專利名稱：：去除含有非所需核酸的溶液的污染的方法去除含有非所需核酸的溶液的污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)含有非所需核酸的溶液去除污染的方法。本發(fā)明還涉及這種處理過(guò)的溶液的用途。分子生物學(xué)的進(jìn)步使得有可能對(duì)核酸進(jìn)行操作。擴(kuò)增方法由此變成了必不可少的工具，這意味著更大量的核酸可以在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)從極少量的核酸產(chǎn)生。這類技術(shù)的主要缺陷在于在臨床檢測(cè)中會(huì)擴(kuò)增非所需的核酸，產(chǎn)生不正確的結(jié)果或者甚至產(chǎn)生假陽(yáng)性。這被稱為污染。這樣的污染可有多種來(lái)源實(shí)驗(yàn)臺(tái)的清潔差，人員，環(huán)境，設(shè)備及吸量管裝置，或未滅菌的樣本。已開(kāi)發(fā)了一定數(shù)量的旨在限制這類污染的推薦方法。其都是預(yù)防性方法，包括例如操作樣本(特別是滅菌技術(shù))或?qū)嶒?yàn)室設(shè)備(物理限定的工作區(qū)域，通風(fēng)櫥的使用，外部與內(nèi)部的壓力梯度，從而氣流可以所需方向恒定抽空等等)。污染還可來(lái)自由預(yù)先擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增子或者樣本之間的交叉污染。其他不可忽視的污染來(lái)源存在于用于擴(kuò)增反應(yīng)的起始材料(酶，試劑)。因此，Corless等人討論了在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中由污染的taq聚合酶引起的對(duì)測(cè)定16SRNA的敏感性問(wèn)題(JClinMicrobio1，38(5)，1747-1752(2000))。對(duì)擴(kuò)增所必需的酶污染進(jìn)行糾正的第一種方式在于酶去除污染方法。因此，專利US-A-5418149描述了使用能夠降解來(lái)自酶生產(chǎn)細(xì)胞的核酸的尿嘧啶-DNA-糖基化酶的方法。該技術(shù)應(yīng)用了所需蛋白的過(guò)表達(dá)，在這種情況下，其是在尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)和脫氧尿苷三磷酸酶(dUTPase)缺陷的大腸桿菌細(xì)胞中的聚合酶。由于UNG缺乏，所述細(xì)胞不能夠清除摻入的脫氧尿嘧啶堿基。由于dUTPase的缺乏，細(xì)胞增加了其脫氧尿苷庫(kù)。因此，所述培養(yǎng)介質(zhì)可以允許產(chǎn)生所需的蛋白(聚合酶)并將脫氧尿苷摻入所述核酸。然后使用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)對(duì)所述合成蛋白進(jìn)行純化并采用能夠?qū)埩艉怂岬哪蜞奏埢位哪蜞奏?DNA-糖基化酶處理。所述糖基化酶隨后通過(guò)加熱滅活以防止在擴(kuò)增反應(yīng)中對(duì)靶DNA的破壞。該方法特異于制備重組蛋白，其主要不足在于該方法的用途。此外，去除污染局限于含有尿嘧啶的核酸。再者，其他可能的不足在于加熱處理僅誘導(dǎo)部分尿嘧啶-DNA-糖基化酶失活。與所述蛋白接觸的靶DNA因此有可能被破壞。由Ashkenas等人所述的其他酶學(xué)方法(Biotechniques;Jul2005;39(1):69-73)包括對(duì)含有擴(kuò)增所必需的全部元件的溶液去除污染。在這種情況下，限制酶的混合物被用于RT-PCR。那些酶降解存在于含有被擴(kuò)增靶RNA的所述擴(kuò)增反應(yīng)介質(zhì)中的雙鏈DNA。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄發(fā)生時(shí)，其隨后通過(guò)加熱而失活。也描述了該方法用于PCR應(yīng)用的替代方法，即在雙鏈耙DNA存在的情況，但僅限于使用一類限制酶(II型RE)。然而，限制酶的使用使得其不足在于僅切割雙鏈核酸，還必需具有識(shí)別位點(diǎn)。出于這一原因，以單鏈和/或具有少數(shù)或沒(méi)有此類位點(diǎn)的形式存在的污染物就不能被清除。其他的酶學(xué)去除污染方法包括在與靶核酸進(jìn)行接觸之前就從溶液中清除非所需的核酸。專利申請(qǐng)WO-A-99/07887描述了在與所述靶核酸接觸之前在反應(yīng)介質(zhì)中含有的能降解雙鏈核酸的不耐熱DNAse的應(yīng)用。該酶隨后通過(guò)加熱失活。該技術(shù)的主要不足在于這樣的酶不能降解以RNA、單鏈DNA或RNA/DNA異源雙鏈形式存在的污染物。此外，在反應(yīng)介質(zhì)中通過(guò)加熱使酶失活也需使用熱穩(wěn)定的聚合酶。現(xiàn)有技術(shù)還描述了非酶學(xué)方法。因此，Mohammadi等人(JClinMicrobiol,Oct2003;41(10):4796-8)描述了包含對(duì)提取試劑進(jìn)行柱過(guò)濾以及任選在擴(kuò)增之前由限制酶Sau3AI消化PCR試劑的技術(shù)。