專利名稱：用于制備抗真菌病原體的植物的多核苷酸和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生成或增強(qiáng)植物的病原體抗性的組合物和方法。另外，本發(fā)明涉 及已經(jīng)用本發(fā)明的組合物遺傳轉(zhuǎn)化的植物。
背景技術(shù)：
禾生毛盤孢(Colletotrichum graminicola) (Ces. ) (Cg)更通常地稱作炭疽病，是 影響玉蜀黍(Zea mays) (L.)的炭疽病葉斑病、炭疽病莖腐爛(ASR)和頂梢枯死的病原體， 所述玉蜀黍也稱為玉米(maize)或玉米(corn)。它是僅僅已知的也會(huì)造成葉斑病的普通莖 腐爛(Bergstrom，等，(1999) ,Plant Disease, 83 596-608, White,D. G. (1998)，Compendium ofCorn Diseases, pp. 1-78)。在美國(guó)，已知它從1855年開始發(fā)生，且已經(jīng)在美洲、歐洲、非 洲、亞洲和澳大利亞有所報(bào)道(McGee, D. C. (1988)，Maize Diseases :A Reference Source for Seed Technologists, APS Press, St. Paul, MN ；White, (1998)同上；White，等，(1979) Proc. Annu. CornSorghum Res Conf (34th)，1-15)。只是在美國(guó)，每年感染超過 3750 萬(wàn)英畝， 全國(guó)范圍內(nèi)的平均產(chǎn)量降低6. 6% (參見

圖1)。產(chǎn)量降低是由于受感染的植物的低核重量 和“倒伏”，也就是說，由于感染造成莖的柔弱，植物倒下(Dodd，J.，(1980),Plant Disease, 64:533-537)。倒伏植物更難以收割，且易感其它疾病。感染后，通常莖的頂部首先死亡， 而莖的下部仍然是綠色的。在外表，通過莖外皮上的斑點(diǎn)樣黑斑，可以識(shí)別感染，同時(shí)在內(nèi) 部，髓組織變色或呈現(xiàn)黑色。接種會(huì)以許多形式發(fā)生。根可以生長(zhǎng)穿過莖碎片，且受到感 染。這將變成日益嚴(yán)重的問題，因?yàn)椤懊飧?no till)”農(nóng)業(yè)方法由于它們的環(huán)境益處而被 更廣泛采用。真菌也可以通過昆蟲損傷和其它傷口感染莖(White(1998)同上)。葉感染可 能先于莖感染，從而造成葉斑病，并提供莖感染的接種物。關(guān)于自然界存在的Cg不同品種 或種族的數(shù)目，技術(shù)文獻(xiàn)中尚有爭(zhēng)論。病原體會(huì)由風(fēng)或受污染的種子批傳播。孢子可以存 活最高達(dá) 2 年(McGee (1988)同上；Nicholson，等，(1980)，Phytopathology, 70 :255_261 ； Warren, H.L. (1977)，Phytopathology, 67 160-162 ；Warren，等，(1975)，Phytopathology, 65 620-623)。通過使用殺真菌劑，農(nóng)民可以與玉米真菌病例如炭疽病感染相斗爭(zhēng)，但是它們具 有環(huán)境副作用，且需要田地監(jiān)控和診斷技術(shù)來確定哪種真菌造成了感染，從而可使用正確 的殺真菌劑。特別對(duì)于大田作物例如玉米，這是困難的。如果可以將負(fù)責(zé)抗性的基因整合 入原種、高產(chǎn)種質(zhì)且不減少產(chǎn)量，那么使用攜帶遺傳的或轉(zhuǎn)基因的抗性來源的玉米系是更 實(shí)用的。已經(jīng)描述了對(duì)Cg的抗性的遺傳來源。已經(jīng)鑒別出攜帶一定水平的Cg抗性的幾種 玉米系(White，等(1979)同上)。它們包括 A556、MP305、H21、SP288、CI88A 和 FR16。使用 A556的相互易位測(cè)交分析表明，控制對(duì)ASR的抗性的基因存在于染色體1、4和8的長(zhǎng)臂上 以及染色體 6 的 2 個(gè)臂上(Carson, Μ. L. (1981)，Sources of inheritance ofresistance to anthracnose stalk rot of corn。 Ph.D.Thesis, University ofIllinois, Urbana-Champaign) 0源自這樣的系的抗性的漸滲是復(fù)雜的。報(bào)道了另一個(gè)近交LB31攜 帶控制對(duì)ASR的抗性的單個(gè)顯性基因，但是表現(xiàn)得不穩(wěn)定，尤其在有歐洲玉米螟感染存在 時(shí)(Badu-Apraku 等，(1987)Phytopathology 77:957-959)。發(fā)現(xiàn) MP305 系攜帶 2 個(gè)顯性的抗性基因，一個(gè)起主要作用，一個(gè)起次要作用(Cars0n(1981)同上)。通過美國(guó)農(nóng)業(yè) U (Department of Agriculture) f= 的國(guó)胃才直·禾中M胃· (National PlantGermplasm System) (GRIN ID :NSL 250298)，可以從密西西比大學(xué)(University of Mississippi)得 至丨JMP305。參見 Compilation of NorthAmerican Maize Breeding Germplasm, J. T. Gerdes 等，Crop ScienceSociety of America,1993。 從 W. Paul Williams, Supervisory ResearchGeneticist USDA-ARS, Corn Host Plant Resistance Research Unit, Box9555, 340Dorman Hall, Mississippi State, MS 39762，可以得到 MP305 的種子。已經(jīng)報(bào)道，在染色體4的長(zhǎng)臂上連鎖有2個(gè)賦予對(duì)Cg抗性的遺傳上可分離的 (即它們作為分開的遺傳基因座而發(fā)揮作用)基因(Toman，等，(1993)，Phytopathology， 83 :981-986 ;Cowen，N 等(1991)MaizeGenetics Conference Abstracts 33)。還己經(jīng) 艮 道了染色體4上的顯著抗性數(shù)量性狀基因座(QTL) (Jung，等，(1994), Theoretical and AppliedGenetics, 89 413-418) Jung 等(同上)報(bào)道，UMC 15 可以用于選擇 MP305 中染 色體4上的QTL，并提示QTL是在UMC 15和UMC66之間的染色體4的12 cM區(qū)域上。實(shí)際 上，如下面更詳細(xì)地討論的，在IBM2相鄰4遺傳學(xué)圖上報(bào)道的UMC15和UMC66之間的區(qū)域 是約129cM，且按照J(rèn)img等(1994，同上)指出的方式選擇QTL，會(huì)最好也只不過選擇具有 相當(dāng)大的連鎖拖曳和負(fù)表型作用的大染色體區(qū)間，且在最壞的情況下，在2個(gè)標(biāo)記之間會(huì) 發(fā)生雙重組，從而導(dǎo)致Rcgl基因座的假陽(yáng)性選擇。攜帶這些基因(負(fù)責(zé)染色體4上QTL所 賦予的表型)的區(qū)域在本文中將被稱作Rcgl基因座或MP305抗性基因座；在其他地方，其 已經(jīng)被稱作ASR基因座。關(guān)于植物的一般疾病抗性機(jī)理已經(jīng)進(jìn)行了大量工作。一些抗性機(jī)理實(shí)際上是非病 原體特異性的，或所謂的“非宿主抗性”。它們可能基于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或類似的保護(hù)機(jī)制。但 是，盡管植物缺少含有循環(huán)抗體的免疫系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的其它屬性，但它們確實(shí) 具有針對(duì)病原體進(jìn)行特異性保護(hù)的其它機(jī)理。其中最重要的和最充分研究的是植物疾病抗 性基因，或“R”基因。該抗性機(jī)理和R基因的非常多的綜述之一，可以參見Bekhadir等， (2004), Current Opinion in Plant Biology 7 :391_399。存在 5 類公認(rèn)的 R基因含有核 苷酸-結(jié)合位點(diǎn)(NBS)和富亮氨酸重復(fù)(LRR)的細(xì)胞內(nèi)蛋白；含有胞外LRR結(jié)構(gòu)域的跨膜 蛋白(TM-LRR)；含有胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域的跨膜和胞外LRR(TM-CK-LRR)；含有卷曲螺旋胞質(zhì)結(jié) 構(gòu)域的膜信號(hào)錨定蛋白(MSAP-CC)；和含有N-末端肉豆蔻基化位點(diǎn)的膜相關(guān)激酶(MAK-N) (參見，例如Cohn，等，(2001)，Immunology, 13 55-62 ；Dangl, ^ (2001), Nature, 411 826-833)。Broglie等人(US專利申請(qǐng)系列號(hào)11/397，153)描述了新型的R基因，其涉及 NBS-LRR型稱為Rcgl，發(fā)現(xiàn)于之前由Jimg等人(如上)所描述的Rcgl基因座內(nèi)。他們描 述了在育種中利用這種基因座作為標(biāo)記物，其染色體區(qū)間可以為谷物植物賦予抗性，以及 含有Rcgl基因的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明改進(jìn)了 Broglie等人的工作，通過提供第二 NBS-LRR 基因，其與Rcgl基因不同，并被稱作Rcglb，其與Rcgl聯(lián)合是對(duì)Cg的抗性所必需的。Rcglb 基因與Rcgl在物理上(200-300kb)和遺傳上(小于1厘摩)緊密相關(guān)，并且代表了 Rcgl 基因座的第二組分。本發(fā)明提供了 Rcglb的序列，結(jié)合Rcgl和Rcglb的嵌合構(gòu)建體，和共 同利用Rcgl和Rcglb基因(Rcgl基因座)育種的方法和標(biāo)記。發(fā)明概述
本發(fā)明的實(shí)施方案基于對(duì)來自系MP305的負(fù)責(zé)抗性表型的基因的精細(xì)作圖、克隆 和表征，含有MP305抗性基因座(Rcgl基因座)的截短的染色體區(qū)間向具有很少或沒有連 鎖拖曳的其它系中的漸滲，這些基因作為轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用的證實(shí)，和使用育種技術(shù)、用分子標(biāo) 記將這些基因或轉(zhuǎn)基因移進(jìn)原種系中。實(shí)施方案包括分離的多核苷酸，其包含編碼能連同Rcgl多肽賦予對(duì)毛盤孢屬 (Colletotrichum)的抗性的Rcglb多肽的核苷酸序列，其中所述Rcgl多肽的氨基酸序 列基于Needleman-Wunsch比對(duì)算法，當(dāng)與SEQ ID NO :3或在2006年2月22日保藏在 Agricultural ResearchService (ARS) Culture Collection 的專利保藏號(hào)NRRL B-30895 的 Rcgl序列所編碼的肽相比時(shí)，具有至少50%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%和 至少95%同一性，以及進(jìn)一步其中Rcglb多肽具有當(dāng)與SEQID NO :246或在2007年6月26 日保藏在 Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection 的專利保藏號(hào) NRRL B-50050的Rcglb序列所編碼的肽相比時(shí)，具有至少50 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%和至少95%同一性的氨基酸，或該核苷酸序列的互補(bǔ)體，其中所述互補(bǔ)體和核苷 酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，且100%互補(bǔ)。實(shí)施方案還包括分離的多核苷酸，其包含 編碼連同Rcgl多肽能夠賦予對(duì)毛盤孢屬(Colletotrichum)的抗性的多肽的核苷酸，其中 所述多肽具有在與SEQNO 246相比時(shí)具有至少50 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少 90%和至少95%同一性的氨基酸序列。 本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括載體，其包含編碼本發(fā)明實(shí)施方案多肽的多核苷酸， 例如SEQ ID N0:3、SEQ NO :246，或保藏為專利保藏號(hào)NRRL-30895的質(zhì)粒的多核苷酸序列， 或保藏為專利保藏號(hào)NRRLB-50050的質(zhì)粒的多核苷酸序列以及包含可操作地連接到至少 一個(gè)調(diào)節(jié)序列上的本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的其他實(shí)施方案 包括載體，其包含編碼SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :246 二者的多核苷酸。本發(fā)明也包括植 物細(xì)胞、以及植物，它們各自包含本發(fā)明實(shí)施方案的重組DNA構(gòu)建體，和包含實(shí)施方案的重 組DNA構(gòu)建體的種子。