專利名稱：一個腫瘤相關(guān)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個腫瘤相關(guān)基因及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是人類健康和生命威脅最大的疾病，及時的發(fā)現(xiàn)和治療對有效防止這類疾病有積極的意義。盡管目前已發(fā)現(xiàn)有數(shù)以百記的基因與腫瘤有關(guān)，但真正能用于從腫瘤診斷和治療的基因?yàn)閿?shù)不多，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)基因用于腫瘤診斷和治療是必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過分子生物學(xué)技術(shù)，克隆了一個人血清抑制基因(Si-1)，該基因位于人2號染色體的長臂上，全長約占45Kb DNA序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA序列)5249bp，編碼791氨基酸(見說明書序列表)，含有21個外顯子，其中編碼序列19個外顯子，基因在染色體上的定位(見說明書序列表見)。本發(fā)明對該基因的功能進(jìn)行了確定，通過基因表達(dá)檢測，在血清饑餓時表達(dá)較血清培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)；通過轉(zhuǎn)基因發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)θ四X腫瘤細(xì)胞(如U251)的生長有抑制作用；通過腫瘤遺傳學(xué)分析，該基因在腦腫瘤，肝癌，肺癌，胃癌，乳腺癌，直腸癌等多種腫瘤中存在缺失和突變。通過檢測腫瘤組織中該基因的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因在腫瘤組織中的缺失或突變率的總和達(dá)到35％。因此，該基因可用于多種腫瘤的診斷標(biāo)志基因，也可以作為腫瘤基因治療的靶基因。


圖1為本發(fā)明基因在染色體上的定位。
圖2為本發(fā)明基因的外顯子分布。
具體實(shí)施例方式1.發(fā)明人所在研究小組通過DD-PCR技術(shù)，比較血清饑餓和血清培養(yǎng)的人腦腫瘤細(xì)胞株(U251)，獲得一個血清饑餓細(xì)胞表達(dá)的特異性片段，將該片段測序得452bp的cDNA序列。
2.用該序列在GenBanK數(shù)據(jù)庫中搜索EST序列，并進(jìn)行延伸，獲得5kb左右的cDNA序列，用此序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，得到兩個2.8Kb左右的產(chǎn)物，克隆后測序，得到5429bp的cDNA序列(見說明書序列表)，登記于genBanK中，接受號AY050169。
3.生物信息學(xué)分析將本基因序列與GenBanK數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行比較，與XM_010868和AK023813的相似程度最高，但這兩個序列都在2101至2107之間缺失了6個堿基，相應(yīng)的氨基酸序列多出2個丙氨酸殘基，其余序列幾乎完全相同。與AK023813相比，同樣多出6個堿基，氨基酸序列多出2個丙氨酸殘基，同時有2個堿基，并且在2075和2097位的堿基分別由C和A轉(zhuǎn)變成T，導(dǎo)致氨基酸殘基由P和S轉(zhuǎn)變成C和S。與XM-03100081和AF311326相比，5’-端有505個堿基不同，導(dǎo)致氨基酸序列丟失25個殘基，與XM-0310006和AB0037731序列比較在5’-端的505bp也不同，同時在1916位相對的位置多出78bp在氨基酸序列上，N-端分別少87和101個氨基酸殘基，在494位相應(yīng)的位置多出了26個殘基。與本克隆序列相似性較大的其它序列基本是這幾個序列的部分序列。上述這些序列雖然與本序列有差異，但與人類基因組草圖序列，PR11-67L23克隆序列，EST序列比較，可以肯定是同一個基因的不同加工產(chǎn)物，因?yàn)樵?101-2108之間是外顯子剪接位點(diǎn)，此處多出的6個堿基有可能是不同剪接方式所至。1916位點(diǎn)也是一個外顯子剪接位點(diǎn)，AF037731和XM_031006中多出的序列在基因組草圖中正好是一個外顯子。5’端的序列雖然幾個序列都有差異，但在基因組草圖中都有相應(yīng)的序列存在，在上述序列不同的區(qū)段，在EST序列中都有相應(yīng)的序列對應(yīng)。所以，這一基因可能有多種不同的剪接方式。經(jīng)與EST序列比較可推測，上述不同的差異序列的豐度較少，本克隆序列所擁有的EST序列最多，氨基酸殘基序列最長，所以有可能是主要的加工方式。
本序列除了在人類基因中有同源序列外，在其它模式生物中沒有找到核苷酸序列的同源序列，蛋白質(zhì)序列的同源性比較，只發(fā)現(xiàn)N-端的390氨基酸殘基與果蠅中2R染色體上的CG8233基因(AE003815)的N-端序列有38％的同源性，expect＝1e-67；176-388之間有213個氨基酸殘基與擬南芥中一個基因有30％的同源性，expcet＝2e-14；241-381之間有142個殘基有27％的同源性，expect＝9e-11。由此顯示，該基因可能是人類特有的基因。
4.基因表達(dá)分析結(jié)果進(jìn)行多組織的northern雜交，雜交結(jié)果顯示該基因在正常組織中都有表達(dá)，但表達(dá)相對較弱，在外周血中的表達(dá)相對較強(qiáng)。細(xì)胞不同時相的RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在血清饑餓后時該基因表達(dá)較強(qiáng)，恢復(fù)血清培養(yǎng)之初表達(dá)減弱，在1小時表達(dá)最強(qiáng)，以后表達(dá)繼續(xù)減弱。在小鼠腦組織的原位雜交中，發(fā)現(xiàn)在小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)。這些結(jié)果表明該基因主要在生長停止細(xì)胞和分化細(xì)胞中表達(dá)。
