專利名稱：：用于治療心力衰竭的rna干擾的制作方法用于治療心力衰竭的RNA干擾發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體涉及治療心臟疾病的方法，并且更具體地，涉及使用RNAi降低受磷蛋白(PLB)以治療慢性心力衰竭的方法，包括通過靶向AAV9載體腺伴隨病毒(AAV)遞送，和診斷對慢性心力衰竭的RNAi治療的易感性的方法。背景信息心力衰竭目前影響超過兩百萬美國人，并且其經(jīng)濟和人員損失將隨著人口的老齡化而繼續(xù)增加。對于65歲和以上的患者，充血性心力衰竭是最常見的住院患者診斷，每年報道超過400，000新病例。預(yù)后差，5年內(nèi)死亡率60%，并且23-52%的死亡可歸因于致死性心律失常(心源性猝死；S⑶)。心力衰竭是心輸出量不能滿足生理需求。因此心力衰竭不是特殊病，而是代表大多數(shù)心臟疾病的終點的綜合征，所述心臟疾病包括缺血性心臟病、心肌疾病(舒張性、限制性、或肥大性)、瓣膜性心臟病以及慢性高血壓和糖尿病。另外，在如急性心肌梗死、心臟手術(shù)后(心肌頓抑、心肌冬眠(hybernation))或再血管化治療后(即再灌注損傷、溶栓后、經(jīng)皮穿刺冠狀動脈成形術(shù)或冠狀動脈旁路移植術(shù))的情形中，心力衰竭的癥狀也可急性呈現(xiàn)(即急性心力衰竭、或心源性休克)。降低的收縮性是充血性心力衰竭的關(guān)鍵特征，而儲存心肌細胞中的鈣的肌質(zhì)網(wǎng)(SR)在心臟收縮性以及興奮和收縮的偶聯(lián)中起關(guān)鍵作用。收縮性力的形成依賴于SR中積累的Ca2+的量。肌質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶(SERCAa)豐度的增加或受磷蛋白(PLB)磷酸化的增加和/或PLB豐度的降低可促進SR的Ca2+攝取的增加，由此增強心肌細胞的收縮性。PLB是53氨基酸、肌肉特異性磷蛋白。去磷酸化的PLB與SERCA2a結(jié)合并調(diào)節(jié)進入心臟組織的SR中的鈣的量。當(dāng)被蛋白激酶A磷酸化時，SERCA2a的PLB抑制被復(fù)活，增加進入SR的鈣流量和增強肌肉的收縮性。心肌基因治療可用于許多心血管疾病的治療，所述心血管疾病包括缺血性心肌疾病、充血性心力衰竭和惡性心律失常。用于心肌基因遞送的有用載體將允許在直接心肌內(nèi)注射或輸注到冠狀動脈或竇中之后有效和穩(wěn)定地向心肌細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)許多轉(zhuǎn)基因。例如，直接注射到左心室心肌的質(zhì)粒DNA載體已被鄰近注射區(qū)域的心肌細胞表達6個月。然而，此方法的治療有用性受到心肌細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低(注射區(qū)域中0.1%至1.0%的心肌細胞)的限制。復(fù)制缺陷型腺病毒(RDAd)載體的心肌內(nèi)注射和冠狀動脈內(nèi)輸注兩種方法已被用于在體內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)嚙齒動物、兔和豬中的心肌細胞。然而，腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的可行性受到對病毒和外源轉(zhuǎn)基因蛋白的免疫應(yīng)答的限制，所述免疫應(yīng)答引起嚴(yán)重的心肌炎癥，感染30天內(nèi)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的消除，并由此造成在免疫活性宿主中短暫的重組基因表達。發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)缺陷的心臟Ca2+穩(wěn)態(tài)而治療嚴(yán)重心力衰竭的靶向RNAi，所述調(diào)節(jié)是經(jīng)由使用腺伴隨病毒(AAV)轉(zhuǎn)染心肌細胞來降低受磷蛋白(PLB)的表達。該方法還涉及使用所公開的方法在受治療者中降低室性心律失常、以及全面改善心力衰竭的存活。此外，本發(fā)明提供可用于診斷對RNAi治療的易感性的方法，并包括基本上由降低PLB活性的RNAi組成的藥物組合物、試劑盒和載體同樣地，本發(fā)明提供用于治療受治療者的心力衰竭的方法。該方法包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用包括RNAi表達盒的載體，其中所述盒包含其表達產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)活性的RNAi序列，所述載體的施用是以與施用載體之前相比，有效治療所述受治療者的心力衰竭和改善所述受治療者的收縮功能的量。在一種實施方案中，所述載體是病毒體。在另一種實施方案中，所述載體是質(zhì)粒。在另一種實施方案中，所述病毒體是細小病毒。在另一種實施方案中，所述細小病毒是腺伴隨病毒(AAV)，包括AAV血清型9。在又一種實施方案中，所述RNAi表達盒包括SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。在相關(guān)的實施方案中，SEQIDNO:1的側(cè)翼為AAV末端重復(fù)序列。在另一種實施方案中，PLB基因表達被抑制至少10%。在另一種實施方案中，所述RNAi序列包括SEQIDNO:2所列的靶序列。同樣地，所述RNAi表達盒編碼至少一個RNA，包括在嚴(yán)格條件下與PLB基因的核苷酸序列雜交的第一核苷酸序列，和為所述第一核苷酸序列的互補反向重復(fù)序列并與所述第一核苷酸序列雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的第二核苷酸序列。在一種實施方案中，所述兩種核苷酸序列通過RNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接。在另一種實施方案中，所述受治療者是哺乳動物，諸如人類。本發(fā)明進一步提供藥物組合物，該藥物組合物包括重組的腺伴隨病毒(AAV)載體和藥學(xué)可接受的載運體，其中所述載體包含其RNA表達產(chǎn)物導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)的表達和/或活性的降低的RNAi表達盒。在一種實施方案中，所述RNAi表達盒的RNA表達產(chǎn)物包括在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件包括但不限于，在42°C下在包含50%甲酰胺、5xSSC和SDS的溶液中雜交，并在65°C下在包含0.2xSSC和0.SDS的溶液中清洗。在另一種實施方案中，所述RNAi表達盒包括SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。在另一種實施方案中，所述RNA表達產(chǎn)物包括SEQIDN0:2所列的靶序列。在另一種實施方案中，所述組合物適于靜脈內(nèi)施用、動脈內(nèi)施用、心室內(nèi)施用、或心瓣膜灌注。本發(fā)明還提供一種腺病毒伴隨病毒(AAV)載體，該載體包括至少一個AAV末端重復(fù)序列，其中所述載體包含其RNAi表達產(chǎn)物導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達或PLB活性降低的RNAi表達盒。在實施方案中，所述RNAi表達盒的RNA表達產(chǎn)物包括在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在另一種實施方案中，所述RNAi表達盒包括SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。在另一種實施方案中，所述RNA表達產(chǎn)物包括SEQIDNO:2所列的靶序列。本發(fā)明還提供增加肌質(zhì)網(wǎng)(SR)的鈣攝取的方法。該方法包括使肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包括編碼RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列，由此增加SR中的鈣攝取，并與和載體接觸之前的收縮性相比增強心肌細胞的收縮性。在一種實施方案中，所述RNAi包括在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在另一種實施方案中，所述載體包括SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。在另一種實施方案中，所述RNAi包括SEQIDNO:2所列的靶序列。在另一種實施方案中，所述RNAi表達盒的RNA編碼區(qū)造成PLB基因的表達下調(diào)。在另一種實施方案中，所述RNAi載體包括與PLB靶基因的RNA編碼區(qū)具有至少約90%同一性的序列。本發(fā)明進一步提供試劑盒，該試劑盒包括腺伴隨病毒(AAV)載體，其中所述載體包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達或PLB活性降低的RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列，一種或多種緩沖液，使用這些組成部分的說明，和包含這些組成部分的容器。在實施方案中，所述RNAi包括在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明還提供診斷受治療者對所述受治療者中的胞內(nèi)鈣失調(diào)所致的慢性心力衰竭(HF)的RNAi治療的易感性的方法。該方法包括使受治療者的肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包括編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達或活性降低的RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列，和確定所述肌肉組織樣品與AAV載體接觸之前和之后所述組織樣品中鈣ATP酶泵(SERCA)的活性，其中SERCA活性的增加與受治療者對HF的RNAi治療的易感性相關(guān)。本發(fā)明還提供改善具有慢性心力衰竭的受治療者的存活的方法。該方法包括施用腺伴隨病毒(AAV)載體，其中所述載體包括編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達降低和細胞中的PLB蛋白的量減少的RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列，并且所述RNAi包括在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在一種實施方案中，所述載體改善收縮功能，由此改善受治療者的存活。在另一種實施方案中，所述AAV是血清型9。本發(fā)明還提供降低受治療者的室性心律失常的方法。該方法包括施用包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達或PLB活性降低的RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列的病毒體，改善心室功能，由此降低所述受治療者的室性心律失常。在一種實施方案中，所述病毒體是AAV9。附圖簡述圖IA是顯示Northern印跡圖的圖像圖示，所述Northern印跡圖展示在開發(fā)用于心力衰竭(HF)治療的RNA干擾(RNAi)載體中通過不同載體的靶向沉默。所示為原代月Jl^ffllfi(primaryneonatalratcardiomyocyte,PNCM)ψshRNA靶向沉默效力。分別在用在泳道上方給出的以顆粒/細胞(p/c)計的劑量的相應(yīng)載體治療后5天(上面部分)或10天(下面部分)收獲細胞。然后使用大鼠PLB-特異性探針進行Northern印跡。為了確保等量的RNA上樣，剝離印跡并使其與β-肌動蛋白-特異性探針重新雜交。泳道1至18顯示基于腺伴隨病毒(AAV)的載體AAV-shPLB(泳道1_6)、AAV-shPLB-CMV-β-內(nèi)含子(泳道7-12)和AAV-shPLB-CMV-GFP(泳道13-18)的RNAi-介導(dǎo)的PLB-mRNA下調(diào)的劑量依賴性。泳道19-24顯示引起用AAV_shGFP治療后的PLB-mRNA表達的非特異性shRNA的對照，其產(chǎn)生shRNA序列靶向的綠色熒光蛋白(GFP)(泳道19-24)。為了與AAV進行比較，使用了腺病毒載體AdV-shPLB(泳道25-28)。至第10天，>98%的PLB-mRNA被4xl03p/c的最低劑量的rAAV_shPLB除去(泳道1，2)，類似于AdV-shPLB(泳道25-28)。在rAAV-shPLB載體中并入CMV-GFP表達盒(泳道7_12)以向此載體提供被體內(nèi)成像易于檢測的標(biāo)簽，導(dǎo)致感染細胞中的強GFP表達(未顯示)，但意外地消除了其PLB基因沉默效應(yīng)。并入CMV-β-內(nèi)含子盒(泳道12-18)具有相似但較不顯著的效應(yīng)。圖IB是顯示圖IA的載體產(chǎn)生的細胞shRNA水平的圖形圖示。在CMV-GFP盒存在下，shPLB產(chǎn)生被消除(泳道13-18)，而不具有其它序列的TO-shPLB載體顯示5天(泳道1-3)和10天(泳道4-6)的穩(wěn)定表達。在NRCM中，AdVshPLB在第5天產(chǎn)生非常高的shPLB水平，然后該水平相當(dāng)迅速地下降。圖IC是顯示腺病毒和AAV載體的詳細圖譜的圖像圖示。AAV-shPLB具有與AdV-shPLB和它們對應(yīng)的shGFP對照載體相同的TO_shRNA表達系統(tǒng)。此外，四種含有CMV的載體攜帶盒，CMV-GFP盒或CMV-β-內(nèi)含子盒與TO-shRNA序列處于頭接頭方向，并且它們被牛生長激素(bgH)末端信號隔開。圖ID是圖像和圖形圖示，左圖顯示治療NRCM過程中的PLB蛋白的Western印跡，而右圖顯示加入載體后第3、5和7天的PLB蛋白定量。在第7天，AdV-shPLB和rAAV6_shPLB造成細胞內(nèi)PLB分別下調(diào)至基線的9%和13%。圖IE是顯示以下的圖形圖示與具有與未治療細胞不可分辨的[&2+幾瞬變(transient)的AAV9_shGFP組相比，AAV9_shPLB治療過程中NRCM中的[Ca2Ii瞬變顯示顯著更高的振幅和加快的瞬變動力學(xué)(縮短的TTP和τ)。AdV-shPLB治療還造成比AdV-shGFP對照顯著更高的振幅。與AAV9組相反，AdV-shPLB和AdV_shGFP組的TTP被延長，該組未顯示τ的差異。圖IF是顯示圖IE中所示的[Ca2+]i瞬變的統(tǒng)計評估的圖形圖示。*表示ρ<0.05和**ρ<0.01。圖2Α是說明體內(nèi)RNAi治療HF的方案的流程圖。最初將用于體內(nèi)RNAi治療的動物分成兩組一組為大動脈被綁扎(TAB)的56只動物，第二組是12只進行模擬手術(shù)的動物。在TAB動物中，在心臟RNAi載體轉(zhuǎn)移之前，經(jīng)過25-30周以允許它們形成左心室(LV)舒張和允許縮短分?jǐn)?shù)(FS)下降25%，如通過連續(xù)超聲波心動描記術(shù)所評估的。在經(jīng)歷TAB的初始的56只動物中，40只動物存活，并進一步分組以接受Ad-shGFP(η=10)或Ad-shPLB(η=10)，或?qū)φ蛰d體AAV9-shGFP(n=10)或AAV9_shPLB(η=10)。載體注射經(jīng)由含有200μ1腺病毒GxliTpfu)或AAV9(5X10"載體基因組)載體溶液的22G導(dǎo)管進行。使導(dǎo)管從LV尖前進至主動脈根，在遠離導(dǎo)管位點的一端將主動脈和肺動脈主干夾住40秒鐘并注射溶液。腺病毒載體組在一個月后、AAV載體治療組在三個月后通過超聲波心動描記術(shù)、尖端導(dǎo)管(tipcatheter)、形態(tài)測定法和組織學(xué)進行結(jié)果評估(參見，圖3A-3F)。在AdV組，8/10和9/10的動物在1個月后存活。3個月后，rAAV-shPLB組中9/10的動物存活，rAAV_shGFP組中6/10的動物存活。同時對這些組中心臟表達的微RNA進行了進一步研究。圖2B是顯示i.v.注射表達綠色熒光蛋白的rAAV9_GFP載體(下)或鹽水(上)的大鼠心臟的圖像圖示。注射后一個月，摘除心臟并通過GFP成像顯現(xiàn)，GFP成像顯示在rAAV9-GFP組中有心臟橫截面大致均勻的信號，而在鹽水組中則沒有信號。圖2C是顯示rAAV9-GFP_治療的大鼠的心臟的GFP熒光在一個月時達到90%表面積的概況的圖像圖示。圖2D是顯示向大鼠i.v.注射rAAV9-GFP后一個月不同器官中的GFP免疫組織化學(xué)染色的圖像圖示。但在i.v.注射腺病毒載體(AdV-GFP)后，未在心臟中檢測到GFP(a)，!AAV9-GFP治療造成強烈的GFP表達(b)和(c)，該表達是大致均勻的。少數(shù)區(qū)域全無GFP免疫反應(yīng)性(已圈出)，其他區(qū)域顯示均勻的細胞質(zhì)染色(已圈出)。在一個月的高表達已明顯造成在細胞中穩(wěn)定的GFP的沉淀(箭頭)形成的部位，染色尤其致密，這與RNAi載體產(chǎn)生的shRNA相反。平均70%的心肌細胞是免疫組織化學(xué)陽性的，而個體細胞之間的表達有差異。(e)顯示一部分細胞具有微弱的染色的骨骼肌，而肝顯示僅個別細胞的顯著信號(d)。肺中沒有可見的信號。關(guān)于AAV9分布的進一步數(shù)據(jù)在圖2J中給出，其中GFP通過Western印跡分析定量，記錄心臟的rAAV9_GFP表達的最高親和性。肝和骨骼肌顯示低表達，而肺僅顯示非常微弱的表達。圖2E是顯示i.v.注射rAAV9_GFP后1周和4周的肝蘇木精-曙紅染色的圖像圖示，顯示無毒性證據(jù)。rAAV-shRNA載體也未造成肝毒性。圖2F是顯示Northern印跡圖的圖像圖示，所述Northern印跡圖展示，與shGFP對照組相比，AdV-shPLB治療后1個月和rAAV9-shPLB治療后3個月的心臟PLB蛋白顯著減少。NCX和GAPDH蛋白保持不變。與模擬(sham)組相比，處于心力衰竭的shGFP組中SERCA2a降低，而兩個shPLB組的SERCA2a均顯著增加。