本發(fā)明包括的方法包括1)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、包括植物細(xì)胞的方法，其包含用本發(fā)明 實(shí)施方案的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，2)生產(chǎn)植物的方法，其包含用本發(fā)明實(shí)施方案的重組 DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物，和3)賦予或增強(qiáng)對(duì)毛盤孢屬和 /或莖腐爛的抗性的方法，其包含用本發(fā)明實(shí)施方案的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，從而賦予 和/或增強(qiáng)對(duì)毛盤孢屬或莖腐爛的抗性。其它實(shí)施方案包括，測(cè)定玉米植物中存在或不存在本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸或 Rcgl基因座的方法，其包含下述的至少一個(gè)(a)從玉米植物分離核酸分子，并通過擴(kuò)增與 多核苷酸同源的序列，測(cè)定是否存在Rcgl基因，以及測(cè)定是否存在或不存在Rcglb基因(b) 從玉米植物分離核酸分子，并進(jìn)行DNA印跡雜交，(c)從玉米植物分離蛋白，并使用Rcgl 蛋白和/或Rcglb蛋白的抗體進(jìn)行蛋白印跡，(d)從玉米植物分離蛋白，并使用Rcgl蛋白 和/或Rcglb蛋白的抗體進(jìn)行ELISA測(cè)定，(e)證實(shí)存在源自RcglmRNA轉(zhuǎn)錄物且Rcgl和 /或Rcglb蛋白特有的mRNA序列，或(f)通過表型測(cè)定證實(shí)新賦予或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬 (Colletotrichum)感染的抗性的存在，從而確定玉米植物中存在多核苷酸或Rcgl基因座。本發(fā)明也包括改變植物或植物細(xì)胞中能賦予對(duì)毛盤孢屬或莖腐爛的抗性的蛋白 表達(dá)水平的方法，其包含(a)用本發(fā)明實(shí)施方案的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和(b)在適合表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致 在轉(zhuǎn)化的宿主中生產(chǎn)改變水平的能賦予對(duì)毛盤孢屬或莖腐爛的抗性的蛋白。本發(fā)明包括的另一種方法是，賦予或增強(qiáng)玉米植物中對(duì)毛盤孢屬和/或莖腐爛的 抗性的方法，其包含(a)使缺少Rcgl基因座的第一種玉米植物與含有Rcgl基因座的第 二種玉米植物雜交，以生成分離群體，(b)篩選分離群體中含有Rcgl基因座的成員，所述 Rcgl基因座具有能與連接到或位于Rcgl基因座內(nèi)的第二種核酸雜交的第一種核酸，不包 括UMC15a或UMC66，和(c)選擇所述成員，用于進(jìn)一步雜交和選擇。本發(fā)明也包括增強(qiáng)對(duì)毛盤孢屬和/或莖腐爛的抗性、或?qū)⒚P孢屬和/或莖腐爛 抗性漸滲入玉米植物的方法，其包含用核酸標(biāo)記進(jìn)行玉米植物的標(biāo)記輔助選擇，其中所述 核酸標(biāo)記特異性地與具有第一種核酸序列的核酸分子雜交，所述第一種核酸序列連接在位 于MP305的Rcgl基因座上的第二種核酸序列上，并基于標(biāo)記輔助選擇來選擇玉米植物。本 文公開的特異性的FLP、MZA和Rcgl-特異性的SNP標(biāo)記是本發(fā)明的其它方面。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是鑒定玉米植物的方法，所述玉米植物表現(xiàn)出新賦予的 或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬感染的抗性，其通過檢測(cè)Rcglb基因上或內(nèi)部的至少一個(gè)標(biāo)記的等位 基因，以及任選地通過檢測(cè)Rcgl基因上或內(nèi)部的第二標(biāo)記。其它實(shí)施方案包括，通過檢測(cè)玉米植物中至少2個(gè)標(biāo)記的等位基因，鑒別表現(xiàn)出 新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中至少一個(gè)標(biāo)記是在UMC2041下 邊、且在Rcglb基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，且至少一個(gè)標(biāo)記是在Rcgl基因下邊、且 在UMC2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部。該方法包含的類似實(shí)施方案包括，至少一個(gè)標(biāo)記是在 UMC1086下邊、且在Rcglb基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，在UMC2285下邊、且在Rcglb基 因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，且至少一個(gè)標(biāo)記是在Rcgl基因下邊、且在UMC2200上邊的 區(qū)間上或內(nèi)部，在Rcgl基因下邊、且在UMC2187上邊的區(qū)間上或內(nèi)部，或在Rcgl基因下邊、 且在UMC15a上邊的區(qū)間上或內(nèi)部。其它實(shí)施方案包括，通過檢測(cè)玉米植物中至少2個(gè)標(biāo)記的等位基因，鑒別表現(xiàn)出 新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中在UMC2041下邊、且在Rcglb基 因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部的至少一個(gè)標(biāo)記選自表16列出的標(biāo)記，且在Rcgl基因下邊、 且在UMC2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部的至少一個(gè)標(biāo)記也選自表16列出的標(biāo)記。實(shí)施方案包 括，通過選擇至少4個(gè)標(biāo)記或至少6個(gè)，鑒別表現(xiàn)出新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬抗性的玉 米植物的方法，其中至少2個(gè)或3個(gè)標(biāo)記是在UMC2041下邊、且在Rcglb基因上邊的染色體 區(qū)間上或內(nèi)部，且至少2個(gè)或3個(gè)標(biāo)記是在Rcgl基因下邊、且在UMC2200上邊的區(qū)間上或 內(nèi)部。當(dāng)在UMC2041下邊、且在Rcglb基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部的2或3個(gè)標(biāo)記，以 及在Rcgl基因下邊、且在UMC2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部的2或3個(gè)標(biāo)記選自表16列出的 那些時(shí)，其它實(shí)施方案包括該相同方法。該方法的另一個(gè)實(shí)施方案包括，檢測(cè)在MZA1112處 的等位基因7，檢測(cè)在MZA2591處的等位基因2，或檢測(cè)在MZA3434處的等位基因8。通過所 包括的方法生產(chǎn)的玉米植物和種子也是本發(fā)明的實(shí)施方案，包括不包含在表16所示的基 因座處在UMC2041處或其上面、或在UMC2200處或其下面的與MP305相同的等位基因的那 些玉米植物。其它實(shí)施方案包括，通過檢測(cè)玉米植物中至少2個(gè)標(biāo)記的等位基因，鑒別表現(xiàn)出 新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中至少一個(gè)標(biāo)記是在UMC2041下邊、且在Rcglb基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，且至少一個(gè)標(biāo)記是在Rcgl基因下邊、且在 UMC2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部，且其中該方法檢測(cè)位于Rcgl基因或Rcglb基因內(nèi)的至少一 個(gè)標(biāo)記的存在或不存在。另一個(gè)這樣的實(shí)施方案包括該方法的修飾，其中選擇4個(gè)標(biāo)記，其 中2個(gè)標(biāo)記是在UMC2285下邊、且在Rcgl基因上邊的染色體區(qū)間內(nèi)部，且至少2個(gè)標(biāo)記是 在Rcgl基因下邊、且在UMC15a上邊的區(qū)間內(nèi)部。該方法的其它實(shí)施方案包括Rcgl基因和 Rcglb基因，這些基因已經(jīng)從供體玉米植物，包括MP305或DE81IASR (BC5)，漸滲進(jìn)受體玉米 植物，以生產(chǎn)漸滲的玉米植物。該方法也包括這樣的情形，其中選擇漸滲的玉米植物在Rcgl 基因下邊和UMC15a上邊的重組事件，從而使得漸滲的玉米植物保持第一個(gè)MP305衍生的在 Rcgl基因下邊、且在UMC15a上邊的染色體區(qū)間，且不保持第二個(gè)MP305衍生的在UMC15a處 和下邊的染色體區(qū)間。通過這些方法生產(chǎn)的玉米植物和種子也是本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā) 明包括的 漸滲的玉米植物包括作為PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基因座轉(zhuǎn)變的那 些，或其后代。本發(fā)明的其它實(shí)施方案是鑒別表現(xiàn)出增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物 的方法，其通過檢測(cè)玉米植物在Rcgl基因座處存在或不存在至少一個(gè)標(biāo)記，和選擇其中存 在至少一個(gè)標(biāo)記的玉米植物來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施方案包括，當(dāng)至少一個(gè)標(biāo)記是在SEQ ID NOs 137, 255，256，257，258或266上或內(nèi)部時(shí)，以及當(dāng)至少1個(gè)標(biāo)記是在Rcgl或Rcglb編碼序列上 或內(nèi)部，或位于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :245所述多核苷酸上或內(nèi)部時(shí)。本發(fā)明包括的漸滲的玉米植物包含，作為PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基 因座轉(zhuǎn)變的那些，或其后代。這樣的實(shí)施方案包括玉米種子，其包含第一個(gè)MP305衍生的由 BNLG2162和UMC1051定義的染色體區(qū)間，且不包含第二個(gè)MP305衍生的在UMC2041上邊或 在UMC1051下邊的染色體區(qū)間，且當(dāng)該玉米種子包含Rcgl和Rcglb基因的至少一種，且當(dāng) 生長(zhǎng)時(shí)生成表現(xiàn)出對(duì)毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物。該實(shí)施方案的種子也包括下述玉米 種子，其包含第一個(gè)MP305衍生的在UMC2285和UMC15a之間但是不包括該二者的染色體區(qū) 間，且不包含第二個(gè)MP305衍生的在UMC2285處或上邊、或在UMC15a處或下邊的染色體區(qū) 間，而且這樣的包含Rcgl和Rcglb基因的玉米種子在生長(zhǎng)時(shí)，生成表現(xiàn)出對(duì)毛盤孢屬感染 的抗性的玉米植物。由該種子生產(chǎn)的玉米植物和植物細(xì)胞也包含在本發(fā)明的實(shí)施方案中。本發(fā)明也包括作為PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基因座轉(zhuǎn)變的后代種子， 或其后代，以及包含在MZAl 1123處的等位基因7、在MZA2591處的等位基因2或在MZA3434 處的等位基因8中的至少2個(gè)或更多個(gè)的后代種子。其它實(shí)施方案包括，包含在MZA2591. 32 處的胞嘧啶核苷酸、在MZA2591. 35處的胸腺嘧啶核苷酸和在MZA3434. 17處的胞嘧啶核苷 酸的后代種子。實(shí)施方案也包括分別在SEQ ID NO 140-146上或內(nèi)部的MZA3434、MZA2591、MZA 11123、MZA15842、MZA1851、MZA8761和MZA11455的遺傳標(biāo)記。其它實(shí)施方案包括位于Rcgl 基因座或Rcgl基因或Rcglb基因上或內(nèi)的遺傳標(biāo)記，包括位于SEQ ID NO: 137上的那些， 或在SEQ ID NOs :255，256，257，258和266任一個(gè)上的那些。包含的標(biāo)記也包括位于SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 245 上的那些。附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示各縣在2002年炭疽病莖腐爛感染嚴(yán)重性的美國(guó)地圖。圖2 (a、b、c)是將它與其它已知NBS-LRR多肽相對(duì)比的實(shí)施方案多肽序列(SEQ IDNO:3)的比對(duì)。