專利名稱：將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化毛囊，以及一種通過轉(zhuǎn)化毛囊將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動物的方法。
背景技術(shù)：
近年來，已經(jīng)鑒別了致病基因、再生相關(guān)基因和其它類似基因，許多病理狀態(tài)和再 生基于其分子水平的機(jī)理而已經(jīng)得到闡明。在這種情況下，現(xiàn)在進(jìn)行的研究在于將外源基 因轉(zhuǎn)移至病人或其它實(shí)驗(yàn)對象的細(xì)胞中，用于病人或?qū)嶒?yàn)對象的疾病的治療以及器官和組 織的再生。通常，用已知的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)外源基因至細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，例如，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(用脂質(zhì) 體)和使用病毒載體，例如，腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在這些技術(shù)中，從基因轉(zhuǎn)移效 率的觀點(diǎn)來看，廣泛采用那些利用了病毒載體的技術(shù)。此外，最近為了克服逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 只可以轉(zhuǎn)移至有絲分裂細(xì)胞中的缺點(diǎn)，已經(jīng)使用慢病毒載體，它是通過將屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒 科(例如，HIV-1)的RNA病毒中的高危特定序列進(jìn)行刪除或失活而構(gòu)建的。另外，也使用 假型慢病毒載體，其所涉及的結(jié)合在細(xì)胞表面的包膜蛋白(envelope protein)變?yōu)閺陌捳?性口腔炎病毒(VSV)、伊波拉薩伊(EboZ)病毒而來的包膜糖蛋白或類似蛋白，從而提高了 對特定細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率。以往的研究事實(shí)上表明使用EboZ糖蛋白作為包膜蛋白，提高了 基因轉(zhuǎn)移至人呼吸道上皮細(xì)胞的效率(Kobinger GP. et al. ,Nat. Biothcnol. 19 :225_230， (2001))以及使用VSV-G作為包膜蛋白，提高了基因轉(zhuǎn)移至人表皮干細(xì)胞的效率(Hachiya A. et al.，Gene Ther. 14 :648_56，(2007))。同時(shí)，考慮到在基因轉(zhuǎn)移時(shí)或轉(zhuǎn)移后監(jiān)測的方便、容易等因素，通常使用存在于 身體表面的皮膚組織的細(xì)胞來作為轉(zhuǎn)移進(jìn)外源基因的細(xì)胞。由于表皮和毛囊是由細(xì)胞在 最終分化階段形成，其干細(xì)胞不斷產(chǎn)生新細(xì)胞(Cotsarelis G.，J Invest. Dermatol. 126 1459-1468，(2006))。因此，當(dāng)希望外源基因長時(shí)間表達(dá)時(shí)，必須將該基因轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的干 細(xì)胞中。至今，在表皮中，已知干細(xì)胞存在于表皮基底層，然而在毛囊中，已知干細(xì)胞存在于 隆突區(qū)。由于研究表明毛囊的干細(xì)胞在表皮傷口的愈合中起到重要作用，與通常的表皮更 新相反(Ito M. et al.，Nat. Med. 11(12) 1351-1354，(2005))，存在于毛囊的隆突區(qū)的表皮 細(xì)胞和黑色素干細(xì)胞已經(jīng)受到關(guān)注，將基因轉(zhuǎn)移至毛囊的干細(xì)胞中已經(jīng)變得越來越重要。換言之，如果在愈合期間將促進(jìn)傷口愈合的外源基因轉(zhuǎn)移至隆突區(qū)的干細(xì)胞中， 部分表皮從具有新的附加功能的干細(xì)胞得到重建。因而，將基因轉(zhuǎn)移至隆突區(qū)的干細(xì)胞中 的技術(shù)實(shí)現(xiàn)了更有效的表皮再生，并且是用于基于表皮中特定基因表達(dá)的基因治療的可以 想象地有效方式。關(guān)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，已經(jīng)報(bào)道了使用脂質(zhì)體包封LacZ，將基因轉(zhuǎn)移至含有小鼠毛 囊的組織中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Li L. et al. ,Nat. Med 1:705-706(1995))。另一出版物記載了對 于脂質(zhì)體組合物優(yōu)選的受體是處于生長階段的毛囊，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，可以將基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)移至被移植到免疫缺陷小鼠上的人頭皮塊的大約10%的毛囊中(Domashenko，A. et al.， Nat. Biotechnol. 18(4) :420_423，(2000))。然而，由于基因是通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法而被暫時(shí)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，該技術(shù)不適合基因 長期表達(dá)的挑戰(zhàn)仍然存在。還有報(bào)道當(dāng)小鼠毛囊組織用膠原酶處理后，接著用腺病毒載體轉(zhuǎn)移基因，從而成 功地在體外對該組織進(jìn)行基因修飾，并且可以將由此修飾的組織成功地移植到健康的哺乳 動物實(shí)驗(yàn)對象上(W02001/042449，US 7067496，JP 2004-500809, Norimitsu S. et al.， PNAS 99(20) 13120-13124，(2002))。然而，即使使用腺病毒載體，轉(zhuǎn)基因存在于細(xì)胞質(zhì)中，而且得到的基因表達(dá)只是暫 時(shí)的，這也仍然是挑戰(zhàn)。據(jù)進(jìn)一步報(bào)道，通過膠原酶處理將完整的毛囊從小鼠真皮分離出來，接著用 Moloney小鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒(MoMLV)載體將致癌基因轉(zhuǎn)移至該完整的毛囊中，通過 移植，癌癥可以在裸鼠的基因轉(zhuǎn)移組織中發(fā)展(Weinberg W. C. et al.，Carcinogenesis 12:1119-1124，(1991) ；Dennis R. R. et al. , Nature 323:822-824，(1986))。