過(guò)濾技術(shù)的不足在于事實(shí)上這樣的技術(shù)還不能夠在不改變濃度或性質(zhì)的條件下應(yīng)用于復(fù)雜介質(zhì)。此外，這樣的補(bǔ)充過(guò)濾步驟有可能本身就成為污染源。專利申請(qǐng)WO-A-94/12515描述了由光反應(yīng)化合物處理含有Taq聚合酶以及潛在污染核酸的溶液的方法。所述光反應(yīng)化合物例如呋喃香豆素衍生物是通過(guò)暴露于紫外線照射而活化的。除了難以使用，該技術(shù)的主要不足在于照射對(duì)蛋白造成的有害影響。此外，該方法保持了低效率，因?yàn)樗龊怂岬碾S機(jī)降解有可能產(chǎn)生也可被擴(kuò)增的片段。由Chang等人(RNA，May2005;11(5):831-6)描述的其他非酶學(xué)方法使用鈷絡(luò)合物來(lái)抑制翻譯。該絡(luò)合物能夠水解DNA和RNA的磷酸二酯鍵。該技術(shù)的主要不足在于核酸的不完全降解以及緩慢的去除污染反應(yīng)(24小時(shí))。為了純化被核酸污染的生物分子，在專利申請(qǐng)WO-A-2006/034009中還描述了金屬絡(luò)合物。因此，由與銅原子結(jié)合的兩個(gè)菲咯啉分子(雙(i,io-菲咯啉/Cu)所構(gòu)成的片段化絡(luò)合物可用于純化含有taq聚合酶的溶液。為了去除污染核酸和/或片段化分子可使用標(biāo)準(zhǔn)層析技術(shù)隨后純化所述溶液。該方法的主要不足在于存在純化步驟，使得其應(yīng)用困難并增加了新污染的風(fēng)險(xiǎn)。專利EP-B-0646180描述了使用金屬螯合物失活核苷酸序列的方法。片段化絡(luò)合物如雙(l，lO-菲咯啉)/Cu被用于在擴(kuò)增步驟之后對(duì)含有全部存在的核酸的溶液去除污染。這可以預(yù)防由之前擴(kuò)增反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增子引起的新樣本的污染。該文件還描述了使用片段化分子來(lái)去除生物產(chǎn)物制品的污染。在第一種使用的情況下，該方法的主要不足在于其不能降解全部的污染核酸，僅能夠降解由之前擴(kuò)增反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在第二種情況下，其主要不足在于存在純化步驟(超濾，沉淀，層析)，使得其應(yīng)用困難并增加了新污染的風(fēng)險(xiǎn)。考慮到現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人提出了新的方法，該方法可簡(jiǎn)單快速地對(duì)含有非所需核酸的溶液去除污染。在此，本發(fā)明在第一方面提供了去除溶液中存在的任意核酸的污染的方法，所述方法包括以下步驟*將所述溶液與稱作片段化分子的具有通過(guò)片段化降解核酸的性質(zhì)的至少一類分子作用充分的時(shí)間，直到所述稱作污染核酸的核酸完全降解；*終止所述片段化分子的活性。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于這種去除污染方法不需要純化步驟清除片段化分子。被處理的核酸是以單鏈或雙鏈形式存在的RNA或DNA以及RNA/DNA異源雙鏈。這一方法對(duì)污染起始材料例如來(lái)自天然來(lái)源例如細(xì)菌的酶特別有用。這些酶因此被得自所述細(xì)菌的天然核酸高度污染。另一方面，本發(fā)明提供了去除含有污染核酸及感興趣核酸的溶液的污染的方法，包括以下步驟*將所述溶液與稱作片段化分子的具有通過(guò)片段化降解污染核酸的性質(zhì)的至少一類分子作用充分的時(shí)間，直到所述污染核酸完全降解，保留了感興趣核酸；終止所述片段化分子的活性。所述污染核酸可以是人類基因組DNA，感興趣核酸可以是以極少量存在于混合物中的病毒或細(xì)菌核酸。所述感興趣核酸可以通過(guò)片段化分子的作用而受到保護(hù)。例如，其可由外包膜(衣殼，細(xì)菌細(xì)胞壁等等)天然保護(hù)，而所述污染核酸則否。在本發(fā)明的一個(gè)有利的實(shí)施方案中，在終止所述片段化分子的活性之后，該方法還包括含有擴(kuò)增反應(yīng)的補(bǔ)充步驟。優(yōu)選地，本發(fā)明所述去除污染方法特征在于所使用的片段化分子具有以隨機(jī)方式水解所述污染核酸的磷酸二酯鍵的性質(zhì)。如一個(gè)實(shí)施方案所述，所述片段化分子是由形成雙(1，10-菲咯啉)/金屬絡(luò)合物的結(jié)合于金屬原子的兩個(gè)UO-菲咯啉分子所構(gòu)成的絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述金屬是過(guò)渡金屬，例如銅，釕，鎳，鐵，鋅，銠，鈷或錳。優(yōu)選地，所述片段化分子的兩個(gè)菲咯啉核通過(guò)連接臂相互連接形成了ClipPhen分子。ClipPhen分子已在文獻(xiàn)中廣泛描述。可有多種連接臂連接兩個(gè)菲咯啉核。