圖3是用Windows QTL Cartographer軟件生成的圖，它顯示了負(fù)責(zé)Cg抗性表型的 基因座位于FLP標(biāo)記定義的染色體上的特定位置(X軸)處的機(jī)會(huì)(Y軸)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖4是RT-PCR反應(yīng)物的等分試樣的電泳凝膠印跡，它揭示了 260bp帶的存在，該 260bp帶存在于源自受感染的和未受感染的抗性植物的樣品中，但是在易感樣品中不存在。 從來自DE811和DE811ASR莖組織的12. 5ng總RNA中，得到了 RT-PCR片段。使用Rcgl特 異性的引物和18S rRNA引物作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。圖5是用于驗(yàn)證Rcgl基因的Mu-標(biāo)記策略的示意圖。 圖6是Rcgl的基因結(jié)構(gòu)，它顯示了 4種不同增變基因插入位點(diǎn)的位置。圖7(a_b)是一系列遺傳學(xué)像，以遞增的分辨率顯示了鄰近Rcgl基因座的區(qū) 域的圖。7(a)中標(biāo)有“A”的圖的圖距按cM計(jì)，且與IBM2相鄰4遺傳學(xué)圖有關(guān)。使用來自 BC7群體的184個(gè)個(gè)體，形成7(b)中標(biāo)有“B”的圖的圖距，且使用來自BC7群體的1060個(gè) 個(gè)體，形成7(b)中標(biāo)有“C”的圖的圖距。與公開的圖相比時(shí)，BC7群體的遺傳作圖使圖分 辨率增加超過10-倍。顯示在每個(gè)圖右邊的標(biāo)記的位置是基于它們?cè)谖锢韴D上的定位的外 推。圖8(a_b)的遺傳學(xué)像顯示了 DE811ASR(BC3)中含有Rcgl基因座的染色體區(qū) 間，在DE811ASR(BC5)中得到的含有Rcgl基因座的染色體區(qū)間的減小的大小，和最初使用 DE811ASR(BC5)作為供體來源得到的近交中染色體區(qū)間的進(jìn)一步減小的大小。關(guān)于所有標(biāo) 記，在Maize⑶B上可公開得到的IBM2相鄰圖上報(bào)道顯示的圖距，除了 MZA15842、FLP27和 FLP56之外，使用相對(duì)于圖7(b)中圖B和C的高分辨率圖的回歸分析，外推它們的圖位置， 其中使用兩種圖共有的UMC2285、PHI093和CSU166a位置。圖9 (a-b)。圖9 (a)顯示了來自DE811ASR(BC5)的非同線性區(qū)域相對(duì)于B73和Mol7 的比對(duì)。圖9 (a)中的BAC大小是估計(jì)值。圖9(b)顯示了其上存在Rcgl的SEQ ID NO 137 所述的非同線性區(qū)域的部分，包括其中的重復(fù)區(qū)域以及Rcgl外顯子1和2。圖10 (a-b)顯示了分別在DE811ASR(BC5)和DE811系中接種Cg后15天時(shí)不同單 個(gè)植物中平均葉子損傷大小的分布。圖11顯示了接種后7和15天時(shí)感染了 Cg的DE811和DE811ASR(BC5)植物上的 平均葉子損傷大小的對(duì)比。圖12顯示了使DE811ASR(BC5)和DE811與指示的系雜交產(chǎn)生的雜種的莖在接種 Cg后4-5周時(shí)疾病的平均嚴(yán)重性。圖13顯示了與使DE811與指示的系雜交產(chǎn)生的雜種的產(chǎn)量相比，使 DE811ASR(BC5)與指示的系雜交產(chǎn)生的雜種在接種Cg后成熟時(shí)產(chǎn)量的提高。圖14顯示了接種后4-5周從DE811ASR(BC5)或MP305衍生的近交系的莖中由Cg 造成的5個(gè)不同位置處的疾病嚴(yán)重性。Rcgl基因陽(yáng)性和陰性的系之間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯 著的，P值小于0. 05。圖15顯示了來自Rcgl陽(yáng)性和陰性的近交PH705系的代表性莖的疾病進(jìn)展。圖16顯示了來自Rcgl陽(yáng)性和陰性的近交PH87P系的代表性莖的疾病進(jìn)展。圖17顯示了通過使DE811ASR(BC5)與指定系雜交衍生的雜種的莖的在5個(gè)不同 位置處接種4-5周后由Cg造成的疾病嚴(yán)重性。Rcgl基因陽(yáng)性和陰性的系之間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，P值小于0. 05，例外是位置5。圖18顯示了從Rcgl陽(yáng)性和陰性的PH4CV和PH705系生成的雜種的代表性莖的疾
病進(jìn)展。圖19顯示了從Rcgl陽(yáng)性和陰性的PH705和PH87P系生成的雜種的代表性莖的疾
病進(jìn)展。圖20顯示了給玉米莖的疾病嚴(yán)重性評(píng)分的方法。給莖評(píng)出指定為antgr75的評(píng) 分， 它代表著超過75%變色的節(jié)間的數(shù)目(最高達(dá)5，包括接種的節(jié)間)。這產(chǎn)生范圍為0-5 的評(píng)分，0表示在接種的節(jié)間小于75%變色，且5表示前5個(gè)節(jié)間(包括接種的節(jié)間)的 75%或更多變色。圖21顯示了與插入了含有DE811ASR(BC5)的Rcgl非同線性區(qū)域的區(qū)域同源的 B73物理圖上的毗連群，這證實(shí)了在可以得到序列信息的目標(biāo)區(qū)域中可得到許多B73衍生 的細(xì)菌人工染色體(BAC)。圖22顯示了含有MZA和公開標(biāo)記的遺傳學(xué)圖與Mol7和B73的物理圖的比對(duì)。使 用來自BC7作圖群體的1060個(gè)體，顯示遺傳學(xué)圖距離。Mol7BAC文庫(kù)的分析也表明Rcgl 基因座與Mo 17的對(duì)應(yīng)區(qū)域是非同線性的。從Mo 17物理圖定位外推出虛線顯示的標(biāo)記在 B73圖中的定位。從B73物理圖定位外推出虛線顯示的標(biāo)記在Mo 17圖中的定位。圖23顯示了為使用INVADER 檢測(cè)系統(tǒng)反應(yīng)而設(shè)計(jì)的Rcgl雜交標(biāo)記的寡核苷酸。圖24顯示了為使用TaqMan 檢測(cè)系統(tǒng)反應(yīng)而設(shè)計(jì)的Rcgi雜交標(biāo)記的寡核苷酸。圖25顯示了從接種后0、3、6、9和13天(dpi)的抗性的和易感的植物分離的約 1. 5mg聚腺苷酸-富集的RNA得到的RNA印跡的結(jié)果。用隨機(jī)引物標(biāo)記的420bp Rcgl片段 探測(cè)膜?？剐越M織來自DE811ASR(BC5)，且易感組織來自DE811。圖26表明，使用Rcgl特異性的引物對(duì)的PCR擴(kuò)增僅僅擴(kuò)增抗性系DE811ASR(BC5) 和供體親本MP305，但是在易感系DE811中卻不能，例外是FLP110F-R，它擴(kuò)增高度保守的卷 曲螺旋_核苷酸結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，并從而擴(kuò)增DE811系的基因組中非Rcgl的其它區(qū)域。IOObp 梯用于片段定大小。圖27顯示了一系列V7-9玉米植物的葉鞘，其在組織創(chuàng)傷之后利用Cg孢子懸浮 液進(jìn)行接種。這些結(jié)果被進(jìn)一步討論于實(shí)施例8中。在缺少Rcgl轉(zhuǎn)基因時(shí)(頂行)，含有 Rcgl基因的植物的葉鞘展示了大的、擴(kuò)展的壞死損傷。相反，當(dāng)存在Rcgl轉(zhuǎn)基因時(shí)(在該 情況中，由其自己的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))(底行)，恢復(fù)了 ASR抗性表型，并且壞死被限定/限制于 創(chuàng)傷和真菌接種位點(diǎn)。圖28顯示利用ETJ115-ETJ116引物對(duì)進(jìn)行的RT-PCR的結(jié)果。該數(shù)據(jù)明確顯示 BAC克隆191超毗連群的NBS-LRR基因?qū)Ｓ械乇磉_(dá)于含有MP305基因漸滲區(qū)的DE811ASR植 物中，正如在實(shí)施例9中所討論的。圖29顯示Rcglb基因的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，正如在實(shí)施例9中所討論的。圖30顯示Northern印跡分析的結(jié)果，其允許獨(dú)立地確認(rèn)Rcglb表達(dá)，并提供了估 計(jì)的轉(zhuǎn)錄物大小。多聚A+來自于抗性和易感植物(0，6，13DPI)的RNA(0. 7mg)的Northern 印跡顯示存在4. 75kb的轉(zhuǎn)錄物條帶，其僅僅存在于抗性樣品中，其與從LRR以及基因的激 酶區(qū)域制備的探針特異性雜交，正如在實(shí)施例9中所討論的。
圖31a 31g提供了實(shí)施方案的Rcglb肽(SEQ ID NO 246)與來自大麥和稻的許 多NBS-LRR蛋白的比對(duì)，其顯示了同源區(qū)。圖32a和32b提供了 SEQ ID NO 246 (其與SEQ ID NO 256所列是分開的)的氨 基酸1036 1399與在BLAST P同源性檢索中所鑒定的許多推定蛋白激酶(SEQ ID NOs 252-254)的比對(duì)。圖33總結(jié)了在存在和不存在天然Rcgl轉(zhuǎn)基因時(shí)，RcglKO植物的葉鞘感染數(shù)據(jù)， 正如在實(shí)施例8中所討論的。圖34顯示了來自被實(shí)施例10中所描述構(gòu)建體E所轉(zhuǎn)化的植物的葉鞘測(cè)定的結(jié) 果?？梢姷矫黠@的Cg感染特征。圖35顯示來自被實(shí)施例10中所描述構(gòu)建體C所轉(zhuǎn)化的植物的葉鞘測(cè)定的結(jié)果。 可見到明顯的Cg感染特征。
圖36來自被實(shí)施例10中所描述構(gòu)建體D所轉(zhuǎn)化的植物的葉鞘測(cè)定的結(jié)果。這些 葉子明顯顯示了由于同時(shí)存在和表達(dá)Rcgl和Rcglb基因的Cg感染的抑制。發(fā)明詳述本發(fā)明實(shí)施方案提供了涉及誘導(dǎo)植物的病原體抗性、尤其是真菌抗性的組合物和 方法(或工藝)。該組合物是賦予或增強(qiáng)對(duì)植物真菌病原體的抗性的新的核苷酸和氨基酸 序列。具體地，某些實(shí)施方案提供了具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 246所述氨基酸序列 的多肽，和其變體和片段。另外提供了分離的核酸分子，和其變體和片段，它們包含編碼SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 246所示氨基酸序列的核苷酸序列。在SEQ ID NO :1和4中，描述了編碼SEQ ID NO 3的多肽的核苷酸序列。編碼SEQ ID NO 246的多肽的核苷酸序列列于SEQ ID NO 255 258以及246和266中。Rcglb基 因及其側(cè)接區(qū)的基因組序列提供與SEQ ID NO 255 258或在SEQ ID NO 266中，其在實(shí) 施例9中被更詳細(xì)地討論。編碼SEQ ID NO 246的多肽的cDNA序列列于SEQ IDNO 245 中。在本文中也公開了包含編碼實(shí)施方案的多肽的核苷酸序列的植物、植物細(xì)胞、種子和微 生物。在布達(dá)佩斯條約規(guī)定下，2006年2月22日將Rcgl核酸分子保藏在位于國(guó)家農(nóng)業(yè) 禾1Jfflff胃(National Center for Agricultural UtilizationResearch(NCAUR))白勺 微生物基因座和生物工藝研究單位(MicrobialGenomics and Bioprocessing Research Unit)的農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection)。為保藏物給出下面的登記號(hào)NRRL B-30895。NCAUR的地址是1815N. UniversityStreet, Peoria, IL，61604。在國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯 條約的條款下，維持該保藏。該保藏僅僅為了本領(lǐng)域技術(shù)人員的方便而作出的，且不是對(duì)在 35U. S. C. § 112下需要的保藏物的承認(rèn)。保藏將是不可撤回的，且在專利授權(quán)后對(duì)公眾的獲 取沒有限制或條件。但是，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的可獲得并不構(gòu)成對(duì)破壞由政府行為授予的專 利權(quán)的實(shí)施主題發(fā)明的許可。在2006年3月13日，將2500粒DE8IlASR(BC5)種子的樣品保藏在美國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)), 10801University Blvd., Manassas, VA 20110-2209，USA，分配的保藏號(hào)是PT0-7434。在本申請(qǐng)未決期間，專利和商 標(biāo)官員(Commissioner of Patentsand Trademarks)、在請(qǐng)求后獲得授權(quán)的由官員確定的人員和在提交本專利申請(qǐng)的外國(guó)專利局的相應(yīng)官員可以獲得該保藏物。在國(guó)際承認(rèn)用于專 利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款下，維持該保藏物。保藏將是不可撤回的，且在專 利授權(quán)后對(duì)公眾的獲取沒有限制或條件。但是，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的可獲得并不構(gòu)成對(duì)破壞 專利權(quán)的實(shí)施主題發(fā)明或方法的許可。