專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)核酸的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)核酸，例如用于分子診斷的方法和設(shè)備，例如生物傳感器。
背景技術(shù)：
磁性顆粒在核酸檢測(cè)方法中是用途是公知的。例如，W02006131892描述了在其中 擴(kuò)增核酸的磁性生物傳感器。在擴(kuò)增期間，磁性顆粒摻入到擴(kuò)增的DNA中。擴(kuò)增的核酸隨后 利用摻入的磁性顆粒來(lái)檢測(cè)。檢測(cè)方法涉及在傳感器表面附近磁性顆粒的結(jié)合。在傳感器 表面附近的結(jié)合是通過(guò)目標(biāo)與附著到傳感器表面的探針的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在這些方法中， 必需添加嚴(yán)格的步驟來(lái)獲得對(duì)探針/目標(biāo)相互作用的高靈敏性和特異性。這一般涉及改變 溫度和/或緩沖條件?，F(xiàn)有技術(shù)提出了在固體表面上的雜化分析，其中信號(hào)產(chǎn)生在核酸酶的作用下被控 制(W003052139、W002059364)。在這些公開(kāi)物中，描述了一些方法，其中核酸目標(biāo)/探針雜 化物被酶裂解，引起可檢測(cè)信號(hào)的分離。這樣的酶裂解步驟使得該分析更為選擇性和更嚴(yán) 格。選擇對(duì)某些堿基序列為選擇性的酶的可能性進(jìn)一步提高了檢測(cè)的特異性。在某些情況 下，甚至可以檢測(cè)到單個(gè)核苷酸錯(cuò)配(例如，SNP)。W002059364提出了磁性顆粒作為標(biāo)記 物的用途?，F(xiàn)有技術(shù)的分析具有幾個(gè)缺點(diǎn)，它們是在反應(yīng)表面附近或反應(yīng)表面上進(jìn)行檢測(cè)的 結(jié)果。在酶消化之后需要洗滌步驟，來(lái)確保低背景信號(hào)和消除假陽(yáng)性。雖然可能等待裂解 的標(biāo)記物擴(kuò)散遠(yuǎn)離表面，但這顯著地提高了得到結(jié)果的時(shí)間。在涉及快速檢測(cè)的應(yīng)用中，過(guò) 程步驟的數(shù)量的減少是期望的。第二，由于標(biāo)記物附著到表面，可測(cè)量的濃度的動(dòng)態(tài)范圍與 在總(bulk)體積中產(chǎn)生信號(hào)的同質(zhì)的分析相比會(huì)是有限的。另外，存在著很少的方法，其容許從目標(biāo)產(chǎn)生的信號(hào)的擴(kuò)增而不擴(kuò)增目標(biāo)本身或 添加更多標(biāo)記物。這些方法對(duì)于低濃度的核酸目標(biāo)的檢測(cè)是有益的，而不會(huì)擴(kuò)增這種目標(biāo)。具有核酸酶活性的核酸(DNAzymes)已經(jīng)用于在擴(kuò)增期間核酸的定量實(shí)時(shí)檢測(cè)。 在同質(zhì)階段，Qzyme探針(Clontech)采用DNAzymes通過(guò)供體和接受體染料之間的拴系物 的酶裂解來(lái)控制光的產(chǎn)生。染料還已經(jīng)與金納米粒子組合作為探針中的淬滅劑。這些探針 的檢測(cè)利用包括熒光和比色方法的方法光學(xué)地進(jìn)行。這些定量性的方法需要探針和染料標(biāo) 記物的復(fù)雜的設(shè)計(jì)。發(fā)明概述本發(fā)明公開(kāi)了基于磁性或可磁化顆粒的操作檢測(cè)核酸目標(biāo)的方法，所述磁性或可 磁化顆粒從探針上朝向傳感器表面釋放。這種釋放是裂解酶的作用的結(jié)果。這些方法可以 應(yīng)用于例如核酸的定量檢測(cè)。它們可以任選地與擴(kuò)增技術(shù)(例如，PCR)組合。本發(fā)明的特別的和優(yōu)選的方面在附隨的獨(dú)立和從屬權(quán)利要求中列出。從屬權(quán)利要 求的特征可以視情況與獨(dú)立權(quán)利要求的特征以及與其他從屬權(quán)利要求的特征組合，不僅僅 是如權(quán)利要求中明確闡述的。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及檢測(cè)樣品中目標(biāo)核酸分子(1)的方法。最特別地，本發(fā)明 涉及一些方法，其組合了通過(guò)磁場(chǎng)移動(dòng)的磁性顆粒的使用和核酸特異性酶的作用。在特定
3的實(shí)施方式中，提供了檢測(cè)樣品中的目標(biāo)核酸分子(1)的方法，其包括步驟a)提供了與目標(biāo)核酸分子(1)互補(bǔ)的核酸探針(2)，其中所述探針(2)與磁性或 可磁化顆粒(3)連接，并附著到表面(4)b)在容許所述探針(2)與所述目標(biāo)核酸(1)的結(jié)合的條件下使所述樣品與所述探 針接觸，從而形成探針/目標(biāo)雜化物，c)施加或活化核酸裂解酶(E)，其區(qū)別未結(jié)合的探針和結(jié)合的探針/目標(biāo)雜化物，d)至少在步驟(c)期間，施加磁場(chǎng)(F)以操作未結(jié)合的磁性或可磁化顆粒朝向遠(yuǎn) 離所述表面的區(qū)域，e)在一個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)在所述表面⑷上磁性或可磁化顆粒的濃度和/或 在遠(yuǎn)離所述表面的所述區(qū)域中磁性或可磁化顆粒的濃度，在特定的實(shí)施方式中，在所述表面處和/或在遠(yuǎn)離所述表面的所述區(qū)域中的檢測(cè) 通過(guò)測(cè)量所述磁性或可磁化顆粒的磁場(chǎng)來(lái)進(jìn)行。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在所述表面處和/或在遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域中磁性或可 磁化顆粒的檢測(cè)是通過(guò)FTIR(frustrated total internalreflection，受抑全內(nèi)反射)進(jìn) 行的。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，在所述表面處和/或在遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域中磁性 或可磁化顆粒的檢測(cè)通過(guò)測(cè)量附著到所述磁性或可磁化顆粒的可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行。在特定的實(shí)施方式中，在本發(fā)明的上下文中使用的磁性或可磁化顆粒是包含磁性 材料和熒光標(biāo)記物的顆粒。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用了核酸裂解酶，其至少裂解所述探針/ 目標(biāo)雜化物中的所述探針。在可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用了核酸裂解酶，其裂解雙鏈DNA。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用了核酸裂解酶，其是序列特異性酶，或是 對(duì)甲基化的核酸具有特異性的酶。在此處描述的方法的某些實(shí)施方式中，在核酸裂解酶之前添加切口酶。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用核酸裂解酶，其是形成所述探針(2)的 一部分的 DNAzyme 或 RNAzyme。在又進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用核酸裂解酶，其在所述目標(biāo)核酸分 子(1)的PCR擴(kuò)增期間被摻入到所述目標(biāo)核酸分子(1)中。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用核酸裂解酶，其裂解DNA/RNA雜化物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，描述了一些方法，其中所述目標(biāo)核酸(1)是DNA，所述探 針⑵是RNA，其中所述酶(E)是僅消化RNA/DNA雜化物中的RNA的酶。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及用于根據(jù)磁性或可磁化顆粒的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)目標(biāo)核酸 的設(shè)備。根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備包括反應(yīng)表面(4)和檢測(cè)區(qū)域，其中所述檢測(cè)區(qū)域是能夠檢測(cè) 結(jié)合到所述表面的標(biāo)記物的檢測(cè)區(qū)域，或是能夠檢測(cè)在遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域中的標(biāo)記物的 檢測(cè)區(qū)域。一般地，此處描述的設(shè)備進(jìn)一步包括移動(dòng)磁性或可磁化顆粒遠(yuǎn)離和/或朝向能 夠檢測(cè)結(jié)合到所述表面的標(biāo)記物的檢測(cè)區(qū)域、和/或遠(yuǎn)離和/或朝向能夠檢測(cè)在遠(yuǎn)離所述 表面的區(qū)域中的標(biāo)記物的檢測(cè)區(qū)域的裝置。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的設(shè)備包 括