5.細(xì)胞轉(zhuǎn)基因分析將Si-1基因重組到真核生物表達(dá)載體CMV啟動子的下游，轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入細(xì)胞，在人腦膠質(zhì)細(xì)胞U251細(xì)胞中過強(qiáng)表達(dá)，結(jié)果表明對細(xì)胞生長有抑制作用；讓該基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)反義序列，結(jié)果對細(xì)胞生長有促進(jìn)作用。
6.腫瘤遺傳分析分析了140多例的人腫瘤組織中的該基因的結(jié)構(gòu)變化，用PCR擴(kuò)增第六和第十五外顯子，正常人血樣擴(kuò)增結(jié)果正常，而35％的腫瘤擴(kuò)增失敗。其中腦腫瘤占55％，直腸癌占21.8％；胃癌占45％，肝癌占50％，肺癌占30.7％，乳腺癌占16.7％。已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，整個基因有多個位點(diǎn)的缺失與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。
根據(jù)上述研究結(jié)果確定，Si-1基因可用于腫瘤診斷的標(biāo)志(marker)基因，根據(jù)其對細(xì)胞生長的抑制作用，該基因也可用于腫瘤的基因治療。
說明書序列表SEQUENCELISTING<110>云南大學(xué)<120>一個人腫瘤相關(guān)基因及其應(yīng)用<130>
<141>2002-12-10<160>1<170>PATENTIN VERSION 3.1<210>1<211>5249<212>DNA<213>人血清抑制基因(SI-1)<220>
<221>GENE<222>(437)..(2812)<223>
<400>1AGGCGTTAAC GCGCACGCGC TTAGGGATCC GGCCGTGGCC GAGCGCGCGG CCGTAAGACC60GCGGGTGACT AGCATGCAGA TACCCATGCT CTGACTTTCT GCCCCTCCAC TGACATGGCC120CACCGGGGTG GGGAGAGGGA CTTCCAGACT TCAGCTCGAC GCATGGGCAC CTCGCTGCTC180TTCCAGCTTT CAGTGCATGA ACGGGAGCTG GACCTGGTTT TTCTGGATCA TAGCTATGCC240AAGCCTTGGA GTGCCCACCC AGATGCCAGT AGTGCCCGCC CCACCCGCAT GCTCTTTGTC300ACTCCCCGGC GGCAGCACGA AAGTACCATA TGATTGTTAA ATACCTGTGA AGTATGTGTG360GCCCGGTCCT ATTTCCTCAC CTGTTTACAG TGAATCAGAC GTCCCAATAG ATGTGGAGAC420GGTCACATCA ACGCCTATGC CACTCTATGA CAATCAGAAG GCACGCAGCG TGATGAATGA480
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權(quán)利要求
1.一個腫瘤相關(guān)基因，該基因的特征在于1.1、該基因位于人2號染色體的長臂上，全長約占45Kb DNA序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5249bp，含有21個外顯子，其中編碼序列19個外顯子，編碼791氨基酸；1.2、該基因在血清饑餓時表達(dá)較血清培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)；該基因在多數(shù)腫瘤中存在缺失和突變。
2.一個腫瘤相關(guān)基因的應(yīng)用，特征在于該基因可作為腫瘤的診斷標(biāo)記和治療的靶基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個腫瘤相關(guān)基因及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明確定了一個人血清抑制相關(guān)基因(Si－1)與腫瘤的相關(guān)性，該基因位于人2號染色體的長臂上，全長約占45Kb DNA序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA序列)5249bp，編碼791氨基酸(見圖1)，含有21個外顯子，其中編碼序列19個外顯子。該基因在生長停止或分化細(xì)胞中表達(dá)，過強(qiáng)表達(dá)后對腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用。該基因在腦腫瘤，肝癌，肺癌，胃癌，乳腺癌，直腸癌等多種腫瘤中存在多位點(diǎn)的缺失和突變。通過檢測腫瘤組織中該基因的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因在腫瘤組織中的缺失或突變率的總和達(dá)到35％。研究結(jié)果表明，該基因可用于多種腫瘤的診斷標(biāo)志基因，也可以作為腫瘤基因治療的靶基因。
文檔編號A61P35/00GK1508248SQ0212806
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月18日
發(fā)明者譚德勇, 賴建華, 余敏 申請人:云南大學(xué)