專利名稱：：天然防腐劑和抗菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及防腐劑和抗菌劑。具體說，本發(fā)明涉及由源自甘蔗的提取物得到的防腐劑和由源自甘蔗的提取物得到的抗菌劑，所述防腐劑可用于食品、化妝品、藥品和其他類似組合物的防腐，所述抗菌劑可用于口腔衛(wèi)生產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：對于本說明書中參考或討論的文件、法案或知識條款，這種參考或討論不是承認該文件、法案或知識條款或者其任意組合在優(yōu)先權(quán)日、公眾可得、公眾已知、構(gòu)成常規(guī)知識的一部分；或者已知與試圖解決本說明書所涉及的任何問題的嘗試相關(guān)。防腐劑防腐劑是一種天然或合成的化學(xué)品，可加入諸如食品、藥品、生物樣品、木材等產(chǎn)品中可防止微生物生長或不希望的化學(xué)變化導(dǎo)致的分解。食品防腐是保存其食用和營養(yǎng)價值的食品加工和處理過程。主要目的是阻止或者顯著減緩腐敗以防止食物傳染疾病(例如，通過鹽腌、冷卻、蒸煮)。然而，一些方法利用有益的細菌、酵母或真菌以添加特定品質(zhì)和保存食品(例如奶酪、葡萄酒)。雖然在保存其作為食品的價值方面維持或產(chǎn)生營養(yǎng)價值、質(zhì)地和口味至關(guān)重要；但這又是一種文化依賴的決定因素，符合一種文化的食品品質(zhì)可能在另一種文化中并不恰當(dāng)。防腐通常包括阻止細菌、真菌和其他微生物生長，以及延緩導(dǎo)致腐敗的脂肪氧化。還包括抑制食品制備期間可能發(fā)生的天然老化和脫色的方法，例如蘋果中的酶性褐變反應(yīng)，切割蘋果時導(dǎo)致褐變。一些防腐方法要求食品在處理后密封以防止被微生物再次污染；諸如干燥等其他工藝使食品無需特殊容器即可長期儲存。應(yīng)用這些工藝的常規(guī)方法包括干燥、噴霧干燥、凍干、冷凍、真空包裝、罐裝、糖漿防腐、糖結(jié)晶、食品輻照、添加防腐劑或惰性氣體如二氧化碳。不僅有助于食品防腐，而且能夠增加風(fēng)味的其他方法包括酸洗、鹽腌、煙熏、糖漿或酒精防腐、糖結(jié)晶和固化。食品防腐添加劑可單獨使用或與其他食品防腐方法聯(lián)用。防腐劑可以是抗微生物的防腐劑，能夠抑制細菌和真菌生長，或者是抗氧化劑如氧吸收劑，能夠抑制食品組分發(fā)生氧化。常用的抗微生物防腐劑包括丙酸鈣、硝酸鈉、亞硝酸鈉、亞硫酸鹽(二氧化硫、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀等)和EDTA二鈉。常用的抗氧化劑包括BHT(丁基化羥基甲苯)和BHA(丁基化羥基茴香醚)。其他防腐劑包括甲醛(通常是溶液形式)、戊二醛(殺死昆蟲)、乙醇和甲基氯代異噻唑啉酮。許多人造食品添加劑(包括防腐劑)的效果和安全性是食品科學(xué)和毒理學(xué)專業(yè)的學(xué)術(shù)派和權(quán)威們爭論的話題。各種各樣的食品中均使用了抗氧化劑來抑制脂肪和油或其氧化產(chǎn)物的分解，這些食品包括但不限于肉、家禽、脂肪、油、人造奶油、魚、海鮮和烘焙食品。目前市場被合成防腐劑如BHT和BHA壟斷。并且開始被天然防腐劑如迷迭香、茶提取物、生育酚和抗壞血酸鹽所替代。然而，目前天然防腐劑非常昂貴，限制了其在食品中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致合成防腐劑的繼續(xù)使用。目前食品工業(yè)中也使用抗微生物劑作為防腐劑來延長產(chǎn)品保存期，改善產(chǎn)品安全性、維持產(chǎn)品品質(zhì)、降低加工成本并提高在復(fù)雜供應(yīng)鏈中全球分銷產(chǎn)品的能力。由于消費者關(guān)注合成添加劑的使用，合成抗微生物的市場份額在下降，正在被天然抗微生物劑取代。諸如鹽、糖、醋和硅藻土等天然物質(zhì)也可用作傳統(tǒng)的防腐劑。另一類防腐劑以水果和蔬菜切割后在水果和蔬菜中繼續(xù)代謝的酶為目標(biāo)。例如，檸檬或其他柑桔汁的檸檬酸和抗壞血酸可抑制導(dǎo)致切開的蘋果和馬鈴薯表面發(fā)生褐變的酚酶作用。酸敗酸敗作用是脂肪、油和其他脂質(zhì)通過水解或氧化或這兩種作用發(fā)生分解。水解導(dǎo)致脂肪酸鏈從甘油酯的甘油主鏈上分裂開。然后，這些游離的脂肪酸經(jīng)歷進一步的自氧化。氧化主要是不飽和脂肪通過自由基介導(dǎo)的過程進行。這些化學(xué)過程可以在酸敗食品和油中產(chǎn)生高度反應(yīng)性分子，負責(zé)產(chǎn)生令人不快和有害的氣味和口味。這些化學(xué)過程也可破壞食品營養(yǎng)價值。在一些條件下，酸敗以及維生素的破壞發(fā)生得非?？?。當(dāng)脂肪物質(zhì)接觸空氣，其不飽和組分轉(zhuǎn)化為氫過氧化物，分解形成揮發(fā)性醛、酯、醇、酮和烴，其中一些具有令人不快的氣味。黃油通過上述過程并通過水解發(fā)生酸敗，釋放揮發(fā)性惡臭的酸，尤其是丁酸。飽和脂肪如牛脂耐受氧化，在常溫下很少發(fā)生酸敗。加速脂肪氧化的因素包括痕量金屬(鐵、鋅等)、鹽、光、水、細菌和霉菌。使用諸如鼠尾草(sage)和迷迭香等香料，將脂肪和油儲存在極少接觸氧或自由基的冰涼暗室中可延緩脂肪氧化，因為熱和光可加速脂肪與氧的反應(yīng)速率。含脂肪的食品中常常加入抗氧化劑來延緩氧化導(dǎo)致的酸敗的發(fā)展。天然抗氧化劑包括類黃酮、多酚、抗壞血酸(維生素C)和生育酚(維生素E)。合成抗氧化劑包括BHA、BHT、3，4，5-三羥基苯甲酸丙酯(也稱為沒食子酸丙酯)和乙氧喹。天然抗氧化劑儲存期較短，所以在需要較長的儲存期時使用合成抗氧化劑。水溶性抗氧化劑在防止脂肪內(nèi)發(fā)生直接氧化方面的有效性有限，但在阻斷通過食品含水部分運動的自由基方面有價值。天然抗氧化劑一些現(xiàn)代的合成防腐劑存在爭議，因為已證明它們可導(dǎo)致呼吸或其他健康問題。一些研究針對在那些存在健康問題的患者中加劇ADD和ADHD癥狀的合成防腐劑和人造著色劑。一些主要的研究表明，當(dāng)學(xué)校食品規(guī)劃中去除人造成分(包括防腐劑)時，大多數(shù)非ADD學(xué)生人群中學(xué)科表現(xiàn)提高而紀律問題下降。食品或藥品中的變應(yīng)性防腐劑可導(dǎo)致敏感個體發(fā)生過敏性休克，如果不進行急救，常常在幾分鐘內(nèi)即可導(dǎo)致死亡。因此，現(xiàn)在傾向于使用天然抗氧化劑。植物包含植物化學(xué)物質(zhì)，其中許多已知具有抗氧化性質(zhì)。多酚是許多植物中天然產(chǎn)生的一類植物化學(xué)物質(zhì)的通稱，包括類黃酮、花色苷和酚酸。大多數(shù)多酚有色，在植物果實或植物其他部分中負責(zé)產(chǎn)生顏色。其生物活性主要是作為抗氧化劑，幫助保護植物免于微生物導(dǎo)致的組織損傷和侵入。關(guān)于植物酚類化合物的文獻很多，與不同植物類別有關(guān)的各種多酚已得到充分表征和研究。許多這種多酚消化產(chǎn)生的生理學(xué)作用也已得到臨床驗證，發(fā)現(xiàn)它們不僅具有抗氧化劑活性而且具有抗炎和血管舒張性質(zhì)。日常消耗的食品如咖啡、茶、可可(巧克力)、紅酒、漿果(藍莓、黑莓、草莓)和水果(山竹、Noni、石榴、Acai、葡萄)顯示具有高抗氧化劑水平和健康促進特性。通常，植物和植物產(chǎn)品比動物食品具有高得多的抗氧化劑含量。某些含香料、漿果、果實、堅果、巧克力的產(chǎn)品、植物和谷物是飲食抗氧化劑的優(yōu)良來源。而且，咖啡、綠茶和紅茶、紅酒及各種漿果和水果果汁飲品也是抗氧化劑的優(yōu)良來源?，F(xiàn)在，許多上述來源的抗氧化劑糖漿和粉末以食品成分和添加劑形式提供，用于許多食品體系。