-反應(yīng)表面(4)，-具有能夠檢測(cè)與所述反應(yīng)表面(4)結(jié)合的標(biāo)記物的第一檢測(cè)區(qū)域的第一傳感器 (61)，-用于施加從所述檢測(cè)表面到遠(yuǎn)離所述檢測(cè)表面的區(qū)域的磁場(chǎng)(F)的裝置-具有遠(yuǎn)離所述檢測(cè)表面的第二檢測(cè)區(qū)域的第二傳感器(62)，和-任選地，用于將磁性或可磁化顆粒移動(dòng)朝向所述第二檢測(cè)區(qū)域的裝置。在特定的實(shí)施方式中，設(shè)備包括反應(yīng)室，其中所述反應(yīng)室包括_包括反應(yīng)表面(4)和能夠檢測(cè)結(jié)合到所述反應(yīng)表面(4)的標(biāo)記物的第一檢測(cè)區(qū) 域的第一區(qū)域，-遠(yuǎn)離所述第一區(qū)域的第二區(qū)域，包括能夠檢測(cè)所述遠(yuǎn)離第一區(qū)域的區(qū)域中的標(biāo) 記物的第二檢測(cè)區(qū)域，和-施加從所述第一區(qū)域到所述第二區(qū)域的磁場(chǎng)(F)的裝置。在此處描述的設(shè)備的特定的實(shí)施方式中，所述第一和/或第二傳感器能夠檢測(cè)不 同的標(biāo)記物。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，此處設(shè)想的設(shè)備進(jìn)一步包括具有附著于所述反應(yīng)表 面的磁性或可磁化顆粒的多個(gè)不同的探針，其中每個(gè)探針包括不同的可檢測(cè)標(biāo)記物。在又進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，在此設(shè)想的設(shè)備的第一和第二區(qū)域處在所述反應(yīng) 室的對(duì)側(cè)上。根據(jù)以下詳細(xì)說(shuō)明，連同附圖，本發(fā)明的上述和其他特征、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得明 顯；


了，舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的原理。給出這種描述僅是為了舉例，而不是限制本發(fā)明 的范圍。以下引用的附圖標(biāo)記涉及附圖。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明附圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的核酸探針/目標(biāo)雜化的核酸酶依賴(lài)性檢測(cè)的特定實(shí)施 方式的示意圖。畫(huà)面A到C描繪了其中存在于樣品中的目標(biāo)核酸結(jié)合到探針的情況(A 目標(biāo)核酸 存在但是不雜化)。探針/目標(biāo)雜化物的存在(B:探針/目標(biāo)雜化物的形成)引起了這種 雜化物被僅消化雙鏈核酸的酶的裂解(畫(huà)面C)，并引起磁性或可磁化顆粒從探針釋放(C: 釋放的磁性或可磁化顆粒被磁場(chǎng)F移動(dòng)離開(kāi)反應(yīng)表面)。畫(huà)面D到F描繪了不與目標(biāo)雜化的(過(guò)量的)探針的結(jié)局(其也相應(yīng)于樣品中不 存在目標(biāo)核酸的情況)。不形成雜化物，不發(fā)生消化，磁性或可磁化顆粒不釋放。(1 目標(biāo)核酸；2 探針核酸；3 磁性或可磁化顆粒；4 反應(yīng)表面；E 核酸酶；F磁 力)。附圖2顯示了其中沒(méi)有目標(biāo)核酸的擴(kuò)增而發(fā)生信號(hào)放大的本發(fā)明的特定實(shí)施方 式的示意圖。在第一個(gè)步驟(A)中，核酸目標(biāo)結(jié)合探針。然后添加僅消化探針/目標(biāo)雜化 物中的探針的酶，引起附著到探針的磁性或可磁化顆粒的釋放(畫(huà)面B)。然后所述釋放的 目標(biāo)核酸可再次結(jié)合探針(畫(huà)面B)。所述探針/目標(biāo)雜化物中的探針再次消化，引起其他 磁性或可磁化顆粒的釋放(畫(huà)面C)。1 目標(biāo)核酸；2 探針核酸；3 磁性或可磁化顆粒；4 反應(yīng)表面；E 核酸酶；F磁 場(chǎng)。
附圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式用于進(jìn)行核酸酶依賴(lài)性分析的設(shè)備的示意 圖。所述設(shè)備包括具有反應(yīng)表面(4)和兩個(gè)傳感器(61和62)的反應(yīng)室(5)和產(chǎn)生磁場(chǎng)(F) 的裝置。附圖3顯示了利用不同的探針和標(biāo)記物用于多路化的設(shè)備起作用的實(shí)施方式。帶 有磁性或可磁化顆粒和標(biāo)記物的每個(gè)探針的部分在雜化和核酸酶處理之后被裂解。存在于 未消化的探針(21)和(22)的部分上的磁性或可磁化顆粒(31)和(32)保持在傳感器(61) 附近。釋放的磁性或可磁化顆粒(31')和(32')通過(guò)磁力F被操縱朝向傳感器(62)。
在不同的附圖中，相同的附圖標(biāo)識(shí)是指相同的或類(lèi)似的元件。將針對(duì)特定的實(shí)施方式和參考某些附圖描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不受此限制，僅 由權(quán)利要求限制。權(quán)利要求的任何附圖標(biāo)識(shí)將不被看做限制范圍。描述的附圖僅是示意性 的而非限制性的。在附圖中，為了說(shuō)明性的目的，某些元件的大小可以被擴(kuò)大，并且沒(méi)有按 比例尺描繪。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“包括”在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用時(shí)，它不排除其他元素或步驟。 當(dāng)涉及單名詞時(shí)使用不定冠詞或冠詞例如“a”、或“an”、“the”的地方，這包括該名詞的復(fù) 數(shù)，除非特別聲明了其他的情況。此外，在說(shuō)明書(shū)中和在權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)第一、第二、第三等等，是用于區(qū)分相似的 要素，而不一定描述次序或時(shí)間順序。要理解的是，這樣使用的術(shù)語(yǔ)在合適的狀況下是可互 換的，在此描述的本發(fā)明的實(shí)施方式能夠以不同于在此描述和說(shuō)明的其他順序來(lái)操作。單獨(dú)地提供以下術(shù)語(yǔ)或定義來(lái)幫助理解本發(fā)明。這些定義不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為具有小于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的范圍。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明定義在此使用的術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)”是指在本發(fā)明的方法中要被檢測(cè)和/或定量的核酸。本 申請(qǐng)?jiān)O(shè)想的目標(biāo)分子的實(shí)例的非限制性列表在說(shuō)明書(shū)中提供。術(shù)語(yǔ)目標(biāo)可以指樣品中存在 的核酸，但還可以指其擴(kuò)增的版本(通過(guò)PCR、AMR、TMR、NASBA等)。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“探針”是指包含能夠特異性結(jié)合目標(biāo)(的部分)的序列 的核酸。在本發(fā)明中“核酸”是指在天然的樣品中存在的DNA和RNA，但還指合成的分子，例 如PNA (具有肽骨架的核酸)。當(dāng)在磁場(chǎng)中的操作的上下文中被提及時(shí)，能夠在磁場(chǎng)中被磁吸的磁性珠子、球體 或其他形狀被稱(chēng)為“顆粒”。