物對(duì)辣椒疫霉消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)及致病特性進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)的操作技術(shù)。先對(duì)所有參試種菌進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性，然后對(duì)土壤卵孢子和游動(dòng)孢子進(jìn)行定量分子檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證其靈敏度，證明了該對(duì)引物可對(duì)不同時(shí)期的辣椒疫霉進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，利用PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)辣椒病田土壤、辣椒疫病組織(病莖、病葉、病果)疫霉菌
進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)。因此，利用該對(duì)引物可對(duì)辣椒疫霉初侵染源及其侵染過(guò)程的各個(gè)時(shí)期病菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)與預(yù)警，本技術(shù)發(fā)明的應(yīng)用推廣，便于選擇最佳有效防控時(shí)期，降低了病害防控成本，實(shí)施綜合防控與高效治理。
本發(fā)明所提供的果膠甲基酯酶,c;7/^l基因的一對(duì)特異性引物，上游引物為1RTF，含17bp，其序列如SeqlDNo:2所示；下游引物為1RTR,含20bp，其序列如Seq ID No:3所示，該對(duì)引物擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為287bp。該對(duì)引物序列與JGI中的jgi/phycaf7/20609中適宜對(duì)疫霉菌進(jìn)行分子檢測(cè)的引物序列比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)一個(gè)與其完全相同序列的引物，因此是一對(duì)新的辣椒疫霉分子檢測(cè)與預(yù)警引物。
2、 本發(fā)明為了證明該對(duì)引物的特異性，提供了利用該對(duì)引物對(duì)若干參試種菌PCR擴(kuò)增的結(jié)果及其特異性驗(yàn)證技術(shù)方法。
3、 本發(fā)明為了驗(yàn)證該對(duì)引物的靈敏度，提供了利用該對(duì)引物定量檢測(cè)土壤辣椒疫霉卵孢子和游動(dòng)孢子的技術(shù)方法。
4、 本發(fā)明提供了利用該對(duì)引物對(duì)辣椒疫病組織(病莖、病果和病葉)中辣椒疫霉進(jìn)行分子檢測(cè)的技術(shù)方法，進(jìn)一步證明了該對(duì)特異引物對(duì)辣椒疫霉分子檢測(cè)與預(yù)警的效果。
5、 本發(fā)明提供了利用該對(duì)特異引物對(duì)病田土壤、病莖、病果、病葉中的辣椒疫霉分子檢測(cè)技術(shù)方法，利用本技術(shù)發(fā)明可適時(shí)預(yù)測(cè)辣椒疫霉病疫情發(fā)展趨勢(shì)。
6、 本發(fā)明用于設(shè)計(jì)合成的特異引物的靶標(biāo)基因尸cp邁e 1的宿主載體為pUC19。具體操作步驟
1、 從辣椒疫霉菌中分離克隆Pe/基因和靶標(biāo)戶cp邊e l基因界定的具體步驟省略
因辣椒疫霉菌尸me基因分離克隆和Pc/M;el被界定為靶標(biāo)基因的具體步驟已在前一個(gè)發(fā)明專利申請(qǐng)中詳述，故在本發(fā)明中不再加一詳述，其,c/wel基因全序列如SeqlDNo:l所示。
2、 靶標(biāo),^/z/e l基因特異引物設(shè)計(jì)與合成
(l)引物設(shè)計(jì)利用DNAMAN對(duì)辣椒疫霉等疫霉種菌，曲霉等真菌，番茄等植物，胡蘿卜歐式桿菌等細(xì)菌及其他能征集到的所有果膠甲基酯酶基因序列進(jìn)行比對(duì),設(shè)計(jì)戶c拜e l基因的特異性引物，其上游引物為1RTF，含17bp;下游引物為1RTR,含20bp，擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度為
4287bp。
(2)引物合成將設(shè)計(jì)合成的引物發(fā)給上海博尚生物公司或上海鼎安生物公司，由生物公司合成寄回后，直接應(yīng)用。