高多酚抗氧化劑糖漿和粉末(例如，來自澳大利亞南部塔瑞克技術(shù)公司(TaracTechnologies,SouthAustralia)和美國加利福尼亞州多酚公司(PolyphenolicsfromCalifornia,USA)的源自葡萄的Vinlife)能夠形成諸如巧克力(澳大利亞墨爾本的可可農(nóng)場(CocoaFarm，MelbourneAustralia)、可可飲料、茶和冰淇淋(澳大利亞的溫迪維萊冰淇淋公司(Wendy，sVinlifeIceCream,Australia)等產(chǎn)品。然而，這些食品成分通常用于提高食品的抗氧化劑含量以提供有益的健康效果而不是作為食品防腐劑。已知甘蔗含有多酚和其他具有有益性質(zhì)的植物化學(xué)物質(zhì)。涉及這些性質(zhì)的出版物的例子包括國際專利申請WO2005/117608、PCT/AU2006/000769和PCT/AU2007/001382。然而，這些文獻并未公開低色度(colour)甘蔗提取物作為食品防腐劑。根據(jù)Payet等，“具有抗氧化劑活性的甘蔗制造產(chǎn)品中酚類組分濃度的比較”(ComparisonoftheConcentrationsofPhenolicConstituentsinCaneSugarManufacturingProductswiththeirAntioxidantActivities)，JAgricFoodChem，2006，54，7270-7276所述測定許多甘蔗制造產(chǎn)品的抗氧化劑活性。文獻報道抗氧化劑活性可能是因為麥拉德反應(yīng)產(chǎn)物的作用和著色劑大量增加的結(jié)果。具有高色度的防腐劑作為食品添加劑的應(yīng)用受到限制。并未公開使用低色度甘蔗提取物作為食品防腐劑。日本專利公開2001-112439揭示，包含蛋白黑素的紅糖提取物具有抗氧化作用，可用于降低體脂和改善皮膚狀況。然而，蛋白黑素是在高溫和低水活度條件下當(dāng)糖和氨基酸組合時形成(通過麥拉德反應(yīng))的褐色、高分子量的異源性聚合物。因此，該提取物具有高色度，限制其作為食品添加劑的應(yīng)用。該提取物還具有強烈的氣味，進一步限制了其作為食品添加劑的應(yīng)用。并未公開使用低色度的甘蔗提取物作為食品防腐劑。日本專利公開2002-161046揭示，可從甘蔗提取具有抗氧化特性的多酚。并未公開使用低色度甘蔗提取物作為食品防腐劑。日本專利公開2001-200250揭示，具有抗氧化性質(zhì)的甘蔗提取物可用作食品添加齊U。然而，并未公開使用低色度甘蔗提取物作為食品防腐劑。同時，目前使用天然抗氧化劑如迷迭香、茶提取物、生育酚和抗壞血酸鹽進行食品防腐。這些天然抗氧化劑較昂貴。由于生育酚的疏水性質(zhì)，還存在實踐的問題。由于抗壞血酸增加食品酸味也存在實踐問題?？咕鷦⑺阑蛞种莆⑸锏脑噭┛煞譃橄緞?、抗菌防腐劑或抗生素?？股厥怯梢环N能夠殺死(殺菌)或抑制(抑菌)其他微生物的微生物產(chǎn)生的分子。抗菌防腐劑和消毒劑是市售化學(xué)品，它們的區(qū)別在于，抗菌防腐劑可以至少短時間地接觸粘膜表面，而消毒劑不應(yīng)接觸粘膜表面，因為消毒劑可能有害?？茖W(xué)事務(wù)的ADA委員會(TheADA'sCouncilonScientificAffairs)強調(diào)了其他ADA接受的產(chǎn)品的口腔健康益處，例如有助于防止和減少菌斑和齦炎的抗微生物漱口水和牙膏，以及相對于單獨使用含氟牙膏能提供針對蛀齒的額外保護作用的含氟漱口水。通常，美國食品藥品管理局(FDA)將漱口水分為美容、治療、或兩者的組合。美容用漱口水是市售非處方(OTC)產(chǎn)品，有助于在刷牙前或者刷牙后去除口腔碎屑，暫時抑制口臭、減少口腔細菌和使口氣清新而具有令人愉快的味道。治療性漱口水不僅具有其美容相應(yīng)產(chǎn)品的效果，而且包含添加的活性成分，有助于針對一些口腔疾病提供保護。治療性漱口水由FDA規(guī)定，得到美國牙科協(xié)會(ADA)自愿批準(zhǔn)。在最低程度上，大多數(shù)漱口水是有效的口腔抗菌劑，能夠清新口腔和抑制口臭最長達3小時。然而，它們在預(yù)防蛀齒、牙齦炎(牙齦組織炎癥)和牙周病方面的療效有限。然而，臨床證明治療性預(yù)防蛀齒的含氟漱口水能夠?qū)棺疃噙_50%及以上的導(dǎo)致蛀齒的細菌。大多數(shù)預(yù)防蛀齒的漱口水包含氟化鈉，長時間過量攝取氟化鈉可能導(dǎo)致氟中毒。大多數(shù)非處方漱口水包含5種標(biāo)準(zhǔn)組分對抗細菌的活性成分，例如季銨化合物、硼酸和苯甲酸、酚類化合物；調(diào)味劑如糖精或甘油；收斂劑如氯化鋅以提供令人愉快的味覺和收縮組織；乙醇，18-26%;和參水。漱口水還可包含緩沖劑以降低酸度，溶解粘膜和緩解軟組織疼痛。預(yù)防蛀齒的漱口水通常包含0.05%的氟化鈉、或0.的氟化亞錫，得到FDA的批準(zhǔn)?？咕呤谒械幕钚猿煞指鞣N各樣。某些漱口水包含氯己定(所測試的最有效的菌斑對抗藥物，僅處方提供)、重金屬鹽或草藥提取物如源自血根植物的血根(sanguinaria)0抗菌性漱口水和牙膏能降低牙菌斑中可能導(dǎo)致齦炎的細菌計數(shù)并抑制細菌活性，齦炎是一種早期可逆形式的牙周(牙齦)疾病。ADA-接受的抗菌性漱口水和牙膏通過顯示在菌斑和牙齦炎中的顯著減輕作用而證實了這些要求。抗菌性漱口水中活性物質(zhì)的濃度常常大大超過提供快速細菌致死作用所確定的最低抑制濃度，使其可用于感染性病癥中。然而，許多人因為關(guān)心毒性和對牙齒的損傷而在市售漱口產(chǎn)品的使用方面較為謹慎。天然替代品包括鹽水清洗劑和碳酸氫鈉溶液清洗劑。因此，需要一種天然防腐劑和抗菌劑的替代性來源。發(fā)明概述糖蜜和其他甘蔗加工產(chǎn)物是復(fù)雜的植物化學(xué)物質(zhì)的混合物，通常包含多酚、多糖、肽和蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、有機酸、單糖和二糖。本發(fā)明提供了具有優(yōu)良的防腐和抗菌劑特性的低色度的甘蔗提取物。具體說，意外地發(fā)現(xiàn)，低色度甘蔗提取物具有高抗氧化劑活性，使其適用于抑制脂肪和油或其氧化產(chǎn)物的分解并可用作抗菌劑。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種防腐劑，其包含具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種食品、化妝品或藥品的防腐方法，該方法包括在食品、化妝品或藥品中加入有效防腐量的具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物的步驟ο本發(fā)明該方面使用的低色度提取物具有抗氧化和抗菌特性。過去，使用不同的防腐劑來獲得這兩種作用。本文所用術(shù)語“低色度”用于指源自甘蔗的提取物時表示750nm測量時的吸收值小于或等于約0.010。本文所用術(shù)語“高抗氧化性”指源自甘蔗的提取物時表示根據(jù)實施例4所述進行測試，抗氧化劑水平至少約為50微克/毫升兒茶素當(dāng)量。優(yōu)選地，源自甘蔗的提取物的抗氧化劑水平為0.99-6克/升兒茶素當(dāng)量；更優(yōu)選4-5克/升兒茶素當(dāng)量。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物作為抗氧化劑在食品、化妝品或藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明的該方面采用富含抗氧化劑的成本有效的提取物，可用于替代目前食品工業(yè)中采用的昂貴的合成抗氧化劑。