優(yōu)選地，兩個(gè)菲咯啉核之間的連接臂是由三個(gè)連續(xù)碳原子組成的鏈構(gòu)成的，其中在中間位置的碳原子是取代的且其中每個(gè)末端碳原子都通過(guò)氧原子例如絲氨醇連接于菲咯啉核。優(yōu)選地，中間位置的碳原子是由-NH2或-皿-(:0-0^取代的且每個(gè)末端碳原子都通過(guò)所述核上的2位或3位的氧原子連接于菲咯啉核。許多其他的連接也是可能的，例如二氨基-環(huán)己垸(ChemistryLetters,vol33，No.6，p684-985，Hayashi等人)或乙二醇，丙二醇或戊二醇(Synlett2001，No.lO，1629-1631，Boldron等人)。與金屬相連的ClipPhen分子的片段化活性是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(ChemicalReview,1993，93，2295-2316，DSigman等人；JChemSoc1961，2007-2019，James等人)。出于改善其水解性質(zhì)的目的，該分子已在眾多研究中進(jìn)行了檢測(cè)。其具有降解全部核酸即以單鏈或雙鏈形式存在的DNA和RNA以及RNA/DNA異源雙鏈的優(yōu)勢(shì)。因此，與雙(l，lO-菲咯啉)/金屬絡(luò)合物相比，2-ClipPhen/金屬((1，3-雙(1,10-菲咯啉-2-基氧基)丙-2-胺/金屬)禾卩3-ClipPhen/金屬(1，3-雙(1,10-菲咯啉-3-基氧基)丙-2-胺/金屬)表現(xiàn)出了大大增強(qiáng)的核酸酶活性(InorganicChemistry1998，3486-3489，Pitie等人；Chemcommun1998，2597-2598，Pitie等人；EurJInorgChem2003，528-540，Pitie等人以及BioconjugateChemistry2000，11，892-900，PitieM等人)。類似地，與銅絡(luò)合的ClipPhen分子可高效并以隨機(jī)方式水解DNA或RNA的磷酸二酯鍵。其可與銅原子絡(luò)合從而產(chǎn)生具有氧化態(tài)I或II的絡(luò)合物，如James等人在JChemSoc1961，2007-2019出版物中所示。分子2-ClipPhen-Cu和3-ClipPhen-Cu如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>因此，本發(fā)明還涉及去除溶液中的存在的任意核酸的污染的方法，所述方法包括將所述溶液與ClipPhen/金屬分子作用充分的時(shí)間，直到所述污染核酸完全降解。又一方面，本發(fā)明包含去除含有污染核酸和感興趣核酸的溶液的污染的方法，包括將所述溶液與ClipPhen/金屬分子作用充分的時(shí)間，直到所述污染核酸完全降解，保留了感興趣的核酸。如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所述，可通過(guò)加入過(guò)量的有機(jī)還原劑終止所述片段化分子的片段化活性。當(dāng)所述有機(jī)還原劑由硫醇構(gòu)成時(shí)，片段化分子與終止所述反應(yīng)的有機(jī)還原劑之間的比例大于1比100，優(yōu)選大于1比1000。本實(shí)施方案的一大優(yōu)點(diǎn)在于所述片段化分子是原位失活的。這些分子因此并不需要從溶液中移出。后者可在各種應(yīng)用例如擴(kuò)增中使用。因此，根據(jù)存在有機(jī)還原劑的濃度，所述片段化分子可被活化或失活。如本發(fā)明的另一實(shí)施方案所述，可通過(guò)加入對(duì)金屬比ClipPhen具有更高親和性的絡(luò)合劑(CA)例如EDTA或任意其他絡(luò)合劑終止所述片段化分子的片段化活性，并替換平衡ClipPhen-金屬+CA—ClipPhen+金屬畫CA在本發(fā)明的一個(gè)特別實(shí)施方案中，所述片段化分子是結(jié)合過(guò)氧化氫H202的I型銅絡(luò)合物，并任選具有其他還原劑，優(yōu)選為有機(jī)還原劑。優(yōu)選地，所述片段化分子是I型ClipPhen/Cu分子。在I型銅絡(luò)合物的情況下，所述核酸酶活性如以下兩個(gè)階段進(jìn)行a)陽(yáng)性電荷的銅絡(luò)合物與所述核酸形成絡(luò)合物；b)在一系列反應(yīng)之后，通過(guò)與H202形成Cu-氧或Cu-OH中間體氧化所述核酸，從而導(dǎo)致核酸切割。如另一實(shí)施方案所述，所述分子是結(jié)合其他還原劑優(yōu)選有機(jī)還原劑的II型銅絡(luò)合物。在這種情況下，在空氣與還原劑的作用下可在原位產(chǎn)生過(guò)氧化氫。再優(yōu)選地，所述片段化分子是II型ClipPhen/Cu分子。當(dāng)其他有機(jī)還原劑是羧酸或羧酸衍生物時(shí)，所述片段化分子與有機(jī)還原劑之間的比例范圍為1比1至1比100。至于前述實(shí)施方案的功能，所述有機(jī)還原劑構(gòu)為*硫醇如二硫蘇糖醇(DTT)，硫代酸如巰基丙酸；或*羧酸；或*羧酸的衍生物如抗壞血酸；或*磷化氫如三羧乙基磷化氫(TCEP)。