3、乾標(biāo)戶c/ 邁e l基因特異性引物驗(yàn)證步驟
(1) 參試種菌制作與菌體收集。
(2) 參試菌體DNA提取。
(3 )靶標(biāo),c/7邁e 1基因特異性引物對(duì)參試種菌DM進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(4)擴(kuò)增結(jié)果的比較分析。
通過(guò)對(duì)所有參試種菌DNA的PCR擴(kuò)增，結(jié)合擴(kuò)增片段的有無(wú)情況，驗(yàn)證該對(duì)引物的特異性，其具體操作技術(shù)方法在具體實(shí)施方式
中詳細(xì)描述。
4、 靶標(biāo)戶c/;逝e l基因特異性引物靈敏度驗(yàn)證步驟
(1) 辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子DNA提取。
(2) 土壤卵孢子DNA提取及純化。
(3) 分別利用入選特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(4) 綜合比較分析PCR檢測(cè)結(jié)果，檢驗(yàn)入選引物的靈敏度。
本技術(shù)操作屬常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)方法，具體操作過(guò)程在后續(xù)的具體實(shí)施方式
中加以詳述。
5、 入選特異性引物對(duì)辣椒疫病組織(病莖、病果、病葉)分子檢測(cè)步驟
(1) 辣椒疫病組織(發(fā)病莖組織、葉片、果實(shí))的DNA提取。
(2) 分別利用入選特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(3) 綜合比較不同病組織PCR檢測(cè)結(jié)果，確定入選引物對(duì)辣椒疫病組織的檢測(cè)技術(shù)。本技術(shù)操作過(guò)程采用的是常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，具體過(guò)程在后續(xù)的具體實(shí)施方
式中加以詳述。
6、 特異引物對(duì)病田土壤、病莖、病果、病葉中的辣椒疫霉分子檢測(cè)步驟
為了進(jìn)一步證明本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的靶標(biāo)戶c/;邁e 1基因特異引物對(duì)辣椒疫霉的檢測(cè)效果，本發(fā)明提供了該對(duì)特異引物對(duì)病田土壤、病莖、病果、病葉中的辣椒疫霉分子檢測(cè)技術(shù)，具體操作步驟
(1) 分別提取辣椒疫霉病病田土壤菌體、病莖、病果、病葉的總DNA。
(2) 以不同來(lái)源的DNA為模板，利用入選特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)不同來(lái)源的辣椒疫霉菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(3) 綜合比較不同來(lái)源的辣椒疫霉PCR檢測(cè)結(jié)果，正確預(yù)警辣椒疫霉消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和疫情發(fā)展趨勢(shì)。
綜合上述檢測(cè)結(jié)果，本發(fā)明所提供的辣椒疫霉果膠甲基酯酶1靶標(biāo)基因的一對(duì)特異性引物能對(duì)不同時(shí)期的辣椒疫霉進(jìn)行定性、定量檢測(cè)與預(yù)警，為對(duì)辣椒疫霉進(jìn)行適時(shí)綜合防控與高效治理提供了方便易行的操作技術(shù)。


圖1.靶標(biāo)Pc/皿e 1基因特異引物對(duì)不同參試種菌DM的PCR擴(kuò)贈(zèng)結(jié)果示意圖
圖中1:標(biāo)準(zhǔn)DNA; 2:陰性對(duì)照水；3-7:辣椒疫霉；8:大豆疫霉；9:寄生疫霉；10:致病疫霉；11:樟疫霉；12:掘氏疫霉；13:棕櫚疫霉；14:熱帶疫霉；15:苧麻疫霉；16:惡疫霉；17:苜蓿疫霉；18:芋疫霉；19:標(biāo)準(zhǔn)DNA; 20:隱地疫霉；21:豌豆疫霉；22:草莓疫霉；23:大雄疫霉；24:菜豆疫霉；25:蔥疫霉；26:冬生疫霉；27:瓜果腐霉；28:水霉；29:甘薯根霉；30:立枯絲核；31:串珠鐮刀菌；32:腐皮鐮孢菌；33:東鏈格孢；34:青霉菌；35:淡黃曲霉。