在此使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”是指產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的任何化合物。在這方面，磁性或 可磁化顆粒當(dāng)它們?cè)诶缢鼈兊拇艌?chǎng)的檢測(cè)或它們的光學(xué)性質(zhì)的檢測(cè)的上下文中被提及 時(shí)，被稱(chēng)為“標(biāo)記物”。術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)表面”是指探針可以附著之上的表面，并且在本發(fā)明的方法中核酸酶消 化在此處發(fā)生。如在此使用的“檢測(cè)區(qū)”(或區(qū)域)是指一種區(qū)域，任選地相應(yīng)于反應(yīng)室的一部分， 其處在傳感器的范圍之內(nèi)，容許這個(gè)區(qū)域內(nèi)標(biāo)記物的檢測(cè)。當(dāng)在表面上進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，這也被 稱(chēng)為檢測(cè)表面。檢測(cè)表面可以相同于或不同于反應(yīng)表面。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及檢測(cè)樣品中的目標(biāo)核酸分子的方法。這些方法基于目標(biāo)核 酸分子與探針的結(jié)合，其除核酸酶活性以外還確保釋放可檢測(cè)的標(biāo)記物。根據(jù)特定的實(shí)施
6方式，這些方法包括以下步驟提供包含與目標(biāo)核酸分子(1)互補(bǔ)的序列的核酸探針(2)，其中所述探針(2)與磁 性或可磁化顆粒(3)連接，并附著到表面(4)，在容許探針(2)與目標(biāo)核酸(1)的結(jié)合的條件下使懷疑含有目標(biāo)核酸的樣品與所 述探針接觸，從而，如果所述目標(biāo)核酸存在于樣品中，容許探針/目標(biāo)雜化物的形成，施加或活化核酸裂解酶(E)，其區(qū)別未結(jié)合的探針和結(jié)合的探針/目標(biāo)雜化物，施加磁場(chǎng)(F)，以操縱未結(jié)合的磁性或可磁化顆粒朝向遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域，在一個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)所述表面(4)上磁性或可磁化顆粒的數(shù)量，和/或在 遠(yuǎn)離所述表面的檢測(cè)區(qū)域中磁性或可磁化顆粒的數(shù)量。在本發(fā)明的上下文中，提及“遠(yuǎn)離”或“遠(yuǎn)離所述表面”的區(qū)域，是指一種區(qū)域，其 特征在于，磁性/可磁化顆粒在該區(qū)域中的存在不影響在所述表面上磁性顆粒的檢測(cè)，和/ 或在該區(qū)域中的檢測(cè)不受到所述表面上磁性/可磁化顆粒的存在的影響。對(duì)于檢測(cè)來(lái)說(shuō)， 遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域與在所述表面處的區(qū)域是不相關(guān)的。取決于使用的核酸酶的特征，在所述表面處或在遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域中磁性或可 磁化顆粒的檢測(cè)直接地或逆反地與樣品中目標(biāo)核酸的數(shù)量相關(guān)。在特定的實(shí)施方式中，區(qū)別未結(jié)合的探針和結(jié)合的探針/目標(biāo)雜化物的核酸酶能 夠至少裂解探針/目標(biāo)雜化物中的探針，并且不裂解未結(jié)合的探針。在這些實(shí)施方式中，僅 未結(jié)合的探針將保持在反應(yīng)表面上。在反應(yīng)表面處由未結(jié)合的探針上的標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào) 與樣品中目標(biāo)的數(shù)量逆相關(guān)。在遠(yuǎn)離結(jié)合表面的檢測(cè)區(qū)域中釋放的顆粒所產(chǎn)生的信號(hào)(裂 解的探針/目標(biāo)雜化物)與樣品中目標(biāo)的數(shù)量直接相關(guān)。在可選擇的實(shí)施方式中，區(qū)別未結(jié)合的探針和結(jié)合的探針/目標(biāo)雜化物的核酸酶 僅裂解未結(jié)合的探針核酸。在這些實(shí)施方式中，僅在使探針與樣品接觸時(shí)形成的探針/目 標(biāo)雜化物保持在反應(yīng)表面上。在反應(yīng)表面處由探針/目標(biāo)雜化物上的標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)與 樣品中目標(biāo)的數(shù)量直接相關(guān)。在遠(yuǎn)離結(jié)合表面的區(qū)域中釋放的顆粒所產(chǎn)生的信號(hào)(裂解的 未結(jié)合的探針)與樣品中目標(biāo)的數(shù)量逆相關(guān)。在此處設(shè)想的方法中，組合核酸雜化、核酸酶裂解和磁性分離。在這些方法的特定 實(shí)施方式中，雜化和核酸酶消化都不受磁場(chǎng)的存在的影響。因而，磁場(chǎng)的應(yīng)用不必限于方法 中的那些步驟，其中釋放的磁性或可磁化顆粒被操縱朝向遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域，和/或其 中在所述表面上磁性或可磁化顆粒的存在被檢測(cè)。這具有的優(yōu)點(diǎn)是，檢測(cè)可以在整個(gè)方法 中發(fā)生，以及目標(biāo)的檢測(cè)可以與例如目標(biāo)的PCR擴(kuò)增同時(shí)地進(jìn)行。本發(fā)明的方法適合于各種各樣的樣品中核酸的檢測(cè)。樣品可以是任何來(lái)源，包括 環(huán)境樣品、法醫(yī)樣品、來(lái)自工業(yè)過(guò)程的樣品、微生物樣品、組織或體液樣品，等等。本發(fā)明的 方法適合于DNA以及RNA。在特定的實(shí)施方式中，樣品中的核酸在分析前被加工，通過(guò)，例 如，除去蛋白質(zhì)、從RNA分離DNA、分離mRNA、經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化成DNA、經(jīng)由超聲處理 或限制消化的DNA的斷裂，等等。在特定的實(shí)施方式中，經(jīng)由PCR或其他方法，例如SDA (鏈置換擴(kuò)增)、TMA (轉(zhuǎn)錄介 導(dǎo)的擴(kuò)增)或NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)，DNA或RNA目標(biāo)核酸在此處描述的分析之前 或期間被擴(kuò)增。在本發(fā)明的方法中使用的核酸探針可以是DNA、RNA或甚至合成的核酸樣分子，例
7如PNA。探針一般經(jīng)由化學(xué)方法合成，但是也可以通過(guò)從質(zhì)粒或其他載體分離核酸來(lái)制備。 做為選擇，所述探針通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和/或翻譯方法，或通過(guò)擴(kuò)增方法例如PCR來(lái)制備。在特 定的實(shí)施方式中，除了能夠特異性結(jié)合目標(biāo)(的部分)的序列之外，探針任選地含有間隔 區(qū)。這樣的間隔區(qū)的功能是進(jìn)一步提高酶裂解位點(diǎn)和磁性顆粒之間，和/或酶的裂解位點(diǎn) 和反應(yīng)表面之間的物理距離。這樣，酶較少地被各種表面阻礙。間隔區(qū)可以是任何物質(zhì)，核 酸、蛋白質(zhì)、小分子、肽，等等，其不是分析中使用的核酸酶的底物。在本發(fā)明的方法中，核酸探針通過(guò)微陣列領(lǐng)域中公知的方法附著到表面。所述表 面被用作反應(yīng)表面，一般地是反應(yīng)室的部分。在現(xiàn)有技術(shù)中使核酸與其他化合物反應(yīng)的不同方法是已知的，例如通過(guò)反應(yīng)性功 能基團(tuán)(_C00H、NH2、HS、環(huán)氧基、醛、甲苯磺?；ⅠR來(lái)酰亞胺，等等)的化學(xué)偶聯(lián)或經(jīng)由中 間結(jié)合基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)對(duì)來(lái)偶聯(lián)，例如抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原、抗體/半抗原、 蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/凝集素、蛋白質(zhì)/DNA、DNA/DNA、蛋白質(zhì)/適體。這些和其他方法 可以用于將探針附著到本發(fā)明的方法中設(shè)想的表面上。此處描述的方法中使用的探針一般進(jìn)一步用磁性或可磁化顆粒來(lái)功能化。