在一個(gè)特別實(shí)施方案中，所述片段化分子和/或還原劑被固定化于固相支持物上。這類固相支持物可以是乳膠顆粒(任選磁性的)，玻璃(CPG)，硅石，聚苯乙烯，瓊脂糖，瓊脂糖(sepharose)，尼龍等等。其還可以是濾器，膜，條或薄膜。當(dāng)其上固定有片段化分子和/或還原劑的固相支持物從溶液中移出時(shí)，所述片段化分子的片段化活性也可被終止。所述片段化分子還可通過(guò)共價(jià)鍵或通過(guò)吸附于被考慮的支持物上得以固定。有許多涉及支持試劑的參考文獻(xiàn)業(yè)已存在；可特別參考Laurent等人的TetrahedronLetters45，8883-8887，2004。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的又一優(yōu)勢(shì)在于核酸所經(jīng)歷反應(yīng)的快速性。對(duì)濃度范圍為lnM至lOOnM的ClipPhen/金屬分子而言，處理時(shí)間的范圍為5分鐘至60分鐘，優(yōu)選范圍為10分鐘至30分鐘。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述溶液含有除核酸外用于擴(kuò)增反應(yīng)必需的全部組分，即靶，擴(kuò)增引物以及檢測(cè)探針。本發(fā)明還涉及如本發(fā)明所述處理的溶液的用途，在有機(jī)還原劑存在的條件下將所述溶液混合于含有擬進(jìn)行擴(kuò)增的靶核酸以及特異于所述靶核酸的擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針的生物樣本，從而產(chǎn)生能夠終止所述片段化分子作用的過(guò)量有機(jī)還原劑。終止所述片段化分子作用的有機(jī)還原劑可以與加入活化所述片段化分子的核酸反應(yīng)的其他有機(jī)還原劑相同或不同。定義術(shù)語(yǔ)"核酸"是指至少2個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的串聯(lián)。所述核酸可以是天然或合成的，寡核苷酸，多核苷酸，核酸片段，基閔會(huì)日DNA，核糖休RNA，信使RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，或通過(guò)酶擴(kuò)增技術(shù)獲得的核酸，例如*PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，見(jiàn)于專利USA-4683195，USA-4683202以及USA-4800159，及其衍生RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)，特別是以一步形式描述的，例如見(jiàn)于專利EP-B-0589272;*LCR(連接酶鏈反應(yīng))，例如描述于專利申請(qǐng)EP-A-0201184;*RCR(RepairChainReaction),描述于專利申請(qǐng)WO-A-90/01069;*3SR(自我持續(xù)序列復(fù)制)，參見(jiàn)專利申請(qǐng)WO-A-卯/06995;*NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)，參見(jiàn)專利申請(qǐng)WO-A-91/02818;以及*TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)，參見(jiàn)專利US-A-5399491。我們應(yīng)該使用術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增子"來(lái)指代通過(guò)酶擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生的核酸。術(shù)語(yǔ)"任意核酸"是指以單鏈或雙鏈形式的RNA或DNA序列以及RNA/DNA異源雙鏈。術(shù)語(yǔ)"終止所述片段化分子的活性"是指*加入過(guò)量的有機(jī)還原劑；或參加入絡(luò)合劑。術(shù)語(yǔ)"降解"是指降解或片段化至少90%的污染核酸。優(yōu)選地，所述降解被稱為"完全的"，其意味著對(duì)DNA或RNA的降解，優(yōu)選為通過(guò)水解磷酸二酯鍵的降解，導(dǎo)致形成了"不可擴(kuò)增的"核酸序列。術(shù)語(yǔ)"不可擴(kuò)增的"核酸意味著在存在有至少10個(gè)核苷酸優(yōu)選大小的引物條件下所述核酸不能被擴(kuò)增。這些"不可擴(kuò)增的"核酸大小因此小于20個(gè)核苷酸，優(yōu)選為小于10個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)"溶液"是指同質(zhì)或異質(zhì)水溶液。其可以是作為混合物或其他的含有酶，有機(jī)分子(三磷酸核苷酸，糖，糖類，多糖，小有機(jī)分子等)，無(wú)機(jī)分子(鹽等)的復(fù)合溶液。