專利名稱：：增加甲硫氨酸得率的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種通過在包含碳源和硫源的適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來生產甲硫氨酸及其衍生物的方法。該微生物和/或該培養(yǎng)基經修飾使得其甲硫氨酸/碳源得率增加。本發(fā)明還要求保護從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離甲硫氨酸及其衍生物?，F(xiàn)有技術含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸對細胞代謝是關鍵的，并工業(yè)上生產用作食物或飼料添加劑以及藥物。尤其甲硫氨酸是一種動物無法合成的必需氨基酸，在許多身體功能中起著重要作用。除了它在蛋白質生物合成中的作用，甲硫氨酸也涉及轉甲基作用，以及硒與鋅的生物利用。甲硫氨酸還直接用作對于病癥如過敏與風濕熱的治療。然而，大部分生產出的甲硫氨酸添加于動物飼料。隨著動物來源的蛋白質因BSE與禽流感(chickenflu)的緣故而減少使用，對純甲硫氨酸的需求增加。D，L-甲硫氨酸通常自丙烯醛、甲硫醇以及氰化氫通過化學方法產生。然而，該外消旋混合物的性能并不像純L-甲硫氨酸一樣好，例如在雞飼料添加劑中(Saunderson,C.L.,(1985)BritishJournalofNutrition54，621-633)。純L-甲硫氨酸可自外消旋甲硫氨酸產生，例如通過?；柑幚鞱-乙酰-D，L-甲硫氨酸來進行。這極大地提高了生產成本。對純L-甲硫氨酸需求增加，連同對環(huán)境的考慮，使甲硫氨酸的微生物生產具有吸引力。微生物發(fā)展出高度復雜的調控機制來調整細胞組分的生物合成，從而允許最大生長速率。結果，僅僅必需量的代謝物如氨基酸被合成，通常無法在野生型菌株的培養(yǎng)物上清中檢測到。細菌主要通過酶的反饋抑制及基因轉錄的阻抑或激活來控制氨基酸生物合成。在大部分情況下，這些調控途徑的效應物是相關途徑的終產物。因此，在微生物中過量生產氨基酸的策略要求對這些控制機制解除調控。在許多微生物中L-甲硫氨酸合成途徑眾所周知(圖1)。甲硫氨酸衍生自氨基酸天冬氨酸，但是其合成需要另外兩條途徑的合流(convergence)，即半胱氨酸生物合成與Cl代謝。天冬氨酸自草酰乙酸合成。在大腸桿菌(E.coli)中，穩(wěn)定的草酰乙酸儲備(pool)是檸檬酸循環(huán)的正常發(fā)揮功能所需的。因此將草酰乙酸轉化為天冬氨酸需要對從該儲備中移出草酰乙酸進行補償的反應。數種稱為添補反應(anapleroticreaction)的途徑，在大腸桿菌中實現(xiàn)了這些功能(Sauer&Eikmanns(2005)FEMSMicrobiolReviews29p76_94)。在指數生長條件及葡萄糖過剩的情況下，PEP羧化酶催化PEP的羧化產生草酰乙酸。羧化的效率取決于胞內PEP濃度及其他。PEP是參與多種反應的中心代謝物。這些反應之一，PEP糖酵解轉化為丙酮酸對大腸桿菌不是必需的，因為葡萄糖通過PTS系統(tǒng)攝入可將產自葡萄糖的兩個PEP分子之一轉化為丙酮酸。在糖酵解中，酶丙酮酸激酶(其在大腸桿菌由基因PykA和pykF編碼的兩個同工酶編碼)催化PEP轉化為丙酮酸。天冬氨酸通過順序的三個反應轉化為高絲氨酸。高絲氨酸可隨后進入蘇氨酸/異亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑。在大腸桿菌中，進入甲硫氨酸途徑需要將高絲氨酸?；癁殓牾８呓z氨酸。這個激活步驟允許隨后與半胱氨酸縮合，生成含有硫醚的胱硫醚。胱硫醚水解生成高半胱氨酸。生成甲硫氨酸的最后甲基轉移通過B12-依賴或B12-非依賴的甲基轉移酶進行。在大腸桿菌中，甲硫氨酸生物合成通過阻抑和激活甲硫氨酸生物合成基因分別經由MetJ和MetR的蛋白來調控(在FiggeRM(2006),WendischVF編，MicrobiolMonogr(5)Aminoacidbiosynthesispl64_185的綜述)。已知MetJ連同其共阻抑物S-腺苷甲硫氨酸調控基因metA、metB、metC、metE和metF。MetR在其共激活子高半胱氨酸的存在下激活編碼涉及甲硫氨酸生成的酶的其它基因，如glyA、metE、metH和metF，而metA僅在高半胱氨酸不存在時被MetR激活。所有這些酶參與Cl單元的產生及其從絲氨酸到甲硫氨酸的轉移。編碼絲氨酸羥甲基轉移酶的GlyA催化絲氨酸到甘氨酸的轉化，以及Cl單元在輔酶四氫葉酸(THF)上的伴隨轉移。甘氨酸可隨即轉化為C02、NH3，而另一個Cl單元轉移到THF上。該反應受到由基因gcvTHP和Ipd編碼的甘氨酸裂解復合物催化。由上述兩個反應所產生亞甲基-THF形式的Cl單元可隨后還原為甲基-THF或進一步氧化為甲酰-THF。甲硫氨酸生物合成需要還原為甲基-THF。因此氧化反應與甲硫氨酸生物合成競爭Cl單元。甲酰-THF或甲酸對嘌呤和組氨酸的生物合成是必需的。在大腸桿菌中，在通過由PurU基因編碼的甲?；?THF脫甲?；复呋姆磻?，甲酰-THF可轉化為THF及游離的甲酸(Nagy等(1995)J.Bacteriol177(5)p.1292-98)。亞甲基-THF到甲基-THF的還原由MetF蛋白催化。甲基到高半胱氨酸上的轉移由MetH通過維生素B12或直接由MetE催化。已知MetH酶的催化速率是MetE酶的一百倍。當缺乏維生素B12因而缺乏活性MetH時，MetE可構成多至5%的總細胞蛋白?；钚訫etH的存在降低MetE的活性，可能是通過降低通常經由MetR激活metE轉錄的高半胱氨酸的量來進行。因此，通過MetH產生甲硫氨酸為細胞節(jié)約了重要的資源，因為MetE并非大量表達。高半胱氨酸的積累對大腸桿菌是有毒的(Tuite等，2005J.Bacteriol，187，13,4362-4371.)，而且同時對經由MetR的metA表達具有負面的調控效應。因此，顯然酶MetH和/或MetE的強表達對有效的甲硫氨酸生成是必需的。在大腸桿菌中，還原的硫整合至半胱氨酸中，并隨即轉移到甲硫氨酸前體O-琥珀酰-高絲氨酸上，該過程稱為轉硫化作用(在Neidhardt，F(xiàn).C.(主編)，R.CurtissIII,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,Μ.Riley,Μ·Schaechter，禾口Η·Ε·Umbarger(Hi)·1996.EscherichiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology.AmericanSocietyforMicrobiology中綜述)。半月光M酸通過硫氫化反應由0-乙酰絲氨酸和H2S產生。該過程受到其產物半胱氨酸的負反饋調控，半胱氨酸作用于由cysE編碼的絲氨酸轉乙酰酶。N-乙酰絲氨酸(其由0-乙酰絲氨酸自發(fā)產生)與轉錄因子CysB—同激活編碼參與如下的酶的基因含硫化合物的運輸，它們變?yōu)镠2S的還原及它們在有機硫化合物半胱氨酸(其與甲硫氨酸一樣是必需氨基酸)中的整合。在缺乏半胱氨酸時，MetB催化甲硫氨酸前體0-琥珀酰高絲氨酸轉化為氨、-酮丁酸及琥珀酸，該反應稱為-消去(Aitken&Kirsch，2005，ArchBiochemBiophys433，166-75)。-酮丁酸可隨后被轉化為異亮氨酸。該副反應對甲硫氨酸的工業(yè)生產而言是不希望的，因為這兩種氨基酸難以分開。因此低_消去反應活性或保持低異亮氨酸產生的其它手段是甲硫氨酸工業(yè)生產的重要方面。臨時專利申請US60/650，124描述了如何通過優(yōu)化酶MetB來減少-消去反應。優(yōu)化半胱氨酸生物合成也可減少_消去反應由此減少副產物異亮氨酸的產生，并構成本發(fā)明的一個實施方案。本發(fā)明的概括描述本發(fā)明涉及一種在發(fā)酵過程中產生甲硫氨酸、其衍生物或前體的方法。所述方法包括-在包含碳源與硫源的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)經修飾的微生物，和_從培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸，其中與未修飾的微生物和/或方法相比，該微生物和/或方法通過如下修飾的至少一種或它們的組合而被修飾，以提供增加的甲硫氨酸/碳源得率1-減少微生物中甲酰-THF的脫甲?；?-減少微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的消耗3-通過在培養(yǎng)基中對微生物限制或使其缺乏(starving)—種或數種無機底物而限制微生物的生長。在本發(fā)明的描述中，使用大腸桿菌中相應基因的名稱來鑒定基因與蛋白質。然而，除非另外指明，根據本發(fā)明使用這些名稱具有更一般的含意，并涵蓋了其它生物中，尤其是微生物中所有相應的基因和蛋白質。還可以詳明來自其它生物的基因和蛋白質，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因和蛋白質作為附加的信息。此附加信息的目的并不是限定基因或蛋白質的一般定義。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，通過降低甲?；?THF的脫甲?；?這通過消弱PurU基因(在谷氨酸棒桿菌中稱為YP_001137322)的表達而實現(xiàn))來增加甲硫氨酸/碳源得率。PurU酶催化甲?；?THF脫甲?；阜磻Ｃ摷柞；富钚缘南魅踉黾恿思谆?THF的產生，而甲基-THF對于高半胱氨酸的甲基化所需的。脫甲?；斐傻腃l代謝物的損失導致不能轉化為甲硫氨酸的高半胱氨酸產量增加。于是，高半胱氨酸可成為酶胱硫醚gamma合酶(MetB)的底物，該酶可催化O-琥珀酰高絲氨酸與高半胱氨酸之間的反應，導致高羊毛氨酸的生成。在本發(fā)明另一個特定的實施方案中，通過降低磷酸烯醇化丙酮酸(PEP)的消耗(這通過削弱丙酮酸激酶編碼基因PykA和/或pykF而實現(xiàn))來增加甲硫氨酸/碳源得率。增加的PEP利用率(availability)可增加天冬氨酸的重要前體草酰乙酸的產生，而天冬氨酸又是甲硫氨酸的前體。谷氨酸棒桿菌僅攜帶一個丙酮酸激酶基因，其對應于YP_226326。在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過限制微生物的生長，或使該微生物缺乏無機底物來增加甲硫氨酸/碳源得率。這可通過限制培養(yǎng)基中可用的磷酸鹽和/或鉀的量來實現(xiàn)。上述對細胞生長的限制允許改善甲硫氨酸/碳源得率，因為碳并非用來生產生物質和/或維持此生物質，而是用來生產甲硫氨酸。具體而言，培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度允許生長至OD600小于200，優(yōu)選為150，更優(yōu)選為100。對于大腸桿菌，OD600為100相應于30到35g/l生物量，對于酵母為40-50g/l。對于其它微生物，該轉換因子是本領域的技術人員所知的。對于大腸桿菌，產生Ig生物量所需的磷酸鹽量為10-20mg，優(yōu)選約18mg。