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物作為抗微生物劑在食品、化妝品或藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明的該方面采用富含多酚的提取物，可用于滿足全球食品工業(yè)對天然抗微生物劑日益增長的需求。此外，本發(fā)明的提取物相對于目前使用的抗微生物劑很可能具有價格優(yōu)勢。術(shù)語“有效防腐量”表示能使脂肪和油的酸敗最小或顯著降低(抗氧化性質(zhì))和/或使微生物生長最小或顯著降低(抗微生物性質(zhì))的量。具體用量取決于具體的組合物和所需的儲存期。通常，用量占全部組合物重量0.0001-5%，更常見0.01-2.5%。本發(fā)明防腐劑可通過以下技術(shù)無需進一步的改進即可直接摻入食品、化妝品或藥品(腸內(nèi)或胃腸外產(chǎn)品)中，這些技術(shù)包括混合、輸注、注射、摻混、分散、精煉(conching)、乳化、浸漬、噴射、團聚和捏合。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種改善口腔衛(wèi)生和/或抑制、治療和/或預(yù)防齲齒形成的方法，該方法包括將具有高抗氧化劑活性的治療有效量的低色度甘蔗提取物加入口腔衛(wèi)生產(chǎn)品的步驟。本文所用術(shù)語“治療有效量”表示能使微生物生長最小或顯著抑制和/或殺死口腔中的微生物的量。通常，用量占全部組合物重量的0.0001-5%，更常見0.01-2.5%。本文所用術(shù)語“口腔衛(wèi)生產(chǎn)品”包括但不限于牙齒清潔產(chǎn)品，例如牙膏、漱口水和口香糖。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了治療有效量的具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物在口腔衛(wèi)生產(chǎn)品中的應(yīng)用，以改善口腔衛(wèi)生和/或抑制、治療和/或預(yù)防齲齒形成。本發(fā)明所用提取物可源自任何甘蔗加工產(chǎn)物，包括甘蔗研磨工藝、甘蔗制糖的精制工藝以及使用甘蔗產(chǎn)物的其他工藝，例如由糖蜜制造乙醇作為甜酒生產(chǎn)的一部分。提取物可源自原料、工藝期間的產(chǎn)物、副產(chǎn)物、最終產(chǎn)物和廢物料。例如，甘蔗提取物可源自甘蔗原汁進料、澄清甘蔗汁和濃縮甘蔗汁糖漿、廢蜜、糖蜜(由主要的糖廠或精煉廠獲得)、金色糖漿、紅糖、甘蔗渣、生物酵母泡沫(biodimder)、田間廢棄物、生長頭、果肉、甘蔗汽提物、髓、再生提取物(中和或非中和的)和研磨濾泥(millmud)。優(yōu)選地，提取物源自糖蜜。本發(fā)明中使用的提取物的物理特性取決于其總的化學(xué)組成。根據(jù)所應(yīng)用的加工方法，提取物可以通過蒸發(fā)濃縮產(chǎn)生糖漿，或者可選地提取物可以完全干燥得到粉末。制備具有不同物理性質(zhì)的提取物的能力提高了提取物的商業(yè)用途。根據(jù)其物理特性和化學(xué)組成，提取物適用于各種應(yīng)用。例如，食品工業(yè)的要求可能與美容工業(yè)的要求存在顯著不同。本文所用術(shù)語“食品”包括任何可食用的產(chǎn)品，例如但不限于糖果，補充劑，小吃(甜食和開胃菜)，含可可和咖啡的食品，調(diào)味料，飲料(包括速食飲料、預(yù)混物)，營養(yǎng)物質(zhì)，動物健康和營養(yǎng)中使用的飲食補充劑和包含補充劑和制劑，乳制品，例如牛奶、酸奶酪、冰淇淋、烘焙產(chǎn)物和食品調(diào)味品，以及動物飼料。本發(fā)明防腐劑可摻入食品中，所述食品包括但不限于乳制品一例如乳酪、黃油、牛奶和其他乳酸飲料、涂抹料(spreads)和乳酪混合物、冰淇淋和酸乳酪；基于脂肪的產(chǎn)品一例如人造奶油、涂抹料、蛋黃醬、起酥油、烹飪和煎炸油以及裝飾料；基于谷物的產(chǎn)品一包括谷物(例如，面包和面制食品(pastas))，不論這些物質(zhì)是烹飪、烘焙或是以其他方式加工；糖果一例如巧克力、蜜餞、口香糖、甜點、非乳酪面飾、果汁凍(sorbets)、冰霜和其他填料；運動營養(yǎng)產(chǎn)品，包括粉末、預(yù)混物、汁液、能量棒、等張飲料和明膠、淀粉基或果膠凝膠凍。眷飲品一不論是熱飲還是冷飲(咖啡、茶、可可、谷類、菊苣和其他基于植物提取物的飲品)、酒精或非酒精飲品，包括可樂和其他軟飲料、果汁飲料、飲食補充劑、速食預(yù)混物和膳食替代飲品；和混合產(chǎn)品一包括蛋和蛋產(chǎn)品、加工食品如湯、預(yù)先制備的面食制品。·本發(fā)明使用的提取物的制備方法本發(fā)明使用的提取物源自甘蔗產(chǎn)物，優(yōu)選甘蔗精制工藝得到的糖蜜。提取物可通過各種方法或者方法的組合從甘蔗產(chǎn)物獲得，這些方法包括采用非水或水性溶劑進行溶劑和反溶劑提?。煌ㄟ^尺寸排阻方法，例如凝膠滲透色譜或超濾方法分離在特定分子量范圍內(nèi)的組分；和采用色譜技術(shù)或技術(shù)的組合，例如離子交換色譜、疏水色譜和通過逐步提高PH或用諸如乙醇等溶劑利用分級洗脫的離子交換色譜，分離低分子量組分和高分子量組分。提取物可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進一步加工，例如微孔過濾、反滲透、真空蒸發(fā)和冷凍干燥、噴霧干燥和隧道干燥(tunneldrying)。提取物制備方法的例子在國際專利申請WO2005/117608和PCT/AU2007/001382中描述。附圖簡要說明圖1示出糖蜜在Bio-GelP_2上凝膠過濾，顯示實施例1中3次運行的A420和抗氧化劑活性。圖2示出糖蜜在Bio-GelP_2上凝膠過濾，顯示實施例1中3次運行的A420和總的酚類化合物。圖3示出糖蜜在Bio-GelP_2上凝膠過濾，顯示實施例1中3次運行的A420和蔗糖。圖4示出糖蜜在Bio-GelP_2上凝膠過濾，顯示實施例1中3次運行的A420和葡萄糖+果糖。圖5是在Bio-GelP_2上獲得的糖蜜分餾物的照片(實施例1的收集池1_5)。圖6示出糖蜜在Bio-GelP_2上凝膠過濾，顯示實施例1采用pH5.O的甲酸鹽/乙腈緩沖液和PH7.5的TrisHCl緩沖液的A420分布曲線。圖7示出實施例4的96-孔板圖樣。圖8示出實施例4中A75tl的原始吸光度數(shù)值。圖9示出實施例4中校正的吸光度數(shù)值。圖10顯示實施例4中糖蜜原料稀釋品和餾分3-23的96孔板圖樣。圖11顯示圖10所示圖樣在750nm的吸光度數(shù)值。圖12示出實施例4的色譜圖。圖13示出實施例4的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖14示出實施例4中餾分3-26的各餾分按兒茶素當(dāng)量表示的總的多酚，誤差為士2SD。圖15示出實施例4中各餾分3-26按兒茶素當(dāng)量表示的總的多酚，誤差為士2SD。圖16示出由實施例4收集的有色餾分。實施例現(xiàn)在將參考以下非限制性實施例闡述本發(fā)明的各種實施方式/方面。縮寫列表BDL低于檢測限CE兒茶素當(dāng)量Dff干重GAE沒食子酸當(dāng)量GI血糖指數(shù)IC或ICUMSA通用糖分析方法的國際委員會MF微孔過濾N/D未檢測N/T未測試實施例1本實施例研究采用凝膠滲透來制備可用于本發(fā)明的提取物。方法在Bio-GelP_2柱上進行制備型凝膠滲透來分餾分子量在100-1800道爾頓(Da)范圍的稀釋的糖蜜(50%w/v)。收集六次色譜運行得到的5個分子量餾分并凍干。分析各餾分的抗氧化劑活性、總的酚類化合物、HPLC分布曲線和糖。用凝膠過濾緩沖液(含10%乙腈的20mM甲酸銨，pH5.0)將糖蜜稀釋至50%(w/ν)，并于10°C在6000g離心約1小時。