所述溶液還可含有固相支持物，例如從乳膠，任選是磁性的乳膠，玻璃(CPG)，二氧化硅，聚苯乙烯，瓊脂糖，瓊脂糖，尼龍等形成的顆粒。其還可以是濾器，薄膜，膜或條。所述溶液還可以由與固相表面例如塑料管(Eppendorf類型)接觸的溶液組成，從而允許對(duì)所述表面去除污染。附圖與實(shí)施例描述了特定的實(shí)施方案，且不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。圖1:對(duì)用ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物在37°C作用1小時(shí)的1080堿基轉(zhuǎn)錄物(野生型沙門氏菌)降解情況的生物分析儀研究(Agilent,RNA6000PicoKit，USA)。在柱2，3，4，6和7中31秒的暗條帶對(duì)應(yīng)于所述1080堿基轉(zhuǎn)錄物。*柱1:核苷酸大小規(guī)模。注射入一系列增加的RNA大小，允許對(duì)所分析核酸的大小進(jìn)行定量并計(jì)算，作為在該時(shí)間其通過(guò)生物分析儀檢測(cè)器前方的時(shí)間函數(shù)。在垂直軸上的測(cè)定單位是秒。通過(guò)時(shí)間與所述核酸質(zhì)量的轉(zhuǎn)化是通過(guò)生物分析儀軟件實(shí)現(xiàn)的。*柱2:在存在5iaM(微摩)ClipPhen-Cu條件下的5nM(納摩)轉(zhuǎn)錄物。*柱3:在存在500nM的ClipPhen-Cu條件下的5nM轉(zhuǎn)錄物。*柱4:在存在50nM的ClipPhen-Cu條件下的5nM轉(zhuǎn)錄物。*柱5:加入500pM抗壞血酸的上述柱2。*柱6:加入50inM抗壞血酸的上述柱3。*柱7:加入5^iM抗壞血酸的上述柱4。圖2:通過(guò)增加DTT濃度(0-16mM)對(duì)核酸片段化的抑制。曲線A對(duì)應(yīng)于OmM的DTT。曲線B對(duì)應(yīng)于lmM的DTT。曲線C對(duì)應(yīng)于3mM的DTT。曲線D對(duì)應(yīng)于5mM的DTT。曲線E對(duì)應(yīng)于10mM的DTT。曲線F對(duì)應(yīng)于16mM的DTT。曲線G對(duì)應(yīng)于對(duì)照OmM的DTT和OmM的抗壞血酸。圖3:在所述混合物中作為DTT濃度函數(shù)的模型熒光寡核苷酸片段化率(相對(duì)熒光單位(RFU)每分鐘)。圖4:ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物對(duì)含有核酸的水溶液(100細(xì)胞當(dāng)量(叫uivalent)/ul蠟狀芽孢桿菌(5Ce^w)的總RNA)的效果。曲線A對(duì)應(yīng)于未經(jīng)任何處理的擴(kuò)增對(duì)照(+對(duì)照)。曲線B對(duì)應(yīng)于50pMClipPhen-Cu/500pM抗壞血酸混合物，通過(guò)加入17rnMDTT并保溫30分鐘，其活性被立即抑制。曲線C對(duì)應(yīng)于保溫30分鐘的50pMClipPhen-Cu/500pM抗壞血酸混合物，在這一時(shí)間之后用DTT終止片段化。圖5:通過(guò)ClipPhen-Cu(與或不與抗壞血酸)對(duì)DNA或單鏈RNA片段化的比較。曲線被標(biāo)準(zhǔn)化為l。曲線a:用于ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的熒光寡核苷酸(DNA)No16025。曲線b:用于ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的熒光寡核苷酸(RNA)No16027。曲線c:實(shí)驗(yàn)a的陰性對(duì)照用于ClipPhen-Cu混合物單獨(dú)作用的熒光寡核苷酸(DNA)No16025。曲線d:實(shí)驗(yàn)b的陰性對(duì)照用于ClipPhen-Cu混合物單獨(dú)作用的熒光寡核苷酸(RNA)No16027。圖6:ClipPhen-Cu混合物(與或不與抗壞血酸)對(duì)單鏈或雙鏈DNA片段化的比較。所述曲線代表對(duì)應(yīng)于每分鐘熒光升高的片段化速率(RFU/分)。曲線a:用于ClipPhen-Cu混合物作用的熒光寡核苷酸(DNA)No16025/互補(bǔ)DNA耙(No16026)雙鏈(陰性對(duì)照)。曲線b:用于ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的熒光寡核苷酸(DNA)No16025/互補(bǔ)DNA耙(No16026)雙鏈。曲線c:用于ClipPhen-Cu混合物作用的熒光寡核苷酸(DNA)No16025(陰性對(duì)照)。曲線d:用于ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的熒光寡核苷酸(DNA)No16025。圖7:ClipPhen-Cu(與或不與抗壞血酸)對(duì)DNA或RNA雙鏈或RNA/DNA異源雙鏈的片段化比較。曲線被標(biāo)準(zhǔn)化為l。