還報(bào)道 了用小鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒(MLV)載體將酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)移至包裝細(xì)胞中，接著將包裝 細(xì)胞和小鼠皮膚組織共同培養(yǎng)，至第6天確認(rèn)在小鼠毛囊的毛母質(zhì)和毛干中出現(xiàn)黑色素 (W02001/042449, US7067496, JP2004-500809)。然而，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因轉(zhuǎn)移至例如神經(jīng)細(xì)胞這樣的非增殖細(xì)胞時(shí)遇到 困難，基因轉(zhuǎn)移細(xì)胞的類型不利地受到限制。該領(lǐng)域普遍接受觀點(diǎn)的是，當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體來轉(zhuǎn)移基因時(shí)，難以在防止轉(zhuǎn)基因逃逸同時(shí)，長時(shí)間維持轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及以下內(nèi)容1. 一種制備轉(zhuǎn)化毛囊的方法，包括利用病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至毛囊中，所述方法 包括提供用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒作為病毒載體，并且用該慢病毒在體外轉(zhuǎn)染毛囊。2.根據(jù)上述1所述的方法，所述毛囊源于人類。3. 一種轉(zhuǎn)化毛囊，是通過如上述1或2所述的方法制備的。4. 一種哺乳動物，被移植了如上述3所述的轉(zhuǎn)化毛囊。5. 一種將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動物的方法，包括下列步驟(1) (3)步驟(1)構(gòu)建慢病毒載體，該慢病毒載體含有目標(biāo)基因，且用VSV-G進(jìn)行了假型 化；步驟(2)用慢病毒載體在體外轉(zhuǎn)染毛囊，從而制備轉(zhuǎn)化毛囊；以及步驟(3)將轉(zhuǎn)化毛囊移植至動物中。6.根據(jù)上述5所述的方法，所述毛囊源于人類。7. 一種轉(zhuǎn)化哺乳動物，是通過如上述5或6所述的方法制備的。8. 一種評估測試基因的功能的方法，包括下列步驟(1) (4)步驟(1)將測試基因轉(zhuǎn)移至用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒載體中；步驟(2)用慢病毒載體在體外轉(zhuǎn)染毛囊，從而制備轉(zhuǎn)化毛囊；步驟(3)將所述轉(zhuǎn)化毛囊移植至測試動物中；以及
4
步驟(4)測定從所述毛囊再生的毛發(fā)的形狀和性能。9. 一種用于將毛囊轉(zhuǎn)化的試劑，包含用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒載體。10.用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒載體在制造用于將毛囊轉(zhuǎn)化的試劑中的用途。


圖1 被修整成蘋果形的毛囊。圖2:移植大約3個(gè)月后再生的毛發(fā)A 含有白種人直發(fā)的頭皮樣品被分成4等份，將其中一個(gè)部分進(jìn)行移植。在觀察 到頭發(fā)再生后，間隔一周皮內(nèi)給予二次慢病毒B 移植白種人直發(fā)毛囊；C:移植白種人卷發(fā)毛囊。圖3 用慢病毒轉(zhuǎn)染后，分離毛囊的器官培養(yǎng)A 培養(yǎng)21天的外觀；B 毛囊轉(zhuǎn)染一次和轉(zhuǎn)染二次的比較(培養(yǎng)21天)；C 培養(yǎng)1周中的生長速率。圖4 在轉(zhuǎn)染一次和轉(zhuǎn)染二次的毛囊中所消耗的葡萄糖的量和所產(chǎn)生的乳酸的 量A 葡萄糖消耗量；B 乳酸鹽產(chǎn)生量。圖5 沒有轉(zhuǎn)染的毛囊、轉(zhuǎn)染一次的毛囊、轉(zhuǎn)染二次的毛囊中細(xì)胞凋亡的狀態(tài)A 沒有轉(zhuǎn)染的毛囊的細(xì)胞凋亡狀態(tài)中的超時(shí)變化；B 器官培養(yǎng)14天細(xì)胞凋亡的比較。圖6 沒有轉(zhuǎn)染的毛囊、轉(zhuǎn)染一次的毛囊、轉(zhuǎn)染二次的毛囊的X-gal染色(器官培 養(yǎng)14天)A 沒有轉(zhuǎn)染的毛囊；B 轉(zhuǎn)染一次的毛囊；C:轉(zhuǎn)染二次的毛囊。圖7 器官培養(yǎng)14天，β _半乳糖苷酶的表達(dá)。圖8 器官培養(yǎng)14天，外層根鞘中β -半乳糖苷酶的表達(dá)紅色β -半乳糖苷酶；綠色角蛋白17(外層根鞘的標(biāo)記)，一個(gè)單元長50μπι。圖9 器官培養(yǎng)7天，毛囊中存在的黑色素細(xì)胞中β -半乳糖苷酶的表達(dá)紅色β -半乳糖苷酶；綠色gpl00 (黑色素細(xì)胞的標(biāo)記)；上部轉(zhuǎn)染一次的毛囊；下部轉(zhuǎn)染二次的毛囊。圖10 沒有轉(zhuǎn)染的毛囊(對照組)、轉(zhuǎn)染一次的毛囊、轉(zhuǎn)染二次的毛囊中，外源基因 的拷貝數(shù)(從開始轉(zhuǎn)染到48小時(shí))圖11 移植二次轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化毛囊后，大約三個(gè)月再生毛囊中半乳糖苷酶的表
5達(dá)a:移植白種人直發(fā)毛囊；紅色β -半乳糖苷酶；綠色角蛋白17(外層根鞘的標(biāo)記)，一個(gè)單元長度50μπι;b:移植白種人卷發(fā)毛囊；紅色β -半乳糖苷酶；綠色角蛋白17(外層根鞘的標(biāo)記)，一個(gè)單元長度50μπι;c:移植白種人直發(fā)毛囊；紅色β -半乳糖苷酶；綠色gplOO (黑色素細(xì)胞的標(biāo)記)，一個(gè)單元長度=IOOym ；d:移植白種人卷發(fā)毛囊；紅色β-半乳糖苷酶；綠色gplOO (黑色素細(xì)胞的標(biāo)記)，一個(gè)單元長度100μπι;e 移植沒有轉(zhuǎn)染的白種人直發(fā)毛囊；紅色β -半乳糖苷酶；綠色gplOO (黑色素細(xì)胞的標(biāo)記)，一個(gè)單元長度=IOOym ；f:移植白種人卷發(fā)毛囊；紅色β -半乳糖苷酶，一個(gè)單元長度100 μ m ；圖12 直發(fā)和卷縮發(fā)的毛囊中IGFBP-5基因的表達(dá)。圖13 :IGFBP_5過度表達(dá)的來自直發(fā)(直的)和卷發(fā)(卷曲的)的毛囊移植后，觀 察到毛發(fā)的曲率明顯增加的照片。圖14 JGFBP-5過度表達(dá)導(dǎo)致嚴(yán)重卷縮的再生毛發(fā)的照片。圖15 從IGFBP-5過度表達(dá)的直發(fā)毛囊中再生的毛發(fā)的掃描電鏡圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化毛囊和一種通過轉(zhuǎn)化毛囊將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動物的方法。