在布達(dá)佩斯條約規(guī)定下，2007年6月22日將Rcglb核酸分子保藏在位于國(guó)家農(nóng) WJfflff^Φ^^ (National Center for AgriculturalUtilization Research(NCAUR)) ^ 微生物基因座和生物工藝研究單位(Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit)的農(nóng)業(yè)研究機(jī) 構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection)。為保藏物給出下面的登記號(hào)NRRL B-50050。NCAUR的地址是1815N. University Street, Peoria, IL，61604。在國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯 條約的條款下，維持該保藏。該保藏僅僅為了本領(lǐng)域技術(shù)人員的方便而作出的，且不是對(duì)在 35U. S. C. § 112下需要的保藏物的承認(rèn)。保藏將是不可撤回的，且在專利授權(quán)后對(duì)公眾的獲 取沒有限制或條件。但是，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的可獲得并不構(gòu)成對(duì)破壞由政府行為授予的專 利權(quán)的實(shí)施主題發(fā)明的許可。實(shí)施方案的兩條全長(zhǎng)多肽(SEQ ID NO 3和246)與NBS-LRR家族的已知多肽 具有不同程度的同源性。具體地，Rcgl(SEQ ID NO 3)與從稻(Oryza sativa)(登記號(hào) NP_910480 (SEQ ID NO 14)、NP_910482 (SEQ ID NO 16)、NP_921091 (SEQ ID NO 17)禾口 NP_910483 (SEQ IDNO : 15))和大麥(Hordeum Vulgare)(登記號(hào) AAG37354 (SEQ ID NO 18)； Zhou等，(2001)Plant Cell 13 :337_350)分離的NBS-LRR蛋白具有同源性。圖2提供了 SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列與稻和大麥蛋白(SEQID NO 14-18)的比對(duì)。使用GAP程 序以將SEQ ID NO :3與各種上述稻和大麥序列的氨基酸比對(duì)表明，SEQ ID NO :3與稻蛋白 NP_910480 (SEQ ID NO 14)共有約 42. 3%序列相似性，與稻蛋白 NP_910482 (SEQID NO 16) 共有41.7%序列相似性，與稻蛋白NP_921091(SEQ ID N0 17)共有56. 9%相似性，且與稻 蛋白NP_910483 (SEQ ID NO 15)共有42. 1 %序列相似性。此外，SEQ ID NO :3與大麥蛋白 AAG37354(SEQ IDNO 18)共有約 42. 8%序列相似性。對(duì)Rcgl肽(SEQ ID NO 246)進(jìn)行相似的分析，發(fā)現(xiàn)其與從稻分離的NBS-LRR蛋 白(登記號(hào) Nos. ABA95308 (SEQ ID NO 250)，ABG66042 (SEQID NO 251), ABA92208 (SEQ ID NO 247)和 ABG66044(SEQ ID NO 248))和從大麥分離的蛋白(登記號(hào) No. AAM22820 (SEQ ID N0249))具有同源性。圖31a 31g提供了 SEQ ID NO :246所列氨基酸序列與其中上 面以登記號(hào)提供的稻和大麥蛋白(SEQ ID NOs 247-251)的比對(duì)。使用ClustalW成對(duì)比 對(duì)的氨基酸比對(duì)(缺口開口罰分=10，缺口延伸罰分=0. 1)表明SEQ ID N0:246與稻蛋 白ABA92208 (SEQ ID NO 247)具有大約37. 的序列同一性，與稻蛋白ABG66044(SEQ ID NO: 248)具有28. 2%的序列同一性，與稻蛋白ABA95308(SEQ ID NO 250)具有26. 6%的同 一性，與稻蛋白ABG66042(SEQ ID NO 251)具有31. 1 %的序列相似性。此外，SEQ ID N0: 3與大麥蛋白AAM22820(SEQ ID NO 249)具有25. 6%的序列相似性。NBS-LRR組的R-基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大類R-基因。在鼠耳芥(Arbidopsis thaliana)中，預(yù)期該基因組中存在超過150個(gè)(Meyers，等，(2003)，Plant Cell, 15 809-834 ;Monosi，等，(2004)，Theoretical andApplied Genetics, 109 1434—1447)，而在 稻中，已經(jīng)預(yù)測(cè)了約500個(gè)NBS-LRR基因(Monosi，(2004)同上)。NBS-LRR類的R基因包含2個(gè)亞類。第一類NBS-LRR基因含有在它們的N’末端的TIR-Toll/白細(xì)胞介素_1樣結(jié) 構(gòu)域；迄今為止僅在雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)它們(Meyers，(2003)同上；Monosi，(2004)同上)。 第二類NBS-LRR含有在它們N末端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域或(nt)結(jié)構(gòu)域(Bai，等(2002)Genome Research, 12 1871-1884 ；Monosi, (2004)同上；Pan，等，(2000), Journal of Molecular Evolution, 50 203-213)。已經(jīng)在雙子葉植物和單子葉植物物種中發(fā)現(xiàn)了第二類NBS-LRR。 (Bai, (2002)同上；Meyers，(2003)同上；Monosi，(2004)同上；Pan，(2000)同上)?；虻腘BS結(jié)構(gòu)域似乎在植物防御機(jī)制的信號(hào)傳導(dǎo)中起作用(vander Biezen, 等，(1998)，Current Biology :CB，8 :R226_R227)。LRR 區(qū)域似乎是與病原體 AVR 產(chǎn)物相互 作用的區(qū)域(Michelmore，等，(1998)，Genome Res.，8 1113-1130 ；Meyers, (2003)同上)。 與NBS結(jié)構(gòu)域相比，該LRR區(qū)域處于大得多的多樣性選擇壓力下(Michelmore，(1998)同 上；Meyers, (2003)同上；Palomino,等，(2002)，Genome Research, 12 1305—1315)。LRR 結(jié) 構(gòu)域也見于其它背景下；這些20-29-殘基基序以串聯(lián)陣列存在于具有不同功能的許多蛋 白中，所述功能例如激素-受體相互作用、酶抑制、細(xì)胞粘附和細(xì)胞運(yùn)輸。許多最近的研究 揭示，LRR蛋白參與早期哺乳動(dòng)物發(fā)育 、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞極化、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡信 號(hào)傳導(dǎo)。實(shí)施方案的基因顯然與第2類家族的NBS-LRR相關(guān)，但是不會(huì)完全擬合經(jīng)典模型。 氨基端與所謂的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)具有同源性。也存在富亮氨酸的區(qū)域，如預(yù)期的， 位于NBS的下游。但是，與以前研究的NBS-LRR蛋白不同，富亮氨酸的區(qū)域缺少在更經(jīng)典 的LRR結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)性重復(fù)性質(zhì)，在一般Lxx重復(fù)模式后一致性更低，且尤其不具有 Wang 等((1999)Plant J. 19 :55_64 ；尤其參見，圖 5)或Bryan 等((2000)，Plant Cell 12 2033-2045 ；尤其參見，圖3)所述的共有序列的實(shí)例。除了 NBS和LRR結(jié)構(gòu)域外，Rcglb含 有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。由于LRR區(qū)域是NBS-LRR的受體部分，所以當(dāng)發(fā)現(xiàn)新的LRR時(shí)，例如本發(fā)明公開的 那些，從該序列不能立即明顯得出它的活性范圍，即它會(huì)起反應(yīng)的病原體的范圍。在Cg抗 性表型的基礎(chǔ)上，分離了實(shí)施方案的基因，且因此新的LRR對(duì)Cg反應(yīng)。但是，不排除它們對(duì) 在此前進(jìn)行的工作中沒有測(cè)定的其它病原體反應(yīng)。實(shí)施方案的核酸和多肽可以用于賦予或增強(qiáng)植物的真菌抗性的方法中。因此，本 文公開的組合物和方法可以用于保護(hù)植物免受真菌病原體?！安≡w抗性”、“真菌抗性”和 “疾病抗性”意指該植物避免疾病癥狀，所述癥狀是植物-病原體相互作用的結(jié)果。也就是 說，預(yù)防病原體造成植物疾病和相關(guān)的疾病癥狀，或者，使病原體造成的疾病癥狀最小化或 減輕，例如，減少應(yīng)激和相關(guān)的產(chǎn)量損失。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，本文公開的組合物和方 法可以與本領(lǐng)域用于保護(hù)植物免受病原體攻擊的其它組合物和方法一起使用。因此，實(shí)施方案的方法可以用于保護(hù)植物免受疾病，尤其由植物真菌病原體造成 的那些疾病。本文使用的“真菌抗性”指，與野生型植物相比，增強(qiáng)的對(duì)真菌病原體的抗性或 耐受性。作用可以從對(duì)真菌病原體作用耐受性的輕微增加(例如，部分抑制)至完全抗性， 從而使植物不受真菌病原體存在的影響。增加水平的對(duì)特定真菌病原體或?qū)Ω鼜V譜真菌病 原體的抗性，構(gòu)成“增強(qiáng)的”或提高的真菌抗性。本發(fā)明實(shí)施方案也將增強(qiáng)或提高真菌植物 病原體抗性，從而使植物對(duì)真菌病原體或病原體的抗性增加。術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”指提高、增加、擴(kuò) 增、倍增、升高、增高等。在本文中，將本發(fā)明的植物描述成抗Cg感染，或?qū)g感染具有增強(qiáng)的抗性'，這是本發(fā)明的Rcgl基因座的結(jié)果。因此，與因?yàn)槿鄙賀cgl基因座而對(duì)Cg感染易感的等價(jià)植物相比，它們通常表現(xiàn)出增加的對(duì)疾病的抗性。例如，使用實(shí)施例11(也參 見圖20)所述的評(píng)分系統(tǒng)，與因?yàn)槿鄙賀cgl基因座而對(duì)Cg感染易感的等價(jià)植物相比時(shí)，它 們的感染評(píng)分通常表現(xiàn)出1點(diǎn)、2點(diǎn)、或3點(diǎn)或更多的降低，甚至評(píng)分減少至1或0。在具體方面，賦予或增強(qiáng)植物的真菌抗性的方法包含，向植物中導(dǎo)入至少一個(gè)表 達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包含編碼實(shí)施方案的抗真菌多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列各 自可操作地連接到驅(qū)動(dòng)在植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子上。植物表達(dá)這兩種多肽，從而賦予植物 真菌抗性，或提高植物的固有抗性水平。在具體實(shí)施方案中，該基因賦予對(duì)真菌病原體Cg 的抗性。如果需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制造兩種獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植物，其各自表達(dá)這兩種多 肽的一種，并然后將這兩種植物雜交，選擇表達(dá)這二者多肽的植物。實(shí)施方案的抗真菌多肽的表達(dá)，可以靶向其中病原體抗性是特別重要的特定植物 組織，例如，葉子、根、莖或維管組織。這樣的組織-優(yōu)選的表達(dá)可以通過根-優(yōu)選的、葉 子_優(yōu)選的、維管組織_優(yōu)選的、莖_優(yōu)選的、或種子_優(yōu)選的啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)。本文使用的“核酸”包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物， 且除非另有限制，包括具有天然核苷酸的基本性質(zhì)、表現(xiàn)為它們以與天然存在的核苷酸類 似的方式與單鏈核酸雜交的已知類似物(例如，肽核酸)。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換地用于指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù) 語(yǔ)適用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué) 類似物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物。實(shí)施方案的多肽可以從本文公開的核酸生產(chǎn)， 或通過使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)。例如，實(shí)施方案的截短的蛋白可以通過在適當(dāng)宿 主細(xì)胞中表達(dá)實(shí)施方案的重組核酸來生產(chǎn)，或者通過先體外后體內(nèi)方法的組合，例如蛋白 酶消化和純化來生產(chǎn)。