曲線a:用于ClipPhen-Cu混合物作用的熒光寡核苷酸(DNA)No16025/互補(bǔ)DNA耙(No16026)雙鏈(陰性對(duì)照)。曲線b:用于ClipPhen-Cu混合物作用的熒光寡核苷酸(RNA)No16027/互補(bǔ)RNA耙(No16028)雙鏈(陰性對(duì)照)。曲線c:用于ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的熒光寡核苷酸(DNA)No16025/互補(bǔ)DNA耙(No16026)雙鏈。曲線d:用于ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的熒光寡核苷(RNA)No16027/互補(bǔ)RNA耙(No16028)雙鏈。曲線e:用于ClipPhen-Cu混合物作用的熒光寡核苷酸(RNA)No16027/互補(bǔ)DNA耙(No16026)異源雙鏈(陰性對(duì)照)。曲線f:用于ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的熒光寡核苷酸(RNA)No16027/互補(bǔ)DNA革巴(No16026)異源雙鏈。圖8:在存在5mM抗壞血酸的條件下，由固定于Tentagel珠的ClipPhen-Cu切割16sRNA(13ng/uL)的生物分析儀(Agilent)觀察。電泳圖A:在水中降解之前的RNA靶。電泳圖B:在存在抗壞血酸條件下降解之前的RNA靶。電泳圖C:在存在抗壞血酸和固定于Tentagel樹(shù)脂的ClipPhen-Cu條件下降解的RNA耙(1個(gè)Tentagel珠，30分鐘)。實(shí)施例1:ClipPhen-Cu分子對(duì)轉(zhuǎn)錄物的水解及抗壞血酸的起始物作用目的本實(shí)施例證明了ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物對(duì)模型核酸(沙門氏菌RNA轉(zhuǎn)錄物1080堿基)的片段化作用。其還證明了抗壞血酸對(duì)片段化反應(yīng)起始的作用。將所述轉(zhuǎn)錄物用于多種濃度的ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物進(jìn)行作用。將對(duì)照也用于在缺乏抗壞血酸條件下的ClipPhen-Cu作用。隨后使用Agilent的生物分析儀對(duì)所述片段進(jìn)行分析(圖1)。操作程序轉(zhuǎn)錄物溶液(沙門氏菌野生型，1080堿基)是由2pl的于水中l(wèi)pM濃度的轉(zhuǎn)錄物和18|ul的pH7.2的80mM(毫摩爾)磷酸緩沖液、20mMMgCl2、100mMNaCl組成的。將該溶液加熱至70°C保持2分鐘然后投入冰中。然后，向5nl這一溶液中加入1^1ClipPhen-Cu(500，50和5pM)和4|nl上述使用的緩沖液。所得為溶液2并在37°C放置1小時(shí)。然后，取5nl溶液2并加入42.5^1緩沖液和2.5nl新配制的抗壞血酸溶液(對(duì)ClipPhen-Cu而言為100eq)或在對(duì)照情況下為水。由此，分別制備含有5nM轉(zhuǎn)錄物，(5pM，500nM和50nM)CIipPhen-Cu以及(500，50和5]liM)抗壞血酸的一系列管或在對(duì)照情況下為水。立即將lpl所述6種溶液注射在RNAPico芯片(參考號(hào)碼為5067-1512的商業(yè)試劑盒，Agilent，USA，用于Agilent,USA的生物分析儀系統(tǒng))上從而觀察片段化產(chǎn)物。結(jié)果與結(jié)論在柱5到7中，對(duì)于所述轉(zhuǎn)錄物的片段化作用可根據(jù)出現(xiàn)的低于20個(gè)核苷酸大小的各種條帶(在20秒時(shí)右側(cè)箭頭)來(lái)觀察。因此，經(jīng)過(guò)ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物處理的轉(zhuǎn)錄物部分或全部降解，作為ClipPhen-Cu濃度的函數(shù)。在5nM至0.5jxM之間，可觀察到初始條帶消失。采用5nM轉(zhuǎn)錄物，5一ClipPhen-Cu和500nM抗壞血酸，獲得完全降解全部擴(kuò)增子的反應(yīng)時(shí)間是30-60分鐘的量級(jí)。全部降解所述轉(zhuǎn)錄物所需的ClipPhen-Cu數(shù)量為微摩爾量級(jí)(柱5)。相反，未用抗壞血酸(柱2)進(jìn)行的相同實(shí)驗(yàn)清楚顯示完整的條帶。這因此證明了當(dāng)抗壞血酸未加入時(shí)(過(guò)量量級(jí)為l-100eq)，所述ClipPhen-Cu混合物沒(méi)有活性。實(shí)施例2:通過(guò)還原劑抑制ClipPhen-Cu分子目的本實(shí)施例旨在表明通過(guò)ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物對(duì)核酸的降解可以被加入過(guò)量的還原劑如DTT完全抑制。將模型熒光寡核苷酸(由Eurogentec(Liege，比利時(shí))合成的序列16025:與ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物的作用。