產生Ig生物量所需的鉀量為10-20mg，優(yōu)選約18mg。對于谷氨酸棒桿菌，產生Ig生物量所需的磷酸鹽量為14-21mg，優(yōu)選約17mg。產生Ig生物量所需的鉀量為23_33mg，優(yōu)選約28mg。對于其它微生物，該轉換因子是本領域的技術人員所知的。微生物可在豐富培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基中，優(yōu)選在基本培養(yǎng)基中生長。合適的基本培養(yǎng)基如下所述。上述三種調節(jié)甲硫氨酸/碳源得率的方法可以單獨使用或者與其它一種或兩種方法組合使用。因此，通過削弱purU基因表達減少甲?；?THF脫甲?；膳c通過削弱基因PYkA和/或pyKF的表達來減少PEP消耗以及與在培養(yǎng)基中限制或缺乏磷酸鹽和/或鉀相纟口口。類似的，通過削弱purU基因表達減少甲酰基-THF脫甲?；膳c通過削弱基因PykA和/或pyKF的表達來減少PEP消耗相結合。類似的，通過削弱purU基因表達減少甲酰基-THF脫甲?；膳c在培養(yǎng)基中限制或缺乏磷酸鹽和/或鉀相結合。類似的，通過削弱基因pykA和/或pyKF的表達來減少PEP消耗可與在培養(yǎng)基中限制或缺乏磷酸鹽和/或鉀相結合。如本申請使用的下列術語可用來解釋權利要求與說明書。根據本發(fā)明，術語“培養(yǎng)”、“發(fā)酵”或“發(fā)酵過程”可以互換使用，以表示在含有簡單碳源的合適生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌?？偧琢虬彼?碳源得率定義為甲硫氨酸+NAM(與甲硫氨酸等當量的NAM質量)(g)%/在發(fā)酵操作過程中消耗的葡萄糖(g)。甲硫氨酸衍生物源自甲硫氨酸轉化和/或降解途徑。具體而言，這些產物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)硫甲基核糖和N-乙酰甲硫氨酸。特別的，NAM是一種可易于回收的甲硫氨酸衍生物，可將其分離并通過脫乙酰作用轉化為甲硫氨酸。短語“從培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸”表示回收甲硫氨酸，SAM與NAM，以及所有其它可能有用的衍生物的行動。甲硫氨酸前體定義為其為甲硫氨酸特異代謝途徑一部分的代謝物，或可由這些代謝物得到。具體而言，這些前體是0-琥珀酰高絲氨酸(OSH),gamma-胱硫醚，高半胱氨酸和高羊毛氨酸。甲硫氨酸特異性途徑始自通過酶高絲氨酸琥珀酰轉移酶將高絲氨酸轉化為琥珀酰高絲氨酸。術語“微生物”表示細菌，酵母或真菌。優(yōu)選地，微生物選自腸細菌科(Enterobacteriaceae)、芽抱桿菌禾斗(Bacillaceae)、鏈霄菌禾斗(Streptomycetaceae)禾口棒桿菌科(Corynebacteriaceae)。更優(yōu)選地，微生物為埃希桿菌屬(Escherichia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬(Salmonella)或棒桿菌屬(Corynebacterium)的菌種。還更優(yōu)選，微生物為大腸桿菌(Escherichiacoli)或谷氨酸棒桿菌菌種。術語“經修飾的微生物”指以增加甲硫氨酸/碳源得率為目標而經遺傳修飾的微生物。本領域的技術人員知道如何調節(jié)特定基因的表達。通常的修飾包括用遺傳元件轉化微生物，包括基因替代、修飾啟動子，以及引入用于表達異源基因的載體。術語“甲硫氨酸/碳源得率”定義為發(fā)酵過程中獲得的甲硫氨酸量除以消耗的碳源量。它可以g甲硫氨酸/g碳源百分比，或mol甲硫氨酸/mol碳源來表示。術語“增強的”在此上下文中描述與無特定修飾的微生物和/或無修飾的培養(yǎng)基相比可測量的增加。在優(yōu)選實施方案中，該增加為至少2%g/g，優(yōu)選至少4%g/g，更優(yōu)選至少7%g/g?？偧琢虬彼?碳源得率優(yōu)選為至少7%g/g，優(yōu)選至少12%g/g，優(yōu)選至少15%g/g，最優(yōu)選至少19%g/為測量該增加，需確定消耗的葡萄糖量與產生的甲硫氨酸量。消耗的碳源量可通過如下方法計算通過HPLC用折射檢測或根據Brix針對補料分批溶液的方法確定生長培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度。對于分批培養(yǎng)，消耗的葡萄糖對應于實驗開始時殘留的葡萄糖量減去實驗結束時殘留的葡萄糖量。對于補料分批發(fā)酵(關于詳細的解釋參見實施例)，消耗的葡萄糖量對應于分批培養(yǎng)中葡萄糖量，接種時加入的葡萄糖量以及補料分批階段過程中注入的葡萄糖量之和減去實驗結束時殘留的葡萄糖量。術語“獲得的甲硫氨酸”包括L-甲硫氨酸與易于回收的甲硫氨酸衍生物NAM。培養(yǎng)基中獲得的甲硫氨酸量可在OPA/Fmoc衍生化后用HPLC，以L-甲硫氨酸(Fluka，Ref64319)為標準品通過熒光檢測獲得。使用折射HPLC使用NAM(Sigma，Ref01310)作為標準品測定NAM的量。根據本發(fā)明的術語“碳源”是指本領域的技術人員可用來支持微生物正常生長的任何碳源，其可為己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)，戊糖，單糖，二糖，寡糖(如蔗糖、纖維二糖或麥芽糖)，糖蜜，淀粉或其衍生物，半纖維素，甘油或它們的組合。一種特別優(yōu)選的簡單碳源是葡萄糖。另一種優(yōu)選的簡單碳源是蔗糖。本發(fā)明中術語“基因表達的削弱”表示基因表達的部分或完全抑制，此時該基因的表達被稱為“削弱的”。此表達抑制可以是基因表達的抑制，基因表達所需的啟動子區(qū)的部分或全部缺失，基因編碼區(qū)的缺失，或將野生型啟動子交換為較弱的天然或合成啟動子。優(yōu)選地，基因削弱基本上是所述基因的完全缺失，該基因可替換為選擇性標記基因以幫助鑒定、分離和純化本發(fā)明所述的菌株。優(yōu)選通過同源重組技術使基因失活(Datsenko,K.A.&ffanner,B.L.(2000)"One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts".Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640_6645)。術語“增強的”或“過表達的”在本上下文中描述由相應DNA編碼的酶活性的胞內活性的增加，例如通過增加基因的拷貝數，使用更強的啟動子或使用具有增加活性的等位基因，及可能地組合這些方法。術語“表達增加”“表達增強”或“過表達”在本文中可互換使用，含意相似。為增加基因表達，該基因可編碼于染色體中或染色體外。如于染色體中，可通過本領域技術人員所知的重組方法將一個或數個拷貝引入基因組中。如于染色體外，可用不同類型的質粒攜帶基因，所述質粒的復制起點和由此在細胞內的拷貝數方面不同。所述基因可以1-5拷貝，大約20拷貝或者直至500拷貝存在，對應于嚴緊復制的低拷貝數質粒(PSC101、RK2)，低拷貝數質粒(pACYC、pRSF1010)或高拷貝數質粒(pSKbluescriptII)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該基因可用不同強度的啟動子表達，該啟動子可為誘導型。這些啟動子可為同源的或異源的。本領域的技術人員知道哪些啟動子最為便禾Ij，舉例而言，啟動子Ptrc、Ptac、Plac或lambda啟動子vl是廣泛使用的。酶的表達可由使其相應信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)或蛋白質(例如GST標簽，AmershamBiosciences)穩(wěn)定化或不穩(wěn)定化的元件而增大或減小。本發(fā)明還涉及含有根據本發(fā)明要增強的基因的一個或數個等位基因的微生物。在本發(fā)明的描述中，使用大腸桿菌中相應基因的名稱來鑒定基因與蛋白質。然而，除非另外指出，根據本發(fā)明使用這些名稱具有更一般的含意，并涵蓋了其它生物中，尤其是微生物中所有相應的基因和蛋白質。PFAM(proteinfamiliesdatabaseofalignmentsandhiddenMarkovmodels,比對和隱藏馬爾可夫模型的蛋白質家族數據庫http://www.Sanger,ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白質序列比對的大集合。每個PFAM可用于觀察多重比對，觀察蛋白質域，評價生物中的分布，獲準進入其他數據庫，以及觀察已知蛋白質結構。COGs(clustersoforthologousgroupsofproteins蛋白質正向同源組的族；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)可通過比較來自66個全部測序完成的基因組的蛋白質序列來獲得，所述基因組代表了30個主要的系統(tǒng)發(fā)生系。每個COG自至少三個系定義，其允許鑒定以前保守的域。識別同源序列及其百分比同源性的方法對于本領域的技術人員來說是公知的，并具體地包含BLAST程序，可由網址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/以該網址上所示的默認參數使用該程序。獲得的序列可以使用如CLUSTALW(http://Ww.ebi.ac.uk/clustalw/)或者MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)以這些網站上所示的默認參數加以利用(例如，比對)。使用GenBank上給出的關于已知基因的參考文獻，本領域的技術人員可確定在其它生物體、細菌菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物等中等同的基因?？梢允褂每赏ㄟ^與源自其它微生物的基因進行序列比對而確定的共有序列并設計簡并探針以克隆在另一種生物中的相應基因而有利地完成此常規(guī)工作。這些分子生物學常規(guī)方法對于本領域的技術人員而言是熟知的，并描述于例如Sambrook等(1989MolecularCloning:aLaboratoryManual.第2版·ColdSpringHarborLab.,ColdSpringHarbor,NewYork.)?！皩ι矬w限制無機底物”定義為該微生物的生長受到添加的非有機化合物的量支配，但仍允許微弱生長的情況。上述底物的實例為磷酸鹽、鉀、鎂或它們的組合。使生物體缺乏無機底物定義為由于缺乏無機底物而導致微生物生長完全停止的情況。上述底物的實例為磷酸鹽、鉀、鎂或它們的組合。在本發(fā)明中，發(fā)明人旨在通過代謝工程改造生產菌株以增加甲硫氨酸/碳源得率。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，甲硫氨酸/葡萄糖和/或甲硫氨酸/蔗糖得率(g/g)為至少10%g/g，優(yōu)選至少15%g/g，更優(yōu)選19%g/g。