當(dāng)在指定的核酸的上下文中使用時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“編碼”或“編碼的”指，該核 酸包含指導(dǎo)核苷酸序列翻譯成指定蛋白的必需信息。通過使用密碼子，指定編碼蛋白的信 息。編碼蛋白的核酸可以包含在核酸的翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)，或可以缺 少這樣的間插非翻譯序列(例如，象在cDNA中那樣)。本發(fā)明實(shí)施方案包括分離的或基本上純化的多核苷酸或蛋白組合物?！胺蛛x的” 或“純化的”多核苷酸或蛋白、或其生物活性部分，是相當(dāng)大地或基本上不含有在它天然存 在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的正常伴隨該多核苷酸或蛋白或與其相互作用的組分。因而，分離的或純 化的多核苷酸或蛋白基本上不含有其它細(xì)胞材料，或當(dāng)通過重組技術(shù)(例如PCR擴(kuò)增)生 產(chǎn)時(shí)的培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。最佳地，“分離的” 多核苷酸不含有在該多核苷酸所來源的生物的基因組DNA中天然側(cè)接該多核苷酸的序列 (即，位于多核苷酸的5'和3'末端的序列)(例如，蛋白編碼序列)。例如，在各種實(shí)施方 案中，分離的多核苷酸可以含有小于約5kb、約4kb、約3kb、約2kb、約lkb、約0. 5kb、或約 0. Ikb的在該多核苷酸所來源的細(xì)胞的基因組DNA中天然側(cè)接該多核苷酸的核苷酸序列。 基本上不含有細(xì)胞材料的蛋白包括含有小于約30%、約20%、約10%、約5%、或約1 % (按 干重計(jì))的污染蛋白的蛋白制劑。當(dāng)重組生產(chǎn)實(shí)施方案的蛋白、或其生物活性部分時(shí)，培養(yǎng) 基最佳地代表小于約30%、約20%、約10%、約5%、或約(按干重計(jì))的化學(xué)前體或非 目標(biāo)蛋白化學(xué)藥品。
實(shí)施方案也包括公開的核苷酸序列和其編碼的蛋白的片段和變體。“片段”意在指 核苷酸序列的部分或氨基酸序列的部分，和由此編碼的蛋白。核苷酸序列片段可以編碼保 持天然蛋白的生物活性的蛋白片段，并因此具有賦予植物真菌抗性的能力?；蛘?，用作雜交 探針的核苷酸序列片段不一定編碼保持生物活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列片段可以 是至少約15個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸，且最高達(dá)編碼實(shí)施方案多肽的全 長(zhǎng)核苷酸序列。編碼實(shí)施方案多肽的生物活性部分的核苷酸序列片段將編碼至少約15、約25、約 30、約40、或約50個(gè)鄰接氨基酸，或最高達(dá)實(shí)施方案全長(zhǎng)多肽中存在的氨基酸總數(shù)(例如， SEQ ID NO :1編碼的肽的980個(gè)氨基酸)。用作雜交探針或PCR引物的核苷酸序列片段通 常不需要編碼蛋白的生物活性部分。當(dāng)提及指定的多核苷酸時(shí)，本文使用的“全長(zhǎng)序列”指天然序列的整個(gè)核酸序列。 “天然序列”意在指內(nèi)源序列，即見于生物基因組中的非工程改造的序列。 因而，實(shí)施方案核苷酸序列的片段可以編碼多肽的生物活性部分，或它可以是用 作使用下述方法的雜交探針或PCR引物的片段。通過分離實(shí)施方案核苷酸序列之一的部 分，表達(dá)編碼的蛋白部分，和評(píng)價(jià)編碼的蛋白部分賦予或增強(qiáng)植物的真菌抗性的能力，可以 制備抗病原體多肽的生物活性部分。作為實(shí)施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至 少約15、約20、約50、約75、約100、或約150個(gè)核苷酸，或最高達(dá)本文公開的全長(zhǎng)核苷酸序 列中存在的核苷酸數(shù)目(例如，對(duì)于SEQ ID N0:l，4212個(gè)核苷酸)。“變體”意在指基本上類似的序列。對(duì)于多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸內(nèi)的 一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，和/或在天然多核苷酸的一個(gè) 或多個(gè)位點(diǎn)置換一個(gè)或多個(gè)核苷酸。本文使用的“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然存 在的核苷酸序列或氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以構(gòu)建實(shí)施方案核酸的變體， 從而維持可讀框。關(guān)于多核苷酸，保守變體包括這樣的序列，其因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，編 碼實(shí)施方案多肽之一的氨基酸序列。天然存在的等位基因變體，例如使用眾所周知的分子 生物學(xué)技術(shù)(例如，下述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù))可以鑒別出的那些。變體多 核苷酸也包括合成地衍生的多核苷酸，例如使用例如定點(diǎn)誘變產(chǎn)生、但是仍然編碼實(shí)施方 案蛋白的那些。通常，如通過本文別處所述的序列比對(duì)程序和參數(shù)測(cè)得的，實(shí)施方案的特定 多核苷酸的變體與該特定多核苷酸將具有至少約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、 約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %或更高序列同一性。通過對(duì)比變體多核苷酸編碼的多肽和參照多核苷酸編碼的多肽之間的百分比序 列同一性，也可以評(píng)價(jià)實(shí)施方案的特定多核苷酸(即，參照多核苷酸)的變體。因而，例如， 公開了編碼與SEQ ID NO :3或246的多肽具有給定百分比序列同一性的多肽的分離的多核 苷酸。使用本文別處所述的序列比對(duì)程序和參數(shù)，可以計(jì)算任意2個(gè)多肽之間的百分比序 列同一性。當(dāng)通過對(duì)比它們編碼的2個(gè)多肽共有的百分比序列同一性來評(píng)價(jià)任意一對(duì)給定 的實(shí)施方案多核苷酸時(shí)，2個(gè)編碼的多肽之間的百分比序列同一性是至少約40%、約45%、 約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列同一性?！白凅w”蛋白意在指，通過在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，和/或在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從天然蛋白衍生出的蛋白。實(shí)施方案包括的變體蛋白是生物活性的，也就是說，它們繼續(xù)具有需要的天 然蛋白的生物活性，即本文所述的賦予或增強(qiáng)植物真菌病原體抗性的能力。這樣的變體可 以源自例如基因多態(tài)性或人工操作。如通過本文別處所述的序列比對(duì)程序和參數(shù)測(cè)得的， 實(shí)施方案天然蛋白的生物活性變體與天然蛋白的氨基酸序列將具有至少約40%、約45%、 約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的序列同一性。實(shí) 施方案蛋白的生物活性變體可以與該蛋白相差少至約1-15個(gè)氨基酸殘基，少至約1-10個(gè)、 例如約6-10個(gè)、少至約5個(gè)、少至4、3、2或甚至1個(gè)氨基酸殘基?？梢砸愿鞣N方式改變實(shí)施方案的蛋白，包括氨基酸置換、缺失、截短和插入。這 樣的操作的方法是本領(lǐng)域普遍已知的。例如，通過DNA突變，可以制備出抗病原體蛋白 的氨基酸序列變體和片段。誘變和多核苷酸改變的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例 如，Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82 488-492 ；Kunkel 等(1987)Methods in Enzymo 1. 154 :367_382 ；美國(guó)專利號(hào) 4，873，192 ；Walker 和 Gaastra，編· (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, NewYork)禾口其中弓I用的參考文 獻(xiàn)。關(guān)于不影響目標(biāo)蛋白的生物活性的適當(dāng)氨基酸置換的指南，可以參見本文引作參考的 Dayhoff 等(1978)Atlasof Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.)的模型。保守置換可能是最佳的，例如將一個(gè)氨基酸替換為具有類似性 質(zhì)的另一個(gè)氨基酸。因而，實(shí)施方案的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突變體形式。類似地， 實(shí)施方案的蛋白包括天然存在的蛋白及其變體和修飾形式。這樣的變體將繼續(xù)具有需要的 賦予或增強(qiáng)植物真菌病原體抗性的能力。顯然，將在編碼變體的DNA中產(chǎn)生的突變必須不 能將該序列置于讀框之外，且最佳地將不產(chǎn)生互補(bǔ)區(qū)，后者會(huì)產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。參見，歐 洲專利號(hào)0075444。預(yù)期本文包含的蛋白序列的缺失、插入和置換不產(chǎn)生蛋白特征的根本變化。但是， 當(dāng)事先難以預(yù)測(cè)置換、缺失或插入的確切作用時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，將通過篩選已經(jīng) 用變體蛋白轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，以確定對(duì)植物的抗真菌病原體攻擊能力的作用，來評(píng)價(jià)該 作用。變體多核苷酸和蛋白也包括源自誘變或重組操作的序列和蛋白，包括且不限于諸 如DNA改組的操作。本領(lǐng)域技術(shù)人員能預(yù)見到會(huì)改變蛋白響應(yīng)的病原體范圍的修飾。利 用這樣的操作，可以操縱一個(gè)或多個(gè)不同的蛋白編碼序列，以生成具有所需的性質(zhì)的新蛋 白。以此方式，從包含具有相當(dāng)大序列同一性、且可以體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)域的 相關(guān)序列多核苷酸群體生成重組多核苷酸文庫(kù)。例如，使用該方案，可以使編碼目標(biāo)結(jié)構(gòu) 域的序列基序在實(shí)施方案的蛋白基因和其它已知蛋白基因之間改組，以得到編碼具有提 高的目標(biāo)性質(zhì)的蛋白的新基因，例如提高的賦予或增強(qiáng)植物真菌病原體抗性的能力。這 樣的DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Stemmer (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 10747-10751 ；Stemmer(1994)Nature 370 :389_391 ；Crameri 等(1997)Nature Biotech. 15 :436_438 ；Moore 等(1997)J.Mol. Biol. 272 :336_347 ；Zhang 等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 4504-4509 ；Crameri 等(1998) Nature 391 :288_291 ；和美國(guó)專利號(hào) 5，605，793 和 5，837，458。實(shí)施方案的多核苷酸可以用于從其它生物、尤其其它植物分離對(duì)應(yīng)的序列。以此 方式，諸如PCR、雜交等的方法等可以用于鑒別這樣的序列，這基于它們與本文所述序列的 序列同源性。實(shí)施方案包括，基于它們與本文所述整個(gè)序列或其變體和片段的序列同一性 而分離的序列。這樣的序列包括作為公開序列的直向同源物的序列?！爸毕蛲次铩币庠谥?源自共同祖先基因且由于物種形成而見于不同物種中的基因。當(dāng)它們的核苷酸序列和/或 它們編碼的蛋白序列共有至少約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約91 %、 約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更大的序列同一性 時(shí)，認(rèn)為在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因是直向同源物。直向同源物的功能經(jīng)常在物種間是高度 保守的。因而，實(shí)施方案包括分離的多核苷酸，其編碼賦予或增強(qiáng)真菌植物病 原體抗性的蛋 白，且在嚴(yán)格條件下與本文公開的序列或其變體或片段雜交。在PCR方案中，可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)中，以從提取自任意目標(biāo)生物 的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的DNA序列。