將磁性 或可磁化顆粒結(jié)合到DNA的方法是技術(shù)人員公知的，由例如Dynal商品化。 為了最佳靈敏度，本發(fā)明的方法利用磁性顆粒，其中磁性顆粒/探針比例是1。在此處設(shè)想的方法的特定的實(shí)施方式中，磁性或可磁化顆粒作為標(biāo)記物起作用， 被能夠在它的檢測(cè)區(qū)域(例如，在檢測(cè)表面上)中檢測(cè)磁性或可磁化顆粒的存在的傳感器 來(lái)檢測(cè)。例如，這可以由顆粒的磁場(chǎng)的檢測(cè)來(lái)確保。做為選擇，磁性顆粒通過(guò)它們的光學(xué)性 質(zhì)利用例如FTIR來(lái)檢測(cè)。在本發(fā)明的上下文中設(shè)想的方法的進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，使用探針，其除了 磁性或可磁化顆粒之外包含一個(gè)或更多個(gè)其他功能基團(tuán)。這樣的基團(tuán)一般是可檢測(cè)標(biāo)記 物，例如光學(xué)標(biāo)記物(熒光、磷光、SERRS)或超聲標(biāo)記物。這些標(biāo)記物可直接附著到核酸探 針上。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，所述磁性或可磁化顆粒包含一個(gè)或更多個(gè)功能基團(tuán)，其 可以用作標(biāo)記物。標(biāo)記物可以經(jīng)由化學(xué)方法附著到磁性或可磁化顆粒的表面，或可以摻入 到磁性或可磁化顆粒中(例如，含有順磁材料的熒光聚合物顆粒)。對(duì)此處描述的方法的主 要要求是，在分析期間，例如，作為核酸酶處理的結(jié)果，所述磁性或可磁化顆粒和可檢測(cè)標(biāo) 記物不相互分離。本發(fā)明的方法設(shè)想DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA探針/目標(biāo)雜化物的形成。一 般地，能夠與目標(biāo)特異性雜化的探針內(nèi)的序列相應(yīng)于比目標(biāo)核酸更短的寡核苷酸。任選地， 如上所述，探針可以包含間隔區(qū)。因素例如雜化物的性質(zhì)(DNA/DNA或DNA/RNA)、探針/目 標(biāo)雜化物的長(zhǎng)度、探針和目標(biāo)之間互補(bǔ)性的程度對(duì)雜化具有影響。探針的長(zhǎng)度和序列、緩 沖劑組成和溫度的合適的選擇容許探針和目標(biāo)之間特異性結(jié)合的操作。合適的條件的選 擇是技術(shù)人員已知的，且例如在 Sambrook 等(2001) 〃 Molecular Cloning :A Laboratory Manual"，Cold Spring HarborPress)中被解釋。如上文詳述的，根據(jù)本發(fā)明的方法包括形成的目標(biāo)/探針雜化物內(nèi)探針(任選地 還有目標(biāo))的裂解，或僅單鏈探針，即，不與目標(biāo)雜化的探針的裂解，從而確保磁性或可磁 化顆粒的釋放。這一般通過(guò)添加或活化核酸酶(核酸裂解酶)到反應(yīng)表面上的目標(biāo)/探針 雜化物來(lái)保證。在本發(fā)明的方法中設(shè)想了不同類(lèi)型的核酸裂解酶的使用。使用的酶可以
8是裂解或消化核酸的任何類(lèi)型的催化分子，包括蛋白質(zhì)、肽和核酶(DNAzymes、RNAzymes或 DNA和RNA的組合)。所選的酶可以在探針內(nèi)的單個(gè)位置或在多個(gè)位置裂解(包括其中的 間隔區(qū)內(nèi))。合適的酶的選擇取決于探針和目標(biāo)的性質(zhì)和序列。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方式中，提供了一些方法，其包括探針/目標(biāo)雜化物的消 化。在此，使用核酸酶，其至少裂解所述探針/目標(biāo)雜化物中的探針，任選地還裂解目標(biāo)。在特定的實(shí)施方式中，目標(biāo)和探針都是DNA。在這樣的方法中，所選的酶一般僅作 用于雙鏈DNA。其實(shí)例是雙鏈特異性DNAses，例如T7核酸外切酶和核酸外切酶III。雙鏈DNA的裂解還可以用僅在特定的位置識(shí)別特定堿基并裂解的限制性?xún)?nèi)切酶 來(lái)進(jìn)行。這些特異性裂解序列可以是目標(biāo)中固有的，或是在目標(biāo)擴(kuò)增過(guò)程期間修飾的結(jié)果。 稀有限制性酶識(shí)別位點(diǎn)(例如，8bp切割物)的摻入顯著地提高分析的特異性。在其中不發(fā) 生擴(kuò)增步驟的那些分析中，特異性可以通過(guò)篩選目標(biāo)核酸的序列中較低頻繁地出現(xiàn)的限制 性酶識(shí)別位點(diǎn)并利用這種區(qū)域用于探針的設(shè)計(jì)來(lái)提高。在此處描述的方法的其他實(shí)施方式中，目標(biāo)和探針都是RNA。在這樣的方法中，所 選的酶一般僅作用于雙鏈RNA。其實(shí)例是E.coli的核糖核酸酶(RNAse)III。在此處描述的方法的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，目標(biāo)是DNA，探針是RNA。在這樣的方 法中，所選的酶一般僅作用于DNA/RNA雜化物，其中至少RNA被裂解。其實(shí)例是Rnase H，其 特異性地降解RNA/DNA雜化物中的RNA，或T7核酸外切酶，其降解RNA/DNA雜化物中的RNA 和DNA，但不降解單鏈RNA。在此處描述的方法的又另一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)是RNA，探針是DNA。在這些方法 中，所選的酶一般僅作用于DNA/RNA雜化物，其中至少DNA被裂解，例如來(lái)自堪察加半島蟹 的雙鏈特異性核酶(DSN) (Shagin 等(2002) Genome Res. 12,1935-1942)。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，目標(biāo)和探針都是DNA，其中在目標(biāo)和探針DNA之 間發(fā)生錯(cuò)配(突變或環(huán)體)。酶例如CEL1 (US658322)或SP1 (Pimkin等(2007) BMC Biotechnol.7,29)可以在存在錯(cuò)配時(shí)切開(kāi)DNA。切口酶一般特異于雙鏈核酸，不裂解單鏈 核酸。任選地，核酸外切酶例如核酸酶Bal-31或T7核酸外切酶可以進(jìn)一步降解切口的DNA， 并促進(jìn)磁性或可磁化顆粒的釋放。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方式中，提供了一些方法，其包括僅未結(jié)合的探針，S卩，不 與目標(biāo)雜化的探針的消化。在此，使用裂解單鏈探針、但是不裂解探針/目標(biāo)雜化物中的探 針或目標(biāo)的核酸酶。在使用DNA探針時(shí)，適合于在這些方法中使用的酶的實(shí)例包括單鏈特異性 DNAses (例如，核酸外切酶1、綠豆核酸酶、核酸酶Bal31、Recjf, SI核酸酶)。在其他實(shí)施 方式中，對(duì)于RNA探針，使用的酶是單鏈特異性RNAse(RNAse I、RNAse A、RNAse T1、綠豆核 酸酶、核酸酶Bal31)。這樣的酶的使用在其中形成DNA/RNA雜化物的分析中是特別適合的。 為了避免在目標(biāo)的結(jié)合之前探針的非期望的消化，單鏈特異性核酸酶在目標(biāo)/探針雜化物 形成之后添加。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方式中，核酸酶是具有催化性質(zhì)的核酸。最特別地，核酸酶 在探針和/或擴(kuò)增的目標(biāo)核酸之內(nèi)存在。在這些實(shí)施方式中，所述酶不需要添加到探針，而 是被活化以確保所需的活性。在特定的實(shí)施方式中，使用基于核酸的酶(例如，DNAzymes和RNAzymes)，從而催化性質(zhì)被構(gòu)建到探針之中，使得DNA或RNAzyme成為探針的整體部分。一種這樣的探針的實(shí) 例是在 Sando 等(2005 Org. Biomol. Chem. 3，1002-1007)中描述的 TASC (Target-Assisted-SelfCleaving,目標(biāo)輔助的自我裂解)探針。這樣的探針與目標(biāo)的結(jié)合產(chǎn)生了導(dǎo)致DNAzyme 裂解自身的構(gòu)象變化。附著到包含這樣的DNAzyme的探針的磁性或可磁化顆粒，由此可以 通過(guò)目標(biāo)與探針的結(jié)合被裂解下來(lái)并釋放。在另一個(gè)實(shí)施方式中，除了能夠與目標(biāo)雜化的序列之外，所述探針還含有作為核 酶的裂解反應(yīng)的底物的序列。在這種情況下，探針可能必需滿(mǎn)足某些酶要求，例如，在裂 解位點(diǎn)處特定核糖核苷酸的存在。