本發(fā)明人對基因轉(zhuǎn)移至毛囊中進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)通過用VSV-G假型病毒載體 在體外轉(zhuǎn)染含有人類毛囊的組織，目標(biāo)基因可以被有效地轉(zhuǎn)移進(jìn)入毛囊，通過使用轉(zhuǎn)化毛 囊以高概率將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入試驗(yàn)動物，由此轉(zhuǎn)基因可以有效地表達(dá)，并且在防止轉(zhuǎn)基 因逃逸同時(shí)，高表達(dá)水平可以維持很長一段時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明，可以將基因以一種簡單的方式轉(zhuǎn)移進(jìn)入人類毛囊中，由此制作轉(zhuǎn)化 毛囊。使用該轉(zhuǎn)化毛囊，目標(biāo)基因可以有效地轉(zhuǎn)移進(jìn)入動物中，經(jīng)過很長一段時(shí)間，可以改 善多種病理情況，可以防止或治愈多種疾病。通過使用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移的方法，例如，經(jīng) 過長時(shí)間可以評估被轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)動物的人類基因的功能。通過提供用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒作為載體，并用慢病毒在體外轉(zhuǎn)染含有毛 囊的組織，從而制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)化毛囊。用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒載體是HIV類的慢病毒載體，其包膜糖蛋白被來源 于皰疹性口腔炎病毒(VSV)的包膜糖蛋白所取代。慢病毒載體沒有特別限制，只要是通常基因轉(zhuǎn)移中使用的載體，并且該載體具有用VSV-G進(jìn)行了假型化的包膜蛋白，但是該載體不能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒粒子。制備慢病毒的方法沒有特別限制，可以使用任意已知的方法。下面是一個(gè)典型的 方法。基于所謂的三重轉(zhuǎn)染原則來制備慢病毒。因此，需提供三個(gè)載體，即，具有HIV輔 助功能的PCMV Δ R8. 2、編碼β -半乳糖苷酶的pHxLacZWP轉(zhuǎn)移載體、和表達(dá)VSV-G的載體。 所使用的這三個(gè)載體可以從加拿大公共衛(wèi)生局(Dr. Kobinger)或賓夕法尼亞大學(xué)衛(wèi)生系 (Dr. Wilson)得到。用來制備病毒的動物細(xì)胞沒有特別限制，可以用任意動物細(xì)胞，只要是慢病毒制 備中通常使用的動物細(xì)胞。然而，從細(xì)胞培養(yǎng)、核酸轉(zhuǎn)移便利性、病毒粒子產(chǎn)生率等觀點(diǎn)來 看，其中優(yōu)選293T細(xì)胞。當(dāng)使用293T細(xì)胞制備慢病毒時(shí)，使用磷酸鈣沉淀法(由Clontech提供)或 Effectene試劑(Qiagen(Valencia, CA)提供)。在這兩種情況下，將VSV-G表達(dá)載體、 pCMV Δ R8. 2和pHxLacZWP轉(zhuǎn)移載體的比例調(diào)節(jié)至3 1 2。當(dāng)使用磷酸鈣沉淀法時(shí)，將無 內(nèi)毒素的載體混合物(10 μ g或180 μ g)添加到種植在平板(60mm或150mm)上的293T細(xì)胞 上。當(dāng)將Effectene試劑添加到10 μ g的載體混合物中時(shí)，需一起加入脂質(zhì)(40 μ L)、用于濃 縮載體的緩沖液(800 μ L)和增強(qiáng)劑(55 μ L)。當(dāng)將Effectene試劑加入180 μ g的載體混合 物中時(shí)，需一起加入脂質(zhì)(2. 9mL)、用于濃縮載體的緩沖液(58mL)和增強(qiáng)劑(4mL)。添加44 小時(shí)后，將介質(zhì)加入每個(gè)平板中，隨后培養(yǎng)16小時(shí)。用0. 45 μ m的過濾器過濾含有病毒樣粒 子的培養(yǎng)介質(zhì)，并采用常規(guī)方法測定滴度。無細(xì)胞的病毒上清液通過超速離心2小時(shí)(4°C， 28，000rpm)來濃縮，并在 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium(Invitrogen, Calsbard, CA))中再懸浮。使用前，該懸浮液可以在_80°C下貯藏。需要指出的是，通過培 養(yǎng)被儲備懸浮液(stock suspension)中的病毒感染的MT4或293T細(xì)胞30天，并檢測培養(yǎng) 物中P24抗原的表達(dá)，來證明所獲得病毒儲備懸浮液不含有可復(fù)制的慢病毒。在JP2005-533485中披露了不同于上述方法的制備慢病毒的典型方法。待轉(zhuǎn)移目標(biāo)(外源)基因包括可編碼控制頭發(fā)生長或頭發(fā)質(zhì)量(顏色、天然垂直 或卷曲、密度等)蛋白的基因或其片段、編碼激素或疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的基因或其片段，涉及 促進(jìn)傷口愈合的基因或其片段。一個(gè)具體的例子是具有胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-5(IGFBP_5)基因，它源于卷 縮毛發(fā)的毛囊中的表達(dá)水平高于下述參考實(shí)施例2中源于直發(fā)的毛囊中的表達(dá)水平。根據(jù) 下述實(shí)施例6的說明，用本發(fā)明的包含IGFBP-5基因的慢病毒載體可以制作表達(dá)IGFBP-5 的轉(zhuǎn)化毛囊，將轉(zhuǎn)化毛囊移植進(jìn)入實(shí)驗(yàn)對象可以使實(shí)驗(yàn)對象的毛發(fā)更卷曲。IGFBP-5在 1994年第一次被克隆，已經(jīng)報(bào)道了其完整的核苷酸序列(Allander S. V. , Larsson C.， Ehrenborg E. , Suwanichkul A. , Weber G. , Morris S. L. , Bajalica S. , Kiefer Μ. C., Luthman H. , Powell D. R. , Characterization of the chromosomal gene and promoter for human insulin-like growth factor binding protein-5. J. Biol. Chem. 1994 Apr 8 ； 269(14) :10891-8)。就基因功能分析而言，待轉(zhuǎn)移基因沒有特別限制。然而，為了提高目標(biāo)基因的功 能，目標(biāo)基因優(yōu)選與啟動子序列轉(zhuǎn)移。啟動子序列的例子包括在所有情況下表達(dá)基因的序 列、組織特異表達(dá)基因的序列、藥物誘導(dǎo)表達(dá)基因的序列。為了減小目標(biāo)基因的功能，啟動