圖2G是顯示不同治療組的Western印跡的統(tǒng)計評估的圖形圖示。*表示與AdV-shGFP相比ρ<0.05，#表示與rAAV9-shGFP相比ρ<0.05。圖2Η是顯示靜脈內(nèi)rAAV9_GFP注射后一個月的心臟GFP表達的圖像圖示。左側(cè)的四個圖(rAAV9-GFP)顯示有初級GFP抗體，而右側(cè)的兩個圖(對照)顯示沒有。關(guān)于AAV9分布的進一步數(shù)據(jù)證明心臟的rAAV9-GFP表達的最高親和性。肝和骨骼肌顯示低表達，而肺僅顯示非常微弱的表達。圖21是顯示靜脈內(nèi)rAAV9-GFP注射后1個月其他器官中的GFP表達的圖像圖示。左側(cè)的圖(RAAV9-GFP)顯示有初級GFP抗體，而右側(cè)圖(對照)顯示沒有。圖2J是顯示靜脈內(nèi)rAAV9_GFP注射后不同器官中通過免疫印跡的GFP定量的圖像和圖形圖示。圖3A是展示RNAi治療對HF的功能和形態(tài)效應(yīng)的系列圖形圖示。其中總結(jié)了RNAi治療對舒張期LV功能的血液動力學(xué)參數(shù)的影響。與shGFP對照(泳道2，4)相比，TAB后大鼠中高LV充盈壓(LVEDP)被shPLB載體顯著降低(泳道3，5)。最大壓力下降速率(maximalrateofpressurefall)(-dP/dt)以及等容松弛時間常數(shù)(isovolumetricrelaxationtimeconstant)Tau被shPLB治療顯著增加。rAAV-shPLB治療(泳道5)后3個月值被恢復(fù)到正常范圍(泳道1)。圖3B是顯示與圖3A類似的對收縮期LV功能的治療效應(yīng)的圖形圖示。超聲波心動描記術(shù)顯示rAAV-shPLB治療后3個月的標(biāo)準(zhǔn)化的縮短分?jǐn)?shù)(FS)，而AdV-shPLB的FS改善雖然是明顯的，但較不顯著。與對照相比，最大壓力上升速率(maximalrateofpressurerise)(+dP/dt)以及收縮期壓力(LVSP)得到改善。圖3C是顯示死后形態(tài)測定法的系列圖形圖示，顯示TAB誘導(dǎo)的顯著的LV肥大(泳道2，4)，1^重量和1^/體重(1^/81)比2/3三分之一高于基線(thirdsabovebaseline)(泳道1)。后者在用AdV-shPLB或rAAV9-shPLB(泳道3、5)治療1或3個月后被降低至正常的范圍內(nèi)。兩種載體類型均顯著減低心臟肥大。圖3D是總結(jié)心臟形態(tài)學(xué)的超聲波心動描記術(shù)數(shù)據(jù)的系列圖形圖示，這與確證形態(tài)測定發(fā)現(xiàn)的圖3C相似。圖3E是顯示RNAi治療后的HF動物中的心臟膠原蛋白含量的圖形圖示。3個月時，rAAV9-shRNA治療造成顯著降低的纖維化。對照載體則無效果。圖3F是顯示兩種治療模式均誘導(dǎo)心肌細胞直徑的顯著下降的圖形圖示。圖3G是顯示RNAi治療過程中心臟BNPmRNA水平的圖形圖示。.表示對于AAV9-shGFP比AAV9_shPLB，ρ<0.05；11表示對于AdV-shGFP比AdV-shPLB，ρ<0.05圖4Α是顯示RNAi治療過程中細胞微RNA的評估的系列圖形圖示。如所示的，在用稍后將用于體內(nèi)治療的載體(AAV-shPLB、AAV—shGFP、AdV-shPLB)進行治療的過程中，與未治療的PNCM相比，五種心臟表達的微RNA(miR)的細胞水平未發(fā)生變化，而含有CMV啟動子的載體改變了這些水平。圖4B是顯示以下的系列圖形圖示與在標(biāo)準(zhǔn)PNCM的培養(yǎng)條件下獲得的圖4A的數(shù)據(jù)相反，在肥大誘導(dǎo)藥物存在下，細胞miRNA水平發(fā)生顯著改變。圖4C是顯示RNAi治療過程中的心臟miRNA_l和miRNA_133水平的系列圖形圖示。J表示對于AAV9-shGFP比AAV9_shPLB，ρ<0.05；1表示對于AdV-shGFP比AdV-shPLB，ρ<0.05。圖5A是顯示CMV啟動子對shRNA產(chǎn)生的干擾的圖形圖示。如所示的，除了圖IA和IB中分析的不同AAV載體之外，還直接比較了載體AAV-ShPLB-CMF-GFP(具有功能性GFP盒)與AAV-shPLB-GFP(無CMV啟動子)，以及AAV-shPLB_CW-β-內(nèi)含子與AAV-shPLB-β-內(nèi)含子(無CMV)。圖5Β是顯示與AAV6shPLB-CMF-GFP標(biāo)記載體孵育后第5天培養(yǎng)的心肌細胞單層的圖像圖示，符合AAV6假型的非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。圖5C是表明在從MCV經(jīng)由終止信號通讀至極短的shRNA序列中U6-shPLB_bGH方向上擾亂的shRNA產(chǎn)生的可能原因的圖像圖示，隨后其影響了介導(dǎo)RNAi的短發(fā)夾的正確形成。圖5D是顯示RNAi治療過程中NRCM中的鈣穩(wěn)態(tài)變化的系列圖形圖示。圖5E是顯示RNAi治療過程中NRCM中的鈣穩(wěn)態(tài)變化的系列圖形圖示。圖6是顯示具有心力衰竭并用AAV9/PL_RNAi治療的大鼠中改善的存活的圖形圖示。其顯示與使用單獨的載體或具有GFP的載體的對照相比，通過使用AAV9/PL-RNAi的表達的RNAi基因轉(zhuǎn)移的受磷蛋白抑制對具有轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ叩膲毫^大性肥大的大鼠的存活的效應(yīng)。圖7是顯示豬缺血性再灌注模型中降低的室性心律失常結(jié)果的圖形圖示。與使用GFP的對照載體相比，該實驗使用AAV9/PL-RNAi的表達。圖8是顯示豬缺血性再灌注模型中改善的心室功能結(jié)果的圖形圖示。與使用單獨的載體或具有GFP的載體的對照相比，該實驗使用AAV9/PL-RNAi的表達。發(fā)明詳述在描述本發(fā)明組合物、方法和治療方法之前，應(yīng)理解，此發(fā)明不限于所述的特定組合物、方法和實驗條件，因為此類組合物、方法和條件可進行變化。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語僅是為了描述特定實施方案的目的，而不意圖為限制，因為本發(fā)明的范圍將僅在所附權(quán)利要求中限制。如本說明書和所附權(quán)利要求中所用，除非上下文另外清楚地指明，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如，“該方法”的含義包括在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開等等之后將變得明顯的一種或多種方法和/或本文所述類型的步驟。除非另外指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與此發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。雖然與本文描述的方法和材料相似或等價的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或檢驗，但是現(xiàn)在描述非限制性方法和材料。除非另外說明，本發(fā)明的實踐將利用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法。此類技術(shù)在文獻中有詳盡說明，參見，如Sambrook等人MolecularCloning=ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)(現(xiàn)行版)；DNACloning:APracticalApproach(DNA克隆實用方法)，第I&II卷(D.Glover,編輯)；OligonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成)(N.Gait編輯，現(xiàn)行版)；NucleicAcidHybridization(核酸雜交)(B.Hames&S.Higgins編輯，現(xiàn)行版)！TranscriptionandTranslation(轉(zhuǎn)錄和翻譯)(B.Hames&S.Higgins編輯，現(xiàn)行版)；CRCHandbookofParvoviruses,(CRC細小病毒手冊)，第I&II卷(P.Tijessen編輯)；FundamentalVirology(基礎(chǔ)病毒學(xué))，第2版，第I&II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe編輯)。本發(fā)明成功展示了使用與心臟Ca2+穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物PLB互補的RNAi治療受治療者中的心力衰竭(HF)。合成的小干擾RNA介導(dǎo)RNAi，但是它們的體內(nèi)使用受到在血漿中不穩(wěn)定和進入靶細胞的低轉(zhuǎn)移的限制。申請人已展示，腺病毒短發(fā)夾RNA載體(AdV-shRNA)沉默心肌細胞(PNCM)中的PLB，并在體內(nèi)改善HF動物的血液動力學(xué)。申請人還開發(fā)了攜帶RNAi的向心臟的腺伴隨病毒(AAV)載體，其實現(xiàn)了心臟功能的恢復(fù)、心臟舒張和肥大的逆轉(zhuǎn)，并改善了存活。在PNCM中，苯腎上腺素誘導(dǎo)的肥大相關(guān)的微RNA失調(diào)被所述RNAi載體校正。除了它們對收縮功能的效應(yīng)外，RNAi靶向改變微RNA水平，由此在不存在血液動力學(xué)因子或神經(jīng)體液活化下直接改變細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄程序。在一種實施方案中，公開了治療心力衰竭的方法，包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用治療有效量的RNAi表達盒，其中所述盒包括病毒體載體和其表達產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)的表達和/或活性的RNAi序列，所述施用以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)所述受治療者的心肌細胞的量進行，由此造成所述RNAi表達盒的表達并治療所述受治療者中的心力衰竭。本發(fā)明公開了通過局部誘導(dǎo)的RNAi治療心臟疾病的策略。HF仍是發(fā)達國家中死亡的主要因素。目前的藥物治療效力有限，而在晚期HF中，左心室輔助設(shè)備或心臟移植是最終的選擇。雖然HF可由多種病因?qū)W引起，但是缺陷的心臟Ca2+穩(wěn)態(tài)已被鑒定為重要的最終共同途徑。衰竭的心臟的機能失調(diào)部分是由于降低的SERCA2a表達和/或PLB磷酸化造成的PLB-控制的肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶泵(SERCA2a)的功能不良(Schmidt等人，AmJPhysiol(1999)277:H474480)。未磷酸化的PLB保持SERCA2a的低Ca2+親和力，造成降低的SRCa2+攝取、緩慢的松弛和降低的SRCa2+負荷，而響應(yīng)于β-腎上腺素能刺激的PLB磷酸化解除這一抑制(MacLennan，D.H.&Kranias，Ε.G.Phospholambanacrucialregulatorofcardiaccontractility(受粦蛋白臟收縮個生的關(guān)鍵i周節(jié)物).NatureReviewsMolecularCellBiology4，566-77(2003))。PLB基因的種系切除(Luo等人，CircRes(1994)75:401-409)、和顯性陰性PLB突變體的體細胞基因轉(zhuǎn)移(Hoshijima等人，MatureMedicine(2002)8:864_871；Iwanaga等人，JClinInvest(2004)113:727_736)、PLB-反義-RNA(Eizema等人，Circulation(2000)1012193-2199；He等人，Circulation(1999)100974-980)、或細胞內(nèi)抑制性PLB抗體被用于增加SERCA2a活性、收縮功能和拯救心力衰竭模型(Dieterle等人，CardiovascRes(2005)67:678_688；Meyer等人，F(xiàn)ASEBJ(2004)181312-1314；Minamisawa,S.等人，Chronicphospholamban-sarcoplasmicreticulumcalciumATPaseinteractionisthecriticalcalciumcyclingdefectindilatedcardiomyopathy(f曼t生蛋白—月JLM網(wǎng)鈣ATP酶相互作用是舒張性心肌病中的關(guān)鍵鈣循環(huán)缺陷.Cell99,313-22(1999))0心肌細胞中由化學(xué)合成的短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的RNAi甚至在體外也顯示低效力和低穩(wěn)定性(Watanabe等人，JMolCellCardiol(2004)37:691_698)。合成siRNA的兩個基本限制是它們在血漿和靶細胞中的快速降解，以及在體內(nèi)實現(xiàn)足夠的轉(zhuǎn)移和靶向的問題。病毒載體具有克服這些限制的潛能。在本發(fā)明中，其他心臟蛋白包括Ca2+調(diào)控蛋白(Ca2+handlingprotein)的表達未發(fā)生改變，表明高度的靶特異性。同樣地，功能表征一系列載體和它們的效力決定因素后，在嚴(yán)重HF的動物模型中沿傳統(tǒng)的腺病毒載體確定了優(yōu)化的細小病毒(即AAV)，并確定了RNAi治療過程中的心肌細胞微RNA(miR)途徑。因此，本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)展示心臟功能的體內(nèi)恢復(fù)以及病理性肥大和擴張的降低。本文使用的術(shù)語“細小病毒”涵蓋細小病毒科(Parvoviridae)，包括自主復(fù)制的細小病毒和依賴病毒。自主細小病毒包括以下屬的成員細小病毒屬(Parvovirus)、紅細胞病毒屬(Erythrovirus)、濃核病毒屬(Densovirus)、重復(fù)病毒屬(Iteravirus)和康特拉病毒屬(Contravirus)。示例性自主細小病毒包括但不限于，小鼠細小病毒、牛細小病毒、犬細小病毒、雞細小病毒、貓全白細胞缺乏癥病毒、貓細小病毒、鵝細小病毒、Hl細小病毒、番鴨(muscovyduck)細小病毒、B19病毒和任何其他細小病毒。其他自主細小病毒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見，如BERNARDN.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒學(xué))，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)。細小病毒科是小的單鏈無包膜DNA病毒科，基因組長大約5000核苷酸。該科的成員包括腺病毒(Ad)和腺伴隨病毒(AAV)。腺病毒代表感染呼吸道、眼睛、腸和泌尿道的膜的一組病毒。腺病毒代表最大的無包膜病毒，因為它們是能夠通過核內(nèi)體運輸?shù)淖畲蟪叽?即包膜融合不是必需的)。病毒體還具有與衣殼的每個五鄰體基質(zhì)有關(guān)的獨特的“刺突”(spike)或纖維(fibre)，所述“刺突”或纖維有助于附著宿主細胞。AAV是依賴性細小病毒，根據(jù)定義，其需要與另一病毒(通常是腺病毒或皰疹病毒)共感染以啟動和維持有生產(chǎn)能力的感染周期。不存在這樣的輔助病毒時，AAV仍能通過受體介導(dǎo)的結(jié)合和內(nèi)化、刺入非分裂細胞和分裂細胞的核而感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞。進入核以后，病毒脫殼并從許多不同的形式表達轉(zhuǎn)基因，其中最持久的形式是環(huán)狀單體。AAV將整合到穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中的1-5%的細胞的基因組(Nakai等人，J.Virol.7611343-349，2002)。轉(zhuǎn)基因的表達可以是特別穩(wěn)定的，在一個用AAV遞送因子IX的研究中，狗模型在用該病毒進行單次直接輸注后4.5年持續(xù)表達治療水平的該蛋白。因為在輔助病毒不存在時AAV感染不產(chǎn)生后代病毒，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的范圍僅限于用AAV感染的初始細胞。這一特征使得AAV成為用于本發(fā)明的合適的基因治療載體。此外，與逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和單純皰疹病毒不同，AAV顯示缺乏人類致病性和毒性(Kay等人，Nature424251，2003禾口Thomas等人，NatureReviews,Genetics4:346_58，2003)。通常，AAV的基因組僅含有兩個基因?！皉印”基因編碼DNA復(fù)制中使用的至少四種單獨的蛋白?！癱ap”基因產(chǎn)物被差異剪接以產(chǎn)生構(gòu)成病毒衣殼的三種蛋白。當(dāng)將基因組包裝成新生病毒時，只有反向末端重復(fù)序列(ITR)是必需的序列；r印和cap可被從基因組中缺失，并被替換為選擇的異源序列。然而，為了產(chǎn)生復(fù)制和將基于AAV-的異源構(gòu)建體包裝成新生病毒體需要的蛋白，必需以反式提供rep和cap蛋白。通常由與輔助病毒諸如腺病毒或皰疹病毒共感染提供的輔助功能也可以一種或多種DNA表達質(zhì)粒的形式反式提供。由于基因組通常僅編碼兩個基因，因此，作為遞送運載體AAV的包裝能力限制為4.5千堿基(kb)單鏈也就不足為奇。不過，雖然此尺寸限制可能限制可以被遞送以替換基因治療的基因，但是它并不有害地影響較短序列諸如RNAi的包裝和表達。AAV對于RNAi應(yīng)用的功效已在使用AAV體外遞送shRNA以抑制p53和半胱天冬酶8表達的實驗中展示(Tomar等人，Oncogene22:5712_15，2003)。