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，參與硫同化、絲氨酸生成、絲氨酸轉化為甘氨酸或甘氨酸裂解的至少一個基因的表達增加。增加微生物的硫同化是有利的，因為甲硫氨酸是一種含硫氨基酸(C5HnN02S)。此外，增加氨基酸絲氨酸和甘氨酸的產量以及甘氨酸裂解(即代謝)是有利的。甘氨酸裂解與絲氨酸轉化為甘氨酸是生成亞甲基-THF的兩個主要的反應，亞甲基-THF可還原為甲基-THF，甲基-THF又是高半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸所需的。絲氨酸生成由3-磷酸甘油酸脫氫酶，磷酸絲氨酸磷酸酶和磷酸絲氨酸氨基轉移酶等酶催化。甘氨酸裂解由甘氨酸裂解復合體催化。在大腸桿菌與谷氨酸棒桿菌中，涉及前述活性且其活性可增加的酶由下述基因編碼(其后為登錄號和相應多肽的功能)基因登錄號功能大腸桿菌谷氨酸棒桿菌(括號表示杰氏棒桿菌(jekeium))cysA1788761Cgl0216硫酸通透酶(sulfatepermease)cysU,cysT1788764Cgl0213硫酸ABC轉運蛋白的組分cysff1788762膜結合硫酸轉運蛋白cysH1789121Cgl2816腺苷酰硫酸還原酶cysl1789122Cgl2817硫酸還原酶，alpha亞基cysj1789123YP_22705亞硫酸還原酶，beta亞基cysK1788754Cgl2562半胱氨酸合酶cysM2367138Cgl21360-乙酰絲氨酸硫化氫解酶cysP1788765周質硫酸結合蛋白cysE1790035Cgl2563絲氨酸乙酰轉移酶gcvT1789272(YP_249980)四氫葉酸依賴性氨甲基轉移酶gcvH1789271(YP_249981)甘氨酸裂解，氨甲基的載體gcvP1789269(YP_249979)甘氨酸脫氫酶(脫羧)Ipd1786307ΥΡ_224666硫辛酰胺脫氫酶serA1789279YP_225572磷酸甘油酸脫氫酶serB1790849YP_226764磷酸絲氨酸磷酸酶serC1787136YP_225120磷酸絲氨酸氨基轉移酶glyA1788902NP_60022絲氨酸羥甲基轉移酶在本發(fā)明的一個特定實施方案中，增加了編碼硫酸(鹽)/硫代硫酸(鹽)輸入蛋白及硫代硫酸(鹽)特異性半胱氨酸合酶的操縱子cysPUWAM，和/或編碼亞硫酸(鹽)還原酶及PAPS還原酶的操縱子cysJIH的表達。在棒桿菌屬的情況中，優(yōu)選增加cySA、cyST、cysl與cysj的表達。在本發(fā)明的另一個特定實施方案中，增加了操縱子gcvTHP和/或編碼甘氨酸裂解復合體的基因Ipd的表達?？赏ㄟ^從杰氏棒桿菌(Corynebacteriumjekeium)將基因gcvTHP可能作為合成基因引入，將甘氨酸裂解復合體引入甘氨酸棒桿菌，并在其中過表達。在本發(fā)明的另一個特定實施方案中，至少一個參與甘氨酸生成的基因，如serA、serB、serC或glyA被過表達。在本發(fā)明的另一個實施方案中，參與甲硫氨酸生物合成的代謝途徑的酶可以過表達，或其活性增加，從而增加甲硫氨酸生成。具體而言，可以過表達編碼這些酶的下述基因中的至少一個-metF1790377Cgl21715，10-亞甲基四氫葉酸還原酶-編碼高絲氨酸琥珀酰轉移酶的metA(1790443)等位基因，該基因針對S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反饋敏感性減少，如W02005/10856所述?；蛟诠劝彼岚魲U菌的情況中，基因metXCgl0652。-編碼天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶的thrA或thrA(1786183)等位基因，該基因針對蘇氨酸的反饋抑制減少。-在谷氨酸棒桿菌的情況中，可過表達asp和hom，潛在的反饋抗性，如W02007/012078所述。-metH1790450Cgll507B12-依賴性高半胱氨酸_N5_甲基四氫葉酸轉甲基酶-CysE1790035Cgl2563絲氨酸乙酰轉移酶在具有或不具有基因aecD/metB過表達，均可以預想metY(Cgl0653)在谷氨酸棒桿菌中的過表達。W02007/077041和W02007/012078中顯示了metF和metH的過表達，所述文件通過提述并入本申請中。在此文件中，發(fā)明人闡明即使使用穩(wěn)定metF信使RNA的元件進一步過表達metF也會進一步增加甲硫氨酸生成。這些穩(wěn)定元件通常是降低RNA降解核酸酶攻擊的環(huán)結構(Carrier禾口Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58—64)。在專利申請W02005/111202中，描述了過表達對其抑制劑SAM及甲硫氨酸的反饋敏感性降低的高絲氨酸琥珀酰轉移酶等位基因。該文件通過提述并入本申請中。W02007/077041表明了cysE的過表達，該文件通過提述并入本申請中。在專利申請W02004/076659中，描述了通過采用改變的metB等位基因可進一步增加甲硫氨酸的生成，所述等位基因優(yōu)先或單獨地使用H2S并由此自0-琥珀酰高絲氨酸產生高半胱氨酸，該文件通過提述并入本申請中。在專利申請JP2000/157267中，描述了通過削弱或缺失負責下調甲硫氨酸調節(jié)子的抑制蛋白MetJ(GenBank1790373)的基因實現(xiàn)了在大腸桿菌中產生L-甲硫氨酸、其前體或其衍生的化合物的進一步增加。在棒桿菌屬中，應該缺失主要的硫調節(jié)物McbR(AAP45010)，如W02007/012078所示。在本發(fā)明的另一個特定實施方案中，降低副產物異亮氨酸的產生。只能以極大難度才能將異亮氨酸與甲硫氨酸分離，且生成純甲硫氨酸的成本急劇增加。另外，異亮氨酸的生成消耗了可用于甲硫氨酸生成的碳。因此希望使異亮氨酸的生成盡可能低?？赏ㄟ^蘇氨酸生物合成途徑或在不存在半胱氨酸時通過0-琥珀酰高絲氨酸的Y-消去反應生成異亮氨酸。在專利申請W02006/082254和W02007/077041中描述了減少Y-消去活性的方法，該文件通過提述并入本申請中。在未修飾的微生物如大腸桿菌中，異亮氨酸的生成低于檢出水平(HPLC)。在經修飾的微生物中，產生的量可達到2%g異亮氨酸/g葡萄糖。從培養(yǎng)基中回收的異亮氨酸量可高于40mM。本發(fā)明人顯示參與絲氨酸生物合成的下述基因中至少一個的過表達也減少異亮氨酸的生成?；虻卿浱柟δ艽竽c桿菌谷氨酸棒桿菌serA1789279YP_22557磷酸甘油酸脫氫酶serB1790849YP_226764磷酸絲氨酸磷酸酶serC1787136YP_225120磷酸絲氨酸氨基轉移酶在本發(fā)明更特定的實施方案中，本發(fā)明人闡明了SerA、SerB和/或serC的增強表達降低副產物異亮氨酸的生成。在本發(fā)明另一個特定實施方案中，降低副產物高羊毛氨酸的生成。高羊毛氨酸是自激活的高絲氨酸和高半胱氨酸生成的氨基酸(Kromer等(2006)JBacteriol188，609-18；和BASF的專利申請WO2007/051725)。只能以極大難度才能將高羊毛氨酸與甲硫氨酸分離，且生成純甲硫氨酸的成本急劇增加。另外，高羊毛氨酸包括兩個自天冬氨酸衍生的高絲氨酸分子以及一個還原的硫分子，所有這些分子若轉化為甲硫氨酸均可以增加甲硫氨酸/碳源得率。因此，希望使高羊毛氨酸的生成盡可能低，并將使用的前體轉化為甲硫氨酸。PCT申請W02007/057125提出了降低高羊毛氨酸生成的一些其他方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了降低高羊毛氨酸生成且與此同時使其底物高半胱氨酸轉化為甲硫氨酸的其它方法。具體而言，有利于高半胱氨酸轉化為甲硫氨酸的方法是削弱由PurU基因編碼的甲酰基-THF脫甲?；富钚裕^表達由metF編碼的亞甲基-THF還原酶活性，削弱pykA和/或pykF基因的表達，過表達serA、serB或serC，或者過表達Ipd基因。發(fā)酵產生L-甲硫氨酸所用的硫源，其前體或由其得到的化合物可為如下的任一種硫酸鹽，硫代硫酸鹽，硫化氫，連二硫酸鹽，連二亞硫酸鹽，亞硫酸鹽，或它們的組合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，硫源是硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽。關于優(yōu)選的碳源，本發(fā)明人推薦葡萄糖或蔗糖。本發(fā)明還涉及生成L-甲硫氨酸、其前體或由其得到的化合物的方法，包括發(fā)酵上述產生甲硫氨酸的微生物，濃縮甲硫氨酸、其前體或衍生物，以及分離從發(fā)酵液中的期望的產物。本領域的技術人員能夠限定用于本發(fā)明微生物的培養(yǎng)條件。具體而言，細菌在200C-55°C，優(yōu)選25°C-40°C的溫度發(fā)酵，更具體地對谷氨酸棒桿菌為大約30°C，對大腸桿菌為大約37°C。通常，發(fā)酵是在發(fā)酵罐中以適于所用細菌的具有已知確定的組成的無機培養(yǎng)基進行，所述培養(yǎng)基包含至少一種簡單碳源，如果需要，還包含生成代謝物必需的共底物。具體而言，用于大腸桿菌的無機培養(yǎng)基可與M9培養(yǎng)基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA32:120-128)和M63培養(yǎng)基(Miller,1992；AShortCourseinBacterialGenetics:ALaboratoryManualandHandbookforEscherichiacoliandRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)，或與如Schaefer等(1999，Anal.Biochem.270:88_96)限定的培養(yǎng)基具有相同或類似的組成。類似地，用于谷氨酸棒桿菌的無機培養(yǎng)基可與BMCG培養(yǎng)基(Liebletal.，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205_210)，或與如Riedel等(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3573-583)描述的培養(yǎng)基具有相同或類似的組成?？裳a充所述培養(yǎng)基以補償突變引入的營養(yǎng)缺陷。發(fā)酵后，可回收L-甲硫氨酸、其前體或由其得到的化合物，并如果需要進行純化。在培養(yǎng)基中回收和純化生成的化合物(如甲硫氨酸和N-乙酰甲硫氨酸)的方法是本領域的技術人員公知的。任選地，在純化發(fā)酵產物的過程中，可保留0%到100%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選95%，還更優(yōu)選至少99%的生物質。任選地，在回收甲硫氨酸之前，將甲硫氨酸衍生物N-乙酰甲硫氨酸通過脫乙?；D化為甲硫氨酸。本發(fā)明也涉及經優(yōu)化以發(fā)酵生成甲硫氨酸的微生物，即與未修飾微生物相比具有改進的甲硫氨酸/碳源得率并包含上述遺傳修飾的微生物。附圖圖1大腸桿菌中的甲硫氨酸生物合成。