上清液通過1.6μmGF/A濾膜(Whatman)過濾并在-80°C以30毫升等分試樣凍存用于凝膠過濾色譜。凝膠過濾以60毫升/小時流速，在玻璃柱(26毫米XlOOO毫米)中填裝Bio-GelP-2(BioRad,USA)至床高度為910毫米。室溫下在含10%乙腈的20mM甲酸銨緩沖液(pH5.0)中以30毫升/小時的速率使床層平衡。將稀釋的糖蜜(20毫升，50%w/v)加載到柱上，收集5毫升的餾分。對總共120毫升的稀釋糖蜜進行六次凝膠過濾。對前三次過濾得到的餾分進行顏色(A42tl)、總酚類化合物和抗氧化劑活性分析。對后三次過濾則省去抗氧化劑活性分析。每次過濾稱量約20個管子，并用1克/毫升的密度確定平均餾分的體積，從而由重量分析法確定各餾分體積。凝膠過濾柱用以下三種標(biāo)準(zhǔn)品進行校準(zhǔn)蔗糖(360kDa)、NADH(663kDa)和維生素B12(1355kDa)。按照KDa=Ve-Vo/Vt-Vo，計算每種標(biāo)準(zhǔn)品的分配系數(shù)(KDa)。用牛血清白蛋白確定空體積。Bio-GelP-2的分餾范圍是100-1800Da(BioRad)。凍干的本體餾分對于每次凝膠過濾分析，根據(jù)顏色(A42tl)、總的酚類化合物和抗氧化劑收集各餾分為5個主要餾分。每次過濾收集的餾分如表1所示。表1每次過濾收集的餾分列表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>六次凝膠過濾之后，合并每個收集池內(nèi)(收集池1-5)的六個樣品。從每個最終收集池取10毫升樣品，其余凍干。顏色(A42tl)用超純水(AriumModel611，Sartorius)稀釋凝膠過濾餾分，并在HeliosA(Unicam)分光光度計上在420nm讀取吸光度?？偡宇惢衔锔鶕?jù)Folin-Ciocalteu比色法(Kim等，2003)測定總的酚類化合物。在75毫米的試管中向50微升稀釋的樣品中加入650微升去離子水。將未稀釋的Folin-Ciocalteu試劑(50微升)加入各試管?；旌先芤翰⒃谑覝叵蚂o置5分鐘。最后加入500微升7%Na2CO3與反應(yīng)液混合，90分鐘后室溫下讀取750nm處的吸光度。酚類化合物總含量以每毫升未稀釋樣品中兒茶素當(dāng)量微克數(shù)表示。制備0-250微克/毫升范圍的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品?？寡趸瘎┗钚允紫龋苽浒润w積的14mMABTS(2，2’-連氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)和4.9mM過硫酸鉀的底物，并在室溫下暗室中儲存過夜。分析之前，用超純水將該溶液稀釋約60倍并調(diào)節(jié)至734nm處的吸光度為0.99-1.01。在75毫米試管中ABTS底物(1毫升)于水浴中26°C預(yù)孵育5分鐘，加入50微升樣品或標(biāo)準(zhǔn)品?；旌先芤翰⒃?6°C保持45分鐘，測定734nm的吸光度。抗氧化劑活性以每毫升未稀釋樣品中沒食子酸當(dāng)量的微克數(shù)表示。制備0-25微克/毫升范圍的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品。RP-HPLC分布曲線在配備有系統(tǒng)控制器(型號SCL-10AVP)、二元泵(型號LC10-AD)、光電二極管陣列(PDA)檢測器(型號SPD-M10AVP)以及用于數(shù)據(jù)采集和分析的經(jīng)典Vp6.14版軟件的Shimadzu系統(tǒng)獲取糖蜜提取物的定性指紋圖譜。樣品(10微升)在30x4.6毫米的Luna3微米C18(2)柱(Phenomenex)上于30°C洗脫。流速為1.5毫升/分鐘。流動性為A相，含0.(ν/ν)三氟乙酸(TFA)的水溶液，B相，60%乙腈在0.085%TFA中。梯度曲線為5-35%B保持12分鐘；35-100%B保持1分鐘，100%B保持3分鐘，100-5%B保持0.3分鐘，5%B重新平衡4.7分鐘。從200到400nm以4nm的波長步階以及在214、254、280、340和400nm的單獨通道測定吸光度圖譜，由PDA檢測器檢測洗脫峰，常規(guī)報道214nm色譜圖。由5個凍干收集池制備凝膠過濾樣品，包含等濃度總的酚類化合物(每毫升1毫克兒茶素當(dāng)量)。用于凝膠過濾的糖蜜樣品包含2毫克CE/毫升。糖分析采用配備系統(tǒng)控制器(型號SCL-10AVP)、泵(型號LC-10ADVP)、折射率檢測器(型號RID-10A)和經(jīng)典Vp6.12軟件的Shimadzu系統(tǒng)，通過反相HPLC分析單糖和二糖。將樣品(10微升)注入5-微升LC-NH2Supelcosil柱(250毫米X4.6毫米，Phenomenex)，40°C下運行。流動相是85%乙腈，流速為1毫升/分鐘。樣品等度洗脫20分鐘，每個樣品進行兩次。采用包含相同重量濃度的各糖的四種標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備0.3-1.2毫克/毫升范圍的葡萄糖、果糖和蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。各標(biāo)準(zhǔn)溶液一式三份注入。SDS-PAGE采用微型ProteanII平板凝膠系統(tǒng)(BioRad)，在12%丙稀酰胺凝膠上，進行SDS-PAGE電泳。凝膠過濾得到的凍干樣品溶解在水中(200毫克/毫升)，取30微升在等體積的加載緩沖液中消化。將15微升(含1.5毫克固體)加載到凝膠上。當(dāng)溴苯酚藍染料前緣到達凝膠底部時停止電泳。在0.25%考馬斯藍中對凝膠染色，在臺式掃描儀(Scanjet5400C，惠普(HewlettPackard))上掃描。MMBio-GelP-2的校準(zhǔn)在Bio-GelP_2柱上制備用于確定分子量的校準(zhǔn)曲線。凝膠過濾分布曲線圖1和2顯示了糖蜜(3次運行)的顏色(A42tl)、抗氧化劑和總的酚類化合物的凝膠過濾分布曲線。A42tl顏色分布曲線顯示，在柱空體積附近的峰和餾分62(MW832Da)的尖峰。然后吸光度逐漸降至基線?？寡趸瘎┖涂偟姆宇惢衔锏姆植记€相互間非常接近。前兩個抗氧化劑/酚類化合物的峰與A42tl峰共洗脫。然而，餾分80(MW352)處的抗氧化劑/酚類化合物寬峰并不對應(yīng)于顏色峰。該峰包含分子量135-599Da范圍的餾分69-100，可能是低色度類黃酮和多酚酸的混合物。圖3和4分別顯示了蔗糖和單糖(葡萄糖+果糖)的分布曲線。柱能夠部分分辨蔗糖和單糖。在抗氧化劑峰的前緣(餾分80前)洗脫蔗糖，尾緣(餾分80后)洗脫單糖。因此，低色度抗氧化劑峰包含所有糖蜜單糖。對于需要低色度抗氧化劑產(chǎn)品的膜過濾應(yīng)用，要求低于600Da的分子量作為目標(biāo)?？梢酝ㄟ^離子排斥色譜由糖分離抗氧化劑。本體凝膠過濾收集池將六次凝膠過濾分析的每次5個收集池融化，合并后凍干。圖5顯示凍干之前合并的收集池(收集池1-5)的顏色。收集池1和2顏色非常深；收集池1稍混濁而收集池2半透明。收集池3-5顏色變淺，從淡褐色到淡黃色。表2顯示了凍干之前合并的收集池的組成以及各個收集池的平均分子量范圍。通過質(zhì)量計算，低色度抗氧化劑/酚類化合物的峰(圖1和2)分別包含49%的抗氧化劑活性和50%的酚類化合物?？阵w積(收集池1)洗脫的深色峰包含14%抗氧化劑活性，深色尖峰(收集池2)包含28%。柱抗氧化劑活性的回收率為70%。表2凍干之前在Bio-GelP_2上凝膠過濾得到合并的收集池的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>加載糖蜜的組成總固體=35.6g/100ml；A420=43.7；總酚類化合物=10340μg/ml；抗氧化劑活性=3390μg/ml。