結(jié)果顯示來(lái)自靶標(biāo)基因？c/;邁e 1的一對(duì)特異引物對(duì)辣椒疫霉具特異的檢測(cè)效果，進(jìn)一步'說(shuō)明A^邁e l基因是辣椒疫霉/^e基因簇成員中的一個(gè)新基因。
圖2.乾標(biāo)戶c;7邁e 1基因特異引物PCR擴(kuò)增不同濃度游動(dòng)孢子DNA示意圖
圖中1:標(biāo)準(zhǔn)DNA; 2:陰性對(duì)照水；3:陽(yáng)性對(duì)照辣椒疫霉DNA; 4-15:來(lái)自不同體積的游動(dòng)孢子DNA 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0, 3. 5， 4. 0, 4. 5, 5. 0, 5. 5, 6. (^L ( 7個(gè)游動(dòng)孢子"L )。
結(jié)果顯示該對(duì)特異引物對(duì)不同濃度的游動(dòng)孢子具明顯的檢測(cè)效果，而且隨著游動(dòng)孢子濃度的增加，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)，致使檢測(cè)游動(dòng)孢子的精度最低可達(dá)3.5個(gè)"L。
圖3.靶標(biāo)/^;邁e 1基因特異引物PCR擴(kuò)增土壤中卵孢子DNA示意圖
圖中1:標(biāo)準(zhǔn)DNA; 2:陰性對(duì)照水；3:陽(yáng)性對(duì)照辣椒疫霉DNA; 4-11:來(lái)自含不同數(shù)量的卵孢子土壤DNA 20， 10,1. 0， 0. 5, 0. 2, 0. 1， 0. 05, 0. 01個(gè)卵孢子/克土壤。DNA模板最低檢測(cè)量分別為10—5ng"L和0. 05個(gè)卵孢子/克土壤。
結(jié)果顯示該對(duì)特異引物對(duì)土壤中的卵孢子具明顯的檢測(cè)效果，而且隨著卵孢子數(shù)量的增加，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)，致使檢測(cè)卵孢子的精度最低可達(dá)0.05個(gè)卵孢子/克土壤。
圖2和圖3檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證了該對(duì)特異引物對(duì)辣椒疫霉具很高的檢測(cè)靈敏度，近而可對(duì)
辣椒疫霉進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)。
圖4.耙標(biāo)戶c/7邁e 1基因特異引物對(duì)不同辣椒疫病組織DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖
圖中1:標(biāo)準(zhǔn)DNA; 2-3:陰性對(duì)照水和健康辣椒組織DNA; 4:辣椒疫霉DNA陽(yáng)性對(duì)照；5-7:
來(lái)自不同辣椒疫病組織的DNA:病莖、病果、病葉(分別取O. 25^L病組織DNA)?？梢娫搶?duì)
特異引物對(duì)不同辣椒疫霉病組織中的辣椒疫霉具明顯的檢測(cè)效果。
圖5.靶標(biāo)/^/^e 1基因特異引物對(duì)不同辣椒疫病材料PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖
圖中1:標(biāo)準(zhǔn)DNA; 2-3:無(wú)菌水和健康辣椒組織DNA; 4:辣椒疫霉菌絲體DNA; 5:病莖組
織DNA; 6:病果組織DNA; 7:病葉組織DNA; 8:人工接種卵孢子的土壤菌體DNA; 9:含
有卵孢子的病田土壤菌體DNA (分別取O. 25^L DNA)。
結(jié)果顯示利用本技術(shù)發(fā)明，可對(duì)不同辣椒疫病材料進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)，應(yīng)用該技術(shù)可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)辣椒疫霉消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和疫情發(fā)展趨勢(shì)，便于及時(shí)確定病害最佳防控時(shí)期，特別是在病菌早期活動(dòng)時(shí)期適時(shí)進(jìn)行綜合防控和治理，如根據(jù)對(duì)土壤中卵孢子檢測(cè)的有無(wú)、多少及繁殖速度，適時(shí)處理土壤，阻斷源頭病菌的繁殖與蔓延，達(dá)到高效治理的目的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所提供的實(shí)施例，均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(NewYork: Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ),或Draper, J等(Blackwell科學(xué)出版社，1988 ),鄭小波(疫霉菌及其研究技術(shù)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997 )所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)施l:乾標(biāo),c;we l基因特異引物設(shè)計(jì)與合成
('l)特異引物設(shè)計(jì)利用DNAMAN對(duì)已知的辣椒疫霉，'大豆疫霉，橡膠疫霉等卵菌，曲霉、鏈格孢菌等真菌，番茄、桃、檸檬等多種植物，及所能查到的所有的果膠甲基酯酶基因進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)戶c/7邁e l的特異性引物，上游引物1RTF和下游引物1RTR，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度287bp。1RTF : 5，-CCCTGGTGTGTACCGTG-3， 17bp, 1RTR: 5，-TGTTACCTTCAATGATGGTG-3, 20bp。
(2)引物合成將設(shè)計(jì)合成的引物發(fā)給上海博尚生物公司或上海鼎安生物公司，由生物公司合成寄回后，直接應(yīng)用。實(shí)施2:特異性引物的驗(yàn)證技術(shù)步驟與方法
1) 供試種菌及其培養(yǎng)制作
供試?yán)苯芬呙?P co/w'd)(山東)、大豆疫霉(Psci/fle )(吉林)、寄生疫霉(i ;^raw'ric )(云南)、致病疫霉(P z'M/e對(duì)fl"s )、樟疫霉(尸 cz7mfl歸附/ X CBS提供)、掘氏疫霉(_R (irec/wZen')(CBS提供)、棕櫚疫霉(i 評(píng)Z附h;ora ) ( CBS提供)、熱帶疫霉(/!加/w'cflfo ) ( CBS提供)、苧麻疫霉(尸6oe/roe/7'fle )(福建)、惡疫霉(尸ca"o畫)(CBS提供)、苜蓿疫霉(陜西)、芋疫霉(P co/oom'fle )(廣東)、隱地疫霉co^togea) (CBS)、豌豆疫霉(f! eo^irasepricfl)(云南)、草莓疫霉介Ggfln'fle)(山東)、大雄疫霉(P megfl^ema) (ATCC)、菜豆疫霉; /uweo/z')(山東)、蔥疫霉GRpom')、冬生疫霉(S ^7 emflfc )( CBS119904 )、瓜果腐霉(i^/i/wnop/w肌Wennfl加/n )(山東)、水霉(SopraZegm'fl sp.)(山東)分別用V8培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的制作參照方中達(dá)，植病研究方法，1998)。甘薯根霉(i /^op^teto^s)(山東)、立枯絲核菌(i /i^:octom.fl so/am')(山東)、串珠鐮刀菌(jFksarz'w附mom'&ybrwe)(山東)、腐皮鐮孢菌(E■so/am')(山東)、東鏈格孢(Jter"fl 7'fl w/flm')、青霉菌(jPem'dffiw/n sp.)(山東)及淡黃曲霉"^e^7/"s cre附ow)(山東)均用馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)(培養(yǎng)基制作參照方中達(dá)，植病研究方法，1998)。辣椒疫霉游動(dòng)孢子懸浮液和卵孢子制備及記述方法參考鄭小波(1997 )描述的方法。
2) 菌體培養(yǎng)與收集
供試疫霉菌移至燕麥平板培養(yǎng)基上，于25。C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3d后，從菌落邊緣切取菌塊，轉(zhuǎn)至V8培養(yǎng)基，而其它參試真菌移至PDA培養(yǎng)基上，所有參試種菌均25X:震蕩培養(yǎng)5-7d,無(wú)菌紗布過(guò)濾，經(jīng)冷凍抽干研制成粉，-20"保存?zhèn)溆谩?br> 3) 參試種菌菌絲體DNA提取釆用CTAB法或改良CTAB法，提取的DNA于-20。C保存?zhèn)溆?，并分別取2^L ( 50ng/^L)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
