專利名稱：一種改進(jìn)的gfp表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
綠色熒光蛋白(GFP)是從水母體內(nèi)分離獲得的一種發(fā)光蛋白，吸收藍(lán)光，發(fā)綠光，且 不需光發(fā)射輔因子。由于GFP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)定、熒光顯微鏡又容易檢測(cè)，因此GFP已 是常用的標(biāo)記分子，是目前分子生物學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家用于目的蛋白示蹤和定量的最有用 的研究工具。但對(duì)表達(dá)GFP的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)固定(常用的固定液有70%乙醇、4%多聚甲醛、 丙酮、甲醇等)、核酸變性(甲酰胺、鹽酸)、多重染色后，GFP信號(hào)明顯減弱，甚至無法檢 測(cè)。圖像結(jié)果往往需要進(jìn)行后期處理。
BrdU是用于標(biāo)記增殖分裂的細(xì)胞，屬于DNA結(jié)合型熒光染料，其基本原理是利用溴化脫 氧尿嘧啶(BrdU)作為胸苷類似物可以摻入到新增殖細(xì)胞合成DNA中。BrdU會(huì)隨著細(xì)胞分裂 而不斷被"稀釋"，以至于最終完全不能檢出，因而不適合做長(zhǎng)時(shí)期的體內(nèi)標(biāo)記追蹤。其主 要優(yōu)點(diǎn)是抗BrdU抗體與BrdU反應(yīng)后顯色可即刻顯現(xiàn)標(biāo)記的情況，其缺點(diǎn)細(xì)胞分裂時(shí)標(biāo)記強(qiáng) 度降低或標(biāo)記丟失，增殖的細(xì)胞逐漸降低細(xì)胞BrdU標(biāo)記。因此，BrdU適用于短期標(biāo)記增殖 的細(xì)胞。
DAPI， 4，，6—diamidino-2—phenyl indole, dihydrochloride (DAPI)，中文名稱是4， 6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚，是一種常用的顯現(xiàn)活細(xì)胞或固定細(xì)胞DNA的熒光染料，其作用機(jī)理與 溴化乙錠等染色劑的機(jī)理類似它們與DNA雙螺旋的凹槽部分可以發(fā)生相互作用，從而與DNA 的雙鏈緊密結(jié)合。沒結(jié)合DNA的DAPI熒光很弱，而一旦和DNA結(jié)合，表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光。 并且對(duì)細(xì)胞相對(duì)無毒，不改變細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而 散射峰是461nm，正好UV (紫外光)的激發(fā)波長(zhǎng)正好是356nm，使得DAPI成為了一種常用的 熒光檢測(cè)信號(hào)。DAPI最大的優(yōu)點(diǎn)就是標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單，而標(biāo)記效率很高(起初達(dá)100%),標(biāo) 記的細(xì)胞能清楚的觀察到；缺點(diǎn)是細(xì)胞分裂將導(dǎo)致DAPI淬滅，以及收縮蛋白或其它蛋白染 色所造成的強(qiáng)背景色等將引起標(biāo)記強(qiáng)度降低。因此DAPI也僅適于短期定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是改進(jìn)以往的細(xì)胞固定、核酸變性方法及處理時(shí)間，從而達(dá)到各染色結(jié) 果互不干擾，GFP顏色明亮易檢的目的。
針對(duì)上述目的，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法，解決了傳統(tǒng)固定、染色方法處理后GFP顏色減弱的問題，使GFP顏色明亮，易于檢測(cè)；且避免了甲酰胺、 鹽酸酸化等方法步驟繁瑣的缺點(diǎn)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法對(duì)以綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告蛋白的 細(xì)胞進(jìn)行BrdU摻入染色和DAPI復(fù)染，然后常規(guī)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。 具體使用時(shí)，可以采用以下步驟
1) 向表達(dá)GFP的細(xì)胞內(nèi)加入BrdU至終濃度30 u g/ml， 37'C培養(yǎng)條件下標(biāo)記0。 5 3h (視細(xì)胞增殖能力而定)；
2) 以Hank's液配制0.1%甲醛(體積濃度)，培養(yǎng)條件下固定細(xì)胞10 12h;
3) Hank's液沖洗3次，每次5 min;
4) 0.2%TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用20min;