將適當(dāng)?shù)男蛄锌寺〉娇諝?gutted)AAV-2載體之后，在HEK293細胞中產(chǎn)生了感染性AAV病毒體，并將該病毒體用于感染HeLaS3細胞。展示了內(nèi)源半胱天冬酶8和p53水平的劑量依賴性減少。Boden等人還使用AAV體外遞送shRNA以抑制組織培養(yǎng)系統(tǒng)中的HIV復(fù)制(Boden等人，J.Virol.77(21)115231-35,2003)，如通過耗盡的培養(yǎng)基中的p24產(chǎn)生所評估的。但是，必須解決使用AAV作為用于RNAi表達構(gòu)建體的運載體的技術(shù)障礙。例如，人口的不同百分比可擁有針對某些AAV血清型的中和抗體。不過，由于存在若干種AAV血清型，含有其中一些血清型的中和抗體的個體百分比大大降低，可使用其他血清型，或可采用假分型(pseudo-typing)。存在至少九種不同的已表征的血清型，還有數(shù)十種其他血清型已被分離但是描述較不充分。另一限制是由于對AAV的可能的免疫應(yīng)答，基于AAV的治療可能僅施用一次；不過，使用替代的、非人類來源的血清型可允許重復(fù)施用。施用路徑、血清型和所遞送的基因組的組成均影響組織特異性。將未修改的AAV系統(tǒng)用于RNAi表達構(gòu)建體的另一限制是轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是效率低下的。體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)可限于5-10%的細胞。不過，本領(lǐng)域已知加強穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的不同的方法。一種方法是采用假分型，其中使用其他血清型來源的cap蛋白包裝AAV-2基因組。例如，通過用AAV-5cap基因置換其AAV-2對等物，Mingozzi等人使穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)增加至大約15%的肝細胞(Mingozzi等人，J.Virol.76(20)10497-502,2002)。Thomas等人使用AAV8衣殼基因體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)了超過30%的小鼠肝細胞(Thomas等人，J.Virol.，發(fā)行中)。Grimm等人(Blood.2003-02-0495)詳盡地用AAV_1、AAV-3B、AAV-4、AAV_5和AAV-6將AAV-2假分型以用于組織培養(yǎng)研究。轉(zhuǎn)基因表達的最高水平由用AAV-6假分型的病毒體誘導(dǎo)；產(chǎn)生比AAV-2高接近2000%的轉(zhuǎn)基因表達。因此，本發(fā)明包括使用假分型AAV病毒來實現(xiàn)高轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，RNAi多啟動子表達構(gòu)建體的表達相應(yīng)增加。如本文所用，術(shù)語“腺伴隨病毒”(AAV)，包括但不限于，AAV1型、AAV2型、AAV3型(包括3A型和3B型)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、羊AAV和現(xiàn)在已知的任何其他AAV。參見，如BERNARDN.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒學(xué))，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)。最近，許多推定的新的AAV血清型和進化枝已被鑒定(參見，如Gao等人，(2004)J.Virology78:6381_6388；Moris等人，(2004)Virology33-:375_383)。在一種實施方案中，所述AAV是AAV9型。AAV的各種血清型的基因組序列和自主細小病毒的基因組序列，以及末端重復(fù)序列(TR)、Rep蛋白和衣殼亞基的序列是本領(lǐng)域已知的。此類序列可在文獻或公共數(shù)據(jù)庫諸如GenBank中找到，包括但不限于，GenBank登錄號NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF28806UAH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540,AF51385UAF513852、AY530579；其公開內(nèi)容通過引用并入本文以教導(dǎo)細小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。另參見，如Srivistava等人，(1983)J.Virology45:555;Chiorini等人，(1998)J.Virology716823；Chiorini等人，(1999)J.Virology731309；Bantel-Schaal等人，(1999)J.Virology73:939;Xiao等人，(1999)J.Virology73:3994;Muramatsu等人，(1996)Virology221208；Shade等人，(1986)J.Virol58921；Gao等人，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA9911854；Moris等人，(2004)Virology33-:375_383；國際專利公布WO00/28061、WO99/61601、WO98/11244；和美國專利第6，156，303號，通過引用并入本文如本文所用的術(shù)語“趨向性”指病毒優(yōu)先進入某些細胞或組織，任選地接著在所述細胞中表達(如轉(zhuǎn)錄和，任選地，翻譯)病毒基因組攜帶的序列，如，對于重組的病毒，表達異源核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不存在反式作用因子時，異源核酸序列從病毒基因組的轉(zhuǎn)錄可能不被啟動，如對于誘導(dǎo)型啟動子或以其他方式調(diào)節(jié)的核酸序列。在rAAV基因組的情形中，病毒基因組的基因表達可來自穩(wěn)定整合的原病毒、來自未整合的附加體以及病毒在細胞內(nèi)可采取的任何其他形式。如本文所用，除非另外說明，術(shù)語“多肽”涵蓋肽和蛋白質(zhì)(包括天然存在的或非天然存在的)。如本文所用，“分離的”多肽(如，“分離的肽”或“分離的蛋白質(zhì)”)意指多肽至少部分地與天然存在的有機體或病毒的至少一些其他組分分開，所述其他組分例如，細胞或病毒結(jié)構(gòu)組分或通常被發(fā)現(xiàn)與所述多肽締合的其他多肽或核酸?！岸嗪塑账帷笔呛塑账釅A基的序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA雜種序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸)，但在代表性實施方案中，其為單鏈或雙鏈DNA序列。如本文所用，“分離的”多核苷酸(如“分離的DNA”或“分離的RNA”)意指多核苷酸至少部分地與天然存在的有機體或病毒的至少一些其他組分分開，所述其他組分例如，細胞或病毒結(jié)構(gòu)組分或通常被發(fā)現(xiàn)與所述多核苷酸締合的其他多肽或核酸。如本文所用，“分離”或“純化”(或語法等同物)病毒載體意指使病毒載體至少部分地與起始材料中的至少一些其他組分分開?！爸委煻嚯摹笔强删徑饣驕p輕細胞或受治療者中由蛋白質(zhì)的缺乏或缺陷造成的癥狀的多肽。可選地，“治療多肽”是以另外方式賦予受治療者益處、如抗心律失常效應(yīng)或從心力衰竭中存活的能力的改善的多肽。“轉(zhuǎn)染”用于指細胞對核酸組合物的攝取。當(dāng)外源核酸組合物穿過細胞膜時，細胞即被“轉(zhuǎn)染”。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域通常已知的。參見，如[69，70],Sambrook等人(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual(分子克隆實驗室手冊),ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,Davis等人(1986)BasicMethodsinMolecularBiology(分子生物學(xué)基本方法)，Elsevier，和[71]。此類技術(shù)可用于將一種或多種核酸組合物諸如質(zhì)粒載體和其他核酸分子引入合適的宿主細胞。該術(shù)語指遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定攝取和瞬時攝取兩方面。對于此發(fā)明目的，“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是經(jīng)由病毒載體的特殊“轉(zhuǎn)染”形式?！稗D(zhuǎn)導(dǎo)”表示經(jīng)由病毒或病毒載體諸如經(jīng)由重組的AAV病毒體，在體內(nèi)、體外或活體外(exvivo)遞送核酸組合物到達、進入受體細胞或在受體細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)導(dǎo)是轉(zhuǎn)染的特殊形式，即術(shù)語轉(zhuǎn)染包括術(shù)語轉(zhuǎn)導(dǎo)。術(shù)語“治療”，包括其語法等同物，意指受治療者的病癥的嚴(yán)重度得到減輕或至少部分改善或緩解，和/或?qū)崿F(xiàn)至少一種臨床癥狀的某種程度的緩解、緩和或降低，和/或病癥的進展有延遲，和/或阻止或延遲了疾病或疾患的發(fā)作。因此，術(shù)語“治療”指預(yù)防性方案和治療性方案兩方面?！爱愒春塑账嵝蛄小被颉爱愒春怂帷笔侵覆皇遣《局刑烊淮嬖诘男蛄?。通常，異源核酸包含感興趣的多肽或非翻譯RNA的開放閱讀框(如，用于遞送到細胞或受治療者)。如本文所用，術(shù)語“病毒載體”、“載體”或“基因遞送載體”指充當(dāng)核酸遞送運載體的病毒(如，AAV)顆粒，以及包含包裝到AAV衣殼內(nèi)的載體基因組(如，病毒DNA[vDNA])的病毒顆粒?？蛇x地，在一些上下文中，術(shù)語“載體”可用于指單獨的載體基因組/VDNA。"rAAV載體基因組”或“rAAV基因組”是包含一種或多種異源核苷酸序列的AAV基因組(即vDNA)。rAAV載體通常只需要順式的145堿基末端重復(fù)序列(TR)來產(chǎn)生病毒。所有其它序列是非必須的，并可以反式提供(Muzyczka，(1992)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.158:97)。通常，rAAV載體基因組將僅保留最小TR序列以使可被載體有效包裝的轉(zhuǎn)基因的尺寸最大。結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)編碼序列可以反式提供(如，從載體，諸如質(zhì)粒，或通過將序列穩(wěn)定地整合到包裝的細胞中)。rAAV載體基因組包含至少一個TR序列(如，AAVTR序列)、任選地兩個TR(如，兩個AAVTR)，其通常在異源核苷酸序列的5'和3'端，但不需與所述異源核苷酸序列鄰接。TR可以彼此相同或不同。“AAV末端重復(fù)序列”或“AAVTR”可來自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。AAV末端重復(fù)序列不需要具有野生型末端重復(fù)序列序列(如，野生型序列可通過插入、缺失、截短或錯義突變而被改變)，只要該末端重復(fù)序列介導(dǎo)所需的功能，如復(fù)制、病毒包裝、整合、和/或原病毒拯救和類似功能。術(shù)語“末端重復(fù)序列”或“TR”包括形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并充當(dāng)反向末端重復(fù)序列的任何病毒末端重復(fù)序列和合成序列，諸如授予Samulski等人的美國專利第5，478，745號中描述的“雙-D序列”。自主細小病毒和AAV的衣殼結(jié)構(gòu)更詳細地描述于BERNARDN.FIELDS等人，VIROLOGY(病毒學(xué))，第2卷，第69&70章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)。另參見對以下的晶體結(jié)構(gòu)的描述:AAV2(Xie等人，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.9910405-10)、AAV4(Padron等人、(2005)JVirol.79:5047_58),AAV5(Walters等人、(2004)JVirol.783361-71)和CPV(Xie等人，(1996)JMol.Biol.6:497_520和Tsao等人、(1991)Science251:1456-64)?！癆AV小基因”指至少包含AAVITR和異源核酸組合物的構(gòu)建體。對于根據(jù)本發(fā)明的rAAV產(chǎn)生，小基因可被攜帶在任何適合的載體包括病毒載體、質(zhì)粒載體和類似載體上。本發(fā)明的病毒載體還可以是如國際專利公布WO0CV28004和Chao等人，(2000)MolecularTherapy2619中所述的“靶向”病毒載體(如，具有定向的趨向性)和/或“雜種”細小病毒(即，其中rAAV基因組和病毒衣殼來自不同的細小病毒)。本發(fā)明的病毒載體還可以是如國際專利申請公布第WO01/92551號中所述的雙鏈體細小病毒顆粒。因此，在一些實施方案中，可將雙鏈(雙鏈體)基因組包裝到本發(fā)明的病毒衣殼中。此外，病毒衣殼或基因組可含有其它修飾，包括插入、缺失和/或置換。因此，如本文所用，術(shù)語“病毒載體”涵蓋細小病毒和AAV的雜種、靶向和雙鏈體病毒顆粒，以及其他修飾形式。如本文所用，術(shù)語“脊椎動物”涵蓋哺乳動物、禽類物種、魚或爬行動物。例如，脊椎動物可以是哺乳動物。術(shù)語“哺乳動物”包括人類和非人靈長類、農(nóng)畜類動物(如綿羊、牛、山羊、豬、驢、馬)、實驗室測試動物(如大鼠、小鼠、兔、豚鼠、倉鼠)、伴侶動物(如狗、貓)或捕獲的野生動物。哺乳動物包括但不限于、人類和鼠科哺乳動物。本發(fā)明部分是基于應(yīng)用促進經(jīng)由RNAi的基因沉默的試劑下調(diào)或沉默一種或多種轉(zhuǎn)錄活性基因區(qū)域作為治療心力衰竭的方法，所述轉(zhuǎn)錄活性基因區(qū)域與心臟細胞中的鈣流量調(diào)節(jié)直接或間接相關(guān)。在一種實施方案中，公開了治療心力衰竭的方法，包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用治療有效量的RNAi表達盒，其中所述盒包括病毒體載體和其表達產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)mRNA的表達的RNAi序列，所述施用以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)所述受治療者的心肌細胞的量進行，由此造成所述RNAi表達盒的表達并治療所述受治療者中的心力衰竭。術(shù)語“RNA干擾”通常指雙鏈RNA分子改變與雙鏈或短發(fā)夾分子具有大致的或完全的同源性的核酸序列的表達的過程。雖然不受理論束縛，作用的機制可包括但不限于，PLB基因的表達的直接或間接下調(diào)，PLBmRNA的減少，和/或PLB活性的降低。術(shù)語“RNAi”指引發(fā)RNA干擾并從載體轉(zhuǎn)錄的RNA序列。術(shù)語“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”指具有雙鏈體區(qū)域和環(huán)狀區(qū)域的RNA結(jié)構(gòu)。該術(shù)語還應(yīng)被理解為特別包括具有莖-環(huán)或鍋柄樣二級結(jié)構(gòu)的RNA分子。在本發(fā)明的一些實施方案中，RNAi最初被表達為shRNA。術(shù)語“RNAi表達盒”指根據(jù)本發(fā)明的實施方案具有至少一個[啟動子-RNAi-終止子]單元的盒。術(shù)語“多啟動子RNAi表達盒”指包含兩個或多個[啟動子-RNAi-終止子]單元的RNAi表達盒。術(shù)語“RNAi表達構(gòu)建體”或“RNAi表達載體”指含有至少一個RNAi表達盒的載體。RNAi通常通過靶和RNAi之間的相同序列優(yōu)化。RNA干擾現(xiàn)象可在低于100%同源性下觀察到，但是互補區(qū)域必須彼此足夠同源以形成特異性雙鏈區(qū)域。尚未完全鑒定得到有效造成RNA干擾的雙鏈區(qū)域的精確結(jié)構(gòu)規(guī)則，但是大約70%的同一性通常是足夠的。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，RNAi和PLB之間的同源性是至少70%核苷酸序列同一性，并且可以是至少75%核苷酸序列同一性。同源性包括但不限于，至少80%核苷酸序列同一性，和至少85%或甚至90%核苷酸序列同一性。在一種實施方案中，靶序列和RNAi的有義鏈之間的序列同源性是至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序列同一性。另一考慮因素是RNA中的堿基配對與DNA中的略有不同，即在RNA雙鏈體中G將與U配對，雖然不如與C的強烈。而且，對于RNAi效力，反義鏈與靶序列同源更為重要。在一些情況中，已知21個核苷酸中有17個同源足以啟動RNAi，但在其他情況中，需要21個核苷酸中有19或20個核苷酸具有同一性。雖然不受理論束縛，在通常的水平，雙鏈區(qū)域的中央部分比其末端需要更大同源性。在僅尋求一定程度的沉默的情況中，可向特定構(gòu)建體中設(shè)計入完美同源性的某種預(yù)定程度的缺乏，以降低其RNAi活性，這將造成靶基因產(chǎn)物的部分沉默或抑制。在此類情形中，反義序列中僅有一個或兩個堿基可被改變。另一方面，有義鏈對突變更具耐受性。雖然不受理論束縛，這可能是因為反義鏈?zhǔn)蔷哂写呋钚缘哪莻€。