通過(guò)片段化，其允許在520nm出現(xiàn)熒光，因?yàn)樗鯢AM熒光團(tuán)物理上與TARMA熒光淬滅劑有一定距離。熒光的出現(xiàn)是使用熒光計(jì)(NucliSenEasyQ分析儀，NasbaDiagnostic,BioMerieux，Boxtel(NL))隨時(shí)間進(jìn)行測(cè)量的。所述實(shí)驗(yàn)是針對(duì)固定濃度的ClipPhen/抗壞血酸使用增加濃度的DTT來(lái)進(jìn)行的，以測(cè)定通過(guò)弱化釋放的熒光而由DTT提供的抑制。操作程序?qū)⒑邢铝性囊幌盗泄茉?7°C保溫5分鐘*熒光寡核苷酸16025，10nM(1)Lil至200nM);*DTT(以在終體積中制備從1到16mM—系列濃度的lnl);以及*17pl磷酸緩沖液，80mM，pH7.2，MgCl220mM，NaCl100mM。然后，加入如下制備的lplClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物臨時(shí)制備的于50/50DMF/水中的200pMClipPhen和200pMCuCl2以及于水中的20rnM抗壞血酸(來(lái)自10mMClipPhen和1M抗壞血酸的濃縮溶液)。最后，所述20nl溶液含有10nM熒光寡核苷酸，10pMCIipPhen+Cu2+，lmM抗壞血酸和0/1/3/5/10/16mMDTT。對(duì)照是不使用抗壞血酸和不使用ClipPhen-Cu制備的。然后，將所釋放的熒光測(cè)定60分鐘(圖2)。條件如下exc/em濾器(485/518nm)，時(shí)間間隔(l分鐘)，積分時(shí)間(100ms)。使用所獲得的曲線，對(duì)所述反應(yīng)前兩分鐘的片段化反應(yīng)速率進(jìn)行了測(cè)定，還繪制了圖，即描述作為DTT濃度函數(shù)的片段化速率的圖3。結(jié)果與結(jié)論可以看出對(duì)增加的DTT濃度而言，從lOmM開(kāi)始不再出現(xiàn)熒光(圖2和圖3)。這意味著所述ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物的活性完全被過(guò)量的還原劑終止了。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了向核酸/ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物中加入10-16mM的DTT能夠終止所述反應(yīng)并使得該混合物符合于擴(kuò)增反應(yīng)的未來(lái)應(yīng)用。實(shí)施例3:ClipPhen在水溶液中的去除污染作用目的以200細(xì)胞當(dāng)量/ul量的蠟狀芽孢桿菌總RNA混合物污染的水溶液被用于與ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物(50nM/500nM)作用30分鐘去除污染。通過(guò)以10mM的量加入DTT使得ClipPhen-Cu的活性隨后被完全終止。然后，進(jìn)行了NASBA擴(kuò)增反應(yīng)(來(lái)自于bioMerieux的NuclisensBasic試劑盒V2，參考號(hào)碼60079136，Boxtel(NL))從而評(píng)價(jià)片段化效率并證明了可擴(kuò)增核酸的缺乏。在對(duì)這一混合物進(jìn)行擴(kuò)增之前無(wú)需進(jìn)行純化。制備了對(duì)照以測(cè)定此后的任意抑制作用，其中ClipPhen-Cu活性從tO就被抑制。至此，DTT是在加入靶RNA之前在充分的條件下(10mM)加入的并保溫30分鐘。操作程序?qū)Ω缓俁NA的水溶液通過(guò)ClbPhen-Cu/抗壞血酸混合物去除污染lOplClipPhen-Cu(250nM于水/DMF，50/50)，20|il水和10^1濃度為2.5mM于水中的抗壞血酸被加入蠟狀芽孢桿菌RNA的總RNA溶液中(以2000細(xì)胞當(dāng)量/ul水的5^1)。將該擬去除污染溶液在環(huán)境溫度下保溫30分鐘。終止ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物的片段化活性向前述溶液加入5inl173.7mMDTT(終DTT濃度17.3mM)從而終止水解反應(yīng)并滅活ClipPhen。獲得溶液A。對(duì)照表明ClipPhen-Cu/抗壞血酸/DTT混合物沒(méi)有片段化活性且如果通過(guò)加入DTT立即終止所述片段化活性則不抑制NASBA同時(shí)進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中蠟狀芽孢桿菌RNA的總RNA溶液在存在5|nl173.7mMDTT，10plClipPhen國(guó)Cu(250(iM在水/DMF50/50，20^1水和lOinl抗壞血酸，2.5mM于水中)的條件下保溫。將其中ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物被立即滅活的這類溶液在環(huán)境溫度下保溫30分鐘。