相關(guān)的活性核酶在擴(kuò)增的核酸目標(biāo)中(例如，經(jīng)由PCR 中的引物)提供，或在擴(kuò)增期間釋放。在探針與目標(biāo)的雜化之時(shí)，磁性或可磁化顆粒被 釋放。裂解的顆粒的數(shù)量可以與核酶的濃度、因而與目標(biāo)的濃度相關(guān)。核酶的實(shí)例包括 (Qzyme (Clontech)，Hammerhead。這樣的核酶的使用容許PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)。本發(fā)明的方法中設(shè)想的核酸酶對(duì)于它們的活性可能需要特定的條件，例如，ATP、 GTP等等和任何輔因子(例如，NAD+)的存在。這些條件是已知的，可以在反應(yīng)表面保證(例 如，通過(guò)使用適合的緩沖劑)。在對(duì)如上所述的核酸酶可應(yīng)用時(shí)，探針結(jié)構(gòu)可以調(diào)配來(lái)滿(mǎn)足合適的核酸酶的要 求(例如，游離的3’或5’末端、切口、缺口)。此外，如果目標(biāo)要經(jīng)歷目標(biāo)擴(kuò)增過(guò)程(PCR、 NASBA、SDA...),擴(kuò)增的目標(biāo)可以被修飾(例如，通過(guò)引物)來(lái)滿(mǎn)足核酸酶的要求，或容許在 目標(biāo)和探針兩者中的相似的修改。本發(fā)明的方法包括通過(guò)探針將磁性或可磁化顆粒結(jié)合到表面，然后釋放磁性或可 磁化顆粒，并確保它移動(dòng)遠(yuǎn)離它所結(jié)合的表面。更特別地，此處描述的方法包括其中磁性或 可磁化顆粒被磁場(chǎng)操縱遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表面的步驟。本發(fā)明的方法公開(kāi)了根據(jù)磁性或可磁化顆粒與表面的結(jié)合、裂解酶釋放所述顆粒 的比活性、和磁性或可磁化顆粒經(jīng)受磁力遠(yuǎn)離所述表面、降低洗滌需要的，用于核酸目標(biāo)的 定量分析。在此處描述的其中核酸酶僅作用于探針/雜化物的方法的實(shí)施方式中，當(dāng)核酶 酶是活性的時(shí)候，施加磁場(chǎng)將所述顆粒拉離所述反應(yīng)表面進(jìn)一步確保了裂解的磁性或可磁 化顆粒被快速地從反應(yīng)表面除去而不影響擴(kuò)增，容許實(shí)時(shí)檢測(cè)。樣品中目標(biāo)的存在所產(chǎn)生的信號(hào)可以在兩個(gè)水平上檢測(cè)。首先，與反應(yīng)表面結(jié)合 的顆粒的數(shù)量可以在核酸酶的活性之前和之后來(lái)檢測(cè)。在這個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)表面作為 檢測(cè)區(qū)域、任選地作為檢測(cè)表面起作用。在僅僅設(shè)想來(lái)自探針/目標(biāo)雜化物的標(biāo)記物的裂 解、以及標(biāo)記物僅可以在存在目標(biāo)分子的情況下從表面釋放的那些實(shí)施方式中，從所述表 面釋放的顆粒的數(shù)量(以及因而在所述反應(yīng)表面上降低的信號(hào))與樣品中存在的目標(biāo)的 數(shù)量相關(guān)。在其中核酸酶特異于單鏈探針的實(shí)施方式中，標(biāo)記物僅可以從處在所述表面上、 不結(jié)合目標(biāo)分子的那些探針釋放。因而在這些實(shí)施方式中，從所述表面釋放的顆粒的數(shù)量 (因而，在反應(yīng)表面上降低的信號(hào))，與樣品中存在的目標(biāo)的數(shù)量逆相關(guān)。其次，釋放的磁性或可磁化顆?？梢栽谶h(yuǎn)離所述反應(yīng)表面的檢測(cè)區(qū)域中測(cè)量(例 如，在傳感器表面)，從而從所述反應(yīng)表面釋放的顆粒(至少部分地)通過(guò)磁場(chǎng)被移動(dòng)朝向 該檢測(cè)區(qū)域(在此稱(chēng)為第二檢測(cè)區(qū)域)。這個(gè)檢測(cè)區(qū)域遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表面。再一次，在僅探 針/目標(biāo)雜化物被裂解的那些方法中，在遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表面的這個(gè)檢測(cè)區(qū)域中檢測(cè)到的顆 粒的數(shù)量，與樣品中存在的目標(biāo)的數(shù)量直接相關(guān)(越多目標(biāo)存在于樣品中，信號(hào)越強(qiáng))，而在利用僅降解單鏈探針的核酸酶的方法中，在第二檢測(cè)區(qū)域中檢測(cè)的信號(hào)與樣品中目標(biāo)的 數(shù)量逆相關(guān)(越多的目標(biāo)存在于樣品中，信號(hào)越弱)。不論在此處描述的方法的不同實(shí)施方 式中是否使用兩個(gè)檢測(cè)區(qū)域，能夠檢測(cè)所述反應(yīng)表面上標(biāo)記物的存在的傳感器和相應(yīng)的檢 測(cè)區(qū)域被稱(chēng)為第一傳感器/第一檢測(cè)區(qū)域，而能夠檢測(cè)遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表面的區(qū)域中的標(biāo)記 物的傳感器和相應(yīng)的檢測(cè)區(qū)域被稱(chēng)為第二傳感器/第二檢測(cè)區(qū)域。進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立測(cè)量的可能性允許以高精度和在大的動(dòng)態(tài)范圍之內(nèi)核酸目標(biāo)的濃 度的動(dòng)力學(xué)測(cè)定，因?yàn)榭梢詫?duì)一個(gè)濃度進(jìn)行若干測(cè)量。用磁場(chǎng)從反應(yīng)表面除去的磁性或可 磁化顆粒的使用進(jìn)一步提供了物理地采集顆粒以及計(jì)數(shù)它們的數(shù)量的選項(xiàng)(例如，作為遠(yuǎn) 離反應(yīng)表面的第二傳感器的特定的實(shí)施方式或除該實(shí)施方式以外)。這容許以高準(zhǔn)確度和 精確度確定目標(biāo)濃度。要注意的是，在上文設(shè)想的檢測(cè)方案中，在反應(yīng)表面處和在遠(yuǎn)離反應(yīng)表面的檢測(cè) 區(qū)域中的檢測(cè)都可以根據(jù)檢測(cè)區(qū)域中磁性或可磁化顆粒的磁性或光學(xué)性質(zhì)，或根據(jù)如下文 詳述的在磁性或可磁化顆粒之中或之上的在一個(gè)或兩個(gè)檢測(cè)區(qū)域中可檢測(cè)的另一個(gè)標(biāo)記 物(不同于磁場(chǎng))來(lái)發(fā)生。因而，在特定的實(shí)施方式中，所述磁性或可磁化顆粒的磁性本身用作檢測(cè)的標(biāo)記 物。這可以用任何適合的電磁傳感器來(lái)進(jìn)行，所述電磁傳感器可以檢測(cè)磁性或可磁化顆粒 的存在，例如，電極、電線、線圈、磁抗性傳感器GMR、AMR、TMR)、磁限的傳感器、Hal 1傳感器、 平面的Hall傳感器、SQUID、磁共振傳感器。做為選擇，檢測(cè)根據(jù)磁性或可磁化顆粒本身的 光學(xué)性質(zhì)發(fā)生(例如，檢測(cè)例如氧化鐵的FTIR)。做為選擇，或與磁性和/或FTIR檢測(cè)組合地，可以使用其他標(biāo)記物或檢測(cè)方法。例 如，磁性或可磁化顆粒也可以用于電檢測(cè)。做為選擇，磁性或可磁化顆?？梢园判圆牧?和例如熒光物質(zhì)的混合物，還容許使用兩種獨(dú)立的方法檢測(cè)這樣的顆粒。在其他實(shí)施方式 中，核酸可以例如單獨(dú)地用磁性或可磁化顆粒和熒光標(biāo)記物(參見(jiàn)上文)兩者來(lái)標(biāo)記。還設(shè)想了其中磁性或可磁化顆粒根據(jù)一種材料來(lái)檢測(cè)的方法，所述材料不被包含 在磁性或可磁化顆粒本身之內(nèi)，或不附著于所述磁性或可磁化顆粒本身。例如，磁性或可磁 化顆粒結(jié)合的探針可以進(jìn)一步包含光學(xué)標(biāo)記物。所設(shè)想的檢測(cè)方法的這樣的實(shí)施方式僅適 合于其中在酶消化步驟中核酸探針不被完全消化的分析(其將引起磁性或可磁化顆粒從 標(biāo)記物上的釋放)。例如，當(dāng)探針包含某接頭和該接頭時(shí)，所述標(biāo)記物可以連接到所述接頭， 條件是標(biāo)記物所結(jié)合的接頭的至少這個(gè)部分(和將這個(gè)部分連接到所述顆粒的區(qū)域)未進(jìn) 行酶裂解?；诖判曰蚩纱呕w粒本身的性質(zhì)，或被包含在顆粒之內(nèi)的或直接附著到所述 顆粒的材料的性質(zhì)的檢測(cè)方法，特別適合于其中核酸探針被完全地消化、因而通過(guò)核酸酶 從所述顆粒完全除去的分析。當(dāng)除了磁性或可磁化顆粒本身的磁性或光學(xué)性質(zhì)之外使用標(biāo)記物時(shí)，探針的差異 化標(biāo)記提供了進(jìn)行多路化分析的可能性。例如，不同的探針(即，結(jié)合不同的目標(biāo))各自用 不同的標(biāo)記物標(biāo)記，從而可以同時(shí)檢測(cè)不同的目標(biāo)的存在。例如，設(shè)想了細(xì)菌的不同菌株的 檢測(cè)。這可以在一種分析中進(jìn)行，在所述分析中，結(jié)合到反應(yīng)表面的菌株特異性探針各自用 包含磁性材料和不同的熒光材料的聚合物顆粒標(biāo)記。取決于樣品內(nèi)存在的菌株的種類(lèi)，特 異性著色的磁性或可磁化顆粒將在探針/目標(biāo)雜化物的消化之后從所述表面釋放。如上文 詳述的，這可以任選地在反應(yīng)表面處和/或在遠(yuǎn)離反應(yīng)表面的檢測(cè)區(qū)域中檢測(cè)。