4)特異引物對(duì)參試種菌DNA的PCR擴(kuò)增技術(shù)方法
PCR反應(yīng)體系為10xPCR緩沖液5^L，模板DNA ( 50ng) 2//L，引物尸a^g 5-F和P";pg 5-R各l^aL, dNTP (2.5mmol/L) MgCLs (25mmol/L) 4//L， TaqE0.5^L, ddH20 ( 32.5//L )。
PCR檢測(cè)程序?yàn)?95。C預(yù)變性4min; 94'C變性lmin， 50°C 30s, 72。Clmin, 35個(gè)循環(huán);最后72。C延伸10min。取10〃LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的TBE膠檢測(cè)，用DL2000 DNA Marker作對(duì)照。電泳結(jié)東后，用Bio Imaging System Gene Cenius LP-400全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描于計(jì)算機(jī)軟件中保存。實(shí)施3:特異引物靈敏度驗(yàn)證技術(shù)方法
1) 辣椒疫霉游動(dòng)孢子DNA提取
取5(^L無(wú)菌水中加入350個(gè)游動(dòng)孢子(顯微鏡下直接記述)，加O. 05g石英砂，在渦旋器上劇烈震蕩3min,稍離心，上清液即為游動(dòng)孢子的DNA粗提液，分別取0.5-10^L上清液直接作為PCR擴(kuò)增模板。
2) 土壤卵孢子DM提取及純化
參照Z(yǔ)hu等(Applied and Environmental Microbiology, 1996， 62:316-322)報(bào)道的方法(稍微改進(jìn))。分別取含有20, 10, 5.0, 2.0，1.0，0.05,0.01個(gè)卵孢子/lg土壤放入5mL滅菌離心管中，加入適量石英砂，劇烈振蕩lmin。然后加2mLNa3PO4緩沖液(0.12mol/L，PH8.0)，于30°C振蕩15min(160rpm/min), 10000rpm/min離心10 min后，棄上清。向沉淀中加入3mLDNA提取液(100mmol/LTris-HCI, lOOmmol/LEDTA, 100mmol/LNa3PO4, 20mol/LNaCI, 1%CTAB,pH 8.0)、 3QaL蛋白酶K (10mg/mL)和0.5mL溶菌酶(50mg/mL),于37。C振蕩20min (225rpm/min),隨后加入0.4mL 20% SDS,置65。C水洛1.5h,經(jīng)2-3次冷凍處理后，室溫條件下6000 rpm/min離心10min，收集上清，加入等體積酚氯仿異戊醇，12000 rpm/min離心10min。在上清中加0.6倍體積異丙醇，4"C沉淀lh,室溫條件下14000rpm/min離心15min,收集核酸沉淀，經(jīng)70%乙醇漂洗2-3次，風(fēng)干后，加100 ^L無(wú)菌水溶解DNA備用，純化方法采用DNA凝膠回收純化法。
3) 特異引物對(duì)辣椒疫霉游動(dòng)孢子DNA PCR擴(kuò)增技術(shù)方法PCR反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)程序及凝膠成像觀察同上，省略。
4) 特異引物對(duì)土壤卵孢子MA PCR擴(kuò)增技術(shù)方法PCR反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)程序及凝膠成像觀察同上，省略。
實(shí)施4:特異引物對(duì)不同病組織DM PCR檢測(cè)技術(shù)方法l)辣椒疫病組織病莖、病葉、病果DM提取
將供試?yán)苯芬呙罐D(zhuǎn)至V8固體平板中，25'C黑暗培養(yǎng)2-3d后，用打空氣從菌落邊緣取菌落塊(2mmx2mm),創(chuàng)傷接種于辣椒幼苗(7-9片葉)莖基部、同一個(gè)辣椒品種的果實(shí)，同樣大小的菌塊微傷口接種于辣椒葉片，然后分別切取不同發(fā)病組織，參考Wang等(Nucleic
8Acids Research, 1993, 21: 4153-4154)的NaOH法(稍加改進(jìn))提取病組織的DNA:分別取一段適量的病莖、病果、病葉，1 mg病組織加入0.5mol/LNaOH，充分研磨后轉(zhuǎn)至1.5mL的eppendorf離心管中，10000 rpm離心5 min,取5〃L上清液加入495〃L0.1mmol/LTris (PH8.0)，混均后取1^L直接用于PCR擴(kuò)增，用本方法提取的健康辣椒莖、果實(shí)、葉片的混合DNA為空白對(duì)照。