縮寫P磷酸，GA3P3-磷酸甘油醛，PGA磷酸甘油酸，PEP磷酸烯醇丙酮酸，Pyr丙酮酸，Asp天冬氨酸，Asp-P天冬氨酰磷酸，Asp-SA天冬氨酸半醛，homoser高絲氨酸，OSH0-琥珀酰高絲氨酸，y-cysγ-胱硫醚，homocys高半胱氨酸，homolan高羊毛氨酸，THF四氫葉酸，Ser絲氨酸，Cyst半胱氨酸，Gly甘氨酸，PPP磷酸戊糖支路。圖2在三種不同培養(yǎng)條件下生長的菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHP的DO600nm和Ymet艦的變化磷酸鹽過量的生長(實心符號)、在IOOUDO600nm時缺乏磷酸鹽的生長(空心符號)和磷酸鹽限制的生長(灰色符號)。發(fā)明詳述2004年5月12日提交的PCTW02005108561描述了一種大腸桿菌菌株，其中由metj基因編碼的甲硫氨酸阻抑物由氯霉素盒取代(AmetJzCm),并攜帶具有對甲硫氨酸和SAM反饋敏感性降低的metA等位基因(metA*ll)。在專利申請W02007/077041中描述了由整合入染色體中位于結構基因上游的人工啟動子(Ptrc-metF，Ptrc-metH)過表達基因metF和metH。此文件也描述了過表達具有對蘇氨酸反饋抑制降低的天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶(thrA*)，及過表達來自質粒ρΜΕΙΟΙ的metA*ll和絲氨酸乙酰轉移酶(cyse)。具有上述專利申請所描述的所有修飾的菌株在本申請中稱為菌株1，它具有基因型AmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metF(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)。下述所有的后續(xù)構建均基于這些構建體。構建過表達操縱子cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP和基因metF、serA、serC、serB、glyA與Ipd的菌株，以及缺失基因pykA、pykF及purU的菌株除metF外所有構建體最初在大腸桿菌菌株MG1655中制備，并隨后通過轉導轉移到最終的菌株中。構建MG1655Ptrc_cysPUWAM使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重組策略，將操縱子cysPUWAM置于異源Ptrc啟動子的控制下。該策略允許將氯霉素或卡那霉素抗性盒與異源啟動子一起插入目標基因上游。為此，使用下列寡核苷酸Ptrc-cysPUWAMF(SEQIDNO1)GCGCGAGTGAGTTCTTTTTCAGTAAGTTAACGGCCATTGCGCACCCTTATAAATTTAATGACTTTCTTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-與基因cysP的序列(2541512-2541578)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-用來擴增氯霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(DatSenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，-trc啟動子序列的區(qū)域(斜體大寫字母)，其中-35和-10盒以下劃線表示Ptrc-cysPUWAMR(SEQIDNO2)CCAAATCACCAAACGGTATATAAAACCGTTACTCCTTTCACGTCCGTTATAAATATGATGGCTATTATCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCCATATGAATATCCTCCTTAG具有-與基因CysP上游區(qū)域的序列(2541644-2541578)同源的區(qū)域(大寫字母(網址http://www.ecoRene.ors/上的參考序歹[J),-用來擴增氯霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(DatSenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，-噬菌體T7終止子序列的區(qū)域(下劃線斜體大寫字母)(GenbankV01146)使用寡核苷酸Ptrc-cysPUWAMF與Ptrc-cysPUWAMR從質粒pKD3擴增氯霉素抗性盒。然后將獲得的PCR產物通過電穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在該菌株中，表達Red重組酶并允許同源重組。然后選擇氯霉素抗性轉化體，并用如下所示的寡核苷酸Ptrc-cysPUWAMRv與Ptrc_cysPUWAMFv通過PCR分析驗證抗性盒的插入。保留的菌株命名為MG1655Ptrc-cysPUWAM:Cm。Ptrc-cysPUWAMRv(SEQIDNO3):GCAGGATTTGTACGTCGGTCACC(與2541260至Ij2541282的序列同源)。Ptrc-cysPUffAMFv(SEQIDNO4):cgtcttgaactaagttcaccaggc(與2541812到2541789的序列同源)。構建MG1655Ptrc-cysJIH使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重組策略，將操縱子cysJIH置于異源Ptrc啟動子的控制下。該策略允許將氯霉素或卡那霉素抗性盒與異源啟動子一起插入目標基因的上游。為此，使用下列寡核苷酸PtrcF-cysJIHR(SEQIDNO5)CCAGTAAGCAAAGCTGTTTCTGCGCCCTGTCAGCGCCCATAAAACAGAAGAGATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-與基因cysj的序列(2889935-2889987)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，-trc啟動子序列的區(qū)域(斜體大寫字母)，其中-35和-10盒以下劃線表示PtrcF-cysJIHF(SEQIDNO6)GGTTATTAGTTATCGCTATCCCGTCTTTAATCCACACCGTTTGCCCCGTTAACCTTACCTTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCCATATGAATATCCTCCTTAG具有-與基因cysj上游區(qū)域的序列(2890047-2889988)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http://www.ecoRene.cxtr/上的參考序歹[J),-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，-噬菌體T7終止子序列的區(qū)域(下劃線斜體大寫字母)(GenbankVOl146)使用寡核苷酸PtrcF-cysJIHF與PtrcF-cysJIHR從質粒pKD4擴增卡那霉素抗性盒。然后將獲得的PCR產物通過電穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在該菌株中，表達Red重組酶并允許同源重組。然后選擇卡那霉素抗性轉化體，并用如下所示的寡核苷酸Ptrc-cysJIHFv與Ptrc-cysJIHRv通過PCR分析驗證抗性盒的插入。保留的菌株命名為MG1655Ptrc-cysJIH:Km。Ptrc-cysJIHFv(SEQIDNO7):GCAGTTCGACAAGTTCTTTCACC(與2889042至Ij2889064的序列同源)。Ptrc-cysJIHRv(SEQIDNO8)CCAGAACACAACACCCTAACATAGCG(與2890663至Ij2890638的序列同源)。構建MG1655Ptrc09-gcvTHP使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重組策略，將操縱子gcvTHP置于異源Ptrc啟動子的控制下。該策略允許氯霉素或卡那霉素抗性盒與異源啟動子一起插入目標基因上游。為此，使用下列寡核苷酸Ptrc-gcvTHPF(SEQIDNO9)CCACCATGCGAGCGCCGCAAAGCGTGTGTTGTTCGTACAAAGGAGTCTGTTGTGCCATAATATACCTCCTTATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-與基因gcvT的序列(3048630-3048687)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，-trc啟動子序列的區(qū)域(斜體大寫字母)，其中-35和-10盒以下劃線表示Ptrc-gcvTHPR(SEQIDNO10)CTGTCGCGATTTTTGCATTTTTTAACCATAAGCTAATGTGATGATCAATTTTACCTTACATATGAATATCCTCCTTAG具有-與基因gcvT上游區(qū)域的序列(3048887-3048830)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http://www.ecoRene.cxtr/上的參考序歹[J),-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，使用寡核苷酸Ptrc-gcvTHPF與Ptrc-gcvTHPR從質粒pKD4擴增卡那霉素抗性盒。然后將或得的PCR產物通過電穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在該菌株中，表達Red重組酶并允許同源重組。隨機選擇卡那霉素抗性轉化體，并用如下所示的寡核苷酸Ptrc-gcvTHPF2與Ptrc-gcvTHPR2通過PCR分析驗證抗性盒的插入。所得菌株命名為MG1655Ptrc-gcvTHP:Km。Ptrc-gcvTHPF2(SEQIDNO11):CTATCACACCGCCAGAGGCATTC(與3048399至Ij3048421的序列同源)。Ptrc-gcvTHPR2(SEQIDNO12):CCCATCACACTTTCATCTCCCG(與3049106至Ij3049085的序列同源)，構建MG1655ApykA使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重組策略，缺失pykA基因。該策略允許氯霉素或卡那霉素抗性盒插入目標基因。