設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法，是本領(lǐng)域 普遍已知的，且公開在 Sambrook 等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (2d ed. , Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, New York)。也參見 Innis 等， 編· (1990) PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (AcademicPress, New York) ；Innis禾口Gelfand,編· (1995)PCR Strategies(AcademicPress,New York)；禾口Innis 禾口 Gelfand，編· (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)。已知的 PCR 方 法包括、且不限于，使用配對(duì)引物、嵌套引物、單特異性引物、簡(jiǎn)并引物、基因-特異性引物、 載體_特異性引物、部分地錯(cuò)配的弓I物等的方法。在雜交技術(shù)中，使用全部或部分已知的多核苷酸作為探針，該探針選擇性地與存 在于從選定的生物克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群體(即，基因組或cDNA文庫(kù))中 的其它對(duì)應(yīng)多核苷酸雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡 核苷酸，且可以用可檢測(cè)基團(tuán)(例如32P)或任意其它可檢測(cè)標(biāo)記作出標(biāo)記。因而，例如，通 過標(biāo)記基于實(shí)施方案多核苷酸的合成寡核苷酸，可以制作雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建 cDNA和基因組文庫(kù)的方法，是本領(lǐng)域普遍已知的，且公開在Sambrook等(1989)同上。例如，本文公開的整個(gè)多核苷酸、或其一個(gè)或多個(gè)部分，可以用作能特異性與對(duì)應(yīng) 多核苷酸和信使RNA雜交的探針。為了實(shí)現(xiàn)在許多條件下的特異性雜交，這樣的探針包括 獨(dú)特的、且最佳為至少約10個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少約15個(gè)核苷酸長(zhǎng)或至少約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的 序列。這樣的探針可以用于通過PCR從選定的生物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)多核苷酸。該技術(shù)可以用于從 所需生物分離其它編碼序列，或作為確定生物中存在編碼序列的診斷測(cè)定。雜交技術(shù)包括 鋪平板的DNA文庫(kù)的雜交篩選(噬斑或菌落；參見，例如，Sambrook等(1989)同上)。這樣的序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行?！皣?yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意指 這樣的條件，在該條件下，探針將與它的靶序列的雜交程度在檢測(cè)上大于與其它序列的雜 交程度(例如，為背景的至少2-倍)。嚴(yán)格條件是序列-依賴性的，且在不同情況下將是不 同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒別出與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同 源探測(cè))。或者，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件，以允許序列中的有些錯(cuò)配，從而檢測(cè)更低程度的相似 性(異源探測(cè))。通常，探針的長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核苷酸，最佳長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。一般地，嚴(yán)格條件是這樣的，其中鹽濃度小于約1. 5M Na離子，通常約0. 01-1. OMNa離子濃度(或其它鹽)，pH 7. 0-8. 3，且對(duì)于短探針(例如，10_50個(gè)核苷酸)，溫度是至 少約30°C，而對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)，溫度是至少約60°C。通過加入去穩(wěn)定 劑例如甲酰胺，也可以達(dá)到嚴(yán)格條件。示例性的低嚴(yán)格性條件包括，在37°C用30-35%甲酰 胺、IM NaCl、l% SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，及在50_55°C在1X-2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴(yán)格性條件包括，在37°C、在 40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、l% SDS中雜交，和在55-60°C、在0. 5X-1X SSC中洗滌。示例性 的高嚴(yán)格性條件包括，在37°C、在50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交，最后在60-65 °C、在
0.IX SSC中洗滌至少30分鐘。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0. -約SDS0雜交 持續(xù)時(shí)間通常小于約24小時(shí)，經(jīng)常約4-約12小時(shí)。洗滌持續(xù)時(shí)間將至少是足以達(dá)到平衡 的時(shí)間長(zhǎng)度。特異性通常隨雜交后的洗滌而變化，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫 度。 對(duì)于 DNA-DNA 雜交體，可以從 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267_284 的 方程估計(jì)出熱解鏈溫度(Tm) =Tm = 81. 50C +16. 6 (log M)+0. 41 (% GC)-0. 61 (% form)-500/ L ；其中M是單價(jià)陽(yáng)離子的體積摩爾濃度，% GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，% form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，且L是按堿基對(duì)計(jì)算的雜交體長(zhǎng)度。Tm是50%的互 補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)。對(duì)于每的錯(cuò) 配，Tm降低約1°C ；因而，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件，以與所需同一性的序列雜交。 例如，如果要得到具有> 90%同一性的序列，則可以使Tm降低10°C。通常，將嚴(yán)格性條件選 擇在，在確定的離子強(qiáng)度和PH處，比特定序列序列和它的互補(bǔ)體的Tm低約5°C。但是，非常 嚴(yán)格的條件可以使用比1低1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格性條件可以使用比 Tm低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格性條件可以使用比Tm低11、12、13、14、15 或20°C的雜交和/或洗滌。使用該方程、雜交和洗滌組合物和所需的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員將理解，內(nèi)在地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化。如果所需的錯(cuò)配程度產(chǎn)生 小于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，則最佳地增加SSC濃度，從而可以使 用更高的溫度。關(guān)于核酸雜交的廣泛指南，參見Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes, Part
1,Chapter 2 (Elsevier, New York)；禾口 Ausubel 等，編· (1995) Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2(GreenePublishing and ffiley-Interscience,New York)。 參見Sambrook等(1989)同上。各種方法可以用于檢查存在或不存在DNA、RNA、或蛋白的特定序列。它們包括，例 如，DNA印跡、RNA印跡、蛋白印跡和ELISA分析。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知 的，且存在許多參考文獻(xiàn)，它們提供了詳細(xì)方案。這樣的參考文獻(xiàn)包括Sambrook等(1989) 同上，禾口 Crowther，J. R. (2001)，The ELISA Guidebook, Humana Press, Totowa, NJ, USA。下面的術(shù)語(yǔ)用于描述2個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系(a) “參照序 列，”(b) “對(duì)比窗，”(c) “序列同一性，”和，(d) “序列同一性百分比”。(a)本文使用的“參照序列”是用作序列對(duì)比的基礎(chǔ)的確定序列。參照序列可以是 指定序列的子集或整體；例如，作為全長(zhǎng)cDNA或基因序列的片段，或整個(gè)cDNA或基因序列。(b)本文使用的“對(duì)比窗”指多核苷酸序列的鄰接的和指定的片段，其中與用于2 個(gè)多核苷酸的最佳比對(duì)的參照序列(不包含添加或缺失)相比，對(duì)比窗中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即，缺口)。通常，對(duì)比窗的長(zhǎng)度是至少約20個(gè)鄰接核苷酸，且任選 地可以是約30、約40、約50、約100、或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，為了避免由于在多核苷 酸序列中包含缺口而與參照序列的高相似性，通常導(dǎo)入缺口罰分，并從匹配數(shù)目中減去。比對(duì)對(duì)比序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。因而，使用數(shù)學(xué)算法，可以確定任 意2個(gè)序列之間的序列同一性百分比。這樣的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Myers和 Miller (1988)CABI0S4 :11_17 的算法；Smith 等(1981)Adv. Appl. Math. 2 482 的局部比 對(duì)算法；Needleman 和 Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48 :443_453 的全局比對(duì)算法；Pearson 和 Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 2444-2448 的局部搜索比對(duì)方法；Karlin 禾口 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264 的算法，如在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877 中所改進(jìn)的。這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)，可以用于對(duì)比序列，以確定序列同一性。這樣的實(shí) 現(xiàn)包括，且不限于PC/Gene 程序中的 CLUSTAL(可從 Intelligenetics，Mountain View, California 得到)；ALIGN 程序(2. 0)和 GCGWisconsin Genetics 軟件包 10 版(可從 Accelrys Inc. , 9685Scranton Road, San Diego，California，USA得到)中的GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA和TFASTA。使用默認(rèn)參數(shù)，可以執(zhí)行使用這些程序的比對(duì)。CLUSTAL程序 詳細(xì)記載在 Higgins 等(1988)Gene 73:237-244(1988) ；Higgins 等(1989)CABIOS 5 151-153 ；Corpet 等(1988)Nucleic Acid Res. 16 10881-90 ；Huang 等(1992)CABIOS 8 155-65 ；和 Pearson 等(1994) Meth. Mol. Biol. 24 :307_331。ALIGN 程序是基于上面 Myers 和Miller(1988)的算法。當(dāng)對(duì)比氨基酸序列時(shí)，可以在ALIGN程序中使用PAM 120加權(quán) 殘基表，缺口長(zhǎng)度罰分為12，缺口罰分為4。Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403的 BLAST程序是基于上面Karlin和Altschul (1990)的算法?？梢杂肂LASTN程序進(jìn)行BLAST 核苷酸搜索，評(píng)分=100，字長(zhǎng)=12，以得到與編碼實(shí)施方案蛋白的核苷酸序列同源的核苷 酸序列。可以用BLASTX程序進(jìn)行BLAST蛋白搜索，評(píng)分=50，字長(zhǎng)=3，以得到與實(shí)施方案 蛋白或多肽同源的氨基酸序列。為了得到用于對(duì)比目的的有缺口的比對(duì)，可以如Altschul 等(1997) Nucleic Acid Res. 25 :3389 所述使用有缺口的 BLAST (在 BLAST 2. O 中)。或者， PSI-BLAST (在BLAST2.0中)可以用于進(jìn)行重復(fù)搜索，其檢測(cè)分子之間的距離關(guān)系。參見 Altschul等(1997)同上。當(dāng)使用BLAST、有缺口的BLAST、PSI_BLAST時(shí)，可以使用各程序 的默認(rèn)參數(shù)(例如，對(duì)于核苷酸序列的BLASTN，對(duì)于蛋白的BLASTX)。參見網(wǎng)站ncbi. nlm. nih.gov。也可以通過目檢，手工地進(jìn)行比對(duì)。除非另有說明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP 10版、使用下述參 數(shù)得到的值使用50的缺口權(quán)重和3的長(zhǎng)度權(quán)重和nwsgapdna. cmp評(píng)分矩陣，核苷酸序列 的％同一性和％相似性；使用8的缺口權(quán)重和2的長(zhǎng)度權(quán)重和BL0SUM62評(píng)分矩陣，氨基酸 序列的％同一性和％相似性；或其任意等價(jià)程序?！暗葍r(jià)程序”是指，當(dāng)與GAPlO版生成的對(duì) 應(yīng)比對(duì)相對(duì)比時(shí)，對(duì)于任意2個(gè)正被討論的序列，產(chǎn)生具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配 和相同百分比序列同一性的比對(duì)的任意序列對(duì)比程序。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 443-453 的算法，以發(fā)現(xiàn)使 匹配數(shù)最大化且使缺口數(shù)最小化的2個(gè)完整序列的比對(duì)。GAP考慮所有可能的比對(duì)和缺口 位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少缺口的比對(duì)。它允許提供以匹配堿基為單位 的缺口產(chǎn)生罰分和缺口延伸罰分。對(duì)于插入的每個(gè)缺口，GAP必須利用缺口產(chǎn)生罰分匹配數(shù)。如果選擇大于O的缺口延伸罰分，則GAP對(duì)于每個(gè)插入的缺口必須另外利用缺口長(zhǎng)度乘以缺口延伸罰分。在GCG Wisconsin Genetics軟件包10版中，蛋白序列的默認(rèn)缺口生 成罰分值和缺口延伸罰分值分別是8和2。對(duì)于核苷酸序列，默認(rèn)缺口生成罰分是50，而 默認(rèn)缺口延伸罰分是3。缺口生成和缺口延伸罰分可以表達(dá)為選自0-200的整數(shù)。因而， 例如，缺口生成和缺口延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65 或更大。GAP代表最佳比對(duì)家族的一個(gè)成員。該家族可以存在許多成員，且其它成員沒有更 好的品質(zhì)。GAP表現(xiàn)出4個(gè)比對(duì)品質(zhì)因數(shù)品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是計(jì)量最大化 的，以比對(duì)序列。比率是品質(zhì)除以更短片段中的堿基數(shù)。百分比同一性是實(shí)際上匹配的符號(hào) 的百分比。百分比相似性是相似的符號(hào)的百分比。忽略在缺口對(duì)面的符號(hào)。當(dāng)一對(duì)符號(hào)的 評(píng)分矩陣值大于或等于0.50 (相似性閾值)時(shí)，評(píng)為相似性。在GCG Wisconsin Genetics 軟件包10版中使用的評(píng)分矩陣是BL0SUM62 (參見Henikoff和Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915)。(c)在2個(gè)多核苷酸或多肽序列的上下文中，本文使用的“序列同一性”或“同一 性”指，當(dāng)比對(duì)指定對(duì)比窗中的最大一致性時(shí)，2個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分 比用于指蛋白時(shí)，公認(rèn)的是，不同的殘基位置的差異經(jīng)常在于保守氨基酸置換，其中氨基酸 殘基被置換為具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基，且因此不改變 該分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列差異在于保守置換時(shí)，可以向上調(diào)節(jié)百分比序列同一性，以改正 置換的保守性質(zhì)。據(jù)稱差異在于這樣的保守置換的序列具有“序列相似性”或“相似性”。 進(jìn)行該調(diào)節(jié)的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。一般地，這包含將保守置換評(píng)分為部分 的、而不是完全的錯(cuò)配，從而增加百分比序列同一性。因而，例如，當(dāng)相同氨基酸評(píng)分為1、且 非保守置換評(píng)分為O時(shí)，保守置換評(píng)分是在0-1之間。計(jì)算保守置換的評(píng)分，例如，如在程 序 PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View, California)中所實(shí)現(xiàn)的。(d)本文使用的“序列同一性百分比”指，通過在對(duì)比窗中對(duì)比2個(gè)最佳比對(duì)的序 列測(cè)得的值，其中與用于2個(gè)序列的最佳比對(duì)的參照序列(不包含添加或缺失)相比，對(duì)比 窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。如下計(jì)算百分比確定2個(gè)序 列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置 的數(shù)目除以對(duì)比窗中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100，以得到序列同一性百分比。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”的應(yīng)用，無意將實(shí)施方案限制為包含DNA的多核苷酸。本領(lǐng)域技 術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。 這樣的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的類似物。實(shí)施方案的多 核苷酸也包括序列的所有形式，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式等。實(shí)施方案的分離的多核苷酸可以整合入能導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在其中復(fù)制的重組DNA 構(gòu)建體中。“載體”可以是這樣的構(gòu)建體，其包括復(fù)制系統(tǒng)和能在給定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和 翻譯多肽編碼序列的序列。已經(jīng)描述了適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或確立轉(zhuǎn)基因植物的許 多載體，例如，Pouwels 等，Cloning Vectors :A Laboratory Manual，1985，supp. 1987 ； Weissbach 和 Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，1989 ; 和 Flevin 等，Plant Molecular Biology Manual,KluwerAcademic Publishers，1990。一 般地，植物表達(dá)載體包括，例如，在5'和3'調(diào)節(jié)序列和顯性選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄控制下的一個(gè)或多個(gè)克隆的植物基因。這樣的植物表達(dá)載體也可以含有啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(例如，控制誘 導(dǎo)型或組成型、環(huán)境-或發(fā)育-調(diào)節(jié)的、或細(xì)胞-或組織-特異性的表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))、轉(zhuǎn)錄起 始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA加工信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多腺苷酸化信號(hào)。術(shù)語(yǔ)“重組構(gòu)建體”、“表達(dá)盒”、“表達(dá)構(gòu)建體”、“嵌合構(gòu)建體”、“構(gòu)建體”、“重組DNA 構(gòu)建體”和“重組DNA片段”在本文中可互換地使用，且是核酸片段。重組構(gòu)建體包含核酸 片段的人工組合，包括且不限于，在自然界不一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和編碼序列。例如，重組DNA 構(gòu)建體可以包含源自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或源自相同來源且以與自然 界發(fā)現(xiàn) 的不同的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。這樣的構(gòu)建體可以單獨(dú)使用，或可以與載體結(jié) 合使用。如果使用載體，則載體的選擇依賴于用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法，如本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知的。例如，可以使用質(zhì)粒載體。熟練的技術(shù)人員熟知必須存在于載體上的遺傳元 件，以成功地進(jìn)行轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖包含實(shí)施方案的任意分離的核酸片段的宿主細(xì)胞。通過 擴(kuò)增、DNA印跡分析、mRNA表達(dá)的RNA印跡分析、蛋白表達(dá)的免疫印跡分析、表型分析等，可 以進(jìn)行篩選，以得到表現(xiàn)出多核苷酸或Rcgl基因座的所需表達(dá)水平和模式的系。術(shù)語(yǔ)“重組DNA構(gòu)建體”指由從不同來源獲取的核酸片段裝配而成的DNA構(gòu)建體。 核酸片段的類型和起源可以非常不同。在有些實(shí)施方案中，另外提供了包含可操作地連接到實(shí)施方案的異源核苷酸序列 上的啟動(dòng)子的表達(dá)盒。實(shí)施方案的表達(dá)盒可以用于生成轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞和微生物，及 用于實(shí)施誘導(dǎo)本文公開的植物真菌病原體抗性的方法。表達(dá)盒包括可操作地連接到實(shí)施方 案的多核苷酸上的5'和3'調(diào)節(jié)序列?！翱刹僮鞯剡B接”意在指2個(gè)或更多個(gè)元件之間的 功能連接?！罢{(diào)節(jié)序列”指位于編碼序列的上游(5’非編碼序列)、之內(nèi)或下游(3’非編碼 序列)的核苷酸，且其可以影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工、穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)節(jié)序列可 以包括，但不限于，啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。例如，目標(biāo)多核 苷酸和調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，例如)之間的可操作連接是允許表達(dá)目標(biāo)多核苷酸的功能連接。 可操作地連接的元件可以是鄰接的或非鄰接的。當(dāng)用于指2個(gè)蛋白編碼區(qū)的連接時(shí)，可操 作地連接的意指編碼區(qū)是在相同讀框中。表達(dá)盒可以另外含有至少一個(gè)要共轉(zhuǎn)化進(jìn)生物中 的其它基因?；蛘?，可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供其它基因。這樣的表達(dá)盒提供有多個(gè)限制位 點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)，用于插入在調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的編碼抗病原體多肽的多核苷酸。