因此，有義鏈和靶基因的區(qū)域的轉(zhuǎn)錄物之間較低的同一性未必會降低RNAi活性，特別是當(dāng)反義鏈與該轉(zhuǎn)錄物完美雜交時。有義鏈中的突變(從而使它與靶基因的區(qū)域的轉(zhuǎn)錄物不同)可用于輔助發(fā)夾構(gòu)建體的測序并可能用于其它目的，諸如調(diào)節(jié)發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的切酶(dicer)加工或RNAi途徑的其他方面。術(shù)語“雜交”和“退火”，包括其語法等同物，在本說明書中涉及核苷酸序列時可互換使用，并指由于其互補性而能夠形成Watson-Crick堿基對的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，非Watson-Crick堿基配對也是可能的，尤其是在RNA序列環(huán)境中。例如，在RNA中的鳥嘌呤核苷和尿嘧啶殘基之間可形成所謂的“擺動配對”。RNAi表達盒的RNA表達產(chǎn)物導(dǎo)致雙鏈RNA(dsRNA)復(fù)合體的產(chǎn)生以誘導(dǎo)RNA干擾并由此下調(diào)或降低哺乳動物基因的表達?！癲sRNA”指包含兩條Watson-Crick堿基配對的互補RNA鏈的核糖核酸復(fù)合體。dsRNA復(fù)合體包含在嚴(yán)格條件下，包括在65°C的0.2xSSC清洗步驟，與至少一個哺乳動物基因的核苷酸序列雜交的第一核苷酸序列和與所述第一核苷酸序列互補的第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列可通過第三核苷酸序列(如RNA環(huán))與所述第二核苷酸序列連接，從而使所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列成為同一RNA分子的部分；可選地，第一核苷酸序列可以是一個RNA分子的部分，而第二核苷酸序列可以是另一RNA分子的部分。因此，dsRNA復(fù)合體可通過分子內(nèi)雜交或退火形成，或者dsRNA復(fù)合體通過分子間雜交或退火形成。“互補”在本文以其通用方式使用以指Watson-Crick堿基配對，而“非互補”用于指非Watson-Crick堿基配對，即使此類非互補序列可形成擺動配對或其他相互作用。然而，在本發(fā)明的上下文中，“非配對”序列的含義具體地指其間不形成Watson-Crick堿基對的序列。因此，根據(jù)本發(fā)明的間隔或鼓泡(bubble)序列的實施方案在本文被描述和闡明為非配對序列，無論理論上或?qū)嶋H上是否可發(fā)生Watson-Crick堿基配對。用于描述兩個或多個多核苷酸之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括“參考序列”、“比較窗”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“大致相似的”和“大致同一性”?！皡⒖夹蛄小遍L度為至少10個但常常15至25個、經(jīng)常大于25或以上諸如30個單體單元，包括核苷酸。因為兩個多核苷酸可各自包含(1)在所述兩個多核苷酸之間相似的序列(即，僅為完整多核苷酸序列的一部分)和(2)在所述兩個多核苷酸之間差異的序列，所以兩個(或多個)多核苷酸之間的序列比較通常通過在“比較窗”比較兩個多核苷酸以鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域來進行。“比較窗”指與參考序列進行比較通常至少約10連續(xù)殘基的概念區(qū)段。與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗可包含約20%或更少的添加或缺失(S卩，缺口)以最優(yōu)地比較兩個序列。用于對比較窗進行比對的序列的最優(yōu)比對可通過算法的計算機化實現(xiàn)來實施(如，WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA禾口TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,Wis，USA)或通過目測和由選擇的多種算法中的任何算法產(chǎn)生的最佳比對(即，在比較窗上產(chǎn)生最高同源性百分比)來實施。也可參考BLAST程序家族，如，例如由Altschul等人所公開的。序列分析的詳細討論可在Ausubel等人的單元19.3中找到。例如，“序列同一性百分比”可通過以下來計算在比較窗上比較兩個最優(yōu)比對的序列，確定兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(如，A、T、C、G、I)的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)(即，窗尺寸)，將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比。對于本發(fā)明目的，“序列同一性”將被理解為意指通過DNASIS計算機禾呈序(用于windows的版本2.5；可獲自HitachiSoftwareengineeringCo,Ltd,SouthSanFrancisco,Calif,USA)，使用軟件隨附的參考手冊中使用的標(biāo)準(zhǔn)默認值計算的“匹配百分比”?？蛇x地，多核苷酸的同源性/同一性可通過雜交實驗確定。如本文所用，認為第一核酸序列或片段(諸如例如，引物或探針)與第二核酸序列選擇性雜交，因此，如果在以下條件下，此第二序列能夠與所述第一序列或變體特異性雜交或能夠特異性引發(fā)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即表明“大致同源性”(i)在典型的雜交和清洗條件下，諸如，例如在Maniatis，(MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)，第2版，1989)中描述的那些，其中雜交條件可以是具有更低嚴(yán)格性或更高嚴(yán)格性的那些；或(ii)使用允許至多約25-30%堿基對錯配的嚴(yán)格清洗條件，例如，在2xSSC、0.1%SDS、室溫下清洗兩次，每次30分鐘；然后，在2xSSC、0.1%SDS、37°C下清洗一次30分鐘；在2xSSC、室溫下清洗兩次，每次10分鐘，或(iii)在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下或在“降落(touch-down)”PCR條件下。如本文所用的術(shù)語“雜交條件”將指允許廣義地核酸的兩條互補鏈之間和特別地具有至少七個核苷酸長度的RNA的兩條互補鏈之間雜交的條件。雜交條件是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，生理條件，諸如但不限于胞內(nèi)生理條件。本發(fā)明的RNAi可包含在正常的哺乳動物細胞中無毒的短的、雙鏈或部分雙鏈(如，鍋柄、莖-環(huán)和發(fā)夾)RNA。對本發(fā)明的RNAi的長度沒有特別限制，只要它們不顯示細胞毒性。RNAi可以是，例如，約10至71bp長、約15至49bp長、約15至35bp長和約19至29bp長或約19至21bp長。RNAi的雙鏈RNA部分可以是完全同源的，或可由于序列錯配(每條鏈上的對應(yīng)核苷酸不互補)、凸出(一條鏈上缺乏對應(yīng)的互補核苷酸)和類似原因而含有非配對的部分。在非配對的部分不顯著干擾RNAi雙鏈體形成或效力的程度，此類非配對的部分可被耐受。“siRNA”或短干擾RNA可通過本領(lǐng)域已知的方法諸如通過典型的寡核苷酸合成來制造，并且經(jīng)常包括化學(xué)修飾以增加siRNA的半衰期和/或效力、和/或以允許更強的遞送制劑。寡核苷酸的許多修飾是本領(lǐng)域已知的。例如，美國專利第6，620，805號公開了與具有凈正電荷的大環(huán)諸如卟啉化合的寡核苷酸；美國專利第6，673，611號公開了各種式；美國專利申請公布第2004/0171570、2004/0171032和2004/0171031號公開包括包含多環(huán)糖代用品的修飾的寡聚體；諸如環(huán)丁基核苷、環(huán)戊基核苷、脯氨酸核苷、環(huán)己烯核苷、己糖核苷或環(huán)己烷核苷；和包括不含磷的核苷間連接的寡聚體；美國專利申請公布第2004/0171579號公開了其中修飾為糖部分上的2’組成基團不是H或OH的修飾寡核苷酸；美國專利申請公布第2004/0171030號公開了用于結(jié)合相反鏈上的胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶堿基的修飾堿基，該相反鏈包含具有選自由以下組成的組的含硼取代基的膨化的C和U或T修飾的結(jié)合堿基-BH2CN、-BH3和-BH2COOR,其中R是Cl至C18烷基；美國專利申請公布第2004/0161844號公開了具有氨基磷酸酯核苷間連接諸如3‘氨基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯或氨基烷基硫代氨基磷酸酯核苷間連接的寡核苷酸；美國專利申請公布第2004/0161844號公開了其它修飾的糖和/或主鏈修飾，其中在一些實施方案中，所述修飾是肽核酸、肽核酸模擬物、嗎啉代核酸、具有酰胺連接的己糖、環(huán)己烯基核酸(CeNA)或無環(huán)主鏈部分；美國專利申請公布第2004/0161777號公開了具有3'末端帽基團的寡核苷酸；美國專利申請公布第2004/0147470號公開了包括一種或多種交聯(lián)的寡聚化合物，所述交聯(lián)改善所述寡聚化合物的核酸酶抗性，或者修改或增強所述寡聚化合物的藥物動力學(xué)性質(zhì)和藥效學(xué)性質(zhì)，其中此類交聯(lián)包含二硫化物、酰胺、胺、肟、羥基胺、氧亞胺(oxyimine)、嗎啉代、硫醚、脲、硫脲或磺酰胺部分；美國專利申請公布第2004/0147023號公開了包含具有第一類型的核苷酸的兩個末端RNA區(qū)段和具有第二類型的核苷酸的內(nèi)部RNA區(qū)段的gapmer，其中所述第一類型的核苷酸獨立地包括至少一個糖取代基，其中所述糖取代基包含鹵素、氨基、三氟烷基、三氟烷氧基、疊氮基、氨基氧、烷基、烯基、炔基、0—、S-或NOO-烷基；0—、S—或N(R*)-烯基；0—、S—或N(R*)-炔基；0—、S—或N-芳基、0—、S—或N(R*)-芳烷基基團；其中所述烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基可以是取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳烷基；并且其中，如果取代，所述取代是烷氧基、硫代烷氧基、酞酰亞胺基、商素、氨基、酮、羧基、硝基、亞硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、咪唑基、疊氮基、胼基、氨基氧、異氰酸基、亞砜、砜、二硫化物、甲硅烷基、雜環(huán)或碳環(huán)基團或嵌入劑、報告基團、軛合物、聚胺、聚酰胺、聚亞烷基二醇或式(一O-烷基)m的聚醚，其中m是1至約10；和R*是氫、或保護基團；或美國專利申請公布第2004/0147022號公開了具有修飾的糖和/或主鏈修飾的寡核苷酸，諸如糖部分上的2'_0013取代基因此，在一方面，本發(fā)明公開了用于治療心力衰竭的方法，包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用治療有效量的RNAi表達盒，其中所述盒包括病毒體載體和其表達產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)mRNA的表達的RNAi序列，所述施用以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)所述受治療者的心肌細胞的量進行，由此造成所述RNAi表達盒的表達并治療所述受治療者中的心力衰竭?！皢幼印被颉皢幼有蛄小痹诒疚娜∑渥顝V泛背景下的含義，并包括能夠在細胞中結(jié)合RNA聚合酶和啟動轉(zhuǎn)錄多核苷酸或多肽編碼序列的DNA調(diào)節(jié)區(qū)域，所述編碼序列諸如信使RNA、核糖體RNA、小核核仁RNA(smallnuclearofnucleolarRNA)或由任何RNA聚合酶的任何類型轉(zhuǎn)錄的任何種類的RNA。本文預(yù)期的“啟動子”還可包括經(jīng)典基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括真核細胞中精確的轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA框，含或不含CCAAT框序列和其它的調(diào)節(jié)元件(即，上游激活序列、增強子和沉默子)。啟動子通常，但不是必須地，位于其所調(diào)節(jié)的序列的上游或5‘。而且，包含啟動子的調(diào)節(jié)元件通常位于要被調(diào)節(jié)的序列的轉(zhuǎn)錄起始位點的2kb以內(nèi)。在本發(fā)明背景中，術(shù)語“啟動子”還用于描述賦予、激活或增強分離的核酸分子在哺乳動物細胞中的表達的合成或融合分子或衍生物。還可需要另一或同一啟動子以在植物、動物、昆蟲、真菌、酵母或細菌細胞中行使功能。啟動子可含有進一步增強結(jié)構(gòu)基因的表達的一種或多種特異性調(diào)節(jié)元件的另外拷貝，其轉(zhuǎn)而調(diào)節(jié)和/或改變基因的空間表達和/或時間表達。例如，賦予結(jié)構(gòu)基因的表達的可誘導(dǎo)性的調(diào)節(jié)元件可被置于與驅(qū)動核酸分子的表達的異源啟動子序列相鄰。將序列置于啟動子序列的調(diào)節(jié)控制下意指放置所述分子以使得表達受到啟動子序列的控制。啟動子通常被放置在它們控制的基因的5'(上游)。在構(gòu)建異源啟動子/結(jié)構(gòu)基因組合中，通常啟動子位置距基因轉(zhuǎn)錄起始位點的距離可以與啟動子和它在其天然背景下控制的基因，即啟動子衍生自的基因，之間的距離大約相同。如本領(lǐng)域已知的，可調(diào)整此距離的一些變化而不喪失啟動子功能。相似地，調(diào)節(jié)序列元件相對于置于其控制下的異源基因的位置由該元件在其天然背景，即其所衍生自的基因的位置確定。同樣，如本領(lǐng)域已知的，此距離也可發(fā)生一些變化。啟動子可組成地調(diào)節(jié)序列的表達，或就表達發(fā)生的細胞、組織或器官而言差異地調(diào)節(jié)序列的表達，或就表達發(fā)生的發(fā)育階段而言差異地調(diào)節(jié)序列的表達，或響應(yīng)于諸如生理應(yīng)激、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、激素、病原體或金屬離子以及其它的刺激而差異地調(diào)節(jié)序列的表達。在本發(fā)明的一些實施方案中有用的啟動子可以是組織特異性的或細胞特異性的。術(shù)語“組織特異性”在應(yīng)用于啟動子時指能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列在特定類型的組織(如，肌肉組織)中的選擇性表達，而相對不存在感興趣的相同核苷酸序列在不同類型的組織(如，心臟)中的表達的啟動子。術(shù)語“細胞特異性”在應(yīng)用于啟動子時指能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列在特定類型的細胞中的選擇性表達，而相對不存在感興趣的相同核苷酸序列在相同組織的不同類型的細胞中的表達的啟動子(參見，如Higashibata等人，J.BoneMiner.Res.19(1):78_88，2004;Hoggatt等人，Circ.Res.91(12):1151_59，2002;Sohal等人，Circ.Res.89(1):20_25，2001；和Zhang等人，GenomeRes.14(1):79_89、2004)。術(shù)語“細胞特異性”在應(yīng)用于啟動子時還意指啟動子能夠促進感興趣的核苷酸序列在單個組織內(nèi)的區(qū)域中的選擇性表達?？蛇x地，啟動子可以是組成型的或可調(diào)節(jié)的。另外，啟動子可被修改以便擁有不同的特異性。術(shù)語“組成型”在用于提及啟動子時意指啟動子能夠在不存在特異刺激(如，熱激、化學(xué)物、光和類似刺激)下指導(dǎo)可操作地連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。通常，組成型啟動子能夠指導(dǎo)編碼序列在幾乎任何細胞和任何組織中的表達。用于轉(zhuǎn)錄RNAi的啟動子可以是組成型啟動子，諸如RNA聚合酶II控制的泛素、CMV、β-肌動蛋白、組蛋白H4、EF-Iα或Pgk基因啟動子，或RNA聚合酶I控制的啟動子元件。在其它實施方案中，采用PolII啟動子，諸如CMV、SV40、U1、β-肌動蛋白或雜種PolII啟動子。在其它實施方案中，使用RNA聚合酶III控制的啟動子元件，諸如U6啟動子(如，U6-l、TO-8、U6-9)、H1啟動子、7SL啟動子、人類Y啟動子(hYl、hY3、hY4(參見Maraia等人，NucleicAcidsRes22(15):3045_52，1994)和hY5(參見Maraia等人，NucleicAcidsRes24(18)3552-59，1994)、人類MRP-7-2啟動子、腺病毒VAl啟動子、人類tRNA啟動子、5s核糖體RNA啟動子以及這些啟動子中任何啟動子的功能雜種和組合。可選地，在一些實施方案中，選擇允許RNAi的可誘導(dǎo)表達的啟動子可能是最優(yōu)的。使用此類啟動子的可誘導(dǎo)表達的許多系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于四環(huán)素響應(yīng)系統(tǒng)和Iac操縱子-阻遏物系統(tǒng)(參見W003/022052Al；和US2002/0162126Al)、蛻化素調(diào)節(jié)系統(tǒng)或受糖皮質(zhì)激素、孕酮、雌激素、RU-486、類固醇、甲狀腺激素、環(huán)式AMP、細胞因子、鈣化醇家族調(diào)節(jié)物調(diào)節(jié)的啟動子或金屬硫蛋白啟動子(受無機金屬調(diào)節(jié))。一種或多種增強子也可存在于病毒多啟動子RNAi表達構(gòu)建體以增加感興趣的基因的表達。