7子序列優(yōu)選與其它序列，例如，編碼目標(biāo)基因SiRNA的序列、反義序列、或編碼目標(biāo)基因產(chǎn) 物的顯性陰性形式的序列一起轉(zhuǎn)移，。這些片段涉及的核苷酸序列每個(gè)包含至少表達(dá)目標(biāo)功能的區(qū)域。本發(fā)明使用的毛囊可以從人類的皮膚或動物，例如，小鼠、豬或猴子的皮膚收集， 優(yōu)選來源于哺乳動物的毛囊，更優(yōu)選來源于人類的毛囊。此處使用的術(shù)語“毛囊”狹義上是指頭皮部分，包括(來自于毛干側(cè))髓質(zhì)、內(nèi)部根 鞘(IRS)、外部根鞘(ORS)、透明膜、結(jié)締組織的毛囊。然而，除非另外規(guī)定，術(shù)語“毛囊”廣義 上指來源于人類或其它動物皮膚的發(fā)根周圍整體的組織(以下，稱為“毛囊器官”)；也就是 說，整體組織至少包括毛發(fā)生長相關(guān)的器官，例如，毛干、真皮乳突、毛囊基質(zhì)細(xì)胞、發(fā)根等。術(shù)語“包含毛囊的組織”是指組織整體，包括毛囊和周圍皮膚組織(表皮、真皮、膜
寸J ο使用毛囊組織提高了移植的成功率。在優(yōu)選狀態(tài)下，通過修剪組織，使其成為如圖 1所示的蘋果形，可以進(jìn)一步提高移植效率。從提高移植效率的觀點(diǎn)來看，脂肪組織優(yōu)選除 去至如圖1所示的程度。當(dāng)進(jìn)行器官培養(yǎng)時(shí)，由于不必考慮在移植進(jìn)入哺乳動物實(shí)驗(yàn)對象 過程中的損壞，毛囊組織優(yōu)選盡可能徹底地修剪。術(shù)語“蘋果形”是指大體上為圓柱形的毛囊器官，該毛囊器官上附著少量的外周組 織。包含毛囊的組織樣品的大小可以按使用的毛囊組織的類型適當(dāng)調(diào)節(jié)。就人類毛囊組織 而言，樣品優(yōu)選直徑3 5_，長度5 15_。至于毛發(fā)周期，毛囊可以在生長期或退化期。由于從供體收集的皮片可以直接組 織培養(yǎng)，優(yōu)選生長期。即使毛囊不處于生長期，也可以進(jìn)行生長期誘導(dǎo)。具體來說，在一個(gè) 可能的過程中，通過蠟法將頭發(fā)從皮膚上去除。毛發(fā)生長建立后，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)收集包含 毛囊的皮片。通常，當(dāng)使用小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象時(shí)，收集的時(shí)間是3天 10天，優(yōu)選5天 7 天，更優(yōu)選6天。當(dāng)使用其它哺乳動物作為實(shí)驗(yàn)對象時(shí)，根據(jù)毛發(fā)生長建立所需要的周期來 決定時(shí)間的選擇。將收集的毛囊移植進(jìn)入的動物，包括動物，例如，猴子、狗、貓、羊、馬，和實(shí)驗(yàn)動物， 例如兔子、小鼠、大鼠。不必說，收集到的毛囊也可以移植進(jìn)入人體。根據(jù)本發(fā)明，通過用病毒在體外轉(zhuǎn)染含有毛囊的組織來實(shí)現(xiàn)利用病毒載體將基因 轉(zhuǎn)移進(jìn)入毛囊。由于病毒載體實(shí)現(xiàn)毛囊的直接轉(zhuǎn)染，本發(fā)明的方法在操作性上比使用逆轉(zhuǎn) 錄病毒的傳統(tǒng)方法更好，即，該傳統(tǒng)方法是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入包裝細(xì)胞，將轉(zhuǎn) 基因包裝細(xì)胞和小鼠皮膚組織片共同培養(yǎng)，從而將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入小鼠組織的方法(例如， 參照 US7067496)。外源基因轉(zhuǎn)移至存在于毛囊的細(xì)胞中，該細(xì)胞最優(yōu)選存在于隆突區(qū)的干細(xì)胞。也 優(yōu)選源自干細(xì)胞的前體細(xì)胞。該干細(xì)胞對于在發(fā)育過程中提供細(xì)胞以及組織/器官的維持 起到作用。因此，基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入干細(xì)胞后，在很長一段時(shí)間，轉(zhuǎn)基因可以有效地表達(dá)并維持 高的表達(dá)水平，并可以防止轉(zhuǎn)基因逃離。在一個(gè)特定的轉(zhuǎn)染過程中，將已經(jīng)制備的毛囊或含有毛囊的組織浸入慢病毒滴度 液中，接著在毛囊器官培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)，由此進(jìn)行轉(zhuǎn)化。介質(zhì)的例子包括RPMI 1640 介質(zhì)、William，s E 介質(zhì)和 / 或 DMEM/HamF12(l 1) 介質(zhì)。在介質(zhì)中可以適當(dāng)添加瓊脂或凝膠。如果需要，在介質(zhì)中也可以添加抗生素、氨基酸、血清、生長因子、生物提取物等。在一個(gè)典型培養(yǎng)過程中，將浸于慢病毒滴度液中的毛囊器官在5% C02、37°C下 在恒溫箱中培養(yǎng)，使用無酚紅的William’ s E介質(zhì)(Sigma, St. Louis, MO)，在介質(zhì)中加 入 2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、10y g/mL 胰島素(Invitrogen)、10 μ g/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Invitrogen)、10ng/mL 硒酸鈉(Sigma)、10ng/mL氫化可的松(Invitrogen)、抗生素和抗菌 藥(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染的次數(shù)沒有特別限制。然而，考慮到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)和由轉(zhuǎn)染引起的毛囊 損壞，次數(shù)優(yōu)選2 3次，更優(yōu)選2次。為了防止由病毒載體引起的毛囊毀滅性的損壞，當(dāng)施行2次轉(zhuǎn)染時(shí)，優(yōu)選在第一 次轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)15 20h后進(jìn)行第2次轉(zhuǎn)染。在使用腺病毒載體的基因轉(zhuǎn)移方法中，已知用膠原酶處理毛囊可以提高目標(biāo)基因 轉(zhuǎn)移的效率(SaitO N. et al. , PNAS. 99(20) =13120-4, (2002))。然而，膠原酶處理可能會 破壞培養(yǎng)的細(xì)胞，必須小心地進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明使用慢病毒載體的方法，不用進(jìn)行任何膠原 酶處理，轉(zhuǎn)染也可以有效進(jìn)行。將由此制作的轉(zhuǎn)化毛囊移植至目的動物(受體)?？梢酝ㄟ^已知的方法將毛囊或 含有毛囊的組織移植至受體。