表 達(dá)盒可以另外含有選擇標(biāo)記基因。表達(dá)盒將在5' -3'轉(zhuǎn)錄方向包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即，啟動(dòng)子)、翻譯起始區(qū)、實(shí)施 方案的多核苷酸、翻譯終止區(qū)和在宿主生物中起功能的任選的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。調(diào)節(jié)區(qū)(即，啟 動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或?qū)嵤┓桨傅亩嗪塑账釋?duì)于宿主細(xì)胞而言或相互可 以是天然的/類似的?；蛘撸{(diào)節(jié)區(qū)和/或?qū)嵤┓桨傅亩嗪塑账峥梢允撬拗骷?xì)胞異源的或 彼此異源的。本文使用的“異源的”序列是源自外來物種的序列，或者如果來自相同物種， 則通過故意的人工干預(yù)，從它在組合物和/或基因組基因座中的天然形式進(jìn)行相當(dāng)大的修 飾。例如，可操作地連接到異源多核苷酸上的啟動(dòng)子來自與多核苷酸所來源的物種不同的 物種，或者如果來自相同/類似物種，則從它們的原始形式和/或基因組基因座相當(dāng)大地修 飾其中之一或二者，或者啟動(dòng)子不是可操作地連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。任選地包含的終止區(qū)可以是對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然的，可以是對(duì)于可操作地連接 的目標(biāo)多核苷酸天然的，可以是對(duì)于植物宿主天然的，或可以源自啟動(dòng)子、目標(biāo)多核苷酸、宿主或其任意組合的另一個(gè)來源(即，外來的或異源的)。方便的終止區(qū)可以從根癌土壤 桿菌(A. tumefaciens)的Ti-質(zhì)粒得到，例如，章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。也參見 Guerineau 等(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ;Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon 等(1991)Genes Dev. 5 141-149 ；Mogen 等(1990)Plant Cell 2:1261-1272; Munroe 等(1990)Gene 91 :151_158 ；Ballas 等(1989)Nucleic Acid Res. 17 :7891_7903 ； 和Joshi等(1987)Nucleic AcidRes. 15 :9627_9639。在具體實(shí)施方案中，使用馬鈴薯蛋 白酶抑制劑II基因(PinII)終止子。參見，例如，Keil等(1986)Nucl. Acids Res. 14 5641-5650 ；和An等(1989) Plant Cell 1 :115_122，它們?cè)诒疚闹姓w引作參考。許多啟動(dòng)子可以用于實(shí)踐實(shí)施方案，包括目標(biāo)多核苷酸序列的天然啟動(dòng)子?？梢?基于所需的結(jié)果來選擇啟動(dòng)子。在本文引作參考的Potenza等(2004) In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40 :1_22的最近的綜述中，討論了許多種植物啟動(dòng)子。例如，核酸可以與組成 型、組織-優(yōu)選的、病原體-誘導(dǎo)型或其它啟動(dòng)子相組合，以在植物中表達(dá)。這樣的組成型啟 動(dòng)子包括，例如，Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子，和在WO 99/43838和美國(guó)專利號(hào)6，072，050中 公開的其它組成型啟動(dòng)子；核心CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell等(1985)Nature 313 :810_812)； 稻肌動(dòng)蛋白(McElroy 等(1990)PlantCell 2:163-171)；遍在蛋白(Christensen 等 (1989)Plant Mol. Biol. 12 619-632 和 Christensen 等(1992)Plant Mol. Biol. 18 675-689) ；pEMU(Last 等(1991)Theor. Appl. Genet. 81 581-588) ；MAS(Velten 等(1984) EMBO J. 3 =2723-2730) ；ALS啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5，659，026)，等。其它組成型啟動(dòng)子包括， 例如，美國(guó)專利號(hào) 5，608，149 ；5，608，144 ；5，604，121 ；5，569，597 ；5，466，785 ；5，399，680 ； 5，268，463 ；5，608，142 ；和 6，177，611。有時(shí)，從誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、尤其從病原體-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)基因有時(shí)是有益的。這 樣的啟動(dòng)子包括，來自致病相關(guān)蛋白(I3R蛋白)的那些，它們?cè)诓≡w感染后被誘導(dǎo)；例 如，I3R蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等。參見，例如，Redolfi等(1983) Neth. J. Plant Pathol. 89 245-254 ；Uknes 等(1992)Plant Cell 4:645-656;和 Van Loon(1985)Plant Mol. Virol. 4 :111_116。也參見本文引作參考的 W099/43819。令人感興趣的是導(dǎo)致在病原體感染部位處或附近局部地表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子。參 見，例如，Marineau 等(1987)Plant Mol. Biol. 9 335-342 ；Matton 等(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2 325-331 ；Somsisch 等(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 2427-2430 ；Somsisch 等(1988)Mol. Gen. Genet. 2 :93_98 ；和 Yang(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 14972-14977。也參見，Chen 等(1996)Plant J. 10 :955_966 ；Zhang 等 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 2507-2511 ；Warner 等(1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz 等(1989) Plant Cell 1 :961_968 ；美國(guó)專利號(hào) 5，750，386 (線蟲-誘導(dǎo)型)；和其 中引用的參考文獻(xiàn)。特別令人感興趣的是玉米PRms基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它的表達(dá)由病原 體串珠鐮孢(Fusarium moniliforme)誘導(dǎo)(參見，例如，Cordero 等(1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41 189-200)。另外，隨著病原體通過傷口或昆蟲損傷進(jìn)入植物，傷口 _誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以用 于實(shí)施方案的構(gòu)建。這樣的傷口-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(Pin II)基 因(Ryan (1990)Ann. Rev. Phytopath. 28 :425-449 ;Duan 等(1996)Nature Biotechnology 14 494-498) ；wunl 和 wun2,美國(guó)專利號(hào) 5，428，148 ；winl 和 win2 (Stanford 等(1989)Mol. Gen. Genet. 215 200-208)；系統(tǒng)素(McGurl 等(1992) Science 225 1570-1573)； WIPl (Rohmeier 等(1993)Plant Mol. Biol. 22 783-792 ；Eckelkamp 等(1993)FEBS Letters 323:73-76) ；MPI 基因(Corderok 等(1994)Plant J. 6 (2) :141_150)；等，本文引
作參考。通過應(yīng)用外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑，可以將化學(xué)藥品調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)基因在植物中 的表達(dá)。根據(jù)目的，啟動(dòng)子可以是化學(xué)藥品_誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(這時(shí)使用化學(xué)藥品誘導(dǎo)基因表 達(dá))或化學(xué)藥品_抑制型啟動(dòng)子(這時(shí)使用化學(xué)試劑阻抑基因表達(dá))。化學(xué)藥品_誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，并包括且不限于，玉米In2-2啟動(dòng)子，它由苯磺酰胺除草劑安全劑 激活，玉米GST啟動(dòng)子，它由用作突出前(pre-emergent)除草劑的疏水親電子化合物激活， 和煙草PR-Ia啟動(dòng)子，它由水楊酸激活。其它化學(xué)藥品調(diào)節(jié)的目標(biāo)啟動(dòng)子包括類固醇-響 應(yīng)型啟動(dòng)子(參見，例如，Schena 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 10421-10425 和 McNellis等(1998)Plant J. 14(2) :247_257中的糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)和四環(huán) 素-誘導(dǎo)型和四環(huán)素-阻抑型啟動(dòng)子(參見，例如，Gatz等(1991)Mol.Gen. Genet. 227 229-237，和美國(guó)專利號(hào)5，814，618和5，789，156)，本文引作參考。組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子可以用于在特定植物組織內(nèi)靶定增強(qiáng)的實(shí)施方案的多肽的 表達(dá)。例如，組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子可以用于在疾病抗性特別重要的植物組織(例如，根、 莖或葉子)中表達(dá)多肽。組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子包括Yamamoto等(1997)Plant J. 12(2) 255-265 ；Kawamata 等(1997)Plant Cell Physiol. 38(7) 792-803 ；Hansen 等(1997) Mol.Gen Genet. 254(3) 337-343 ；Russell 等(1997)Transgenic Res. 6(2) 157-168 ； Rinehart 等(1996)Plant Physiol. 112(3) 1331-1341 ；Van Camp 等(1996)Plant Physiol.112(2) 525-535 ；Canevascini 等(1996)PlantPhysiol.112 (2) :513_524 ； Yamamoto 等(1994)Plant Cell Physiol. 35(5) 773-778 ；Lam(1994)Results Probl. Cell Differ. 20 181-196 ；Orozco 等(1993)Plant Mol Biol.23(6) 1129-1138 ；Matsuoka 等 (1993)Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20) :9586_9590 ；和 Guevara-Garcia 等(1993)Plant J. 4(3) :495-505。如果需要，可以修飾這樣的啟動(dòng)子，進(jìn)行弱表達(dá)。維管組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，且包括選擇性地驅(qū)動(dòng)在例如木質(zhì)部 和韌皮部組織中的蛋白表達(dá)的那些啟動(dòng)子。維管組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子包括且不限于， 野黑櫻(Primus serotina)的野黑櫻苷水解酶基因啟動(dòng)子(參見，例如，國(guó)際
發(fā)明者K·E·布羅利, K·H·巴特勒 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司