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依靠探針/目標(biāo)雜化物中探針的選擇性裂解的、此處描述的方法的那些實(shí)施方式 僅僅提供了額外的益處，即，任一檢測(cè)區(qū)域(或附著到任一傳感器表面)中標(biāo)記物數(shù)量的檢 測(cè)可以在分析期間進(jìn)行，以及作為時(shí)間的函數(shù)的信號(hào)的測(cè)量可以用于確定目標(biāo)濃度。雖然 在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)足以評(píng)估濃度，一般進(jìn)行在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)量，因?yàn)檫@改善了精確度。 基于動(dòng)力學(xué)的測(cè)量的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以測(cè)定在大的范圍內(nèi)的濃度。對(duì)于高濃度，可能希望 的是使用短的反應(yīng)時(shí)間，因?yàn)闃?biāo)記物從反應(yīng)表面的完全除去可以快速地獲得，而對(duì)于低濃 度，結(jié)合到反應(yīng)表面的標(biāo)記物的數(shù)量不受限制，長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間是實(shí)現(xiàn)盡可能大的信號(hào)改變 所希望的。依靠終點(diǎn)或單一時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的分析，例如在現(xiàn)有技術(shù)中描述的，檢測(cè)更有限的濃 度范圍。來(lái)自高目標(biāo)濃度的信號(hào)的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)可以在短時(shí)間方式中測(cè)量(在從反應(yīng)表面除 去所有標(biāo)記物之前)，并外推到長(zhǎng)時(shí)間方式，或反之，來(lái)自低目標(biāo)濃度的信號(hào)可以在長(zhǎng)時(shí)間 方式中測(cè)量，并內(nèi)推到短時(shí)間方式。由于測(cè)量可以實(shí)時(shí)地完成，有可能原位地根據(jù)反應(yīng)速度 確定濃度是屬于高濃度方式還是低濃度方式。在信號(hào)改變的測(cè)量中，大信號(hào)中的小的改變(即，低目標(biāo)濃度)將具有高誤差。為 了提高測(cè)量的精確度，在此處描述的方法的特定的實(shí)施方式中，測(cè)量從反應(yīng)表面釋放的標(biāo) 記物的數(shù)量，而不是保持附著到所述表面的標(biāo)記物的數(shù)量。與其他力場(chǎng)(優(yōu)選磁性的)組 合地、被用于除去已經(jīng)被酶裂解反應(yīng)釋放的顆粒的磁力，被用于收集和重定向裂解的顆粒 到另一個(gè)區(qū)域，在其中任選地檢測(cè)它們的標(biāo)記物和測(cè)定它們的數(shù)量。裂解的和未裂解的顆 粒的測(cè)量產(chǎn)生了目標(biāo)濃度的確定方面的非常高的精確度。容許裂解的和未裂解的顆粒的同 時(shí)實(shí)時(shí)測(cè)量的特定結(jié)構(gòu)是通過(guò)與在反應(yīng)表面處的第一傳感器、在遠(yuǎn)離但是平行于這個(gè)反應(yīng) 表面的檢測(cè)區(qū)域(例如，在傳感器表面處)中的第二傳感器，以及能夠拖動(dòng)顆粒遠(yuǎn)離所述反 應(yīng)表面并朝向所述第二檢測(cè)區(qū)域的磁力的一種反應(yīng)。所有裂解的顆粒通過(guò)磁力被拖離所述 反應(yīng)表面，以及任選地在第二檢測(cè)區(qū)域就位，并被檢測(cè)。其他可能的結(jié)構(gòu)包括鄰近的傳感器 (例如，在同一平面上相互遠(yuǎn)離的兩個(gè)區(qū)域)與磁力組合，所述磁力能夠?qū)⑵叫杏谶@些表面 的磁性或可磁化顆粒從反應(yīng)表面處的第一檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)到遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表面的第二檢測(cè) 區(qū)域。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)包括磁場(chǎng)與例如顆粒的微流運(yùn)動(dòng)組合，從而在通過(guò)磁力從所述反應(yīng)表 面上除去之后，所述顆粒通過(guò)微流轉(zhuǎn)運(yùn)到第二檢測(cè)區(qū)域。本發(fā)明的方法容許擴(kuò)增的目標(biāo)核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)。在包括病原體鑒定、病毒載荷測(cè) 試、食物測(cè)試和mRNA表達(dá)作圖的許多應(yīng)用中，低數(shù)量的目標(biāo)核酸使得必需利用各種指數(shù)性 (例如，PCR，NASBA)和線性(例如，LCR、TMA)擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)。這些核酸目標(biāo)的定量 檢測(cè)例如在某些診斷方法中通常是理想的。在擴(kuò)增期間目標(biāo)核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)確保拷貝形成 的速率與原始目標(biāo)核酸濃度的偶聯(lián)。因此，本發(fā)明的方法進(jìn)一步確保實(shí)時(shí)地測(cè)定作為模板 的核酸目標(biāo)的擴(kuò)增速率。在這些實(shí)施方式中，核酸探針含有可在核酶的作用下裂解的片段 (DNA、RNA或組合)。如上所述，核酶的活化可以在核酸目標(biāo)的擴(kuò)增期間發(fā)生。更具體地，模 板復(fù)制的循環(huán)過(guò)程(聚合酶結(jié)合、引物結(jié)合或鏈延伸)可以引起核酶的釋放、活化或產(chǎn)生。 對(duì)于PCR和NASBA來(lái)說(shuō)，有可能使用例如含有核酶的模板的引物，從而鏈延伸引起附著到擴(kuò) 增子的活性核酶序列的產(chǎn)生(這樣的引物是在W02007056312A2中公開(kāi)的Qzyme引物)。活 性核酶可以與含有必需的識(shí)別序列的核酸探針雜化，并從反應(yīng)表面釋放磁性或可磁化顆粒 (即，標(biāo)記物)。隨著每一輪擴(kuò)增，酶的數(shù)量與擴(kuò)增子的數(shù)量成正比地提高。在釋放的標(biāo)記 物的提高中觀察到酶活性的指數(shù)式提高。如在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)PCR中，目標(biāo)的濃度越高，達(dá)到某一檢測(cè)水平所需的循環(huán)數(shù)越少。游離標(biāo)記物由于酶作用僅可在溶液中存在，背景信號(hào)將是 極低的。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法被用于檢測(cè)甲基化的目標(biāo)核酸。DNA甲基化一 般通過(guò)DNA甲基化酶在CpG位點(diǎn)(在順序上為胞嘧啶隨后是鳥(niǎo)嘌呤)發(fā)生。在細(xì)菌中，甲基 化通過(guò)酶，例如通過(guò)EcoR I甲基化酶(識(shí)別GAATTC序列)在腺嘌呤位點(diǎn)發(fā)生。還描述了 甲基化RNA底物的RNA甲基化酶。取決于分析的設(shè)計(jì)(甲基化的或未甲基化的探針DNA)， 可以使用某些核酸內(nèi)切酶，對(duì)于它們，裂解取決于甲基化DNA的存在(例如，MCRBc, Dpnl) 或甲基化DNA的缺乏(例如，DpnII、SacI)。這些分析適合于，例如，腫瘤診斷，因?yàn)樵S多基 因的甲基化狀況是某些癌癥的指示。