為此，使用下列寡核苷酸DpykAF(SEQIDNO13)cgcggcgggtgccaacgttgtacgtatgaacttttctcacggctcgcctgaagatcacaaaatgcgcgcggataaagacgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-與pykA區(qū)域的序列(1935756-1935838)同源的區(qū)域(小寫字母)(網址http//www.ecoRene.ors/上的參考序歹[J)，-用來擴增氯霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(DatSenko，K·A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，DpykAR(SEQIDNO14)CGCCGCATCCGGCAACGTACTTACTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACTCATCACGTCGCCCCATATGAATATCCTCCTTAG具有-與pykA區(qū)域的序列(1937135-1937055)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-用來擴增氯霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(DatSenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，使用寡核苷酸DpykAF與DpykAR從質粒pKD3擴增氯霉素抗性盒。然后將獲得的PCR產物通過電穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在該菌株中，表達Red重組酶并允許同源重組。然后選擇氯霉素抗性轉化體，并用如下所示的寡核苷酸PykAF與pykAR通過PCR分析驗證抗性盒的插入。所得菌株命名為MG1655ApykA::Cm。PykAF(SEQIDNO15):ggcaattaccctcgacgtaccgg(與1935338到1935360的序列同源)PykAR(SEQIDNO16):ccgcctctaacagatcatccatcgg(與1935401到1937425的序列同源)構建MG1655ApykF使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重組策略，缺失pykF基因。該策略允許氯霉素或卡那霉素抗性盒插入目標基因。為此，使用下列寡核苷酸DpykFF(SEQIDNO17)cccatccttctcaacttaaagactaagactgtcatgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatcggaccgaaaaccgaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-與pykF區(qū)域的序列(1753689-1753767)同源的區(qū)域(小寫字母)(網址http://www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，DpykFR(SEQIDNO18)ggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaccataactacaacgtcacctttgtgCATATGAATATCCTCCTTAG具有-與pykF區(qū)域的序列(1755129-1755051)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www.ecoRene.org/上的參考序歹[J)，-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，使用寡核苷酸DpykFF與DpykFRR從質粒pKD4擴增卡那霉素抗性盒。然后將獲得的PCR產物通過電穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在該菌株中，表達Red重組酶并允許同源重組。然后選擇卡那霉素抗性轉化體，并用如下所示的寡核苷酸pykFF與pykFR通過PCR分析驗證抗性盒的插入。所得菌株命名為MG1655DpykF:Km。PykFF(SEQIDNO19):gcgtaaccttttccctggaacg(與1753371到1753392的序列同源)。PykFR(SEQIDNO20):gcgttgctggagcaacctgccagc(與1755518到1755495的序列同源)。構建MG1655ApurU使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重組策略，缺失purU基因。該策略允許氯霉素或卡那霉素抗性盒插入目標基因。為此，使用下列寡核苷酸DpurUF(SEQIDNO21)ggtaaaaaatttaaaaagtgctgcggccaataatggttgacggtacggtttagcaaacactctcaacaaggtttttccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-與purU區(qū)域的序列(1287929-1287849)同源的區(qū)域(小寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，DpurUR(SEQIDNO22)ggttgcgtaattttcatccgtaacggattaaaggtaaccagttatttttgctggcgattaaagaataatcgttcgattaccCATATGAATATCCTCCTTAG具有-與purU區(qū)域的序列(1286948-1287028)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(粗體大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，使用寡核苷酸DpurUF與DpurUR從質粒pKD4擴增卡那霉素抗性盒。然后將獲得的PCR產物通過電穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在該菌株中，表達Red重組酶并允許同源重組。然后選擇卡那霉素抗性轉化體，并用如下所示的寡核苷酸purUF與purUR通過PCR分析驗證抗性盒的插入。所得菌株命名為MG1655DpurU:Km。PurUF(SEQIDNO23):ggaatgcaatcgtagccacatcgc(與1288447到1288424的序列同源)。PurUR(SEQIDNO24):gcggattcgttgggaagttcaggg(與1286129到1286452的序列同源)。構建pCClBAC-serA-serC為增加serA和serC基因的表達，通過表達來自拷貝數控制載體pCClBAC(Epicentre)的酶使它們的適當啟動子，在產生甲硫氨酸的細胞中增加這兩種基因的基因劑量。為此，首先用寡核苷酸-serCF(XbaI)和serCR(HindIII)從大腸桿菌基因組中擴增serC基因。使用酶xbal和HindIII限制性切割PCR產物，并克隆入經相同限制酶限制性切割的載體PUC18(Stratagene)中。所得載體命名為pUC18-serC。serCF(XbaI)(SEQIDNO25)tgcTCTAGAgtccgcgctgtgcaaatccagaatgg具有-與基因serC區(qū)域的序列(956619-956644)同源的區(qū)域(小寫字母)(網址http//www.ecoRene.otr/上的參考序歹[J)，-攜帶XbaI位點的區(qū)域(粗體大寫字母)serCR(HindIII)(SEQIDNO26)cccAAGCTTAACTCTCTACAACAGAAATAAAAAC具有-與基因serC區(qū)域的序列(958028-958004)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-包含HindIII位點的區(qū)域(粗體大寫字母)隨后用寡核苷酸serAF(XbaI)和serAR(SmaI-HindIII)從大腸桿菌基因組中擴增serA基因。使用酶xbal和SmaI限制性切割PCR產物，并克隆入經相同限制酶限制切割的載體pUC18-serC中。所得載體經測序驗證，并命名為pUC18-serA-serC。serAF(XbaI)(SEQIDNO27)ctagTCTAGAttagtacagcagacgggcgcg具有-與基因serA區(qū)域的序列(3055198-3055218)同源的區(qū)域(小寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-攜帶XbaI位點的區(qū)域(大寫字母)serAR(SmaI-HindIII)(SEQIDNO28)tccCCCGGGaagcttCCGTCAGGGCGTGGTGACCG具有-與基因serA區(qū)域的序列(3056878-3056859)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-攜帶SmaI和HindIII位點的區(qū)域(粗體字母)為將基因serA與serC轉移到拷貝數控制載體pCClBAC中，用酶HindIII限制性切割載體pUC-serA-serC，并克隆入準備用于HindIII克隆的pCClBAC(Epicentre)中。所得構建體經驗證，稱為pCClBAC-serA-serC。構建載體pCClBAC-serB-serA-serC為增加serA、serB和serC基因的表達，通過表達來自拷貝數控制載體pCClBAC(Epicentre)的酶使用它們的適當啟動子，在產生甲硫氨酸的細胞中增加這三種基因的基因劑量。為此，用寡核苷酸serB(SphI)和SerB(SmaI)從大腸桿菌基因組中擴增serB基因。用酶SphI和SmaI限制性切割PCR產物，并克隆入經相同限制酶限制切割的pUC18-serA-serC中。所得載體命名為pUC18-serB-serA_serC。serB(SphI)(SEQIDNO29)atgcGCATGCCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC具有-與基因serB區(qū)域的序列(4622362-4622383)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www.ecoRene.otr/上的參考序歹[J)，-攜帶SphI位點的區(qū)域(下劃線大寫字母)serB(SmaI)(SEQIDNO30)gcatgtcgacatCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGATTACTTCTGATTCAGGCTGCC具有-與基因serB區(qū)域的序列(4623433-4623412)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-攜帶SmaI位點的區(qū)域(下劃線大寫字母)-噬菌體T7終止子序列的區(qū)域(斜體大寫字母)(GenbankVOl146)為將serA，serB與serC基因轉移到拷貝數控制載體pCClBAC中，用酶HindIII限制性切割載體PUC18-serB-serA-serC，并克隆入準備用于HindIII克隆的pCClBAC(Epicentre)中。