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，受體的皮膚到筋膜開一個(gè)孔，通過該孔 加入毛囊器官培養(yǎng)介質(zhì)，加入轉(zhuǎn)化毛囊，用生物用瞬干膠使加入的毛囊固定在皮膚上。例如，當(dāng)要將轉(zhuǎn)化毛囊移植到實(shí)驗(yàn)室小鼠，在每個(gè)小鼠從背部皮膚到筋膜制成小 孔(直徑1 2mm，深度10 20mm)，使孔軸平行于小鼠的毛干，通過小孔加入毛囊器官培 養(yǎng)介質(zhì)，插入轉(zhuǎn)化毛囊，插入的毛囊用生物用瞬干膠固定在皮膚上。通過這個(gè)過程，在移植 幾個(gè)月后毛發(fā)可以再生，再生的毛發(fā)保持供體毛發(fā)的形態(tài)特征。從上述哺乳動物和人類中選擇實(shí)驗(yàn)對象作為受體。為了防止移植組織的排異，受 體優(yōu)選和毛囊供體動物為同種。至于人類，優(yōu)選使用從相同實(shí)驗(yàn)對象上收集的毛囊。當(dāng)使 用從其它實(shí)驗(yàn)對象收集的毛囊時(shí)，移植可以給予免疫抑制劑或其類似物來進(jìn)行。在后一種 情況下，可以使用免疫缺陷動物，例如，SCID小鼠或裸鼠作為受體。本發(fā)明基因轉(zhuǎn)移的方法也可以用于評估測試基因的功能。具體地說，將測試基因 用上述方法轉(zhuǎn)移進(jìn)入毛囊，通過將轉(zhuǎn)化毛囊應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)動物上，還可以評估被轉(zhuǎn)移的測試 基因所表達(dá)的蛋白或其類似物的效應(yīng)。按照本發(fā)明的方法，測試基因可能轉(zhuǎn)移進(jìn)入毛囊的 干細(xì)胞。因而，測試基因的功能可以長時(shí)間表達(dá)，可以長時(shí)間評估該功能的影響。不必說， 也可以得到轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)動物。測試基因沒有特別限制，可以使用任意上述基因。功能評估的方法可以通過根據(jù) 轉(zhuǎn)基因的類型而通常選擇使用的評估技術(shù)來進(jìn)行。測試基因可以是已知的或未知的。然而， 優(yōu)選功能未知的已知測試基因或未知的測試基因。特別是，當(dāng)測試與包括形態(tài)特征在內(nèi)的 毛發(fā)性質(zhì)相關(guān)的基因時(shí)，該測試基因包括與包括形態(tài)特征在內(nèi)的毛發(fā)性質(zhì)相關(guān)的已知基 因、功能未知的已知基因、以及可以想象地與包括形態(tài)特征在內(nèi)的毛發(fā)性質(zhì)相關(guān)的未知基 因。測試基因的具體例子包括控制毛發(fā)周期的基因、和控制包括顏色和形態(tài)特征在內(nèi)的毛 發(fā)性質(zhì)的基因。當(dāng)評估與包括形態(tài)特征在內(nèi)的毛發(fā)性質(zhì)相關(guān)的基因的功能時(shí)，例如，測定包括從 毛囊再生的毛發(fā)的形態(tài)特征在內(nèi)的性質(zhì)。特別是當(dāng)毛囊還未移植到實(shí)驗(yàn)對象(受體)時(shí)，通過圖像分析、在顯微鏡下使用測微計(jì)的測定、計(jì)數(shù)在毛囊器官中凋亡細(xì)胞等，對于毛囊器 官，在器官培養(yǎng)期間，在毛干生長(長度)、毛干直徑變化(減小或增大)和毛囊彎曲特點(diǎn)方 面進(jìn)行分析。移植后，直接評估或圖像分析毛發(fā)性質(zhì)，例如，從再生的毛根到毛干尖端的長 度、毛干直徑(截面)、毛發(fā)生長速率、色調(diào)、卷曲度和其它性質(zhì)。通過上述分析，可以評估毛發(fā)生長狀態(tài)(生長速率、粗細(xì)等)、顏色、包括形態(tài)特征 (卷的或直的)的毛發(fā)性質(zhì)和其它性質(zhì)。此外，用上述分析的外源基因轉(zhuǎn)移后，通過有效地并且經(jīng)濟(jì)地評估長好了的人的 毛發(fā)的生長、顏色和性質(zhì)的改善，本發(fā)明方法可以用于毛發(fā)相關(guān)疾病的基因治療。下面用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，這些實(shí)施例不能被解釋為限制了本發(fā) 明。實(shí)施例實(shí)施例1 將基因轉(zhuǎn)移至毛囊中的方法(1)含有毛囊的皮膚組織樣品的制備用穿刺活檢法從白種人對象得到頭皮樣品，由St印hens Mssociates (S&A)(合約 實(shí)驗(yàn)室，Dallas)進(jìn)行該手術(shù)。具體說，用穿刺活檢法(穿刺針直徑4mm)從一個(gè)對象得到二個(gè)皮膚組織塊。將 組織塊浸入4°C含抗菌劑的DMEM中運(yùn)送。組織塊到達(dá)后，馬上在解剖顯微鏡下從每個(gè)組織 塊中除去脂肪組織，并將其修剪成如圖1所示，從而制備含毛囊并且具有蘋果形(尺寸直 徑3 5mm、長度5 15mm)的皮膚組織樣品。(2)病毒載體的制備從加拿大公共衛(wèi)生局(Dr. Kobinger)得到VSV-G (HIV類慢病毒載體，其包膜蛋白 用皰疹性口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)來取代)假型慢病毒，在使用前將其在-80°C下儲存。下面說明制備病毒載體的典型方法。將三種載體(即，具有HIV輔助功能的pCMVAR8.2、編碼β-半乳糖苷酶的 PHxLacZffP轉(zhuǎn)移載體、和表達(dá)VSV-G包膜蛋白的pMD. G載體)同時(shí)轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞中來制 備用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒載體。用239T細(xì)胞制備慢病毒時(shí)，用磷酸鈣沉淀法(由 Clontech提供)或Effectene試劑(Qiagen提供，(Valencia, CA)) 在這兩種情況下，將 VSV-G表達(dá)載體、pCMVAR8. 2和pHxLacZWP轉(zhuǎn)移載體的比例調(diào)節(jié)至3 1 2。當(dāng)使用磷 酸鈣沉淀法時(shí)，將無內(nèi)毒素的載體混合物(IOyg或180yg)添加到種植在平板(60mm或 150mm)上的293T細(xì)胞上。當(dāng)將Effectene試劑添加到10 μ g的載體混合物中時(shí)，需一起加 入脂質(zhì)(40 μ L)、用于濃縮載體的緩沖液(800 μ L)和增強(qiáng)劑(55 μ L)。當(dāng)Effectene試劑加 入180 μ g的載體混合物中時(shí)，需一起加入脂質(zhì)(2. 9mL)、用于濃縮載體的緩沖液(58mL)和 增強(qiáng)劑(4mL)。添加44小時(shí)后，將介質(zhì)加入每個(gè)平板中，隨后培養(yǎng)16小時(shí)。用0. 45 μ m的 過濾器過濾含有病毒樣粒子的培養(yǎng)介質(zhì)，采用常規(guī)方法測定滴度。無細(xì)胞的病毒上清液通 過超速離心 2 小時(shí)(4°C，28，OOOrpm)來濃縮，并在 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium(Invitrogen,Calsbard,CA))中再懸浮。使用前，該懸浮液可以在_80°C下貯藏。應(yīng) 當(dāng)注意的是，通過培養(yǎng)被儲備懸浮液中的病毒感染的MT4或293T細(xì)胞30天，并檢測培養(yǎng)物 中P24抗原的表達(dá)，來證明所獲得病毒儲備懸浮液不含有可復(fù)制的慢病毒。(3)轉(zhuǎn)化