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于進(jìn)行例如此處描述的那些的方法的設(shè)備。更特別 地，提供了設(shè)備，其容許磁性或可磁化顆粒從反應(yīng)表面移動(dòng)到遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表面的區(qū)域，和 具有檢測(cè)區(qū)域的傳感器，所述檢測(cè)區(qū)域能夠檢測(cè)在所述反應(yīng)表面處和/或遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表 面的顆粒。在特定的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備包括反應(yīng)表面(4)遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表面的檢測(cè)區(qū)域施加磁場(chǎng)的裝置，所述磁場(chǎng)能夠?qū)⒋判曰蚩纱呕w粒從所述反應(yīng)表面移動(dòng)到遠(yuǎn)離 所述反應(yīng)表面的區(qū)域。在此設(shè)想的設(shè)備的特定的實(shí)施方式進(jìn)一步包括傳感器(在此稱(chēng)為第一傳感器)， 其保證第一檢測(cè)區(qū)域能夠檢測(cè)結(jié)合到所述反應(yīng)表面的標(biāo)記物。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，施加磁場(chǎng)的裝置保證了在反應(yīng)表面和遠(yuǎn)離所述反應(yīng) 表面的檢測(cè)區(qū)域之間磁場(chǎng)的存在。做為選擇，設(shè)想了設(shè)備，其除了施加磁場(chǎng)的裝置之外，還 包括移動(dòng)磁性或可磁化顆粒朝向第二檢測(cè)區(qū)域的裝置。在包含第一和第二檢測(cè)區(qū)域的設(shè)備中，第一和第二檢測(cè)區(qū)域可以位于設(shè)備中不同 的位置，只要在一個(gè)檢測(cè)區(qū)域中標(biāo)記物的檢測(cè)不受另一個(gè)檢測(cè)區(qū)域中標(biāo)記物的存在的影 響。典型的布置是檢測(cè)區(qū)域處在反應(yīng)室的對(duì)側(cè)，或鄰近(即，在同一平面中)但相互足夠地 遠(yuǎn)離的放置。在可選擇的實(shí)施方式中，提供了僅包含上文描述的第二檢測(cè)區(qū)域的設(shè)備，所述第 二檢測(cè)區(qū)域遠(yuǎn)離所述反應(yīng)表面。在特定的實(shí)施方式中，提供了包含反應(yīng)室的設(shè)備，其中所述反應(yīng)室包括第一區(qū) 域，其包含反應(yīng)表面和保證第一檢測(cè)區(qū)域能夠檢測(cè)結(jié)合到所述反應(yīng)表面的標(biāo)記物的傳感 器，和遠(yuǎn)離所述第一區(qū)域的第二區(qū)域，包含能夠檢測(cè)遠(yuǎn)離所述第一區(qū)域的區(qū)域中的標(biāo)記物 的第二傳感器(和相應(yīng)的檢測(cè)區(qū)域)。這樣的設(shè)備進(jìn)一步包括在所述第一區(qū)域和所述第二 區(qū)域之間施加磁場(chǎng)的裝置，以確保顆粒從/到所述表面和/或從/到遠(yuǎn)離所述表面的檢測(cè) 區(qū)域的移動(dòng)。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，提供了設(shè)備，其包括_反應(yīng)室，包括所述反應(yīng)室的第一區(qū)域，其包含反應(yīng)表面(4)和傳感器(61)，所述傳感器保證在 所述反應(yīng)表面附近的第一檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)結(jié)合到所述反應(yīng)表面的磁性或可磁化顆粒(3)反應(yīng)室的遠(yuǎn)離所述第一區(qū)域的第二區(qū)域，包括第二傳感器(62)，所述第二傳感器
13保證第二檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)從所述反應(yīng)表面釋放的磁性或可磁化顆粒，和-施加從所述第一區(qū)域到所述第二區(qū)域的磁場(chǎng)(F)的裝置。如上文詳述的，所述第一和/或第二傳感器可以是檢測(cè)磁性或可磁化顆粒的磁 性、光學(xué)或電學(xué)特征的相同或不同的傳感器，和/或檢測(cè)磁性或可磁化顆粒上直接存在、磁 性或可磁化顆粒內(nèi)的、或通過(guò)探針的部分間接結(jié)合到所述磁性或可磁化顆粒的其他標(biāo)記物 的傳感器。在特定的實(shí)施方式中，設(shè)備可以隨時(shí)可使用地提供，S卩，包括附著到反應(yīng)表面的適 合的核酸探針(2)，從而所述探針攜帶磁性或可磁化顆粒。在特定的實(shí)施方式中，傳感器具備能夠檢測(cè)結(jié)合到反應(yīng)表面的標(biāo)記物的檢測(cè)區(qū) 域。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，所述反應(yīng)表面可以處在透明材料，例如玻璃或塑料(例 如，聚苯乙烯或聚碳酸酯)中，其容許結(jié)合到附著于玻璃反應(yīng)表面的探針的光學(xué)(例如，熒 光)標(biāo)記物的檢測(cè)。在特定的實(shí)施方式中，能夠檢測(cè)結(jié)合到所述反應(yīng)表面的標(biāo)記物的傳感器僅特異性 檢測(cè)緊密接近于或處于反應(yīng)表面上的區(qū)域中的標(biāo)記物，而不是檢測(cè)靠近所述反應(yīng)表面的區(qū) 域中存在的主體(bulk)溶液。如上所指出的，根據(jù)所述磁性或可磁化顆粒本身的任何性 質(zhì)，傳感器可以是適合于檢測(cè)所述反應(yīng)表面上磁性標(biāo)記的核酸顆粒的存在的任何傳感器， 例如，它可以通過(guò)磁方法(例如，磁阻的、Hall、線圈)、光學(xué)方法，例如FTIR(受抑的全內(nèi)反 射)、聲波的檢測(cè)(表面聲波，體聲波、懸臂、石英晶體等等)或電檢測(cè)(例如，傳導(dǎo)、阻抗、電 流計(jì)、氧化還原循環(huán))來(lái)檢測(cè)。在特定的實(shí)施方式中，所述磁性顆粒通過(guò)FTIR來(lái)檢測(cè)。在 此，傳感器表面用對(duì)給定光譜范圍的光線具有高透明度的材料制成(例如，玻璃或某些透 明塑料)。這種材料的折射率大于鄰近傳感器表面的樣品的折射率。傳感器表面以一定角 度用光束(來(lái)自，例如，激光或LED)照明，從而這完全內(nèi)部反映了傳感器表面和樣品之間的 界面。在控制條件下，所有光線將被反射到這個(gè)界面。僅當(dāng)顆粒在靠近界面處結(jié)合時(shí)(例 如，具有磁性顆粒的高指數(shù)聚苯乙烯)，全內(nèi)反射通過(guò)光的吸收或散射被破壞，可以測(cè)量到 反射強(qiáng)度的降低。另外或作為選擇，所述傳感器是適合于通過(guò)例如成像、熒光、化學(xué)發(fā)光、吸收、散 射、表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振、Raman等等，或上文描述的方法之一來(lái)檢測(cè)直接或間接附著其 上的標(biāo)記物的傳感器。在特定的實(shí)施方式中，所述第一或第二傳感器能夠檢測(cè)超過(guò)一種標(biāo)記物和/或超 過(guò)一種類(lèi)型的標(biāo)記物。這在此處描述的方法中進(jìn)行多路化的情況中是令人感興趣的。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，反應(yīng)表面和相應(yīng)的第一檢測(cè)區(qū)域被分格，容許在所 述反應(yīng)表面上的不同區(qū)域中信號(hào)的差異化檢測(cè)。這還容許在本發(fā)明的方法中的多路化。下 文詳述了進(jìn)行多路化的方法。利用本發(fā)明的方法多路化是通過(guò)使用附著于反應(yīng)表面的不同的探針(即，針對(duì)不 同的目標(biāo))來(lái)進(jìn)行的。這些探針可以被同樣地標(biāo)記(例如，標(biāo)記物是在所有探針上存在相 同的磁性或可磁化顆粒)或不同地標(biāo)記。在第一實(shí)施方式中，所述不同的探針被相同地標(biāo)記(例如不同的探針被施加到反 應(yīng)表面的獨(dú)立的區(qū)域(例如，篩格內(nèi))，其可以由傳感器在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)區(qū)分。信號(hào)強(qiáng)度方面 的降低對(duì)篩格內(nèi)的每個(gè)區(qū)域同時(shí)地(或接連地)測(cè)量。