適合用于本發(fā)明的實施方案的增強子包括ApoEHCR增強子、最近已描述的CMV增強子(參見，Xia等人，NucleicAcidsRes31-17，2003)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他增強子。在本發(fā)明中，啟動子可以能夠調(diào)節(jié)核酸分子在哺乳動物細胞中的表達，至少在靶基因在其中表達期間，以及在靶基因在所述細胞中的可檢測的表達即將開始之前。啟動子可以是組成型的、誘導(dǎo)型的或發(fā)育調(diào)節(jié)的。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“與…可操作地連接”或“可操作地處于…的控制下”或相似的諸如“可操作地連接于”將被視為表明細胞中結(jié)構(gòu)基因的表達處于與其空間連接的啟動子序列的控制下。在一些實施方案中，可在RNAi表達盒內(nèi)或包含多個RNAi表達盒的RNAi表達載體的不同盒之間采用不同強度的啟動子。例如，使用兩個或更多個強啟動子(諸如PolIII-型啟動子)可通過，如耗盡可利用的核苷酸庫或轉(zhuǎn)錄所需的其它細胞組分，而使細胞承受重負。此外或可選地，使用數(shù)個強啟動子可造成細胞中毒性水平的RNAi表達。因此，在一些實施方案中，多啟動子RNAi表達盒中的一個或多個啟動子可以比盒中的其它啟動子更弱，或盒中的所有啟動子可以低于最大速率的速率表達RNAi。啟動子還可以或可以不使用分子技術(shù)或以其他方式如通過調(diào)節(jié)元件進行修改以實現(xiàn)較弱的轉(zhuǎn)錄水平。載體還可含有其它的基因元件。載體中可包括的元件的類型不受任何形式的限制，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，其他基因元件可包括報告基因，諸如一個或多個以下基因熒光標(biāo)記蛋白諸如GFP或RFP；容易測定的酶諸如β-半乳糖苷酶、螢光素酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或分泌的胚胎堿性磷酸酶；或易于進行免疫測定的蛋白質(zhì)諸如激素或細胞因子?？捎糜诒景l(fā)明的實施方案的其它基因元件包括編碼賦予細胞選擇性生長優(yōu)勢的蛋白質(zhì)諸如腺苷脫氨酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、藥物抗性的那些基因，或編碼提供營養(yǎng)缺陷型中缺失的生物合成能力的蛋白質(zhì)的那些基因。如果RNAi表達盒中包括了報告基因，則可包括內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列。其它的基因元件可與獨立的啟動子/增強子可操作地連接并受其控制。此夕卜，可采用用于在細菌中繁殖載體的合適的復(fù)制起點。復(fù)制起點的序列通常與RNAi和將在靶細胞、組織和/或器官中表達的其它基因序列隔開。此類復(fù)制起點是本領(lǐng)域已知的，并包括pUC、ColEl、2-微米或SV40復(fù)制起點。本文描述的載體或其部分還可進行修改以整合到表達其的細胞的基因組。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，為了實現(xiàn)基因序列或表達盒與宿主細胞基因組的整合，可能需要某些其它的基因序列。在一種實施方案中，所述載體的效應(yīng)是降低PLB的功能表達而不顯著降低PLB的轉(zhuǎn)錄水平?？蛇x地或此外，包括合成基因的基因構(gòu)建體不造成總RNA的穩(wěn)態(tài)水平的顯著下降。因此，在另一方面，本發(fā)明包括以下RNAi表達載體，其中所述RNAi表達載體包含如本文所定義的一個或多個RNAi表達盒。本發(fā)明的RNAi造成或以其它方式促進靶轉(zhuǎn)錄物翻譯成表達產(chǎn)物的改變的翻譯能力。雖然表達產(chǎn)物通常是蛋白質(zhì)，但是本發(fā)明進一步包括參與基因調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA、eRNA或從轉(zhuǎn)錄物中剪接下來的內(nèi)含子形式的表達產(chǎn)物?！案淖兊哪芰Α钡暮x包括但不限于相對于未進行遺傳修飾的細胞的翻譯水平的下降，諸如約10%至約100%和約20%至約90%。在一種實施方案中，對應(yīng)于靶內(nèi)源序列的基因基本上沒有被翻譯為蛋白質(zhì)產(chǎn)物。方便地，改變的翻譯能力通過表型的任何變化確定，其中在未進行遺傳修飾的細胞中，所述表型由編碼PLB的基因的表達促成。攜帶本發(fā)明的遺傳因子的任何細胞被稱為是“遺傳修飾的”。遺傳修飾可以是永久的或瞬時的。瞬時的遺傳修飾發(fā)生于，例如，當(dāng)細胞攝取遺傳因子并允許產(chǎn)生其轉(zhuǎn)錄物時。可選地，該遺傳因子直接降低翻譯的水平，諸如通過施用反義寡核苷酸或更大的核酸分子。在任一種情況下，該分子促進基因沉默機制，該機制可隨著細胞分裂被移除。永久的基因沉默更可能發(fā)生于當(dāng)該遺傳因子整合到細胞的基因組并且該因子被傳遞給子代細胞時?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法將RNAi或RNAi表達構(gòu)建體施用至細胞、組織或器官，目的是調(diào)節(jié)靶基因的表達。施用的有用方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化、用減毒的病毒顆粒或細菌細胞轉(zhuǎn)化細胞、細胞接合、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或由Ausubel等人(1992)描述的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染程序。例如，核酸分子可以作為裸DNA或RNA、任選地封裝在脂質(zhì)體中、在作為減毒病毒的病毒顆粒中或以與病毒外殼或運輸?shù)鞍踪|(zhì)或惰性載運體諸如金締合的形式或作為重組的病毒載體或細菌載體或作為構(gòu)建體、以及其它形式引入。在一種實施方案中，可使用基于任何合適的病毒的病毒遞送系統(tǒng)來遞送本發(fā)明的RNAi表達構(gòu)建體。此外，雜種病毒系統(tǒng)也可能是有用的。病毒遞送系統(tǒng)的選擇將取決于多種參數(shù)，諸如遞送至心肌細胞或其它靶組織的效率、系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、致病能力、免疫和毒性考慮因素和類似參數(shù)。顯然不存在適于所有應(yīng)用的單一病毒系統(tǒng)。當(dāng)選擇用于本發(fā)明的病毒遞送系統(tǒng)時，重要的是選擇其中含有RNAi表達構(gòu)建體的病毒顆粒具有以下性質(zhì)的系統(tǒng)1)重復(fù)和穩(wěn)定地繁殖；2)能夠純化至高滴度；和3)能夠介導(dǎo)靶向遞送(將多啟動子RNAi表達構(gòu)建體遞送至靶組織(如，心肌細胞)而不廣泛傳染)。此外，可使用雜種病毒系統(tǒng)以組合兩種或更多種病毒系統(tǒng)的有用性質(zhì)。例如，野生型AAV的位點特異性整合機制可與腺病毒的有效內(nèi)化和核靶向性質(zhì)偶聯(lián)。AAV在腺病毒或皰疹病毒存在下經(jīng)歷生產(chǎn)復(fù)制周期；然而，在不存在輔助功能時，AAV基因組整合到染色體19的特異性位點。AAV基因組的整合需要AAVr印蛋白質(zhì)的表達。因為常規(guī)的rAAV載體缺失了包括r印在內(nèi)的所有基因，所以它們不能特異性地整合到染色體19。但是，在合適的雜種系統(tǒng)中可利用這一特征。另外，可在病毒遞送系統(tǒng)中使用非病毒基因元件以實現(xiàn)期望的性質(zhì)，諸如允許位點特異性重組的基因元件。將RNAi表達構(gòu)建體包裝到病毒顆粒中?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來產(chǎn)生感染性病毒顆粒，其基因組包含病毒RNAi表達構(gòu)建體的拷貝。包裝細胞系可以是能夠表達病毒蛋白質(zhì)的任何細胞系，包括但不限于293、HeLa,A549、PerC6、D17、MDCK,BHK、Cf2Th或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或開發(fā)的任何其它系。一種包裝細胞系描述于，例如美國專利第6，218，181號，通過引用并入本文?？蛇x地，可將未穩(wěn)定表達必需的病毒蛋白質(zhì)的細胞系用兩種或更多種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染以實現(xiàn)有效的功能顆粒產(chǎn)生。一種構(gòu)建體包含病毒RNAi表達盒，而其它的質(zhì)粒包含編碼允許細胞產(chǎn)生功能病毒(復(fù)制和包裝構(gòu)建體)以及其它輔助功能的蛋白質(zhì)的核酸。包裝細胞系或復(fù)制和包裝構(gòu)建體可不表達包膜基因產(chǎn)物。在這樣的實施方案中，編碼包膜基因的基因可在與病毒RNAi表達構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的單獨的構(gòu)建體上提供。因為包膜蛋白質(zhì)部分負責(zé)病毒顆粒的宿主范圍，病毒可以被假分型?！凹俜中偷摹辈《臼蔷哂衼碜耘c基因組所衍生自的病毒不同的病毒的包膜蛋白質(zhì)的病毒顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可針對使用的病毒遞送系統(tǒng)和要靶向的細胞而選擇適當(dāng)?shù)募傩?。除了賦予特異的宿主范圍外，選擇的假型可允許病毒被濃縮至非常高的滴度。可選地，可用將感染限制于特定物種的親嗜性包膜蛋白質(zhì)(如，親嗜性包膜僅允許感染例如鼠細胞，而雙嗜性包膜允許感染如人類和鼠細胞兩者)假分型病毒。另外，遺傳修飾的配體可用于細胞特異性靶向，諸如去唾液酸糖蛋白用于肝細胞，或轉(zhuǎn)鐵蛋白用于受體介導(dǎo)的結(jié)合在包裝細胞系中產(chǎn)生之后，純化并定量(滴定)含有RNAi表達盒的病毒顆粒。純化策略包括但不限于密度梯度離心或柱層析方法。本文公開的RNAi或RNAi表達盒可通過經(jīng)由但不限于注射或灌注應(yīng)用于心臟而引入到心肌細胞。在一種實施方案中，可在體外或活體外將RNAi表達盒引入靶細胞，然后接著置于動物內(nèi)以實現(xiàn)治療，或可通過體內(nèi)施用將RNAi表達盒直接施用于有機體、器官或細胞。通過病毒感染遞送可以是一種遞送方法。可使用任何方便的方案將包含盒的載體施用于哺乳動物宿主，其中許多不同的此類方案是本領(lǐng)域已知的。通過使AAV載體溶解、懸浮或乳化在適當(dāng)?shù)?、藥學(xué)可接受的載運體或稀釋劑中，可將它們配置成用于注射或施用的制品。此類藥學(xué)可接受的載運體或稀釋劑的實例包括含水或不含水的溶劑諸如油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇；并且，如果需要，含有常規(guī)的添加劑諸如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在一種實施方案中，公開了包括重組的腺伴隨病毒(AAV)載體和藥學(xué)可接受的載運體的藥物組合物，其中所述載體包括RNAi表達盒，其RNA表達產(chǎn)物導(dǎo)致細胞中受磷蛋白(PLB)mRNA的表達的下降和PLB蛋白質(zhì)的量的下降，并且其中所述RNAi表達盒的RNA表達產(chǎn)物包括在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在一方面，RNAi表達盒包括核苷酸序列5‘GGATCCCGTACCTTACTCGCTCGGCTATTCAAGAGATAGCCGAGCGAGTAAGGTATTTTTTGGAAAAGCTT3'(SEQIDNO:1)。在另一方面，RNA表達產(chǎn)物包括靴序列5'UACCUUACUCGCUCGGCUA3'(SEQIDNO:2)。在又一方面，本發(fā)明考慮了包括RNAi表達構(gòu)建體的藥物組合物，其中所述RNAi構(gòu)建體包括各自包含RNAi靶向序列的一種或多種RNAi表達盒，所述RNAi靶向序列包括與包括PLB或其衍生物、直系同源物或同源物的核苷酸序列的至少部分具有至少70%同一性的核苷酸序列。本發(fā)明的方法和組合物涉及施用有效量的RNAi或RNAi盒以實現(xiàn)預(yù)定的或期望的基因表達調(diào)節(jié)結(jié)果。這通常是在表型上測量的。設(shè)想在一些情況下，一定程度的常規(guī)試驗和誤差，如藥學(xué)領(lǐng)域公知的，可能是確定施用的最有效的量所必需的。“遺傳治療”在本文的含義包括基因治療。本發(fā)明預(yù)期的遺傳治療還包括體細胞基因治療，由此細胞被取出、進行遺傳修飾然后再放回個體中。基因治療可以是瞬時的或永久的。優(yōu)選地，所述動物是人類。在另一方面，本發(fā)明還擴展至包含如本文所述的ddRNAi表達盒或基因組整合形式或其部分的遺傳修飾的細胞。在一方面，所述細胞是哺乳動物細胞。在相關(guān)的方面，所述細胞是靈長類動物細胞或嚙齒動物細胞，并可包括人類或小鼠細胞。還公開了含有在用于施用的合適藥物懸浮液中的AAV載體的藥物試劑盒。在這一方面，本發(fā)明提供用于遞送所述重組的腺伴隨病毒載體或病毒體的藥物試劑盒。所述試劑盒可含有用于施用預(yù)定劑量的容器。所述試劑盒還可含有用于遞送預(yù)定劑量的含有基因轉(zhuǎn)移載體或病毒體的懸浮液，所述懸浮液包含(a)包含RNAi表達盒的AAV基因轉(zhuǎn)移載體或病毒體(b)生理學(xué)相容的載運體。本發(fā)明還提供編碼能夠形成雙鏈RNA復(fù)合體并因此能夠誘導(dǎo)RNA干擾的RNA分子的RNAi表達盒。此類RNAi表達盒可以是作為rAAV基因組的部分的單一DNA分子，該DNA分子在被引入細胞中時產(chǎn)生能夠形成分子內(nèi)dsRNA復(fù)合體的單一RNA分子。然而，應(yīng)理解，根據(jù)下列描述，可同時或順序向細胞中引入多于一個rAAV基因組或RNAi表達盒或RNA編碼區(qū)以產(chǎn)生能夠形成分子內(nèi)dsRNA復(fù)合體的兩個或更多個RNA分子。通常，能夠形成無論是分子內(nèi)或分子間dsRNA復(fù)合體的兩個RNA部分是其表達要被下調(diào)或降低的基因或核酸序列的至少部分正義序列和至少部分反義序列。RNAi表達盒的設(shè)計不限制本發(fā)明的范圍?？蓱?yīng)用設(shè)計RNAi表達盒的不同策略，并且基于不同設(shè)計的RNAi表達盒將能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)RNA干擾。所有RNAi表達盒共同的特征是它們包含編碼能夠通過形成分子內(nèi)或分子間雙鏈RNA復(fù)合體而單獨或與另一RNA分子組合來誘導(dǎo)RNA干擾的RNA分子的RNA編碼區(qū)?？墒褂貌煌脑O(shè)計原理來實現(xiàn)相同的目標(biāo)，這些設(shè)計原理是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，RNAi表達盒可編碼一種或多種RNA分子。在RNA從RNAi表達盒表達過程中或之后，可由單一的、自互補的RNA分子或兩個互補RNA分子形成雙鏈RNA復(fù)合體。dsRNA復(fù)合體的形成可在細胞核內(nèi)或細胞核外啟動。在一方面，提供了雙鏈RNA復(fù)合體，其包含能夠在生理條件下與mRNA分子的至少一部分雜交的第一RNA部分，和第二RNA部分，其中所述第二RNA部分的至少一部分能夠在生理條件下與所述第一部分雜交。在一方面，所述第一部分和第二部分是同一RNA分子的部分，并且能夠在生理條件諸如細胞內(nèi)存在的條件下雜交，雜交后，所述第一部分和第二部分形成雙鏈RNA復(fù)合體。在另一方面，提供形成雙鏈RNA復(fù)合體的線性RNA分子，該RNA包含能夠與細胞內(nèi)mRNA分子的至少一部分雜交的第一部分，和第二部分，其中所述第二部分的至少一部分能夠與所述第一部分雜交以形成發(fā)夾dsRNA復(fù)合體。在又一方面，所述方法包括具有部分或完全體內(nèi)雙鏈性狀的AAV-介導(dǎo)的RNA的表達。在某些實施方案，本發(fā)明可采用含有核酶的RNA分子以產(chǎn)生dsRNA復(fù)合體，由此克服與產(chǎn)生dsRNA相關(guān)的某些已知的困難。例如，可使用核酶功能來移除聚腺苷酸化信號，由此阻止或最小化RNA分子從細胞核的釋放。在其他實施方案中，本發(fā)明是基于RNA分子的部分編碼增強dsRNA的比活性的RNA或蛋白質(zhì)的能力。RNA分子的此比活性增強部分的一個實例是抑制細胞內(nèi)dsRNA復(fù)合體降解的編碼HIVTat蛋白質(zhì)的分子的部分。本發(fā)明還提供通過抑制受治療者心臟中的PLB表達治療受治療者中的心力衰竭、或降低室性心律失常、或增加心力衰竭后的受治療者存活的方法，包括向所述受治療者施用治療有效量的包含rAAV病毒體的藥物組合物，所述rAAV病毒體包含編碼能夠形成dsRNA復(fù)合體的至少一個RNA分子的一種或多種RNAi表達盒，其中在雜交條件下，所述dsRNA復(fù)合體的部分能夠與PLB基因編碼的mRNA的至少一部分雜交。在另一實施方案中，公開了增加肌質(zhì)網(wǎng)(SR)的鈣攝取的方法，包括使肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包括編碼RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列，其中所述RNAi包括在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，由此增加SR中的鈣攝取。對于本發(fā)明目的，“哺乳動物受治療者”意指哺乳動物類別的任何成員，包括但不限于人類和非人靈長類諸如黑猩猩以及其他猿和猴類物種；農(nóng)畜諸如牛、綿羊、動物、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物諸如狗和貓；實驗室動物包括嚙齒動物諸如小鼠、大鼠、倉鼠、兔和豚鼠以及類似動物。