制備慢病毒滴度為109TU/mL的液體。將每個(gè)上述制備的含毛囊的皮膚組織樣品 浸入該滴度的液體中4小時(shí)，接著在37°C、5% CO2氣氛下在毛囊器官培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。培養(yǎng)19小時(shí)后，浸入相同滴度的液體中進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染。第二次轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)在 相同介質(zhì)中器官培養(yǎng)14 35天。毛囊器官培養(yǎng)介質(zhì)補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA)、10 μ g/ mL 胰島素(Invitrogen)、10 μ g/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Invitrogen)、10ng/mL 硒酸鈉(Sigma)、 10ng/mL氫化可的松(Invitrogen)和抗生素、抗真菌藥(Invitrogen)的無酚紅的Williams E 介質(zhì)(Sigma，St. Louis, MO)(4)移植慢病毒轉(zhuǎn)染后，用18G注射器(直徑1mm)在免疫缺陷小鼠身上(重癥聯(lián)合免疫 缺陷，SCID)從背部皮膚到筋膜開孔(直徑大約1mm，深度大約10 20mm)，使孔軸平行 于小鼠的毛干。通過小孔加入毛囊器官培養(yǎng)介質(zhì)(大約25 μ L)，將轉(zhuǎn)化毛囊插入孔中。用 生物用瞬干膠將插入的毛囊固定在皮膚上。通過該步驟，發(fā)現(xiàn)移植大約3個(gè)月后，大部分毛囊再生毛發(fā)(圖2Β和2C)。由此再 生的毛發(fā)保持供體毛發(fā)的形態(tài)特征。參考實(shí)施例1 觀察含毛囊的組織將用穿刺活檢法收集到的毛囊組織樣品根據(jù)頭皮面積(直徑2 3mm)(沒有修 剪成蘋果形)分成4等份。用與實(shí)施例1相似的方法轉(zhuǎn)化被等份的部分，將每個(gè)被轉(zhuǎn)化的 組織樣品移植至小鼠。在該參考實(shí)施例中，移植的直發(fā)再生成卷發(fā)。由于小鼠皮膚張力使該毛發(fā)卷曲 (圖 2A)。實(shí)施例2 轉(zhuǎn)染次數(shù)對毛囊的影響為了評估慢病毒轉(zhuǎn)染引起毛囊受損情況，分析了毛囊生長速率、在毛囊培養(yǎng)介質(zhì) 中葡萄糖轉(zhuǎn)變成乳酸的量、以及毛囊的凋亡狀態(tài)。(1)毛囊的生長速率用顯微照片和SPOT 軟件(Diagnostic Instruments, Sterling Heights,MI)每周
測定一次毛囊生長速率。開始器官培養(yǎng)的第一周，比較了未轉(zhuǎn)染的毛囊(對照組)、轉(zhuǎn)染一次的毛囊、轉(zhuǎn)染 二次的毛囊的生長速率。雖然區(qū)別不明顯，但發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染延緩了生長速率(圖3)。之后，從 第2周開始，比較了轉(zhuǎn)染一次和轉(zhuǎn)染二次毛囊的生長速率。結(jié)果，相比于轉(zhuǎn)染一次的毛囊， 轉(zhuǎn)染二次的毛囊從14天開始生長減少，第21天沒有發(fā)現(xiàn)生長。(2)培養(yǎng)基中葡萄糖轉(zhuǎn)變成乳酸的量用2300STAT Plus 葡萄糖和乳酸分析儀(YSI, Inc.，Yellow Springs, OH)測定培
養(yǎng)基中葡萄糖的消耗量和乳酸的生成量。使用轉(zhuǎn)染一次的毛囊和轉(zhuǎn)染二次的毛囊，測定第4天、第14天、第21天的每日葡 萄糖轉(zhuǎn)變成乳酸的量。任意測定時(shí)間下，兩組間轉(zhuǎn)變量沒有發(fā)現(xiàn)區(qū)別(圖4)。(3)毛囊的凋亡狀態(tài)使用ApopTaq 原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Chemicon，Temecula, CA)觀察毛囊的 凋亡狀態(tài)。
觀察隨著時(shí)間變化沒有轉(zhuǎn)染毛囊的凋亡狀態(tài)。如圖5A所示，紅色區(qū)域表示隨著時(shí) 間流逝，凋亡增加。特別在第14天，毛球處于退化階段?；谠撚^察，比較沒有轉(zhuǎn)染的毛囊 (對照組)、轉(zhuǎn)染一次的毛囊、轉(zhuǎn)染二次的毛囊在第14天的凋亡狀態(tài)。沒有觀察到凋亡狀態(tài) 的區(qū)別(圖5B)。如上所述，用慢病毒轉(zhuǎn)染稍微影響毛囊的生長，但相比在器官培養(yǎng)時(shí)毛發(fā)周期中 的變化，其遲緩不明顯。在到第14天這段時(shí)間內(nèi)(S卩，進(jìn)入退化階段)，如下所述，優(yōu)選進(jìn)行
二次慢病毒轉(zhuǎn)染。實(shí)施例3 基因轉(zhuǎn)移效率的測定在按實(shí)施例1的方法器官培養(yǎng)14天結(jié)束后，用X-gal測定基因(β _半乳糖苷酶) 轉(zhuǎn)移進(jìn)入轉(zhuǎn)化毛囊的基因轉(zhuǎn)移效率，其中X-gal是β _半乳糖苷酶的底物。具體地說，轉(zhuǎn)化毛囊用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗三次，并用0. 戊二醛固定。固 定的產(chǎn)物在用含有 5mM K3Fe(CN)6、5mM K4Fe (CN)6UmM MgCl2、0. 02% NP-40 和 0. 01 % 脫氧 膽酸的0. IM磷酸緩沖液(β Η7. 4)稀釋的lmg/mL X-gal溶液中培養(yǎng)18小時(shí)。結(jié)果如圖6所示。藍(lán)色區(qū)域增大，則基因轉(zhuǎn)移效率增加。觀察到轉(zhuǎn)染二次的毛囊 總體表現(xiàn)顏色(藍(lán)色)增長，表明基因轉(zhuǎn)移效率對轉(zhuǎn)染次數(shù)的反應(yīng)。接著，通過免疫組織化學(xué)分析，研究外源基因在毛囊中表達(dá)的位置。沿著水平或垂直方向切開轉(zhuǎn)化毛囊，制成切片。使用半乳糖苷酶的抗體來分 析基因表達(dá)的位置。結(jié)果如圖7 9所示。器官培養(yǎng)14天，在外部根鞘(ORS)和內(nèi)部根鞘(IRS)觀察 到紅色(陽性)區(qū)域，隨著毛球到觀察點(diǎn)距離的增加，顏色濃度增加(圖7)。分別制備沿著 垂直方向切開的切片，用角蛋白17的特定抗體分析基因表達(dá)，角蛋白17的特異抗體用作外 部根鞘(ORS)的標(biāo)記物和半乳糖苷酶的抗體。