6次過濾操作的糖蜜總體積=120ml。表3顯示了凍干之后合并的收集池的組成。相對于物理性質(zhì)，收集池1是顯著不同于收集池2的松散產(chǎn)品，收集池2具有硬質(zhì)易碎質(zhì)地。收集池3和4易碎(crimchy)且吸濕，分別包含71%和64%的糖。收集池5顏色深且粘性，難以從干燥托盤中取出而導(dǎo)致大量產(chǎn)品損失。以固體為基準(zhǔn)計(mgGAE/g固體)，收集池2和收集池5在凍干后發(fā)生顯著的抗氧化劑活性損失，分別為26%和34%。表3凍干后在Bio-GelP_2上凝膠過濾的合并的收集池的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>加載糖蜜的組成總固體=35.6g/100ml；A420=43.7；總的酚類化合物=10340μg/ml；抗氧化劑活性=3390μg/ml。6次運行的糖蜜總體積=120ml。RP-HPLC分布曲線檢測凍干的凝膠過濾收集池的反相HPLC分布曲線(分布曲線b_f)?？捎糜诒碚魇占氐乃蟹植记€之間存在顯著差異。收集池1顯示逐漸升高的曲線，只有一個小峰。推測該樣品包含不均勻的聚合物材料，該材料不能通過HPLC柱解析成各峰。收集池2代表分子量范圍636-1377Da，包含深褐色材料的尖峰。該收集池顯示能在不到1分鐘即洗脫的親水性最強材料以及許多在梯度上分辨率良好的峰。收集池3和4代表低色度抗氧化劑峰，其各自的分布曲線之間存在顯著差異。收集池5顯示的一系列峰可代表低分子量酚酸以及弱結(jié)合于柱、根據(jù)其分子量未被洗脫的較高分子量的化合物。該收集池中親水性材料的比例較低，導(dǎo)致在分布曲線的疏水區(qū)域存在較大的峰高。糖蜜加載樣品使得一些峰能夠匹配收集池中的某些分子量范圍，以及顯示收集池5中那些弱結(jié)合于凝膠和被洗脫的糖蜜峰。所有樣品在14.5分鐘顯示與色譜無關(guān)的顯著峰，代表分析結(jié)束時用乙腈沖洗以去除柱上所有結(jié)合的材料。有趣的是，代表糖蜜中疏水性較高的化合物的峰隨著收集池分子量而降低。SDS-PAGE使用凍干收集池的變性電泳來檢測提取物中的蛋白質(zhì)材料。提取物中沒有明顯超過14kDa的蛋白質(zhì)條帶。在收集池1(道2)中，在接近染料前緣觀察到較淺的染色，但不確定其是否是染色的蛋白質(zhì)或是不均勻染料前緣的殘留考馬斯藍。低分子量多肽(<IOkDa)的檢測可能要求16%凝膠的Tris-Tricine緩沖液。Mrk凝膠過濾分布曲線表明，在420nm處測定的深色糖蜜在柱的空體積中(>ISOODa)和832Da處洗脫。抗氧化劑活性和總的酚類化合物與這兩個顏色峰共洗脫。在135和599kDa之間洗脫抗氧化劑/酚類化合物寬峰，但不存在顏色峰。該抗氧化劑峰包含所有蔗糖和單糖。其包含49%洗脫的抗氧化劑活性和50%總的酚類化合物。因此，去除深色糖蜜可能將產(chǎn)物的抗氧化劑活性降低約一半。在空體積附近洗脫的深色聚合物材料包含14%洗脫的抗氧化劑活性。凍干的凝膠過濾收集池的量從0.5g到18g，兩個含糖的收集池獲得高質(zhì)量。三個凍干的收集池中抗氧化劑活性回收率大于92%，但收集池2和5中抗氧化劑活性存在顯著損失。凍干收集池的HPLC指紋圖譜顯示一些可用于表征這些樣品的獨特差異。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的蛋白質(zhì)分析顯示，在所有凍干樣品中缺乏超過HkDa的蛋白質(zhì)材料。收集池1顯示在染料前緣附近的痕量蛋白質(zhì)染色。這可能是與可水解鞣質(zhì)締合的結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后分析凍干樣品中的多糖和多酚特征，分析其抑制腸酶的能力。該實施例顯示，糖蜜凝膠過濾所得顏色分布曲線依賴于緩沖液的pH和/或組成并且可制備本發(fā)明色度較低的高抗氧化劑提取物。在pH7.5，大多數(shù)深色在空體積洗脫，而在PH5.0，在較低分子量觀察到第二深色峰。pH5.0緩沖液包含10%乙腈，可能有助于凝膠滲透性質(zhì)的改變。這種較低色度的高抗氧化劑提取物可用作食品添加劑以降低GI、降低致癌性、改變機體組成，可用作抗氧化劑或抗微生物劑而不干擾食品顏色或感官特性。并且，本發(fā)明較低色度的提取物可用于藥品應(yīng)用，尤其是顏色和苦味是重要問題的情況下。實施例2本實施例進一步研究實施例1中收集池1-4的多酚組合物。本實施例還證實了酵母泡沫(dunder)提取物中的多酚含量。溶劑萃取將各樣品的等分試樣(約200毫克)溶解在酸化(pH1.6)的水中(10毫升)。然后用乙酸乙酯萃取混合物(3X15毫升)，真空蒸發(fā)溶劑(40°C)，混合物在甲醇水溶液中重建(11，2毫升)然后進行HPLC分析。HPLC分析采用Shimadzu系統(tǒng)(澳大利亞新南威爾士雷達米爾的新馬度有限公司(ShimadzuInc.，Rydalmere，NSW，Australia))進行HPLC，該系統(tǒng)配備兩個LC-10ADVP高壓泵、SIL-10ADVP自動進樣器(250微升進樣環(huán)路)、CT0-1-ADVP柱加熱器和SPD-M10ADVP光二極管陣列檢測器。用于分離多酚的柱是LimaC18(直徑4.6mmX長度250mm，粒度5μπι，澳大利亞新南威爾士雷恩可弗的飛諾麥克斯公司(Phenomenex，LaneCove,NSW,Australia))。用于分離的流動相是2%乙酸的水溶液㈧和0.5%乙酸的乙腈水(11)的溶液(B)，流速1毫升/分鐘。用線性梯度洗脫分析物59分鐘內(nèi)10-100%B，再在100%B保持5分鐘。在280、320和370nm進行檢測。與可靠的標(biāo)準(zhǔn)品(澳大利亞新南威爾士卡斯特_希爾的西格瑪_奧德里奇公司(Sigma-Aldrich，Castle-Hill,NSW,Australia))比較洗脫時間來鑒定分析物。結(jié)果和討論基于以下三個特定波長之一(280nm、320nm和370歷)的最大UV吸收定量分析各化合物。分別由丁香酸、P-香豆酸和槲皮素的校正曲線得到基于這些波長的定量數(shù)據(jù)。HPLC-DAD鑒定的樣品中八種化合物的水平如下所示(表4)。表4=HPLC-DAD檢測5種糖蜜樣品中存在的多酚化合物的濃度所有樣品包含不同水平的丁香酸，大多數(shù)樣品中主要的化合物。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)樣品中存在表兒茶素。表5=HPLC-DAD檢測4種樣品在每個波長處酚類化合物的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表5可知，所有樣品中在280nm處顯示最大吸收的組分濃度較高，然后是主要在320nm處存在吸收的組分，再是370nm。這表明樣品主要包含酚酸。Mrt通過HPLC-DAD分析檢測樣品中的八種酚類化合物。這些樣品的高酚含量表明，它們適合用作食品或藥品的防腐劑。實施例3本實施例比較了糖蜜提取物與綠茶提取物(目前用作食品抗氧化劑)的抗氧化能力。材料和方法樣品制備研磨樣品并將約50毫克樣品溶解在5毫升甲醇中。樣品渦流、超聲30分鐘，離心5分鐘(1900RCF)。收集上清液，進行干燥。樣品以10毫克/毫升的濃度重新溶解在甲醇中。綠茶提取物和糖蜜提取物是水溶性的。氧自由基吸收容量(ORAC)試驗本研究中采用的ORAC試驗測定37°C測試樣品對抗2，2'-氮雜二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)誘導(dǎo)的過氧化自由基的抗氧化清除活性。使用熒光素作為熒光探針。