該術(shù)語不指明具體年齡或性別。因此，成年和新生受治療者以及胎兒，無論是雄性或雌性，均意欲涵蓋在內(nèi)。對于本發(fā)明目的，如本文所用的術(shù)語“個體”或“受治療者”或“患者”指脊椎動物，特別是哺乳動物物種的成員，包括但不限于家養(yǎng)動物、體育動物(sportsanimal)、靈長類和人類；更特別地，該術(shù)語指人類。本發(fā)明的病毒體可懸浮在藥學(xué)可接受的遞送運載體(即生理相容的載運體)中以施用于人類或非人類哺乳動物患者。合適的載運體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇，并可取決于選擇的核酸轉(zhuǎn)移載體的性質(zhì)。藥物組合物將包含足夠的遺傳物質(zhì)以產(chǎn)生治療有效量的dsRNA復(fù)合體。藥物組合物還將含有藥學(xué)可接受的賦形劑。此類賦形劑包括自身不誘導(dǎo)對接受組合物的個體有害的免疫應(yīng)答并且其施用不造成過多毒性的任何藥劑。藥學(xué)可接受的賦形劑包括但不限于，液體諸如水、鹽水、甘油和乙醇。其中可包括藥學(xué)可接受的鹽，例如礦物酸鹽諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽和類似礦物酸鹽；和有機酸鹽諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、安息香酸鹽和類似有機酸鹽。另外，此類運載體中可存在輔助物質(zhì)，諸如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)和類似輔助物質(zhì)。其他示例性載運體包括乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油和水。載運體的選擇不是本發(fā)明的限制因素。任選地，本發(fā)明的組合物可在AAV病毒體和運載體之外含有其它常規(guī)的藥物成分，諸如防腐劑或化學(xué)穩(wěn)定劑。合適的示例性成分包括微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚山梨酯80、苯乙醇、氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯類、乙基香草醛、甘油、苯酚、對氯酚、明膠和白蛋白。藥學(xué)可接受的賦形劑的詳盡討論可在REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(雷明頓藥物科學(xué))(MackPub.Co,NJ.1991)中獲得。可重建的遞送系統(tǒng)的溶液、懸浮液和粉末包括運載體，諸如懸浮劑(如樹膠類、黃原膠類(zanthans)、纖維素類和糖類)、濕潤劑(如山梨醇)、助溶劑(如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性劑(如硫酸月桂酯鈉、司盤(Spans)、吐溫和十六烷基吡啶)、防腐劑和抗氧化劑(如對羥基苯甲酸酯類、維生素E和C、以及抗壞血酸)、抗結(jié)塊劑、包衣劑和螯合劑(如EDTA)。在此發(fā)明中，施用本發(fā)明藥物組合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和遞送系統(tǒng)中的任何方法和遞送系統(tǒng)來實現(xiàn)或執(zhí)行。施用可例如靜脈內(nèi)、口服、經(jīng)由植入物、跨黏膜、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)和皮下進行。組合物可適于靜脈內(nèi)施用、動脈內(nèi)施用、心室內(nèi)施用或心瓣膜灌注。此外，本發(fā)明藥物組合物理想地含有一種或多種常規(guī)使用的藥學(xué)可接受的載運體。此類載運體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。采用多種常規(guī)使用的載運體的下列遞送系統(tǒng)僅是設(shè)想用于施用本發(fā)明組合物的許多實施方案的代表性實施方案?？勺⑸渌幬镞f送系統(tǒng)包括溶液、懸浮液、凝膠、微球和聚合物注射劑(polymericinjectables)，并可包含賦形劑諸如改變?nèi)芙庑詣?如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(如聚己內(nèi)酯(polycaprylactone)和PLGA)。可植入系統(tǒng)包括棒(rod)和盤(disc)，并可含有賦形劑諸如PLGA和聚己內(nèi)酯。確定本發(fā)明藥物組合物的治療或預(yù)防有效量可基于使用常規(guī)計算方法的動物數(shù)據(jù)進行。適當(dāng)?shù)膭┝繉⑷Q于不限于以下的因素選擇的轉(zhuǎn)移載體的特異性，施用路徑，受治療的哺乳動物(如人類或非人靈長類或其它哺乳動物)，所治療的受治療者的年齡、體重和一般狀況，治療的疾患的嚴(yán)重度、治療的區(qū)域在心臟內(nèi)的位置和施用模式。因此，適當(dāng)?shù)膭┝靠筛鶕?jù)患者不同而變化。適當(dāng)?shù)挠行Я靠捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。用于根據(jù)本發(fā)明的所述載體的體內(nèi)遞送的治療有效的人類劑量認為是在約20至約50ml鹽水溶液中含有約IOki至IO14功能載體/ml溶液的濃度范圍。將調(diào)整劑量以平衡針對任何副作用的治療益處。在又一實施方案中，藥學(xué)有效的AAV劑量通常在約IxlO5至IxlO5ci基因組rAAV、約IO8至IO2tl基因組AAV、約IOltl至約IO16基因組或約IO11至IO16基因組AAV的濃度范圍內(nèi)。人類劑量可以是約IxIO13AAV基因組AAV。此類濃度可在約0.OOlml至100ml、0.05至50ml或10至25ml載運體溶液中遞送。其它有效劑量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過常規(guī)試驗建立劑量響應(yīng)曲線而容易地建立。劑量治療可以是單一劑量方案或多劑量方案。而且，受治療者可接受適當(dāng)?shù)亩鄤┝渴┯?。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)?shù)膭┝繑?shù)。然而，劑量可能需要調(diào)整以考慮可選的施用路徑、或平衡針對任何副作用的治療益處。此類劑量可根據(jù)重組載體所用于的治療應(yīng)用而變化。保證轉(zhuǎn)移的核酸組合物的足夠的功能水平，以提供治療益處而無過多的不利的效應(yīng)或具有醫(yī)學(xué)可接受的生理效應(yīng)，其可由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員確定。任選地，在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的AAV-介導(dǎo)的遞送可與通過其它病毒和非病毒載體的遞送組合。此類其他病毒載體，包括但不限于腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體和桿狀病毒載體，可以容易地選擇，并可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。相似地，非病毒載體，包括但不限于脂質(zhì)體、基于脂質(zhì)的載體、多聚物(polyplex)載體、分子軛合物、多胺和聚陽離子載體，可以容易地選擇，并可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。當(dāng)通過這些可選的路徑施用時，劑量需要在上述范圍內(nèi)。動物(包括人類)擁有針對具有dsRNA基因組的病原體的天然防御機制dsRNA在胞質(zhì)溶膠中的存在誘導(dǎo)干擾素相關(guān)途徑的激活，這些途徑抑制RNA干擾。因此，為了避免激活這些途徑，dsRNA復(fù)合體長度不應(yīng)超過30堿基對一設(shè)計siRNA構(gòu)建體的首要規(guī)則。在某些實施方案中，dsRNA復(fù)合體的長度是至少20、21或22堿基對，如對應(yīng)于切酶依賴的切割產(chǎn)生的RNA產(chǎn)物的尺寸。下列實施例意欲說明而不是限制本發(fā)明。實施例1材料和方法重組的腺病毒載體和AAV載體的開發(fā)開發(fā)重組的腺伴隨病毒(rAAV)載體，假分型rAAV2.6用于體外研究，而rAAV2.9用于體內(nèi)工作。二者含有相同的AAV2載體基因組以及所示的shRNA表達盒，并進行相同的加工，只是分別使用質(zhì)粒AAV6cap用于rAAV2.6，使用AAV9cap用于rAAV2.9。在所有的體外和體內(nèi)研究中，僅使用自互補的(“二聚的”)rAAV基因組，因為與單鏈(“單體的”)rAAV載體相比它們具有增強的表現(xiàn)。從腺病毒(AdV)載體AdV-shPLB中先前使用的shRNA表達盒開始，該shRNA表達盒有效和穩(wěn)定地沉默了培養(yǎng)的原代新生大鼠心肌細胞(PNCM)中的PLB表達，試圖開發(fā)共表達shRNA和作為標(biāo)記的GFP的AdV和rAAV載體，這允許在使用心力衰竭(HF)動物的實驗中通過體內(nèi)成像跟蹤載體。但是，構(gòu)建體rAAV-shPLB-CMV-GFP與不含CMV-GFP組件的原始AdV-shPLB載體相比顯示非常低的沉默活性(圖1A)。rAAV載體在CMV的控制下產(chǎn)生GFP，CMV-GFP盒中的轉(zhuǎn)錄與U6-啟動子-shRNA盒以相反的方向運行。為了檢驗是否CMV啟動子本身和/或GFP序列造成了沉默活性的損失，使用內(nèi)含子“填充”序列代替GFP構(gòu)建了載體rAAV-shPLB-CMV-β-內(nèi)含子。rAAV-shPLB-CMV-GFP(尺寸為2.30kb)和rAAV-shPLB-CMV-β-內(nèi)含子(尺寸為2.55kb)二者均具有包裝入衣殼的視為必要的尺寸。不含CMV也不含GFP或β-內(nèi)含子，而僅含有來自AdV-PLB的原始TO_shPLB盒的第三載體賦予了1.15kb的總載體基因組尺寸。雖然如此，這一“極小化”rAAV-shPLB在標(biāo)準(zhǔn)方案中被有效包裝，很可能是作為多聯(lián)體。載體圖譜顯示于圖1C病毒載體產(chǎn)牛和純化rAAV9-shGFP和rAAV9-shPLB使用由Zolotukin等人(GenTher(1999)6(6)973-985)描述的雙質(zhì)粒方案產(chǎn)生，方案有以下修改在添加磷酸鈣沉淀之前，在三個燒瓶中培養(yǎng)293-T細胞(ATCC，Manassas，VA)24h(DMEM，10%FBS)。72小時后，經(jīng)碘克沙醇密度梯度(Optipr印，GreinerBio-OneInc，Longwood，F(xiàn)L)、然后是肝素-瓊脂糖I型親和層析(Sigma-AldrichInc,St.Louis,M0)從benzonase處理的細胞粗裂解物中純化病毒。最后，使用Vivaspin20離心濃縮機50KMWCO(VivascienceInc，Carlsbad，CA)濃縮病毒并將其配制成乳酸林格氏液(BaxterHealthcareCorporation,Deerfield,IL)，儲存在_80°C。載體質(zhì)量評估和滴定通過電泳后的銀染色評估載體貯液的生物化學(xué)純度(>95%)。含有基因組的顆粒(gcp)通過實時PCR方法(LightCycler,RocheDiagnostics)確定，使用SYBRGREENTAQREADYMIX(SIGMA,Saint-Louis,MO)和引物CMV-F禾口CMV-R。心肌細胞培養(yǎng)物中的載體評估原代新生心肌細胞(NRCM)適于在決定性的體內(nèi)檢驗之前預(yù)檢驗任何基于RNAi的心臟治療，這是因為雖然SERCA2a/PLB系統(tǒng)是發(fā)育調(diào)節(jié)的，但是其在NRCM中功能正常，而且靶向SERCA2a/PLB系統(tǒng)的腺病毒基因轉(zhuǎn)移策略在新生和成年心肌細胞二者中都取得了成功。雖然兩種細胞類型都非常適于體外預(yù)檢驗，但是培養(yǎng)的心肌細胞和體內(nèi)完整的心臟之間的許多其他差異使得培養(yǎng)細胞中對基于RNA的治療的任何體外研究都是相當(dāng)初步的。細胞培養(yǎng)物原代心肌細胞(PNCM)和原代新生心肌細胞(NRCM)從1_3天大的Wistar大鼠幼仔的心室組織制備。將PNCMs在6-孔皿中培養(yǎng)。受磷蛋白沉默的評估NRCM和大鼠心臟中的PLB、Tnl、NCX和SERCA2amRNA和蛋白表達水平、以及大鼠心臟中的SERCA2a和NCX蛋白質(zhì)通過所述的Northern印跡分析確定(Fechner等人，GeneTherapy(2006)；發(fā)行中)。RNAi治療過程中的鈣瞬變用8μMFluo-4/AM加載NRCM20分鐘后，測量IHz電刺激過程中的[&2+幾瞬變(120HZ、8.3ms/圖像下的圖像捕獲)。研究了五個NRCM治療組(細胞數(shù)目):AAV9-shPLB(η=26)、AAV9_shGFP(η=26)、AdV_shPLB(η=71)、AdV_shGFP(η=49)和未治療的對照細胞(η=32)。測量了瞬變振幅(收縮期[Ca2+](F/FJ)、其到達峰值的時間(TTP)(ms)和其衰變的時間常數(shù)τ(ms)。AAV9_shPLB治療NRCM過程中的[Ca2Ii瞬變的測量(圖IE和1F)顯示，與AAV9-shGFP組相比，此載體導(dǎo)致顯著更高的振幅和加快的瞬變動力學(xué)(具有縮短的TTP和τ)，AAV9-shGFP組具有與未治療的細胞不可分辨的瞬變。與AdV-shGFP組相比，AdV-shPLB治療還造成顯著更高的振幅。不過，與AAV9組相反，AdV-shPLB和AdV-shGFP中的TTP被延長，而τ則無差異。因此，AdV組中的肌質(zhì)網(wǎng)(SR)Ca2+負荷的其他研究(圖1D)如下進行在用SyMFluo-VAM加載NRCM20min、但接著迅速加入阻斷經(jīng)由SERCA2a的Ca2+進入SR的再攝取的20mM咖啡因后，再次測量IHz電刺激過程中的[Ca2+Ji瞬變。比較電刺激的[Ca2+Ji瞬變和咖啡因誘導(dǎo)的[Ca2+Ji瞬變，并計算Ca2+的釋放分?jǐn)?shù)(參見Kockskamper等人Endothelin-IenhancesnuclearCa2+transientsinatrialmyocytesthroughIns(1,4,5)P3-dependentCa2+releasefromperinuclearCa2+stores(內(nèi)皮縮血管肽_1通過核周Ca2+存儲的Ins(1,4,5)P3-依賴性的Ca2+釋放增強心房肌細胞中的核Ca2+瞬變).JournalofCellScience.2008;121:186_195，和其中引用的參考文獻)。肥大的誘導(dǎo)在部分體外研究中采用濃度為100μM的苯腎上腺素(PE)、10μM的血管緊張素II(Ang-II)和IOOnM的內(nèi)皮縮血管肽-I(ET-I)作為肥大性刺激。定量細胞內(nèi)miR的TAQMAN測定在PNCM/NRCM中在基線條件下(圖4A)或在肥大性劑存在下(圖4B-4D)進行。肥大性劑在培養(yǎng)的第2天添加，其單獨或與相應(yīng)的RNAi載體一起添加。小RNA測定使用下列引物通過TAQMAN測定來確定短發(fā)夾RNA(shRNA)表達水平。在探究載體來源的shRNA對心臟細胞內(nèi)miRNA途徑的可能的載體劑量依賴性影響中，采用TAQMAN測定定量已知在心臟中表達的以下miR:miRNA-l、miRNA_24、miRNA_133a、miRNA-208和miRNA_195。通過Taaman測定定量基因表汰和shRNA產(chǎn)牛微RNA測定在探究載體來源的shRNA對心肌細胞miRNA的可能影響中，使用TAQMAN測定來定量(圖4A-4C)已知在心臟中功能表達的兩種miRNA(miRNA-I、miRNA-133a)。BNP測定通過TAQMAN同樣地定量載體治療的大鼠的心臟中的心臟BNP基因表達(圖3G)。shPLB產(chǎn)生不同RNAi載體的短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)錄的定量(圖1B)按先前公布的方案進行(Fechner等人，HighlyEfficientandSpecificModulationofCardiacCalciumHomeostasisbyAdenovector-DerivedshorthairpinRNATargetingPhospho1amban(靶向受磷蛋白的腺病毒載體來源的短發(fā)夾RNA對心臟鈣穩(wěn)態(tài)的高效和特異性調(diào)節(jié))·GeneTherapy.2007；14:211-218；和Fechner等人，CoxsackievirusB3andadenovirusinfectionsofcardiaccellsareefficientlyinhibitedbyvector-mediatedRNAinterferencetargetingtheircommonreceptor(革巴向柯薩奇病毒B3和腺病毒的共同受體的載體介導(dǎo)的RNA干擾有效抑制它們對心臟細胞的感染).GeneTher.Jun2007；14(12):960_971)。主動脈綁扎用腹膜內(nèi)戊巴比妥(65mg/kg)麻醉四周齡SpragueDawley大鼠(70_80g)并將其置于通氣機上。進行胸骨切口以暴露主動脈根，并將內(nèi)徑0.58mm的鉭夾(Week，Inc.)夾在升主動脈上。模擬組中的動物經(jīng)歷相似的程序但不插入夾子。然后閉合鎖骨切口，并將大鼠放回它們的籠子。進行鎖骨方法是因為在基因遞送過程中，開胸術(shù)是必需的，而通過在初始的主動脈綁扎中不打開胸腔，避免了進行基因遞送時的粘連。將動物初始地分為兩組一組56只動物進行主動脈綁扎，第二組12只動物進行模擬手術(shù)(模擬手術(shù)動物中有10只存活)。在進行主動脈綁扎的動物中，在進行心臟基因轉(zhuǎn)移之前，我們等待了25-30周來讓動物發(fā)展左心室舒張和使射血分?jǐn)?shù)降低25%。