所得構建體經驗證，稱為pCClBAC-serB-serA-serC。構建pCClBAC-serB-glyA-serA-serC為增加serA、serB、serC和glyA基因表達，通過表達來自拷貝數控制載體pCClBAC(Epicentre)的酶使用它們的適當啟動子，在產生甲硫氨酸的細胞中增加這三種基因的基因劑量。為此，使用寡核苷酸PglyAF(HindIII)和glyAR(EcoRI-HindIII)從大腸桿菌基因組中擴增glyA基因。將PCR產物用酶HindIII限制性切割，用Klenow片段平頭化并克隆入經限制酶SmaI限制切割的載體pUClS-serB-serA-serC中。所得載體命名為pUC18-serB-glyA-serA_serC0PglyAF(HindIII)(SEQIDNO31)TCATCGGATCCATCAAGCTTGAAAGAATGTGATGAAGTG具有-與基因glyA區(qū)域的序列(2683760-2683742)同源的區(qū)域(大寫粗體字母)(網址http://www.ecoRene.ors/上的參考序歹[J),-攜帶HindIII位點的區(qū)域(下劃線大寫字母)glyAR(EcoRI-HindIII)(SEQIDNO32)ATCTAGTAAGCTTAGTGAATTCGTTACGACAGATTTGATGGCGCG具有-與glyA區(qū)域的序列(2682084-2682061)同源的區(qū)域(斜體大寫字母)(網址http//www.ecoRene.otr/上的參考序歹[J)，-攜帶HindIII和EcoRI位點的區(qū)域(下劃線大寫字母)為將serA、serB、serC和glyA基因轉移到拷貝數控制載體pCClBAC中，用酶Hindi11限制性切割載體PUC18-serB-glyA-serA-serC，并克隆入準備用于HindiII克隆的pCClBAC(Epicentre)中。所得構建體經驗證，稱為pCClBAC-serB-glyA-serA-serC。構建載體pJB137_lpd使用寡核苷酸IpdF(HindIII)和IpdR(EcoRI)從大腸桿菌基因組中擴增Ipd基因。用酶EcoRI和HindIII限制性切割PCR產物并克隆入經相同限制酶限制切割的載體PJB137中。所得載體命名為pJB137-lpd。IpdF(HindIII)(SEQIDNO33)atgcgctaMGCTTGGTTATTAGCGAATAGACAAATCGG具有_與基因Ipd區(qū)域的序列(127644-127668)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-攜帶HindIII位點的區(qū)域(粗體大寫字母)IpdR(EcoRI)(SEQIDNO34)RcatRatcGAATTCTGCAGACGTAAAAAAAGCGGCGTGG具有-與基因Ipd區(qū)域的序列(129404-129380)同源的區(qū)域(大寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-攜帶EcoRI位點的區(qū)域(粗體大寫字母)所得構建體經驗證，稱為pJB137_lpd。將上述各個突變整合入菌株1隨后，通過Pl噬菌體轉導及視需要移除抗性盒，由菌株AmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metF得到下列菌株。構建出的菌株AmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHAmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHAmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAAmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPAmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurUAmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmstl7-metFAmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔPurUPtrc36-ARNmstl7-metF經由Pl轉導及移除抗性盒的轉移將通過菌株AmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUffAM:CmPtrcF-cysJIH::Km例示。除包含Ptrc36-ARNmStl7-metF的菌株(見下)外，所有其它構建體以相似方式構建。為將啟動子構建體PtrcF-cysPUWAM:Cm轉移到菌株MG1655ΔmetJmetA*11Ptrc-metHPtrc-metF中，使用噬菌體Pl轉導的方法。在制備菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM:Cm的噬菌體裂解液和后續(xù)轉導入菌株MG1655AmetJmetA^llPtrc-metHPtrc-metF的兩個步驟中實施下述規(guī)程。制備噬菌體Pl裂解液-用100μ1過夜培養(yǎng)的菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM:Cm接種IOmlLB+Km50μg/ml+葡萄糖0.2%+CaCl25mM。-在37°C振蕩溫育30分鐘-加入100μ1在菌株MG1655中制備的噬菌體裂解液Pl(大約1.IO9噬菌體/ml)-在37°C振蕩3小時直至所有細胞裂解-加入200μ1氯仿，并渦旋振蕩-在4500g離心10分鐘以去除細胞碎片-將上清轉移到無菌試管中，加入200μ1氯仿-將裂解液儲藏在4°C轉導-將5ml的菌株MG1655AmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metF在LB培養(yǎng)基中的過夜培養(yǎng)物在1500g離心10分鐘-在2.5mlIOmMMgSO4,5mMCaCl2中懸浮細胞沉淀-對照管100μ1細胞100μ1菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm的噬菌體Pl-測試管100μ1細胞+100μ1菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm的噬菌體Pl-無振蕩條件下在30°C溫育30分鐘-向每管中添加100μIlM檸檬酸鈉并并渦旋振蕩-添力口ImlLB-在37°C振蕩溫育1小時-在7000rpm將管離心3分鐘后，涂布在LB+Cm50μg/ml平板上-在37°C溫育過夜驗證菌株選擇氯霉素抗性轉化體，并使用上述用于驗證菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm的寡核苷酸通過PCR分析，來驗證啟動子構建體MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm的存在。保留的菌株命名為AmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAM::Cm。隨后，使用如上所述Pl轉導過程引入PtrcF-cysJIH等位基因。將所得菌株命名為AmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUffAM:CmPtrcF-cysJIH::Km。為引入pykA與pykF的缺失，將抗性盒自菌株DmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAM::CmPtrcF-cysJIH::Km中消除。為此，通過電穿孔將質粒pCP20引入重組菌株，該質粒攜帶在抗性盒的FRT位點起作用的FLP重組酶。在42°C—系列培養(yǎng)之后，通過PCR分析驗證兩個盒的丟失。將保留的菌株命名為AmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH。然后，可通過Pl轉導引入PykA和pykF等位基因的缺失。類似地，在消除了相應的盒后，引入甘氨酸裂解復合物過表達構建體Ptrc09-gcVTHP和purU基因的缺失。由于鄰近，構建體Ptrc36-ARNmstl7-metF無法通過Pl轉導而引入，而是經由PCR通過引入而構建。為此，使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重組策略。該策略允許在目標基因附近插入氯霉素或卡那霉素抗性盒。為此，使用下列寡核苷酸Ptrc36-ARNmst-metF(SEQIDNO35)(GGCTCTGATTCAGGGCATCCCGCTGGCTGGCGTGAAAAAAGCTCATAATATACCTCCTcgtcaacaatatctcactcgagataactccaccTATTCCACACATTATACGAGCCGG粗體大寫字母核糖體結合位點和-10區(qū)域小寫字母RNA穩(wěn)定化序列斜體大寫字母Ptrc啟動子的部分Ptrc-metFF(SEQIDNO36)ccttcatctttacatctggacgtctaaacggatagatgtgcacaacacaacatataactacaagcgattgatgaggtaaggttcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcCATATGAATATCCTCCTTAG包含-與基因metF區(qū)域的序列(4130114-4130195)同源的區(qū)域(小寫字母)(網址http//www,ecogene.org/上的參考序歹[J)，-與噬菌體T7末端序列同源的區(qū)域(斜體小寫字母)(GenbankVOl146)-用來擴增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(大寫字母)(Datsenko，K.A.&ffanner,B.L.，2000，PNAS，976640-6645中的參考序列)，對于PCR，使用從專利申請W02007077041中描述的MG1655metA*lIDmetJ:CmPtrc-metF::Km中分離出的DNA作為基質(matrix)。使用寡核苷酸Ptrc-metFF與Ptrc36-ARNmst_metF從質粒pKD4中擴增卡那霉素抗性盒。然后通過電穿孔將所得PCR產物轉移到菌株AmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHApykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurU(pKD46)中，其中表達的Red重組酶允許同源重組。選擇卡那霉素抗性轉化體，并使用下述寡核苷酸Ptrc-metFvF與Ptrc-metFvR通過PCR分析驗證抗性盒的插入。Ptrc-metFvF(SEQIDNO37):GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG(與4129866至Ij4129894的序列同源)。