5) 用Hank's液沖洗3次，每次5 min;
6) 100U/ml DNase I (DNA酶)，室溫處理5min;
7) TBS沖洗3次，每次5min;
8) 室溫封閉液封閉lh;
9) 加入抗BrdU—抗，4'C濕盒中過夜；
10) TBS沖洗3次，每次5 min;
11) 加入二抗，37。C孵育30min;
12) TBS沖洗3次，每次5min;
13) 加入DAPI，室溫2min;
14) TBS沖洗3次，每次5min;
15) 防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。 所述培養(yǎng)條件是指5%<:02、飽和濕度、溫度37'C。
所述Hank's液的pH在7.2 7.4,其中各物質(zhì)的濃度為5.4mmol/L KC1， 0.3mmol/L Na2HP04， 0.4mmol/L KH2P04， 4.2腿ol/L NaHC03, 1.3腿ol/L CaCl2， 0.5mmol/L MgCl2， 0.6mmol/LMgSO4， 137腿ol/LNaCl， 5.6mmol/L D-葡萄糖。
所述TBS的pH為7.6，其中各物質(zhì)的濃度為150mmol/LNaCl,20mmol/LTris.Cl。
所述封閉液為正常血清，為本領(lǐng)域中所常用，可以視二抗來源確定。 采用本發(fā)明的方法檢測(cè)表達(dá)GFP的細(xì)胞，其GFP顏色保持鮮亮，信號(hào)強(qiáng)度較培養(yǎng)狀態(tài) 下無明顯改變，徹底解決了傳統(tǒng)固定、染色方法處理后GFP顏色減弱的問題，使GFP顏色明亮，易于檢測(cè)和后續(xù)多重標(biāo)記，且避免了甲酰胺變性、鹽酸酸化等方法步驟繁瑣的缺點(diǎn)。 本發(fā)明方法適用于多種細(xì)胞，并可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多種后續(xù)標(biāo)記。結(jié)果可分析以GFP為
報(bào)告蛋白的目的基因的轉(zhuǎn)染率以及目的基因?qū)?xì)胞增殖的影響及相關(guān)抗原檢測(cè)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，操作簡(jiǎn)單，避免了常規(guī)固定方法和甲酰胺變性、鹽酸酸化等對(duì)
GFP的影響，可以更好的保持GFP的熒光信號(hào)。本發(fā)明將BrdU摻入染色、DAPI復(fù)染與GFP
表達(dá)細(xì)胞相結(jié)合，GFP信號(hào)仍能保持到與培養(yǎng)條件相當(dāng)強(qiáng)度，取得了意想不到的效果，有創(chuàng)造性。


圖1為轉(zhuǎn)染腺病毒細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)GFP;
圖2為常規(guī)固定、染色后所得GFP圖片與本發(fā)明的方法所得GFP亮度圖片的比較B為 常規(guī)固定、染色后所得GFP圖片，C為本發(fā)明的方法所得GFP亮度圖片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作逬一步的說明
實(shí)施例對(duì)GFP表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行增殖檢測(cè)，步驟如下
1) 向表達(dá)GFP的細(xì)胞內(nèi)加入BrdU至終濃度30 H g/ml， 37"培養(yǎng)條件下?lián)饺雔h;
2) 以Hank's液配制0.1%甲醛(體積濃度)，培養(yǎng)條件下固定細(xì)胞12h;
3) Hank's液沖洗3次，每次5 min;
4) 0.2°/。TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用20min;
5) 用Hank's液沖洗3次，每次5 min;
6) 100U/mlDNase I (DNA酶)，室溫處理5min;
7) TBS沖洗3次，每次5 min;
8) 正常山羊血清室溫封閉lh;
9) 加入抗BrdU—抗，4。C濕盒中過夜；
10) TBS沖洗3次，每次5min;
11) 加入羊抗小鼠二抗(羅丹明標(biāo)記)，37'C孵育30min;
12) TBS沖洗3次，每次5min;
13) 加入DAPI，室溫2min;
14) TBS沖洗3次，每次5min;
15) 防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。 所述培養(yǎng)條件是指5%<:02、飽和濕度、溫度37'C。所述Hank's液的pH在7.2 7.4,其中各物質(zhì)的濃度如下；5.4mmol/L KC1， 0,3mmol/L Na2HP04， 0.4mmol/L KH2P04， 4.2mmol/L NaHC03 ， 1,3隨ol/L CaCl2， O.5mmol/L MgCl2， 0.6mmol/LMgSO4, 137mmol/LNaCl， 5.6鍾ol/L D-葡萄糖。