在經(jīng)歷壓力超負荷肥大(pressureoverloadhypertrophy)的初始的56只動物中，僅有40只動物存活，將它們進一步分為接受Ad-shGFP(η=10)或Ad_shPLB(n=10)，或AAV9_shGFP(η=10)或AAV9-shPLB(η=10)。連續(xù)超聲波心動描記評估在綁扎二十二周后，在輕微麻醉的動物(戊巴比妥40mg/kg，腹膜內(nèi))中每周一次進行連續(xù)超聲波心動描記圖。使用GEVivid-7超聲機和12MHz寬頻轉(zhuǎn)換器進行經(jīng)胸M-模式和二維超聲波心動描記術(shù)。使用中乳頭水平左心室短軸視圖，并采集后壁厚度、左心室舒張期內(nèi)徑和縮短分?jǐn)?shù)測量。在檢測到與綁扎后12周的縮短分?jǐn)?shù)(FS)相比FS下降>25%的3天內(nèi)在所有動物中進行基因轉(zhuǎn)移。在模擬手術(shù)的大鼠中，基因遞送在第27周進行。靜脈內(nèi)灃射后的AAV9載體的心臟分布向大鼠靜脈內(nèi)(i.v.)注射表達標(biāo)記蛋白質(zhì)GFP的載體rAAV9_GFP或注射鹽水。遞送rAAV9-GFP或鹽水后一個月，摘除心臟，并在510nm在熒光系統(tǒng)下顯現(xiàn)(MaestroInVivoImaging,Woburn,ΜΑ),490nm藍光處的單激發(fā)峰(圖2B和2C)顯示觀察到的圖像。除了宏觀水平的此GFP表達顯現(xiàn)外，還在i.v.注射rAAV9_GFP后一個月進行GFP免疫組織化學(xué)染色以在微觀水平評估其分布(圖2D、2H和21)。30%過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶之后，在PBS緩沖液中清洗，以11000稀釋度加入多克隆兔抗hrGFP抗體(VITALITY,目錄號240142，Stratagene)120min。清洗后，作為二級抗體，以150稀釋度使用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/HRP抗體(目錄號P0448，Dako，Glostrup,Denmark)60min。使用haemalaun的染色禾口復(fù)染如所述地進行(Noutsias等人，HumanCoxsackie-Adenovirus-ReceptorisCo-LocalizedwithIntegrinsανβ3andανβ5οηtheCardiomyocyteSarcolemmaandUpregulatedinDilatedCardiomyopathy-ImplicationsforCardiotropicViralInfections(人類柯薩奇—腺病毒-受體與整聯(lián)蛋白ανβ3和ανβ5共定位于心肌細胞肌膜并在舒張性心肌病中上調(diào)-對親心性病毒感染的暗示)·Circulation.2001；104:275_280)。對于不同器官中GFP表達的Western印跡分析，以15000稀釋度使用多克隆兔抗hrGFP抗體(VITALITY，目錄號240142Stratagene)在4°C過夜。作為二級抗體，以12000稀釋度使用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/HRP抗體(目錄號P0448，Dako，Glostrup,Denmark)在室溫60min。然后將GFPWestern印跡對X-光膠片曝光5min。這些膠片的定量在圖2J中給出。體內(nèi)RNAi治療的實驗方案腺病毒遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的。簡要而言，在麻醉大鼠和進行開胸術(shù)后，將含有200μ1腺病毒(3X10、^)溶液的22G導(dǎo)管從左心尖前進至主動脈根。在距導(dǎo)管部位的遠端夾住主動脈和肺動脈主干40sec并注射溶液，然后閉合胸腔，讓動物恢復(fù)。對于使用rAAV9的實驗，使用5x10"個任一種rAAV9shRNA的載體基因組進行簡單的尾靜脈注射。模擬組的動物注射鹽水。RNAi治療過程中的血液動力學(xué)評估將不同治療組和處于腺病毒基因轉(zhuǎn)移的不同階段的大鼠用40mg/kg戊巴比妥麻醉和機械通氣。然后通過中線切口打開胸腔，暴露出心臟。然后在左心尖開一小口，向左心室引入2.OFr.高保真壓力轉(zhuǎn)換器(MILARInStrumentS，TX)。壓力測量在IKHz下進行數(shù)字化并儲存用于進一步的分析。測量或獲得了不同組的左心室收縮壓(LVSP)、舒張末期左心室壓力(LVDP)、最大壓力上升速率(+dP/dt)和最大壓力下降速率(-dP/dt)和松弛時間常數(shù)(t)。使用以下等式測量了等容松弛的時間過程V=Ρ^—μ+Ρβ，其中P是左心室等容壓力，Ptl是達到峰值-dP/dt時的壓力，Pb是殘余壓力。RNAi治療后的心臟組織學(xué)心肌細胞尺寸和心臟纖維化對動物子集進行組織學(xué)分析以評估肌細胞尺寸(CMD)和膠原蛋白含量(CAP)。將LV樣本用10%福爾馬林固定并在石蠟中包埋。切片(3μm厚)用蘇木精-曙紅染色以確定CMD或用Azan-Mallory染色以評估CAP。在縱向定向的心肌細胞中，跨核寬度測量為CMD(圖3F)。在每個Azan-Mallory切片的六個部位拍攝數(shù)碼照片。使用NIH成像儀通過計數(shù)計算機化的像素分別確定間隙/血管周圍膠原蛋白面積和肌細胞面積(圖3E)。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值士SD。使用STATVIEW(AbacusConcepts,Barkeley,CA)通過ANOVA進行多重比較。接受P<0.05水平的統(tǒng)計顯著性。進行雙因子ANOVA以比較不同組之間的不同血液動力學(xué)參數(shù)。對于回波數(shù)據(jù)，其中以不同的區(qū)間檢查變量，進行重復(fù)測量的AN0VA。接受ρ<0.05水平的統(tǒng)計顯著性。實施例2RNAi載體系統(tǒng)的優(yōu)化研究了病毒RNAi載體沉默效力的決定因素，因為觀察到具有顯然很小結(jié)構(gòu)差別的AAV-shPLB載體在體外在PNCM中顯示顯著不同的shRNA產(chǎn)生速率和靶沉默(圖1)。對于PNCM中的這些初始研究，使用了AAV2.6假型，其在體外具有比AAV2.9更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效力。對于圖2和3中報告的稍晚的RNAi治療研究，僅使用了AAV2.9，其顯示更好的體內(nèi)心臟轉(zhuǎn)導(dǎo)。體外實驗顯示共表達向含有shPLB載體的細胞加標(biāo)簽的GFP標(biāo)記蛋白質(zhì)幾乎消除了shPLB產(chǎn)生(圖1B)和PLB沉默(圖1A)。如果GFP由CMV驅(qū)動，以及如果CMV連接于β-內(nèi)含子，含有用于shRNA轉(zhuǎn)錄的TO啟動子的表達盒中CMV啟動子的存在強烈降低shRNA產(chǎn)生(圖5Α)。圖1顯示到目前為止，最高的效力是由以前認為太短而無法進行有效包裝的AAV構(gòu)建體展示的。PNCM中AdV-shPLB與AAV6_shPLB的shRNA轉(zhuǎn)錄的比較顯示，到第10天腺病毒的表達下降了三分之一，而AAV載體的表達則不變(圖IB)。4xl03p/c劑量下，兩種載體的PLB表達消除都>98%。令人感興趣的是，允許通過體內(nèi)成像進行檢測的CMV-GFP盒的并入意外地導(dǎo)致載體不能沉默其靶標(biāo)。CMV啟動子驅(qū)動的標(biāo)記基因表達顯然不適合用于U6-shRNA載體，因此僅有最簡單和有效的TO-shRNA載體(圖1)被選擇用于體內(nèi)RNAi。由于rAAV9-shRNA與AdV-shPLB相比的高度穩(wěn)定的shRNA產(chǎn)生和長期的體內(nèi)穩(wěn)定性，因此將其用于長期體內(nèi)治療。對于短期治療，使用腺病毒載體。在體外，蛋白質(zhì)水平的PLB消除比mRNA水平的PLB消除滯后數(shù)天，在第7天，蛋白質(zhì)水平分別下降了基線的9%(AdV-shPLB)和12%(rAAV6-shPLB)(圖ID)。與AAV9_shGFP組相比，對AAV9_shPLB治療NRCM過程中的[Ca2Ii瞬變的測量(圖IE和1F)顯示此載體導(dǎo)致顯著更高的振幅和加快的瞬變動力學(xué)(縮短的TTP和τ)，AAV9-shPLB組具有與未治療的細胞不可分辨的瞬變。與AdV-shGFP相比，AdV-shPLB治療還造成顯著更高的振幅。與AAV9組相反，AdV-shPLB和AdV-shGFP中的TTP被延長，而τ則無差異。AdV組中的肌質(zhì)網(wǎng)(SR)Ca2+負荷研究顯示AdV-shPLB和AdV-shGFP組中增加的SRCa2+負荷和自SR的Ca2+釋放分?jǐn)?shù)(FR)(圖5D)。關(guān)于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞間差異，圖5B顯示用rAAV-GFP標(biāo)記載體治療的NRCM中大致均勻的GFP表達，其可充當(dāng)對體外均勻的shPLB表達的直接展示的最佳可能逼近。使用現(xiàn)有的技術(shù)，均勻的shPLB表達可能無法直接顯現(xiàn)，原因是GFP與shPLB的共表達消滅了其沉默能力(圖IB和1C)。所述RNAi載體在體內(nèi)在大鼠心臟中均勻的空間和時間分布還由與用于RNAi治療(圖3A-3D)的相同類型的GFP載體(rAAV9)的熒光成像(圖2B和2C)間接推斷出來。圖2D和圖2H-2J顯示i.v.注射rAAV9-GFP后心臟和其它器官的GFP免疫組織化學(xué)染色。心臟中強烈和大致均勻的表達與肝和骨骼肌中的微弱染色以及肺中的無可見染色形成對比(定量參見圖2J)。實施例3體內(nèi)RNAi治療的效力跨主動脈的縊痕在30周后導(dǎo)致大鼠中嚴(yán)重的HF。體內(nèi)RNAi治療的實驗方案概述于圖2。與用于RNAi治療的相同類型(rAAV9)的GFP載體的熒光成像和免疫組織學(xué)分析在宏觀和微觀水平顯示了i.v.注射后一個月大致均勻的心臟GFP表達，并可被假定為接近RNAi載體產(chǎn)生的心臟shRNA表達水平(圖2B-2D)?，F(xiàn)有技術(shù)難以實施體內(nèi)shPLB產(chǎn)生的直接測量。圖2F和2G顯示用AdV-shPLB或rAAV9_shPLB治療后顯著下降的心臟PLB蛋白質(zhì)。SERCA2a蛋白質(zhì)在衰竭的心臟中是降低的，而shPLB治療伴有心臟SERCA2a蛋白質(zhì)的增加。NCX未發(fā)生顯著變化。與AdV-shGFP對照載體(產(chǎn)生針對GFP的shRNA序列)相比，通過主動脈根注射AdV-shPLB的治療充當(dāng)嚴(yán)重HF的短期治療模型。注射后一個月，AdV-shPLB中的舒張功能(圖3A)顯著(ρ<0.05)好于對照組左心室舒張末期壓力(LVEDP)10士3mmHg對比14+4mmHg,LV壓力下降速率(_dp/dt)5215士540對比4017+471mmHg/sec，等容松弛時間常數(shù)1^11(1)17士3對比24+41^沈。收縮功能(圖3B)同樣得到改善，LV收縮壓(LVSP)90士5對比78士4mmHg、LV壓力上升速率(+dp/dt)7.448士659對比5.624士698mmHg/sec，和縮短分?jǐn)?shù)(FS)46.1士3.2對比39.1+3.7%。除了對血液動力學(xué)的有益效應(yīng)之外，TAB后LV重量和舒張的大幅增加在一個月時也被顯著降低LV重量1.34士0.22對比1.87士0.21g，LV/體重(LV/BW)比2.4士0.2對比3.2士0.2x10"3,LV/脛骨長度(LV/TL)比29.3士4對比43.3+5(圖3C)。這些死亡后形態(tài)測定數(shù)據(jù)與超聲波心動描記術(shù)相關(guān)(圖3D)。存活率為8/10對比9/10。與AAV9_shGFP載體相比，通過尾靜脈注射最有效AAV9_shPLB的治療充當(dāng)慢性嚴(yán)重HF的長期治療模型。注射后三個月，與對照組相比，AAV9-shPLB治療中的舒張功能(圖3A)得到顯著改善，并且不再顯著不同于模擬手術(shù)的(無主動脈綁扎)非HF組LVEDP為8士3mmHg對比18士4(非HF:6士2)mmHg,-dp/dt5.722士503對比3.877+643(非HF6.O32士344)mmHg/sec，Tau16+3對比23士4(非HF:14士3)msec。收縮功能(圖3B)也得到恢復(fù)，盡管遜色于舒張功能參數(shù)LVSP92士4對比80+3(非HF:98士4)mmHg，+dp/dt7.851+803對比4.997士766(非HF8.772士832)mmHg/sec，F(xiàn)S50.1+2.1對比35.2+5.1%(非HF:52.2+4.1)。除了血液動力學(xué)之外，這一治療在3個月時降低了LV肥大和舒張LV重量1.34+0.12對比1.76士0.27g(非HF1.11+0.09),LV/BW2.2士0.1對比3.1士0.2xl(T3(非HF:1·8+0.2)，LV/TL27.2士4對比45.3士5(非HF:24.5+4)(圖3C)。超聲波心動描記術(shù)確證了LV壁厚和舒張的降低(圖3D)。組織學(xué)顯示rAAV9-shRNA治療3個月后心肌細胞尺寸和心臟膠原蛋白二者均有降低(圖3E和3F)。3個月后AAV9-shPLB-治療的動物的存活率為9/10，對比對照組中的6/10。實施例4心力衰竭的RNAi治療這些數(shù)據(jù)表明，對于中間時間尺度，腺病毒載體可能是足夠的，甚至可提供超過長期穩(wěn)定的AAV的優(yōu)點(Wang等人，NatBiotechnol(2005)23:321_328；Gregorevic等人，NatureMedicine(2004)10:828_834；Inagaki等人，MolTher(2006)14:45_53；Pacak等人，CirRes(2006)99:e3_9)，原因是在急性和可能逆轉(zhuǎn)的HF中僅短暫地需要RNAi。事實上，AdV-shPLB治療后一個月舒張和收縮功能以及LV形態(tài)學(xué)的顯著改善證明了腺病毒系統(tǒng)的至少功能性治療益處。先前顯示的用于經(jīng)典基因轉(zhuǎn)移治療的內(nèi)容(delMonte等人，ProcNatlAcadSciUSA(2004)101:5622_5627;Sakata等人，JMolCellCardiol(2007)42852-861；Sakata等人，AmJPhysiolHeartCircPhysiol(2007)292:Η1204_1207；Sakata等人，MolTher(2006)13:387_996)顯然也可適用于基于RNAi的策略，盡管存在對RNAi載體結(jié)構(gòu)的其他限制因素以避免損失治療效力(圖IA和1Β)和擾亂miRNA途徑。雖然從AAV產(chǎn)生shRNA在幾個方面不同于經(jīng)典的基因轉(zhuǎn)移(圖1)，但是來自本發(fā)明AAV組的數(shù)據(jù)提供了基于AAV的shRNA產(chǎn)生在能夠改善心臟功能和可能的存活的水平保持穩(wěn)定數(shù)個月的一手證據(jù)。本文使用的AAV9載體實現(xiàn)了應(yīng)用于人類HF的一個首要要求，因為在靈長類中它是親心性的(Pacak等人，(2006))。與嚙齒動物相反，可調(diào)節(jié)的PLB調(diào)節(jié)是人類中最可能需要的，因為已將由基因組突變造成的永久性PLB缺乏或PLB功能失調(diào)與心肌疾病關(guān)聯(lián)(Schmitt等人，Science(2003)2991410-1413；Haghighi等人，ProcNatlAcadSciUSA(2006)1031388-1393;Zhao等人，(2006)113:995-1004)。然而，藥物可調(diào)節(jié)的RNAi顯示在現(xiàn)有載體平臺上是可能的。RNAi治療后，發(fā)現(xiàn)與HF組相比，SERCA2a表達增加，這與RNAi治療使LV功能正?；氖聦嵰恢隆Ｒ驗镾ERCA2a表達是HF程度的公知標(biāo)志物，其通過shPLB的RNAi治療后ERCA2a的增加反映了改善的心臟功能狀態(tài)。實施例5RNAi治療過程中的心肌細胞微RNA表達RNAi的細胞機器經(jīng)過數(shù)百萬年的進化，是已知用于特異性基因沉默的最有效和通用的機制。shRNA采用這一機器通過模擬內(nèi)源過程介導(dǎo)治療效應(yīng)，在遠低于反義RNA的濃度下實現(xiàn)沉默，但可擾亂細胞miRNA途徑(Grimm等人，Nature(2006)441:537_541)。因為miR在心臟形態(tài)發(fā)生(Zhao等人，Cell(2007)129:303_317)、肥大(Care等人，NatureMedicine(2007)13613-618；vanRooij等人，Science(2007)316:575_579)、心律失常發(fā)生(Yang等人，NatureMedicine(2007)13486-491)和衰竭(Thum等人，Circulation(2007)116258-267；vanRooij等人，ProcNatlAcadSciUSA(2006)10318255-18260)中起重要作用，在PNCM/NRCM中在miRNA水平探究了RNAi載體的可能副作用。首先，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，然后在肥大誘導(dǎo)藥物苯腎上腺素(PE)存在下。在無此肥大性刺激時，體內(nèi)使用的載體無一對在心臟中具有已知的功能重要性的細胞miRl、21、133a、195,208具有任何顯著效應(yīng)(圖4B)。在PE存在下，在培養(yǎng)的第5天，幾種心肌細胞miRNA有顯著的下降(圖4A)。顯著地，具有抗肥大(Care等人(2007)MicroRNA-133controlscardiachypertrophy(微RNA-133控制心臟肥大)·NatMed13，613-8；和vanRooij等A(2007)Controlofstress-dependentcardiacgrowthandgeneexpressionbyaMicroRNA(微RNA控制應(yīng)激依賴的心臟生長和基因表達).Science316，575-9)和抗心律失常發(fā)生(Yang等人(2007)Themuscle-specificmicroRNAmiR-lregulatescardiacarrhythmogenicpotentialbytargeticGJAlandKCNJ2(肌肉特異性微RNAmiR-I通過靶向GJAl和KCNJ2調(diào)節(jié)心臟心律失常發(fā)生潛能).NatMed13,486-191)潛能的miRNA的水平的這一下降在用AdV-shPLB或AAV6-shPLB治療的PNCM中被反轉(zhuǎn)，AdV-shPLB或AAV6-shPLB將這些miRNA的水平恢復(fù)至基線在PE存在下，在培養(yǎng)的第5天，心肌細胞miR有顯著的下降(圖4B)。