黃色(陽性)區(qū)域表示兩種蛋白質(zhì)共同 表達(dá)，在毛囊全體ORS中觀察到黃色區(qū)域(圖8)。當(dāng)使用黑色素細(xì)胞中黑色素(gplOO)抗 體HMB45和半乳糖苷酶抗體時(shí)，黃色(陽性)區(qū)域表示兩種蛋白質(zhì)共同表達(dá)，器官培養(yǎng) 7天時(shí)在出現(xiàn)黑色素細(xì)胞的基質(zhì)區(qū)可以觀察到黃色區(qū)域(圖9)。實(shí)施例4 外源基因的拷貝數(shù)第二次轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用DNeasy提取試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從毛囊器官 抽提染色體DNA和載體DNA。用 TaciManw 探針(Applied Biosystems)和 ABI PRISM 7300序 列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems)測定外源基因的拷貝數(shù)，其中，該探針對于轉(zhuǎn)移的β -半 乳糖苷酶特異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比轉(zhuǎn)染一次的毛囊，轉(zhuǎn)染二次的毛囊中外源基因的拷貝數(shù)大大 增加(圖10)。實(shí)施例5 移植了轉(zhuǎn)化毛囊的小鼠的轉(zhuǎn)基因分析移植大約3個(gè)月后，人類毛囊器官來源的毛發(fā)再生。毛發(fā)再生時(shí)，毛囊恢復(fù)，將毛 囊沿著垂直方向切開，制成切片。用半乳糖苷酶的抗體研究每個(gè)切片的基因表達(dá)位置。具體地說，移植大約3個(gè)月后，將再生的直發(fā)毛囊(圖Ila)和卷發(fā)毛囊(圖lib) 沿其垂直方向切開，制成切片。用角蛋白17的特異抗體和半乳糖苷酶的抗體分析基因 表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)半乳糖苷酶在內(nèi)部根鞘(IRS)、外部根鞘(ORS)和髓質(zhì)中表達(dá)。進(jìn)一 步，當(dāng)使用ΗΜΒ45和β -半乳糖苷酶的抗體時(shí)，在黑色素細(xì)胞出現(xiàn)的基質(zhì)區(qū)中觀察到表示兩 種蛋白質(zhì)共同表達(dá)的黃色(陽性)區(qū)域(圖Ilc和lid)。移植三個(gè)月后也在毛囊角質(zhì)形成
12細(xì)胞和黑色素細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外源基因蛋白質(zhì)表達(dá)，表明外源基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入了干細(xì)胞。相反，從未處理的毛囊再生的毛囊中沒有觀察到半乳糖苷酶陽性區(qū)域(圖 lie)。然而，出乎意料地，在轉(zhuǎn)染的人類毛囊附近的一些小鼠毛囊的毛球中觀察到非常小的 β -半乳糖苷酶陽性區(qū)域(圖Ilf人類毛囊(左下)，小鼠毛囊(中央))，表明已經(jīng)轉(zhuǎn)移了 外源基因的人類細(xì)胞中有一部分移向了小鼠毛囊。參考實(shí)施例2 毛囊中IGFBP-5表達(dá)的分析(1)人類毛囊的制備按照辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心的機(jī)構(gòu)審查委員會(the Institutional Review Board of Cincinnati Children' s Hospital Medical Center)批準(zhǔn)的協(xié)議，直發(fā)的白種 人對象、卷縮發(fā)(kinky hair)的非洲裔對象、卷發(fā)(curly hair)的西班牙裔對象，他們都 具有受試者同意書，用穿刺活檢法(沖頭直徑6mm)從他們每個(gè)人獲得2個(gè)頭皮組織塊。將 組織塊浸入4°C含有抗菌劑的DMEM中運(yùn)送。收集組織塊的2小時(shí)內(nèi)，在解剖顯微鏡下從每 個(gè)組織塊中除去脂肪組織，分離毛囊。(2) IGFBP-5 表達(dá)的分析為了避免RNA的分解，分離后立刻將分離的毛囊浸入RNAlater(Qiagen的產(chǎn)品， Valencia, CA)中，用RNeasy micro kit(Qiagen的產(chǎn)品)提取總RNA。用寡脫氧胸腺嘧啶 (oligo dT)禾口莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)通過常規(guī)方法合成cDNA。為了研究直發(fā)和卷縮發(fā)之間IGFBP-5表達(dá)水平 的區(qū)別，從應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)(福斯特市，CA)購買基因特異探針和 TaqMan Gene Expression Assays (檢測編號Hs00181213ml)。通過使用 ABI PRISM 7300 序列檢測系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的產(chǎn)品)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR。使用甘油醛-3-磷酸脫 氫酶(GAPDH的檢測編號人類GAPDH VIC-MGB No. 4326317E)的表達(dá)作為內(nèi)標(biāo)。對于直發(fā)毛囊中IGFBP-5的基因表達(dá)水平，將基因表達(dá)水平相對評估為1的值。卷 縮發(fā)毛囊中IGFBP-5的基因表達(dá)水平大約是3. 5，該值顯著高于直發(fā)毛囊中的表達(dá)水平(圖 12)。實(shí)施例6 毛囊中IGFBP-5的過度表達(dá)引起的實(shí)驗(yàn)對象的轉(zhuǎn)化(5)將IGFBP-5基因轉(zhuǎn)移至毛囊中按實(shí)施例1 (2)中所述的步驟制備將IGFBP-5基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入毛囊的慢病毒載體。使 用CMV作為表達(dá)IGFBP-5的啟動子。使用下列引物通過人類皮膚cDNAs (Invitrogen的產(chǎn) 品)的PCR擴(kuò)增來克隆IGFBP-5基因5’ :ATATATCTAGAGCCACCATGGTGTTGGTCACCGC3’ :ATATAGGATCCCTCAACGTTGCTGTC確定克隆基因的序列后，將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入慢病毒轉(zhuǎn)移載體。為了過度表達(dá)IGFBP-5，將如參考實(shí)施例2分離的毛囊浸入慢病毒滴度液體 (1.6X109TU/mL)4小時(shí)，接著在37°C、5% 0)2氣氛下，在毛囊器官培養(yǎng)介質(zhì)(無酚紅的 Williams E介質(zhì)(Sigma公司的產(chǎn)品，St. Louis，MO)中進(jìn)行培養(yǎng)，其中，該毛囊器官培 養(yǎng)介質(zhì)補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen的產(chǎn)品，Calsbard，CA)、10 μ g/mL胰島素 (Invitrogen 的產(chǎn)品)、10 μ g/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Invitrogen 的產(chǎn)品)、10ng/mL 硒酸鈉(Sigma 的產(chǎn)品)、10ng/mL氫化可的松(Invitrogen的產(chǎn)品)、抗生素和抗真菌藥(Invitrogen的產(chǎn)