2)特異引物對(duì)不同辣椒疫病組織DNA PCR擴(kuò)增技術(shù)方法
PCR反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)程序及凝膠成像觀察同上，省略。實(shí)施5:特異性引物對(duì)不同辣椒疫病材料DNA檢測(cè)技術(shù)
1) 不同辣椒疫霉病原材料DNA提取均按上述方法進(jìn)行。
2) 特異引物對(duì)不同辣椒疫病材料MA的PCR擴(kuò)增技術(shù)方法PCR反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)程序及凝膠成像觀察同上，省略。序列表 <110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120〉辣椒疫霉果膠甲基酯酶,c/M;e l基因序列
<160>3
<210〉1
<211>1038
<212>DNA
<213〉辣椒疫霉(Phytophthora capsici)
<220>
<221>CDS
<222>(1) ... (1038)
<400>1
"gcgcgtcttcgctcttcctctcgtagtgctcgccacgtttatctcaagctcagtcgga60
tacgcttgcaccggacccaacactcga^ctC6LgCCCCCSLCccggagcceitcgtcgtcgac120
gccactggagctUc3gcggaagttaccgta"gUtcggaagca^ttgcg組gtgccc180
aacacgacggagcagcacactgtcttcctattccctggtgtgUccgtgagcaggtgctc240
atttccaagttga汪cggtccgttggtgctccagggctacacgtgtaacacgacatcgtac300
gcttccaacgaggtgacUtC9LCtCaggCCaaggctcagcgetgatattcctcctgaaatc360
accagcggtcgcaacgacctgaccagtacgctgcgtctcaagaccaataacatgagactg420
tacaacctcaacatcgccaacaicagccggc￡Lgg€LCggCC￡Lagctgttgcc480
accatcattgaaggUacaactacggcttctacgcctgcaacttcactggatatcaggac540
actgtgtacgctaataagggtcgtgaactctttgccetagtCgt3LC8LttgCtggagccgtc600
gactttgtcttcggtacc^ggccgaagcgtggtttgaatcttgcgatattgagacggtg660
ggcgaaggcgccattactgctaatggccgtgtg獄gagtccagtccgtccttctacgtc720
ttcaacaacgcacgtgtcttcggU識(shí)gtgg固tgg"ccgcctatctgggccgtcca780
tggcgtccgt汪ctcgcgcgttgtgtggcagaacagtg^cttggagatgtcattaatccg840
gaaggttggcagttgtggaacaacgacaacaacacggctaatgtgtttUcaaggagttc900
a3caaccgaggccctggtgctgctacggataagcgtgtgtcttttagtgg960
gctcccgtgccUtcacggaaatcctcggtggcaactteacg獄gagtggtttgttgac1020
accacttacctttggtag1038
<210>2 <211〉17 <212>腿 <213>人工序列
10<400>2
ccctggtgtg taccgtg 17
<210>3
<211>20
<212>腿
<213>人工序列
<400>3
tgttaccttc .aatgatggtg 20
權(quán)利要求
1.利用辣(甜)椒疫霉菌果膠甲基酯酶Pcpme 1基因設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)驗(yàn)證其特異性和靈敏度，然后對(duì)辣椒病田土壤、病莖、病葉及病果中的辣椒疫霉進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)與預(yù)警。本技術(shù)發(fā)明可對(duì)不同時(shí)期的辣椒疫霉及其致病特性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)與預(yù)警。這對(duì)特異性引物，上游引物為1RTF，含17bp，其序列為SeqID No2所示；下游引物為1RTR，含20bp，其序列為Seq ID No3所示。該對(duì)特異引物擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為287bp。