所述TBS的pH為7.6，其中各物質(zhì)的濃度為150mmol/LNaCl， 20mmol/LTris.Cl。 本實(shí)施例中表達(dá)GFP的細(xì)胞為攜帶GFP的兔血管外膜成纖維細(xì)胞。 顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示，由圖可見，進(jìn)行BrdU、 DAPI標(biāo)記后，GFP顏色保持鮮亮， 信號(hào)強(qiáng)度較培養(yǎng)狀態(tài)下無明顯改變。
另外對(duì)GFP表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)固定、染色、封片、顯微鏡觀察，得到GFP圖片作為對(duì) 照，與經(jīng)本發(fā)明的方法處理后得到的GFP圖片對(duì)比(如圖2所示)。由圖可見，經(jīng)本發(fā)明的 方法處理后得到的GFP圖片中GFP顏色鮮亮，信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)，圖像結(jié)果無需進(jìn)行后期處理， 且各染色結(jié)果互不干擾。
本發(fā)明與常規(guī)方法相比，其不同點(diǎn)如表l所示
表l
常規(guī)方法本發(fā)明的方法
固定劑4%多聚甲醛 (配制繁瑣且4'C不能超過1周)0.1%甲醛
固定時(shí)間20-40 min10-12 h
固定條件室溫37 °C
常規(guī)條件培養(yǎng)條件
BrdU暴露1NHC1冰上lOmin 2NHC1室溫20min (HC1需現(xiàn)用現(xiàn)配)甲酰胺IOO'C變性5min 冰浴冷卻 (操作復(fù)雜)DNasel室溫5min
GFP顏色損失保持
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法，其特征在于對(duì)以綠色熒光蛋白作為報(bào)告蛋白的細(xì)胞進(jìn)行BrdU標(biāo)記檢測(cè)和DAPI復(fù)染，然后常規(guī)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法，其特征在于具體步驟如下1) 向表達(dá)GFP的細(xì)胞內(nèi)加入BrdU至終濃度30yg/ml， 37'C培養(yǎng)條件下?lián)饺?, 5 3h;2) 以Hank's液配制0.1%甲醛，培養(yǎng)條件下固定細(xì)胞10 12h;3) Hank's液沖洗3次，每次5 min;4) 0.2。/。Triton X-100作用20 min;5) Hank's液沖洗3次，每次5 min;6) 100U/mlDNase I ，室溫處理5min;7) TBS沖洗3次，每次5min;8) 室溫封閉液封閉lh;9) 加入抗BrdU—抗，4'C濕盒中孵育過夜；10) TBS沖洗3次，每次5min;11) 加入二抗，37'C孵育30min;12) TBS沖洗3次，每次5min;13) 加入DAPI,室溫2min;14) TBS沖洗3次，每次5min;15) 防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法，其特征在于所述培養(yǎng)及固定條件是指5%<202、飽和濕度、溫度37'C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法，其特征在于所述Hank's液的pH在7.2 7.4,其中各物質(zhì)的濃度為5.4mmol/LKCl， 0。3mmol/LNa2HPO4,0.4mmol/LKH2PO4， 4.2mmol/LNaHC03， 1.3mmol/LCaCl2, 0.5mmol/LMgCl2， 0.6匪ol/LMgS04， 137mmol/LNaCl， 5,6mmol/LD-葡萄糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法，其特征在于所述TBS的pH為7.6，其中各物質(zhì)的濃度為150mmol/LNaCl,20mniol/LTris'Cl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法對(duì)以綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告蛋白的細(xì)胞進(jìn)行BrdU摻入染色和DAPI復(fù)染，然后常規(guī)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。采用本發(fā)明的方法檢測(cè)表達(dá)GFP的細(xì)胞，其GFP顏色保持鮮亮，信號(hào)強(qiáng)度較培養(yǎng)狀態(tài)下無明顯改變，徹底解決了傳統(tǒng)固定、染色方法處理后GFP顏色減弱的問題，使GFP顏色明亮，易于檢測(cè)和后續(xù)多重標(biāo)記，且避免了甲酰胺變性、鹽酸酸化等方法步驟繁瑣的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101643780SQ20091001823
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月1日
發(fā)明者王旭平 申請(qǐng)人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院