Ptrc-metFvR(SEQIDNO38):CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG(與4130524至Ij4130497的序列同源)。所得菌株稱為AmetJmetA*llPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurUPtrc36_ARNmst17-metF:Km。隨后，將質粒(pME101-tgrA*l-cysE-PgapA-metA*ll)導入上述菌株，得到下述菌株菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHP菌株lPtrcF-cysPUffAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurU菌株lPtrcF-cysPUffAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔPykAPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmstl7_metF菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF在某些菌株中，導入質粒pJB137-lpd，pCClBAC-serA-serC、pCClBAC-serB-serA-serC或pCClBAC-serB-glyA-serA-serC，得至Ij菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHP(pJB137_lpd)菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurU(pCClBAC-serA-serC)菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF(pCClBAC-serA-serC)菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF(pCClBAC-serB-serA-serC)菌株lPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF(pCClBAC-serB-glyA-serA-serC)評估產生甲硫氨酸的菌株首先在小錐形瓶中評估生產菌株。在混合培養(yǎng)基(10%含2.5gL_i葡萄糖的LB培養(yǎng)基(Sigma25%)，和90%基本培養(yǎng)基PCl)中培養(yǎng)5.5mL的預培養(yǎng)物，并將其用于接種50mL培養(yǎng)物至培養(yǎng)基PCl中OD6tltl為0.2。如果需要以50mg.Γ1的濃度加入卡那霉素與大觀霉素(spectinomycin)，以30mg.Γ1的濃度加入氯霉素。當培養(yǎng)物達到OD6tltl為6到7時，在OPA/Fmoc衍生化后通過HPLC確定胞外氨基酸的量。使用HPLC以折射檢測(有機酸和葡萄糖)和甲硅烷基化(Silylation)后的GC-MS來確定其它相關代謝物的量。表1基本培養(yǎng)基組成(PCl)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>可由表2看出在過表達cysJIH與cysPUWAM后甲硫氨酸/葡萄糖得率(Ymet)增加。編碼丙酮酸激酶的等位基因PykA與pykF的缺失可進一步增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。由PurU基因編碼的甲酰基-THF脫甲?；傅娜笔нM一步增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。metF基因通過構建體Ptrc36-ARNmStl7-metF額外的進一步表達還給出更高的甲硫氨酸/葡萄糖得率。SerA、SerC和serB的過表達還進一步增加甲硫氨酸/葡萄糖得率，而額外的glyA表達還增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。表2.上述菌株在分批培養(yǎng)中產生的以％g甲硫氨酸/g葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymrt)。n.d.表示未測定。甲硫氨酸/葡萄糖得率的精確定義見下。SD表示Ymrt的標準偏差。*在終培養(yǎng)物中用5g/l葡萄糖進行的測試<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>基因型YmetSD~Y高羊毛氨酸<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>為了在體外測定酶活性，如上所述在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌菌株，并在對數中期收獲。將細胞懸浮在冷磷酸鉀緩沖液中，并在冰上超聲處理(Bransonsonifier，70W)。在兩種情況下(在表3中用灰色字母表示)用precellys提取系統(tǒng)(Bertintechnologies,法國)提取蛋白質將細胞懸浮在冷磷酸鉀緩沖液中，與0.Imm玻璃珠混合并以一次操作30秒進行提取。離心后，確定上清含有的蛋白質的量(Bradford，1976)。通過LC-MS定量產生的硫代半胱氨酸(sulfocysteine)以測定硫代半胱氨酸合酶活性(CysM)。在測定中，將25μg/mL蛋白質置于含有25mM0-乙酰絲氨酸和25mM硫代硫酸鹽的磷酸鉀緩沖液(0.5M，pH6.5)中。在30°C進行10分鐘反應，并進一步處理用于LC-MS定量。通過NADPH的消失測定亞硫酸還原酶活性(CysJI)。反應混合液由IOmM亞硫酸氫鈉和IOmMNADPH于Tris-HCl(0.5M，pH7.5)中組成。反應通過添加30μL蛋白質提取物開始，并在340nm在恒溫分光光度計中追蹤30分鐘。為測定丙酮酸激酶活性(PykA/F)，進行了乳酸脫氫酶(LDH)偶聯(lián)的測定法。將10μL蛋白質提取物加入含有IOmMDTTUOOmMMgCl2、IOOmMKCl、IOmMPEP、50mMAMPUOmM1，6-二磷酸果糖、IOmMNADH和10單位LDH的用Tris-HCl(0.5M，ρΗ7·5)緩沖的溶液中。在340nm在30°C在恒溫分光光度計中追蹤反應30分鐘。通過測量甘氨酸脫羧反應過程中發(fā)生的CO2生成來估計甘氨酸裂解復合物的組分GcvTHP的活性。該反應在含有pH7的0.5M磷酸鉀緩沖液，2mM磷酸吡哆醛，200mM硫辛酰胺和50μCi/mL的1-14C-甘氨酸IM的側臂Warburg燒瓶中進行。將400μL海胺(hyamine)放置在燒瓶的中孔中，整個反應系統(tǒng)在37°C預溫育5分鐘。通過添加2mg蛋白質開始反應，在37°C進行。通過穿過支管的隔膜添加500μL6ΝH2SO4以終止反應，通過在37°C再溫育1小時用海胺俘獲14C-C02。然后移除在中孔中的液體，并添加至3mL閃爍液，然后在閃爍計數器中測定CPM。通過放射性去甲基化的甲基載體的衍生化測定亞甲基四氫葉酸還原酶活性(MTHFR,MetF)。反應混合液含有磷酸鉀(50mM，ρΗ6·7)，0·02%BSA(將2%BSA溶于30mMEDTA),37.5μMFAD，140μM甲萘醌和300μM5-14C-甲基-THF(925dpm/nmol)。在37°C預溫育5分鐘后，Wlyg蛋白質/μL添加100μL蛋白質提取物。反應在37°C進行15分鐘，通過添加300yL的3mg/mL溶于乙酸鈉(1Μ，ρΗ4.7)的雙甲酮溶液來終止反應。然后將反應溶液在100°C溫育2分鐘，在冰上冷卻5分鐘。然后添加3mL甲苯，并將反應溶液在室溫下以1500g離心5分鐘。取1.5mL液相并添加到3mL閃爍液中。用閃爍計數器測定CPM并計算活性。基于用NADH作為電子供體還原硫辛酰胺來測定Lpd的硫辛酰胺脫氫酶活性。將EDTAIOmM,NADHImM和NAD+25mM禾Π1μg蛋白質提取物添加到Tris-HCl(0.5M,pH8.0)緩沖的溶液中。通過添加200mM硫辛酰胺開始反應，并在340nm在30°C在恒溫分光光度計中追蹤NADH消失30分鐘。通過追蹤NADH的消失來監(jiān)測SerA的磷酸甘油酸脫氫酶活性。將30μL蛋白質提取物置于含有360μM3-Ρ-羥基丙酮酸的Tris-HCl(10mM,pH8.8)溶液中。添加200μMNADH以開始反應，在340nm在30°C在恒溫分光光度計中追蹤NADH消失30分鐘。通過用GC-MS測量產生的絲氨酸來測定SerB蛋白攜帶的磷酸絲氨酸磷酸酶活性。反應混合液包含TEA-HCl(IOmM,pH7.5)，ImMMgCl2,ImMO-磷酸-L-絲氨酸以及15μg蛋白質。在37°C溫育反應，在10和30分鐘通過添加丙酮終止反應，并進一步處理用于GC-MS定量。通過將測定法與谷氨酸脫氫酶偶聯(lián)來測定SerC的磷酸絲氨酸_氨基-轉移酶活性。反應混合液用Tris-HCl(50mM，pH8.2)緩沖，并包含30mM乙酸銨，2mM谷氨酸(鹽)，2uts谷氨酸脫氫酶，200μMNADH0通過添加30μL蛋白質提取物開始反應，在340nm在30°C在恒溫分光光度計中追蹤NADH消失30分鐘。通過用GC-MS監(jiān)測生成的甘氨酸來測定絲氨酸羥甲基轉移酶活性。將30yg蛋白質添加到含有磷酸鉀(50mM，ρΗ7.3)，400μΜ四氫蝶酰谷氨酸(Tetrahydopteroylglutamate)，IOmML-絲氨酸和500μMDTT的溶液。反應在37°C進行10分鐘，10分鐘后通過添加丙酮終止反應，并進一步處理用于GC-MS定量。表3.以mUI/mg蛋白質表示產生甲硫氨酸的菌株中下列蛋白的活性半胱氨酸合酶B(CysM)，亞硫酸還原酶(CysJI)，丙酮酸激酶(PykA/F)，亞甲基-四氫葉酸還原酶(MetF)，硫辛酰胺脫氫酶(Lpd)，3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)，磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)，磷酸絲氨酸_氨基-轉移酶(SerC)，絲氨酸羥甲基轉移酶(GlyA)。GcvTHP的甘氨酸脫羧酶活性以μυ/mg蛋白質表示。灰色字符標記的活性是由以Precellys系統(tǒng)提取的培養(yǎng)物獲得的。LOQ定量限度；ND未測定<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表3所示，構建體PtrcF-cysPUWAM,PtrcF-cysPtrc09-gcvTHP禾口Ptrc39-ARNmstl7-metF，pJB137-lpd,ρCC1BAC-serB-serA-serC禾口pCClBAC-serB-glyA-serA-serC與相應等位基因未修飾的菌株相比，均增加了相應酶的活性。pykA與pykF的缺失導致丙酮酸激酶活性完全喪失。在發(fā)酵條件下確證甲硫氨酸生成然后使用磷酸鹽缺乏的補料分批策略，在生產條件下在2.5L發(fā)酵罐(PierreGuerin)中測試產生大量目標代謝物的菌株。