13品))。開始培養(yǎng)19小時(shí)后，將毛囊浸入相同滴度的溶液中進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染。使用半 乳糖苷酶(LacZ)基因作為與IGFBP-5基因?qū)φ?。從而制成了用于表達(dá)具有CMV啟動子的 LacZ基因的慢病毒滴度溶液，以上述相同方法用來處理毛囊。(2)移植用慢病毒轉(zhuǎn)染后，將毛囊移植至免疫缺陷(嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷，SCID)小鼠，評估 再生毛發(fā)的毛發(fā)形態(tài)。具體地說，用18G注射器(直徑1mm)在每只SCID小鼠背部從皮膚 到筋膜開孔(直徑大約1mm，深度大約5 20mm)，使孔軸平行于小鼠的毛干。在小孔中 加入毛囊器官培養(yǎng)的介質(zhì)(大約25 μ L)，接著在其中插入毛囊。插入的毛囊用生物用瞬干 膠(強(qiáng)力膠)固定于皮膚。在插入位置滴加2. 5%利多卡因(Iidocaine)，用來局部麻醉， 用粘膜(Tegaderm的產(chǎn)品，3M，0ntario，加拿大)覆蓋小鼠整個(gè)背部包括移植點(diǎn)。確認(rèn)粘膜 附著在小鼠背部至少48小時(shí)。(3)毛囊移植后毛發(fā)形態(tài)的變化當(dāng)移植半乳糖苷酶過度表達(dá)的毛囊時(shí)，移植后幾個(gè)月中，不論毛發(fā)類型(直 發(fā)或卷發(fā))，毛發(fā)生長都保持了毛囊供體的毛發(fā)形態(tài)(圖13Α和13D)。相比而言，當(dāng)移植 IGFBP-5過度表達(dá)的直發(fā)毛囊時(shí)，再生毛發(fā)具有如移植卷發(fā)的毛發(fā)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)某些毛發(fā)絲非 常卷曲(圖13B、13C和圖14)。當(dāng)移植IGFBP-5過度表達(dá)的卷發(fā)毛囊時(shí)，卷曲度大大提高 (圖 13Ε 和 13F)。用SEM分析再生毛發(fā)。具體地說，將再生毛發(fā)絲切成2 3mm段，每段固定在鋁 樣本支架上(Electron Microscopy Sciences 的產(chǎn)品，Hatfield, PA)。用 Hummer 溉射涂 膜機(jī)(Hummer Sputter Coater，Anatech產(chǎn)品，Hayward, CA)在蒸發(fā)的條件下用鈀金合金 進(jìn)行2分鐘涂層，目測毛干的形狀和毛發(fā)絲的橫截面。用FEI Quanta 200SEM(FEI產(chǎn)品， Hillsboro，OR)在20kV工作電壓下獲得圖像。如圖15所示，發(fā)現(xiàn)從毛囊中半乳糖苷酶過度表達(dá)的白種人對象的直發(fā)的再 生毛發(fā)和供體毛囊的毛發(fā)的再生毛發(fā)具有相似的結(jié)構(gòu)。具體地說，薄角質(zhì)層互相重疊大約 4/5的部分，形成不整齊但致密的橫向起伏的樣式。還用SEM觀察到從毛囊中IGFBP-5過 度表達(dá)的相同實(shí)驗(yàn)對象的毛囊中再生的毛發(fā)。此時(shí)，角質(zhì)層密度低，沒有規(guī)律地起伏。其形 態(tài)和非洲裔對象的卷縮發(fā)非常相似(Guohua Wei, Bharat Bhushan, Peter M. Torgerson, Ultramicroscopy 105 :248_266，2005)。
權(quán)利要求
一種制備轉(zhuǎn)化毛囊的方法，包括利用病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至毛囊中，其特征在于所述方法包括提供用VSV G進(jìn)行假型化的慢病毒作為病毒載體，并且用該慢病毒在體外轉(zhuǎn)染毛囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于 所述毛囊源于人類。
3.一種轉(zhuǎn)化毛囊，其特征在于是通過如權(quán)利要求1或2所述的方法制備的。
4.一種哺乳動物，其特征在于 被移植了如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化毛囊。
5.一種將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動物的方法，其特征在于 包括下列步驟⑴ ⑶步驟(1)構(gòu)建慢病毒載體，該慢病毒載體含有目標(biāo)基因，且用VSV-G進(jìn)行了假型化； 步驟(2)用慢病毒載體在體外轉(zhuǎn)染毛囊，從而制備轉(zhuǎn)化毛囊；以及 步驟(3)將轉(zhuǎn)化毛囊移植至動物中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于 所述毛囊源于人類。
7.一種轉(zhuǎn)化哺乳動物，其特征在于是通過如權(quán)利要求5或6所述的方法制備的。
8.一種評估測試基因的功能的方法，其特征在于 包括下列步驟⑴ ⑷步驟(1)將測試基因轉(zhuǎn)移至用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒載體中； 步驟(2)用慢病毒載體在體外轉(zhuǎn)染毛囊，從而制備轉(zhuǎn)化毛囊； 步驟(3)將所述轉(zhuǎn)化毛囊移植至測試動物中；以及 步驟(4)測定從所述毛囊再生的毛發(fā)的形狀和性能。
9.一種用于將毛囊轉(zhuǎn)化的試劑，其特征在于 包含用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒載體。
10.用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒載體在制造用于將毛囊轉(zhuǎn)化的試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化毛囊和一種通過轉(zhuǎn)化毛囊將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動物的方法。一種制備轉(zhuǎn)化毛囊的方法，包括利用病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至毛囊中，其特征在于，包括提供用VSV-G進(jìn)行假型化的慢病毒作為病毒載體，并且用該慢病毒在體外轉(zhuǎn)染毛囊。
文檔編號C12N5/071GK101918011SQ200880125200
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者P·詩威理雅諾, 八谷輝 申請人:花王株式會社