測定各樣品的親水ORAC值。根據(jù)初步篩選所得大致抗氧化劑容量，從樣品相關(guān)濃度開始，一式四份，用AWA(丙酮水乙酸；7029.50.5)制備系列稀釋品，采用ORAC方法分析提取物/樣品。包括綠茶提取物作為陽性對照，該提取物根據(jù)樣品制備方法制備。包括甲醇綠茶提取物作為陽性對照，也溶解在磷酸鹽緩沖液中(pH7.4)。妥羅(Trolox)，一種水溶性維生素E類似物，用作參比標(biāo)準(zhǔn)品。在100、50、25和12.5μM的AWA溶液中制備妥羅標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。簡言之，將20μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品/對照/空白(AffA)、10μL熒光素(6.0XI(T7M)和170μLAAPH(20mM)加入各孔中。加載后立即將板轉(zhuǎn)移到預(yù)先設(shè)定為37°C的平板讀數(shù)儀，以1分鐘的時間間隔測定熒光35次。熒光讀數(shù)參比溶劑空白孔。用妥羅濃度和熒光素衰減曲線下凈面積之間的回歸方程計算最終的ORAC值，以每克樣品的微摩爾妥羅當(dāng)量(TE)表不。結(jié)果和討論各產(chǎn)物的產(chǎn)率在表4中示出。表4:各樣品提取物的產(chǎn)率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>抗氧化劑容量通過制備甲醇提取物獲得的樣品的抗氧化劑容量在表5中示出。糖蜜提取物顯示最大的抗氧化劑容量，產(chǎn)生提取物時的ORAC值為4395微摩爾TE/克樣品，或者在緩沖液中直接溶解時樣品的ORAC值為5020微摩爾TE/克樣品(表6)。這兩個值都顯著高于對應(yīng)的綠茶提取物。表5與綠茶甲醇提取物相比，用甲醇萃取的糖蜜提取物樣品的抗氧化劑容量<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>數(shù)值是均值士均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。表6與綠茶甲醇提取物相比，直接溶解在磷酸鹽緩沖液中(pH7.4)的糖蜜提取物的抗氧化劑容量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>數(shù)值是均值士均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。本實施例清楚說明，源自糖蜜的提取物是強效抗氧化劑，相對于目前市售的天然食品抗氧化劑如綠茶具有更高的ORAC活性。這表明，本發(fā)明產(chǎn)生的提取物可用作食品和藥品中的抗氧化劑和抗微生物劑。實施例4本實施例研究各糖蜜餾分中的多酚化合物相對于色度的分布以制備低色度的食品抗氧化劑。方法試劑Folin-Ciocalteu反應(yīng)試劑(未稀釋)7%碳酸鈉(無水)兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(lmg/ml)制備以下用于96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。將14微升稀釋樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入分析管中。加入182微升超純水并混合。加入14微升Folin-Ciocalteu反應(yīng)試劑?；旌喜㈧o置5分鐘。加入140微升7%的碳酸鈉?；旌喜⑹覝仂o置90分鐘。λ750nm讀數(shù)。目的是讀取加入碳酸鈉后90士5分鐘的試管。酚類分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線lmg/ml兒茶素的冷凍標(biāo)準(zhǔn)品。制備以下標(biāo)準(zhǔn)稀釋品表7兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>樣品選擇用于試驗的樣品是以下凝膠滲濾所得餾分3-26。糖蜜以14的比例用0.IM氯化鈉溶液稀釋。注入0.35毫升樣品，以0.35毫升/分鐘的速率通過Ρ2凝膠，收集3毫升餾分。餾分在4°C儲存36小時后進行分析。餾分升高至室溫，渦流混合后取樣。在包括兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的96孔板上測試樣品。用微板讀數(shù)儀中存在的混合機制實現(xiàn)各個混合步驟。采用750nm濾光片的單一讀數(shù)模式中的終點函數(shù)，用BioRadModel680XR微板讀數(shù)儀讀取板。結(jié)果和討論比較兩份“原始數(shù)據(jù)”報告以確認由于第二次讀取前的額外時間，樣品是否存在顯著改變。吸光度讀數(shù)非常接近，所以認為結(jié)果是準(zhǔn)確的。結(jié)果在圖7-16和表8-12中示出。圖7-9中96-孔板圖樣和吸光度讀數(shù)。在圖7中，空白(Blk)、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(CS···)和餾分樣品(F)都是一式三份，空孔標(biāo)以“Emp”。圖9顯示了校正的吸光度數(shù)值，即從標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中減去空白。所得兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性程度非常高，R2值為0.999(參見表8和圖13)。表8兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表9分餾樣品的原始數(shù)據(jù)，右欄列表出其兒茶素當(dāng)量。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>將各餾分具有±2S[)誤差的兒茶素當(dāng)量繪圖要求將各一式三份的吸光度變換為兒茶素當(dāng)量，這些數(shù)字的SD用于代表誤差。為此重新計算表9中的數(shù)值，剔除F14repl和F18rep2，因為它們超出所示誤差。表lo餾分樣品的數(shù)據(jù)，以兒茶素當(dāng)量表示(板1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>各板再重復(fù)兩次以確保是一次公正的結(jié)果。表11按兒茶素當(dāng)量表示的各餾分樣品的數(shù)據(jù)(板2)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>各樣品一式三份進行測試，各板具有其自身的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)參比曲線。圖9描繪了各板中各餾分的多酚結(jié)果，證實分析準(zhǔn)確性。相對于各餾分的士2SD誤差，不存在明顯偏離結(jié)果。這就表明，該分析相對準(zhǔn)確，即使一式三份各餾分的吸光度讀數(shù)并不完全精確，如％CV數(shù)值所示。在0.35毫升樣品上，用微板讀數(shù)儀在750nm分析各餾分的吸光度。圖10顯示糖蜜原料稀釋品和餾分3-23的96孔板圖樣。(在圖10中ND-沒有稀釋，Dl2_12稀釋，F(xiàn)-餾分編號，Emp-空孔。)圖11顯示圖10所示圖樣在750nm的吸光度數(shù)值。圖12顯示上述分析的色譜結(jié)果。橙色、紫色、綠色和藍色痕跡分別顯示λ405、350,280和214nm。頂部坐標(biāo)軸示出收集的餾分。