多路化的更精致的方法利用各自具有不同的可檢測(cè)標(biāo)記物的不同的探針。其實(shí)例 有攜帶包含磁性材料和不同的熒光標(biāo)記物的珠子的探針，所述標(biāo)記物可以相互區(qū)別。在這 種架構(gòu)中，不同的探針可以任意地附著到反應(yīng)表面，在顆粒從表面釋放時(shí)，在檢測(cè)表面處標(biāo) 記物的降低和/或在遠(yuǎn)離反應(yīng)表面的第二檢測(cè)區(qū)域中標(biāo)記物的提高可以被檢測(cè)，從而來(lái)自 不同的探針的磁性或可磁化顆粒根據(jù)不同的熒光標(biāo)記物來(lái)區(qū)分。各種身體樣品中目標(biāo)的定性和/或定量測(cè)量已經(jīng)應(yīng)用于例如各種疾病如遺傳性 疾病或傳染性失調(diào)的診斷。對(duì)于常規(guī)分析，可以將試劑作為準(zhǔn)備使用的反應(yīng)室或反應(yīng)室的部分來(lái)提供，在其 中探針、酶和緩沖劑作為干燥的或冷凍的成分保存。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的其他方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。要理解的是，雖然對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備已經(jīng)在此討論了優(yōu)選的實(shí)施方式、特定 的結(jié)構(gòu)和配置以及材料，可以進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上各種變化和修改而不背離本發(fā)明的范圍和 精神。
實(shí)施例實(shí)施例1 探針/目標(biāo)結(jié)合的核酸酶依賴(lài)件檢測(cè)本實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方式。核酸探針(2)用磁性或可磁化顆粒(3)標(biāo)記 并附著到表面(4)。附圖1的畫(huà)面A顯示了使探針⑵與包含目標(biāo)核酸⑴的樣品接觸的 步驟。畫(huà)面B顯示了探針(2)與目標(biāo)(1)的特異性結(jié)合。畫(huà)面C顯示了裂解目標(biāo)和探針核 酸之間的雜化物的酶(E)的作用。探針DNA的裂解引起磁性或可磁化顆粒(即，標(biāo)記物) (3)的釋放。畫(huà)面D到E顯示了不與DNA目標(biāo)結(jié)合的過(guò)量探針的結(jié)局。在探針和目標(biāo)之間 不形成雜化物(畫(huà)面E)。在酶(E)的作用時(shí)，不發(fā)生裂解。結(jié)果，磁性或可磁化顆粒(即， 標(biāo)記物)(3)不從表面上釋放(畫(huà)面F)。在分析期間，磁力(F)被施加遠(yuǎn)離所述表面，從而由于酶裂解而游離的標(biāo)記物被 快速和連續(xù)地從所述表面移除。實(shí)施例2 信號(hào)擴(kuò)增的實(shí)時(shí)定量的檢測(cè)該實(shí)施例由附圖2說(shuō)明。具有磁性或可磁化顆粒(3)的探針(2)附著到表面(4)， 并暴露于含有目標(biāo)(1)的樣品。目標(biāo)(1)和探針(2)是互補(bǔ)的，并且相互特異性地結(jié)合。 酶(E)可以消化探針核酸(2)，但是不消化目標(biāo)核酸(1)，但是僅僅是在探針結(jié)合到目標(biāo)的 條件之下。在消化時(shí)，磁性或可磁化顆粒(即，標(biāo)記物)(3)和原封不動(dòng)的目標(biāo)被釋放。原 封不動(dòng)的目標(biāo)因而可以再次與反應(yīng)表面上存在的另一個(gè)探針(2)雜化。這再次導(dǎo)致新的探 針對(duì)消化敏感，釋放另一個(gè)標(biāo)記物(3)。結(jié)果，在樣品中一個(gè)單獨(dú)的目標(biāo)核酸的存在可以導(dǎo) 致幾個(gè)標(biāo)記物的釋放。例如，可利用RNA探針和DNA目標(biāo)，使用RNAse A作為酶來(lái)進(jìn)行這個(gè)實(shí)施例的方法， 這種酶特異性地降解RNA:DNA雜化物中的RNA，并且將不降解DNA或未雜化的RNA。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)樣品中的目標(biāo)核酸分子(1)的方法，其包括步驟a)提供包含與所述目標(biāo)核酸分子(1)互補(bǔ)的序列的核酸探針(2)，其中所述探針(2)與磁性或可磁化顆粒(3)連接，并附著到表面(4)，b)在容許所述探針(2)與所述目標(biāo)核酸(1)的結(jié)合的條件下使所述樣品與所述探針接觸，從而形成探針/目標(biāo)雜化物，c)施加或活化核酸裂解酶(E)，其區(qū)別未結(jié)合的探針和結(jié)合的探針/目標(biāo)雜化物，d)至少在步驟(c)期間，施加磁場(chǎng)(F)以操作未結(jié)合的磁性或可磁化顆粒朝向遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域，e)在一個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)在所述表面(4)上磁性或可磁化顆粒的濃度，和/或在遠(yuǎn)離所述表面的區(qū)域中磁性或可磁化顆粒的濃度，其中所述檢測(cè)通過(guò)測(cè)量附著到所述磁性或可磁化顆粒的可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述磁性或可磁化顆粒是包含磁性材料和熒光標(biāo)記物 的顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶至少裂解所述探針/目標(biāo)雜化物中的 探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在所述核酸裂解酶之前添加切口酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶是形成所述探針(2)的一部分的 DNAzyme 或 RNAzyme。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶在所述目標(biāo)核酸分子(1)的PCR擴(kuò)增 期間被摻入到所述目標(biāo)核酸分子(1)中。
7.一種用于磁性或可磁化顆粒的檢測(cè)的設(shè)備，包括-反應(yīng)表面(4)，-具有能夠檢測(cè)與所述反應(yīng)表面(4)結(jié)合的標(biāo)記物的第一檢測(cè)區(qū)域的第一傳感器 (61)，-用于施加從所述檢測(cè)表面到遠(yuǎn)離所述檢測(cè)表面的區(qū)域的磁場(chǎng)(F)的裝置，-具有遠(yuǎn)離所述檢測(cè)表面的第二檢測(cè)區(qū)域的第二傳感器(62)，和-任選地，用于將磁性或可磁化顆粒移動(dòng)朝向所述第二檢測(cè)區(qū)域的裝置。
8.權(quán)利要求7的設(shè)備，包括反應(yīng)室，其中所述反應(yīng)室包括-包括所述反應(yīng)表面(4)和所述能夠檢測(cè)結(jié)合到所述反應(yīng)表面(4)的標(biāo)記物的第一檢 測(cè)區(qū)域的第一區(qū)域，_遠(yuǎn)離所述第一區(qū)域的第二區(qū)域，其包括能夠檢測(cè)所述遠(yuǎn)離第一區(qū)域的區(qū)域中的標(biāo)記 物的所述第二檢測(cè)區(qū)域，和-施加從所述第一區(qū)域到所述第二區(qū)域的磁場(chǎng)(F)的裝置。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的設(shè)備，其中所述第一和/或第二傳感器能夠檢測(cè)不同的標(biāo)記物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的設(shè)備，進(jìn)一步包括具有附著到所述反應(yīng)表面的磁性或可磁化顆 粒的多種不同的探針，其中每種探針包含不同的可檢測(cè)標(biāo)記物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的設(shè)備，其中所述第一和第二區(qū)域在所述反應(yīng)室的對(duì)側(cè)上。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于核酸雜化的核酸酶依賴(lài)性檢測(cè)的方法和工具。在這些方法中，磁性或可磁化顆粒被用于區(qū)分雜化的和未雜化的DNA。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101855366SQ200880116004
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者W·U·迪特默 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司