預培養(yǎng)基B1僅包含50mM磷酸鹽以避免用接種物將額外的磷酸鹽引入分批培養(yǎng)基。為在細胞濃度為30g.L—1時停止生長，向無機培養(yǎng)基B2中添加磷酸鹽至28.7mM。補料分批培養(yǎng)基(F1與F2)不含磷酸鹽。簡言之，使用在10mL含2.5g.L—1葡萄糖的LB培養(yǎng)基中生長的8小時培養(yǎng)物接種基礎培養(yǎng)基(B1，不含硫代硫酸銨，但含有5g.L^MOPS)中的12小時預培養(yǎng)物。在含有50mL基本培養(yǎng)基(B1)的500mL帶擋板的燒瓶中，在37°C在旋轉振蕩器(200RPM)中進行溫育。第三個預培養(yǎng)步驟在裝有200mL基礎培養(yǎng)基(B1)的生物反應器中進行，所述培養(yǎng)基中用1.5mL濃縮預培養(yǎng)物(5g.廠1)接種至生物量濃度為0.05g.L—1。該預培養(yǎng)溫度在37°C保持恒定，并使用10%NH40H溶液將pH自動保持在6.8。以通氣和/或攪拌將溶氧濃度持續(xù)調節(jié)到30%的飽和空氣分壓。在分批培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡后，以0.7mL.h—1的初始流速開始補料分批培養(yǎng)，以0.ISh-1的生長速率指數性增加24小時以獲得大約24g.r1的最終細胞濃度。表4用于分批預培養(yǎng)的無機培養(yǎng)基組成(B1)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表6用于分批培養(yǎng)的無機培養(yǎng)基組成(b2及b3)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>隨后，用600mL基礎培養(yǎng)基(B2)充滿2.5L發(fā)酵罐(PierreGuerin)，并用45到60mL的預培養(yǎng)物體積接種至生物量濃度為2.Ig.Γ1。培養(yǎng)物溫度在37°C保持恒定，通過自動添加NH4OH溶液(10%NH4OH進行10小時，和24%NH4OH直至培養(yǎng)結束)將pH保持在工作值(6.8)。在分批階段過程中將初始攪拌速率設定為200rpm，而在補料分批階段過程中增加到多至lOOOrpm。在分批階段過程中將初始氣流速率設定為40NL.h—1，而在補料分批階段開始時增加到100NL.h—1。通過增加攪拌將溶解氧濃度保持在20-40%，優(yōu)選30%的飽和度。當細胞量達到接近5g.Γ1的濃度時，以5mL.IT1的初始流速開始補料分批。以S曲線分布以在21小時后達到21mL.h—1的漸增流速注入補料溶液。通過下列方程計算精確的補料條件:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>其中Q(t)是用mL.表示的補料流速，及分批體積為600mL，pi=1.15，p2=18.32，p3=0.270，p4=5。在21小時補料分批之后，細胞濃度達到30g.L—1，培養(yǎng)基中的磷酸鹽耗盡，細胞進入磷酸鹽饑餓(phosphatestarvation)。此時，補料溶液的注入增加到37mL.IT1的恒定值，進行4小時。然后，恒定流速降至IOmL.h—1，保持該流速值直至補料分批結束(50小時)。表8.上述菌株經補料分批發(fā)酵中得到的最大甲硫氨酸/葡萄糖得率(NAM計算為甲硫氨酸，％g/g，lT)。甲硫氨酸/葡萄糖得率的精確定義見下。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>胞外甲硫氨酸濃度在0PA/FM0C衍生化后通過HPLC定量。NAM濃度與殘余葡萄糖濃度使用HPLC以折射檢測分析。甲硫氨酸得率表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>分批培養(yǎng)為確定初始與最終培養(yǎng)物體積，分別在空瓶，裝有培養(yǎng)基及培養(yǎng)結束時稱量錐形瓶。甲硫氨酸得率表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>其中甲硫氨酸^與甲硫氨酸f分別為初始與最終甲硫氨酸的濃度，葡萄糖^與葡萄糖f分別為初始與最終葡萄糖的濃度，而Vtl與Vf分別為初始與最終體積。補料分批培養(yǎng)通過初始容積加上添加以調節(jié)pH和補料培養(yǎng)物的溶液的量，再減去取樣使用與蒸發(fā)損失的體積來計算發(fā)酵罐體積。通過稱量補料儲液(feedingstock)連續(xù)追蹤補料分批體積。然后基于注入的重量、溶液密度和用Brix([葡萄糖])的方法確定的葡萄糖濃度計算注入的葡萄糖量。甲硫氨酸得率表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>其中甲硫氨酸^與甲硫氨酸t(yī)分別為初始與最終甲硫氨酸的濃度，而Vtl與Vt分別為初始與時間t時的體積。消耗的葡萄糖計算如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>注入的葡萄糖t=補料體積t*[葡萄糖]消耗的葡萄糖t=[葡萄糖]Q*VQ+注入的葡萄糖_[葡萄糖]殘留*Vt其中[葡萄糖]。、[葡萄糖]、[葡萄糖]分別為初始、補料以及殘留的葡萄糖濃度。磷酸鹽限制或缺乏增加甲硫氨酸/葡萄糖得率為證明磷酸鹽限制以及磷酸鹽缺乏(饑餓)增加甲硫氨酸/葡萄糖得率，如上所述進行補料分批發(fā)酵。對沒有磷酸鹽限制或缺乏的培養(yǎng)物，使用無機培養(yǎng)基B3，且補料分批培養(yǎng)基為用Na2SO4(8.95g·Γ1)和(NH4)2SO4(8.32g·Γ1)補足的F2。對于在磷酸鹽限制條件下生長的培養(yǎng)物，引入下述改變。使用的分批無機培養(yǎng)基為Β2，且補料分批培養(yǎng)基是以60mM磷酸鹽補足的F2。在OD6tltlnm為100時進行磷酸鹽限制。由圖2可見，在磷酸鹽過剩的條件下，OD6tltlnm在培養(yǎng)過程中持續(xù)增加，并在實驗結束時達到160UD0。在磷酸鹽限制或缺乏的情況下，細胞生長速率在OD6tltlnm為100(20小時)時開始降低，且最終OD6tltlnm接近于120。通過離子色譜證實，殘留的磷酸鹽濃度接近零。作為磷酸鹽缺乏(饑餓)和限制的結果，甲硫氨酸得率增加，并達到分別為0.147與0.139g.g"1的最大值，作為比較在磷酸鹽過剩條件下為0.124g.g—1。權利要求一種在發(fā)酵工藝中產生甲硫氨酸，其衍生物或前體的方法，包括以下步驟-在包含碳源與硫源的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)經修飾的微生物，和-從所述培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸，其中與未修飾的微生物和/或方法相比，該微生物和/或方法通過如下修飾的至少一種或它們的組合而被修飾，以提供增加的甲硫氨酸/碳源得率-減少微生物中甲酰-THF的脫甲?；?減少微生物中PEP的消耗-通過對該經修飾的微生物限制或使其缺乏培養(yǎng)基中一種或數種無機底物，而限制該微生物生長及生物質的產生。2.權利要求1的方法，其中通過削弱基因purU的表達來減少甲酰-THF的脫甲?；?。3.權利要求1的方法，其中通過削弱下述至少一個基因的表達來減少PEP的消耗PykAPykF04.權利要求1的方法，其中對該微生物限制或使其缺乏磷酸鹽和/或鉀。5.權利要求1的方法，其中通過削弱基因purU的表達來減少甲酰-THF的脫甲酰化，其中通過削弱PykA和/或pykF基因的表達來減少PEP的消耗，而且其中對該微生物限制或使其缺乏磷酸鹽和/或鉀。6.權利要求1的方法，其中通過削弱基因purU的表達來減少甲酰-THF的脫甲?；?，而且其中通過削弱PykA和/或pykF基因的表達來減少PEP的消耗。7.權利要求1的方法，其中通過削弱基因purU的表達來減少甲酰-THF的脫甲?；?，而且其中對該微生物限制或使其缺乏磷酸鹽和/或鉀。8.權利要求1的方法，其中通過削弱pykA和/或pyKF基因的表達來減少PEP的消耗，而且其中對該微生物限制或使其缺乏磷酸鹽和/或鉀。9.權利要求1-8的方法，其中在該微生物中下列至少一個基因的表達增加cysP、cysU、cysff>cysA、cysM、cysj、cysl、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA。10.權利要求9的方法，其中在該微生物中操縱子cysPUWAM和/或cysJIH的表達增加。11.權利要求9的方法，其中在該微生物中由基因gcvTHP和/或Ipd編碼的甘氨酸裂解復合物的表達增加。12.權利要求9的方法，其中至少一個涉及甘氨酸生物合成途徑的基因如serA、serB、serC或glyA過表達。13.權利要求1-12的方法，其中在該微生物中下列至少一個基因過表達metF、metA等位基因，其編碼對S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反饋敏感度降低的酶，thrA或thrA等位基因，其對蘇氨酸的反饋抑制降低，cysE,metH。14.權利要求1-13的方法，其中在該微生物中由metj基因編碼的甲硫氨酸阻抑物的表達削弱。15.權利要求1-14的方法，其中所述培養(yǎng)基中的硫源是硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化氫、連二硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、亞硫酸鹽或不同來源的組合。16.權利要求15的方法，其中所述培養(yǎng)基中的硫源是硫酸鹽或硫代硫酸鹽或兩者的混合物。17.權利要求1-16的方法，其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖。18.權利要求1-17的方法，包括分離任選地在終產物中以部分或總量(0-100%)殘留的生物質和/或發(fā)酵液中所需的氨基酸/組分的步驟19.權利要求18的方法，其中在回收甲硫氨酸之前，通過脫乙酰作用將甲硫氨酸衍生物N-乙酰-甲硫氨酸轉變?yōu)榧琢虬彼帷?0.一種微生物，其包含如權利要求1-3與5-14中所述的修飾。全文摘要本發(fā)明涉及通過在包含碳源和硫源的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來生產甲硫氨酸或其衍生物的方法。該微生物和/或該培養(yǎng)基經修飾，使得甲硫氨酸/碳源得率增加。本發(fā)明也描述了從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離甲硫氨酸或其衍生物。文檔編號C12P13/12GK101821401SQ200880110059公開日2010年9月1日申請日期2008年9月25日優(yōu)先權日2007年10月2日發(fā)明者吉勞姆·巴比爾,格溫耐爾·貝斯特爾-科雷,米歇爾·查蒂厄,菲利普·蘇凱勒,錫德里克·博伊薩特,雷納·菲格申請人:代謝探索者公司