圖12中的圖例<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在該波長(750nm)，餾分8向前的吸光度數(shù)值低于0.010，認為具有“低色度”。由圖15可見，相對于兒茶素當(dāng)量，餾分12具有相當(dāng)高的多酚含量，該餾分也與圖12中λ280痕跡上的肩峰一致。圖12中餾分12的λ405nm痕跡非常低，表明低色度。各餾分的色度差異可參見圖16。結(jié)論認為具有“高抗氧化劑”的餾分在這些試驗條件下包含的多酚含量為50微克/毫升兒茶素當(dāng)量或者更高。認為“低色度”的餾分在這些試驗條件下的吸光度讀數(shù)為0.010或更低。750nm波長用于多酚反應(yīng)。在415nm可更好地分析各餾分實際色度的吸光度，因為該顏色在該波長吸收更多能量，使其對餾分間的差異更加敏感。然而，750nm檢測提供了色度測量的有用指標(biāo)。該實驗表明，可從糖蜜分離許多低色度的高抗氧化劑餾分。圖16示出相對于對照(糖蜜)，一些低色度餾分。所有低色度樣品均沒有明顯的氣味。由于低色度高抗氧化劑餾分的色度低，可用于許多應(yīng)用而不干擾最終食品的感官性質(zhì)。實施例5基于以下成分制備牙膏，根據(jù)本發(fā)明該牙膏可用于治療或預(yù)防齲齒或口腔衛(wèi)生的方法中。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>提供為淺褐色水溶性可自由流動的粉末的低色度高抗氧化劑糖蜜提取物。將A的組分合并到一起，然后加入所有B的組分，70°C混合直至均勻。然后加入C，混合直至均勻。最后，混合的同時緩慢加入D，直至均勻。用檸檬酸適量調(diào)節(jié)至pH5.9-6.3。實施例6適用于兒童的包含0.3%—氟磷酸鈉的上述實施例5的牙膏。實施例7包含牙齒增白化合物的上述實施例5的牙膏。實施例8該組合物提供漱口水。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>該組合物提供口香糖。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實施例11該組合物提供經(jīng)調(diào)味的水基飲料。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>制備攪拌的同時將苯甲酸鈉溶解到50毫升水中加入檸檬酸溶液和低色度高抗氧化劑糖蜜提取物攪拌直至低色度高抗氧化劑糖蜜提取物溶解加入糖并攪拌直至溶解，然后加入調(diào)味劑并攪拌直至摻合加水配至1升實施例12該組合物提供果泥小吃。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>制備將各果泥和濃縮果汁混合到一起加入糖蜜提取物和調(diào)味劑充分混合直至摻合實施例13該組合物提供了具有加入的糖蜜抗氧化劑的油。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例14該組合物提供谷物棒。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>制備將低色度高抗氧化劑糖蜜提取物與脫脂奶粉混合并置于Hobart混合機中加入稻米和小麥脆皮，與粉末成分輕柔混合。然后加入水果成分并混合混合葡萄糖糖漿、轉(zhuǎn)化糖漿和山梨糖醇糖漿并加熱至113°C。然后在冷水浴中冷卻以終止蒸煮過程。在75°C的水浴中熔化棕櫚仁脂肪和卵磷脂將脂肪混合物加入糖漿組合中混合糖、水和鹽并加熱至110°C將脂肪加入糖溶液中將液體物質(zhì)加入干成分，在Kenwood型混合機中混合均勻?qū)⑽锪现糜诖罄硎迳希堉了韬穸?。使物料在室溫下冷卻切割成同一篩分大小的片并包裝實施例15為測定糖蜜提取物多酚粉末對食品腐敗和口腔衛(wèi)生微生物的抗微生物活性。^^糖蜜提取物多酚粉末來自糖蜜的多酚粉末(5g)由地平線科技控股有限公司(HorizonSciencePtyLtd)按國際專利申請WO2005/117608所述提供。菌株和生長條件本試驗所用試驗菌是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)菌株6571(NCTC-國家標(biāo)準(zhǔn)菌庫(NationalCollectionofTypeCultures),英國倫敦針對感染的健康防護管理中心(HealthProtectionAgencyCentreforInfection,London,UK))，變形鏈球菌(Str印tococcusmutans)ACM969和普通變形桿菌(Proteusvulgaris)ACM4730,由澳大利亞昆士蘭大學(xué)的微生物保藏中心(ACM)提供(AustralianCollectionofMicroorganisms(ACM),UniversityofQueensland)。試驗菌在胰蛋白大豆酵母提取物肉湯(TSYEB)(OxoidCM129B,Basingstoke,UK)，30g/L；酵母提取物(OxoidCM19)，6g/L上培養(yǎng)24小時。在540nm測定光密度(吸光度)并用TSYEB調(diào)節(jié)至吸光度0.5，定量接種。菌株的制備與稀釋連續(xù)稀釋(11)試驗菌在TSYEB肉湯中的過夜培養(yǎng)物22次，制備接種物。11-22次稀釋用于96孔微量滴定板。進行稀釋之后，將最低稀釋物接種到所有試驗菌的板計數(shù)瓊脂上(OxoidCM0463)以驗證細菌計數(shù)。由糖蜜制備多酚粉末將來自糖蜜的多酚粉末(0.1克)溶解在10毫升TSYEB中。該溶液在TSYEB中稀釋，從濃度(w/v)開始，稀釋至0.0005%(w/v)。抗生素溶液的制備本研究中使用抗生素青霉素G和鹽酸土霉素(密蘇里州圣路易斯的西格瑪_奧德里奇公司(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))。將各0.01克的青霉素G和鹽酸土霉素分別溶解在20毫升TSYEB中。青霉素G和鹽酸土霉素的抗生素溶液在TSYEB(11)稀釋，從濃度0.05%(w/v)開始，稀釋至2.44x10_5%(W/V)ο微板分析方法本研究使用帶蓋的平底96孔無菌微量滴定板以防止交叉污染(德國奴姆布萊特的斯卡特德公司(Sarstedt，Ntimbrecht，Germany))。各96孔微量滴定板中的一排孔只包含培養(yǎng)基(無菌陰性對照)。從第一排孔起的三排孔包含11稀釋的試驗菌(最左側(cè)孔中相當(dāng)于105CfU/ml的細菌對照，最右側(cè)孔中102cfu/ml)以及來自糖蜜的多酚溶液從最高到最低濃度(1%到0.0005%w/v)。一式三份測定多酚溶液與細菌細胞的各組合。接下來三排孔包含相同數(shù)量的細菌稀釋品，但多酚溶液從最低到最高濃度(0.0005%到l%w/v)。一式三份測定多酚溶液與細菌細胞的各組合。其余一排孔包含相同數(shù)量的細菌稀釋品和生長培養(yǎng)基以及多酚溶液，稱為陽性對照。在用于試驗菌的另一塊板中進行不含多酚溶液的陽性對照的復(fù)孔(η=6)。每個300微升孔包含50微升接種物、150微升多酚溶液。每個陰性或無菌對照孔包含200微升TSYEB肉湯。各陽性對照孔包含50微升接種物、150微升TSYEB肉湯。青霉素G和鹽酸土霉素用作參比標(biāo)準(zhǔn)品，用于測定試驗菌的敏感性，并將多酚溶液的抗微生物活性與抗生素的抗微生物活性進行比較。在分光光度計SBT(Sunrise-BasicTecan)(GrSdig，奧地利)中540nm測定光密度(OD)。測定培育之前的0D，代表零時間(To)的分光光度計讀數(shù)。將板置于培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)22小時。