顯著地，具有抗肥大(Zhao等人，(2007)；Care等人，(2007))和抗心律失常發(fā)生(Yang等人，(2007))潛能的miR的這一下降在用AdV-shPLB或AAV6_shPLB治療的PNCM中被反轉(zhuǎn)，AdV-shPLB或AAV6-shPLB將這些miRNA的水平恢復(fù)至基線，其中特別值得關(guān)注的是miRNA-133和miRNA-1。由于惡性心律失常是HF中重要的并發(fā)癥，新穎治療對任何心律失常相關(guān)的微RNA諸如miRNA-1的脫調(diào)節(jié)(Yang等人，(2007))應(yīng)被視為可能的嚴(yán)重有害作用。然而，體外數(shù)據(jù)顯示PE-誘導(dǎo)的miRNA-1降低被shPLB治療抵消(圖4A-4C)。結(jié)合AAV_shPLN治療組中存活改善的趨勢，目前為止沒有此治療的心律失常發(fā)生的副作用的證據(jù)。用shPLB載體治療的大鼠心臟具有比shGFP組更高的miRNA水平(圖2H-2J)。關(guān)于RNAi載體的可能副作用，載體注射后肝(圖2E)和其他器官的HE染色揭示無病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。miRNA-133在控制心肌細胞尺寸中起關(guān)鍵作用(Care等人，(2007))，并且在通過RNAi治療降低肥大方面值得關(guān)注。不管體外shPLB治療恢復(fù)miRNA-133水平的分子機制如何，必須承認它們的升高具有抗肥大效應(yīng)。雖然RNAi治療過程中改善的收縮和舒張功能是由其對經(jīng)由總體Ca2+瞬變的興奮-收縮偶聯(lián)(ECC)的影響直接造成的，觀察到的LV肥大和舒張的顯著降低(圖3C、3D和3F)是不容易推斷的，原因是RNAi治療主要僅靶向總體Ca2+循環(huán)的單個組分。意外的是，這一狹窄靶向的干預(yù)仍然將幾種PE誘導(dǎo)的miRNA抑制恢復(fù)到正常水平(圖4A)。由于在體外，無論是血液動力學(xué)應(yīng)激，還是像體內(nèi)HF中那樣的細胞因子活化的神經(jīng)體液，都不能起任何作用，因此這一恢復(fù)顯然是由細胞水平的Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)造成的。因為無法假定PLB消除對細胞內(nèi)miRNA的直接效應(yīng)，所以RNAi誘導(dǎo)的Ca2+穩(wěn)態(tài)變化顯然不僅影響收縮相關(guān)的總體Ca2+瞬變，而且還影響核周腔中產(chǎn)生的單獨的和隔離的Ca2+信號(Wu等人，JClinInvest(2006)116675-682；MolkentinJ,JClinInvest(2006)116623-626)，這些Ca2+信號決定肥大過程中的轉(zhuǎn)錄變化。被PE誘導(dǎo)并且被RNAi校正的miRNA抑制可能僅反映改變的Ca2+穩(wěn)態(tài)引起的細胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的間接變化?？蛇x地，后者可作為第一靶標(biāo)直接影響miRNA表達?；谶@些結(jié)果，開發(fā)了針對心臟疾病的高效的局部化RNAi治療策略。當(dāng)使用優(yōu)化的RNAi載體和主動脈根載體注射將RNAi限于心臟時，不存在毒性或擾亂miRNA途徑的證據(jù)。不被理論束縛，載體miRNA對肥大相關(guān)的miRNA的脫調(diào)節(jié)的矯正表明miRNA參與治療過程。雖然通過腺病毒載體的短期的RNAi-介導(dǎo)的PLB沉默在1個月后改善了心臟功能，但是來自優(yōu)化的親心性AAV9載體的長期RNAi在3個月的時間段內(nèi)改善HF大鼠中的功能、形態(tài)和存活。此外，使用所公開的載體在缺血灌注模型中造成降低的心室心律失常以及心室功能的改善。而且，PLB的抑制增加了具有轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ叩膲毫Τ摵煞蚀蟮膭游锏拇婊?。雖然已參考上述實施例描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解，修改和變化涵蓋在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅受下列權(quán)利要求的限制。權(quán)利要求一種治療受治療者中心力衰竭的方法，包括向有相應(yīng)需要的受治療者施用有效治療所述受治療者的心力衰竭的量的包含RNAi表達盒的載體，其中所述盒包含RNAi序列，所述RNAi序列的表達產(chǎn)物降低受磷蛋白(PLB)的表達或活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述RNAi表達盒包含SEQIDN0:1所列的核苷酸序列，由此與施用所述載體之前相比改善所述受治療者的收縮功能。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體是病毒體。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體是質(zhì)粒。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述病毒體是細小病毒。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細小病毒是腺伴隨病毒(AAV)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述AAV是血清型9。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中PLBmRNA的表達被抑制。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中SEQIDNO:1的側(cè)翼為AAV末端重復(fù)序列。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中病毒體載體的基因組是自互補的。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受治療者是哺乳動物。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述受治療者是人類。13.一種藥物組合物，包含重組的腺伴隨病毒(AAV)載體和藥學(xué)可接受的載運體，其中所述載體包含其RNA表達產(chǎn)物導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)的表達或PLB活性降低的RNAi表達盒。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述RNAi表達盒的RNA表達產(chǎn)物包含在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述RNAi表達盒包含SEQIDNO=I所列的核苷酸序列。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述RNA表達產(chǎn)物還包含SEQIDNO2所列的靶序列。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物適于靜脈內(nèi)施用。18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物適于動脈內(nèi)施用。19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物適于心室內(nèi)施用。20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述組合物適于心瓣膜灌注。21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述AAV是血清型9。22.—種腺伴隨病毒(AAV)載體，包含至少一個AAV末端重復(fù)序列，其中所述載體包含其RNAi表達產(chǎn)物導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達或PLB活性降低的RNAi表達盒。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的腺伴隨病毒，其中所述RNAi表達盒的RNA表達產(chǎn)物包含在嚴(yán)格條件下與PLB基因mRNA核苷酸序列雜交的核苷酸序列，由此轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌細胞。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的AAV載體，其中所述RNAi表達盒包含SEQIDNO1所列的核苷酸序列。25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的AAV載體，其中所述RNA表達產(chǎn)物還包含SEQIDNO2所列的靶序列。26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的AAV載體，其中所述AAV是血清型9。27.一種增加肌質(zhì)網(wǎng)(SR)的鈣攝取的方法，包括使肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包含編碼RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列，由此增加SR中的鈣攝取。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述RNAi包含在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，由此與接觸所述載體之前的收縮性相比增強心肌細胞的收縮性。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述載體還包含SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述RNAi包含SEQIDNO:2所列的靶序列。31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述RNAi表達盒的RNA編碼區(qū)的表達造成PLB基因的表達下調(diào)。32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述RNAi載體包含與PLB靶基因的RNA編碼區(qū)具有至少約90%同一性的序列。33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中PLB基因表達被抑制至少10%。34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述AAV基因組是自互補的。35.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述AAV是血清型9。36.一種試劑盒，包含i)腺伴隨病毒(AAV)載體，其中所述載體包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)的表達或PLB活性降低的RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列；)一種或多種緩沖液；iii)使用(i)和(ii)組成部分的說明；以及iv)包含(i)、(ii)和(iii)組成部分的容器。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述RNAi包含在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述載體包含SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述RNAi還包含SEQIDNO:2所列的靶序列。40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述AAV是血清型9。41.一種診斷受治療者對所述受治療者胞內(nèi)鈣失調(diào)所致的慢性心力衰竭(HF)的RNAi治療的易感性的方法，該方法包括(a)使受治療者的肌肉組織樣品與腺伴隨病毒(AAV)載體接觸，其中所述載體包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達或活性降低的RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列；和(b)確定所述肌肉組織樣品與AAV9載體接觸之前和之后所述組織樣品中肌質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶泵(SERCA)的活性，其中SERCA活性的增加與受治療者對HF的RNAi治療的易感性相關(guān)。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述RNAi包含在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述載體包含SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述RNAi還包含SEQIDNO2所列的靶序列。45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述受治療者是人類。46.一種改善具有慢性心力衰竭的受治療者的存活的方法，該方法包括施用載體，其中所述載體包含編碼導(dǎo)致受磷蛋白(PLB)mRNA的表達或PLB活性降低和收縮功能改善的RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列，由此改善所述受治療者的存活。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述RNAi包含在嚴(yán)格條件下與PLB靶基因mRNA的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述載體是病毒體或質(zhì)粒。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述病毒體是細小病毒。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述細小病毒是腺伴隨病毒(AAV)。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述AAV是血清型9。52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述病毒體包含SEQIDN0:1所列的核苷酸序列。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中SEQIDNO1的側(cè)翼為AAV末端重復(fù)序列。54.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述RNAi還包含SEQIDNO2所列的靶序列。55.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述受治療者是人類。56.一種降低受治療者的室性心律失常的方法，該方法包括施用包含編碼RNAi表達產(chǎn)物的多核苷酸序列的載體，其中所述RNAi包含改善心室功能的核苷酸序列，由此降低所述受治療者的室性心律失常。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述載體是病毒體或質(zhì)粒。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述病毒體是細小病毒。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述細小病毒是腺伴隨病毒(AAV)。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述AAV是血清型9。61.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述病毒體包含SEQIDNO:1所列的核苷酸序列。62.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述RNAi還包含SEQIDNO2所列的靶序列。63.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述受治療者是人類。全文摘要本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)缺陷的心臟Ca2+穩(wěn)態(tài)而治療心力衰竭的靶向RNAi，所述調(diào)節(jié)是經(jīng)由使用腺伴隨病毒(AAV)轉(zhuǎn)染心肌細胞來降低受磷蛋白(PLB)的表達或活性。還公開了在受治療者中降低室性心律失常的方法，以及全面改善心力衰竭存活的方法。此外，本發(fā)明提供了可用于診斷對RNAi治療的易感性的方法，并包括包含RNAi序列的藥物組合物、試劑盒和載體。文檔編號C12N15/63GK101970051SQ200880125234公開日2011年2月9日申請日期2008年12月23日優(yōu)先權(quán)日2007年12月31日發(fā)明者亨利·費克納,沃爾夫?qū)h.·波爾,羅杰·J·哈賈申請人:納諾科爾治療公司