2. —種辣椒疫霉菌果膠甲基酯酶？c/^e l基因分子檢測(cè)技術(shù)的制備方法，其步驟如下1) 從辣椒疫霉中分離克隆尸me基因和靶標(biāo)戶c/7/z/e 1基因界定的具體步驟省略 基因分離克隆和靶標(biāo)基因界定步驟已在前一發(fā)明專利中詳述，故在本發(fā)明中不再詳述，其,c; 邊e 1基因全序列如Seq ID No: 1所示。2) A^邁e l基因特異引物設(shè)計(jì)與合成(l)引物設(shè)計(jì)利用DNAMAN對(duì)辣椒疫霉等疫霉種菌，曲霉等真菌，番東等植物，胡蘿卜 歐式桿菌等細(xì)菌及其他能征集到的所有果膠甲基酯酶基因序列進(jìn)行比對(duì),設(shè)計(jì)并合成,c，，e 1 基因的特異性引物。2) ,c/ z/e l基因特異性引物驗(yàn)證(1) 參試種菌制作與菌體收集；(2) 參試種菌DNA提??；(3) 特異性引物對(duì)參試種菌DNA的PCR擴(kuò)增；(4) 擴(kuò)增結(jié)果比較分析。3) 戶cp邁e l基因特異引物靈敏度驗(yàn)證(1) 辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子DNA提取。(2) 土壤卵孢子DNA提取及純化。(3) 分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(4) 綜合比較分析，檢驗(yàn)入選引物的靈敏度。4) 入選特異引物對(duì)辣椒疫病莖、病果、病葉檢測(cè)(1) 病莖、病葉、病果的DNA提取。(2) 入選特異引物對(duì)不同模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3) 綜合比較不同病組織PCR檢測(cè)結(jié)果，確定入選引物對(duì)辣椒疫病組織的檢測(cè)技術(shù)。5) 、入選引物對(duì)病田土壤、病莖、病果、病葉辣椒疫霉菌的分子檢測(cè)(1) 分別提取辣椒疫霉病田土壤菌體、病莖、病果、病葉DNA。(2) 對(duì)不同模板的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較對(duì)不同來(lái)源辣椒疫霉菌的檢測(cè)效果。(3) 綜合比較入選特異引物對(duì)不同來(lái)源辣椒疫霉菌的PCR檢測(cè)結(jié)果，正確預(yù)警辣椒疫 霉菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和疫情發(fā)展趨勢(shì)。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，利用辣(甜)椒疫霉菌果膠甲基酯酶Pcpme 1基因設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR對(duì)多個(gè)參試種菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，然后對(duì)土壤辣椒疫霉卵孢子和游動(dòng)孢子進(jìn)行定量分子檢測(cè)，驗(yàn)證其靈敏度，在此基礎(chǔ)上，對(duì)辣椒病田土壤、病莖、病葉及病果中的辣椒疫霉菌進(jìn)行定性、定量分子檢測(cè)與預(yù)警。應(yīng)用該技術(shù)發(fā)明可對(duì)不同時(shí)期的辣椒疫霉菌及其致病特性進(jìn)行檢測(cè)與預(yù)警，便于制定綜合防控技術(shù)策略，確定選擇最佳防控時(shí)期對(duì)辣椒疫霉菌進(jìn)行綜合防控和高效治理，真正從源頭上控制病菌的侵染與危害，提高辣(甜)椒疫霉病綜合防控的效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101643783SQ200910018359
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者張修國(guó) 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)