變形鏈球菌在37°C培養(yǎng)22小時和44小時。板中溶液用多通道移液器混合以防止在22小時(T22)后分光光度計中讀取OD之前發(fā)生團聚。結(jié)果分析抑制百分比的計算是基于Casey等，2004；Patton等，2006的研究。抑制百分比=1-(0D測試孔/相應(yīng)陽性對照孔的0D)xl00MIC0是不導(dǎo)致生長抑制的多酚溶液或抗生素的最高濃度；MIC50是導(dǎo)致50%生長抑制的多酚溶液或抗生素的濃度；和MIC100是導(dǎo)致100%生長抑制的多酚溶液或抗生素的最低濃度。MM表13來自糖蜜的多酚粉末中抗菌活性的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表14.青霉素G中抗菌活性的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表15.土霉素中抗菌活性的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>討論初步篩選多酚溶液對抗金黃色葡萄球菌的抗菌活性。通過篩選，檢測可使用的多酚溶液的最高濃度。多酚粉末濃度大于(w/v)時的光密度讀數(shù)大于1，超出分光光度計分析所推薦的范圍。多酚溶液能夠抑制金黃色葡萄球菌，MIC0<0.001%,MIC50為0.28%和MICiqq>1%(w/v)，參見表13。普通變形桿菌是食物腐敗微生物，多酚溶液能夠抑制普通變形桿菌，MIC0<0.02%，MIC5Q為和MICiqq>(w/v)，參見表13。22小時內(nèi)變形鏈球菌不生長，生長周期延長至44小時。變形鏈球菌完全抑制濃度為1%，MIC50為0.5%和MICtl為0.06%(w/v)，參見表13。用作參比標(biāo)準(zhǔn)品的抗生素顯示完全抑制的濃度低得多，然而不同的試驗菌要求不同濃度。最低濃度的土霉素(2.44x10_5%W/V)即可完全抑制金黃色葡萄球菌和變形鏈球菌，參見表15。這兩種革蘭氏陽性菌也能夠被糖蜜提取物多酚粉末所抑制。結(jié)論糖蜜提取物多酚粉末能夠抑制食物腐敗菌普通變形桿菌。變形鏈球菌和金黃色葡萄球菌都是病原體，其生長能夠被糖蜜提取物多酚粉末所抑制。糖蜜提取物多酚粉末抑制作用所要求的濃度相對于其他植物提取物來說非常低，在防止微生物生長方面具有優(yōu)良效果。本研究中試驗的批次并非最近制備的，新鮮批次的糖蜜提取物多酚粉末的效果更佳，因為如儲存不當(dāng)多酚易發(fā)生快速氧化。雖然實施例采用高色度糖蜜提取物，但預(yù)期本發(fā)明方法中使用的低色度高抗氧化劑提取物中也存在相關(guān)多酚。由這些結(jié)果可以推斷，源自甘蔗的低色度高抗氧化劑提取物可用于抑制齲齒形成和改善口腔衛(wèi)生。參考文獻CaseyJT,0，CleirighC，WalshPK,0，SheaDG，用于評價生物活性的基于穩(wěn)胃itfi·胃Ife的去的Jf胃(Developmentofarobustmicrotiterplate-basedassaymethodforassessmentofbioactivity)，JournalofMicrobiologicalMethods58(2004)327-334.PattonT,BarrettJ，BrennanJ，MoranN，分光光度生物分析在檢測微生物對麥盧卡樹蜜敏感性中的應(yīng)用(Useofaspectrophotometricbioassayfordeterminationofmicrobialsensitivitytomanukahoney),JournalofMicrobiologicalMethods64本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“包含”和“包括”并不限制本發(fā)明而排斥任何任何變體或添加。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易理解本發(fā)明的修飾和改進。這些修飾和改進也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求一種包含具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物的防腐劑。2.如權(quán)利要求1所述的防腐劑，其特征在于，所述具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物在750nm測量時的吸光度值小于或等于0.010，抗氧化劑水平至少約為50微克/毫升兒茶素當(dāng)量。3.一種食品、化妝品或藥品的防腐方法，該方法包括在食品、化妝品或藥品中加入有效防腐量的具有高抗氧化活性的低色度蔗糖提取物的步驟。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述有效防腐量為組合物總重量的0.0001-5.0%。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述有效防腐量為組合物總重量的0.01-2.5%。6.如權(quán)利要求3-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物在750nm測量時的吸光度值小于或等于0.010。7.如權(quán)利要求3-6中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物的抗氧化劑水平至少約為50微克/毫升兒茶素當(dāng)量。8.一種改善口腔衛(wèi)生和/或抑制、治療和/或預(yù)防齲齒形成的方法，該方法包括將具有高抗氧化活性的治療有效量的低色度蔗糖提取物加入口腔衛(wèi)生產(chǎn)品的步驟。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述治療有效量為組合物總重量的0.0001-5.0%。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述治療有效量為組合物總重量的0.01-2.5%。11.如權(quán)利要求8-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物在750nm測量時的吸光度值小于或等于0.010。12.如權(quán)利要求8-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物的抗氧化劑水平至少約為50微克/毫升兒茶素當(dāng)量。13.一種包含具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物的口腔衛(wèi)生產(chǎn)品。14.如權(quán)利要求13所述的口腔衛(wèi)生產(chǎn)品，其特征在于，所述具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物在750nm測量時的吸光度值小于或等于0.010，抗氧化劑水平至少約為50微克/毫升兒茶素當(dāng)量。15.具有高抗氧化劑活性的低色度甘蔗提取物在食品、化妝品或藥品中作為抗氧化劑和/或抗微生物劑的應(yīng)用。16.治療有效量的具有高抗氧化活性的低色度蔗糖提取物在口腔衛(wèi)生產(chǎn)品中的應(yīng)用，以改善口腔衛(wèi)生和/或抑制、治療和/或預(yù)防齲齒的形成。全文摘要本發(fā)明涉及包含甘蔗提取物的防腐劑和抗微生物試劑。文檔編號A23L1/30GK101815444SQ200880110510公開日2010年8月25日申請日期2008年10月3日優(yōu)先權(quán)日2007年10月5日發(fā)明者B·J·基奇,D·坎納申請人:地平線科技控股有限公司