這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以測(cè)定由ClipPhen-Cu/抗壞血酸/DTT混合物對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的任意抑制。此為溶液B。去除污染后對(duì)殘留于溶液A中且仍存在于溶液B中核酸的擴(kuò)增接下來(lái)，向5^1溶液A或B中加入10^"反應(yīng)混合物REAG"(來(lái)自NecliSensEasyQBasic試劑盒，bioMerieux，商業(yè)參考號(hào)碼285006，Boxtel(NL))。這樣的混合物含有擴(kuò)增所需的試劑，兩種引物以及檢測(cè)擴(kuò)增所需的探針。這樣的溶液還含有足量的DTT(6mM)以防止ClipPhen的反應(yīng)性。因此所述混合物的終濃度為lOmMDTT。所述溶液在65°C保溫2分鐘然后在41。C保溫2分鐘。然后，向前述溶液中加入5jli1來(lái)自BasicKitNucliSensbioMerieux"酶混合物ENZ"混合物以進(jìn)行擴(kuò)增。所述反應(yīng)介質(zhì)在bioMerieux的"NucliSensEasyQ，，熒光計(jì)(NucliSenEasyQ分析儀，NasbaDiagnostic,BioMerieux,Boxtel(NL))中在41。C保持了l小時(shí)30分鐘。記錄所述熒光檢測(cè)結(jié)果并繪制曲線(圖4)。結(jié)果與結(jié)論在對(duì)應(yīng)于通過(guò)加入DTT溶液立即抑制ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的對(duì)照的曲線B中觀察到了輕微的延遲。在擴(kuò)增中的這種延遲完全不會(huì)改變所述檢測(cè)的靈敏度，因?yàn)閿U(kuò)增起始的斜率是相同幅度的。這是因?yàn)閷?duì)陽(yáng)性對(duì)照而言DTT的濃度增加(曲線A)。在這種情況下，表明ClipPhen-Cu/抗壞血酸/DTT混合物對(duì)NASBA沒(méi)有作用且適于這一擴(kuò)增反應(yīng)的酶也不會(huì)受到這一化合物混合物的影響。此外，還表明DTT抑制ClipPhen-Cu的片段化活性，因?yàn)楫?dāng)加入足量的DTT之后，沒(méi)有觀察到降解活性。曲線C表示盡管ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物的活性已經(jīng)維持了30分鐘，然后通過(guò)加入DTT(17mM)終止，所述片段化依然終止以至于所述擴(kuò)增曲線不再延遲。在此已經(jīng)證明絡(luò)合物混合物(ClipPhen-Cu/抗壞血酸)可用于降解核酸，且這樣的活性可通過(guò)加入過(guò)量的DTT而終止，且這樣的溶液(沒(méi)有純化)可用于隨后的酶學(xué)擴(kuò)增。這一技術(shù)因此可方便地解決核酸污染的問(wèn)題。實(shí)施例4:ClipPhen-Cu對(duì)除了RNA的核酸的片段化；對(duì)單鏈DNA、雙鏈DNA和雙鏈RNA以及RNA/DNA異源雙鏈的應(yīng)用目的本實(shí)施例證明了ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物可降解單鏈RNA或DNA以及相應(yīng)的雙鏈或異源雙鏈。操作程序由熒光寡核苷酸(探針)和由Eurogentec訂購(gòu)的互補(bǔ)靶制備下表所示的溶液(表l)。表l:用于實(shí)施例4中的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>熒光寡核苷酸母液的濃度在水中為200nM，其在18^1的80mM磷酸緩沖液，pH7.2，MgCl220mM，NaCl100mM中被稀釋成10nM(lpl)。以相同濃度加入互補(bǔ)靶作為本實(shí)施例的功能。將所述溶液隨后變性，并在37。C放置1小時(shí)從而允許兩條鏈雜交。然后，在使用EasyQ(bioMerieux，參見(jiàn)實(shí)施例1)在37°C實(shí)施120分鐘的熒光測(cè)定之前，除了對(duì)照，還需加入ClipPhen-Cu溶液(luL至20pM在水/DMF中，[終ClipPhen-Cu]=lpM)，然后是抗壞血酸溶液(1^1至2pM在水中，[終抗壞血酸]-100i^M)。根據(jù)所對(duì)應(yīng)的不含有抗壞血酸的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，這些測(cè)定進(jìn)行4次。將平均值列示于圖5，6禾口7。表2:用于實(shí)施例4中的寡核苷酸混合物ODN混合物在緩沖液中的ClipPhen-Cu抗壞血酸摩爾濃度(mM)摩爾濃度熒光DNA探160251010100針熒光RNA探160271010100針DNA/DNA16025/1602610/1010100RNA/RNA16027/1602810/1010100RNA/DNA16027/1602610/1010100結(jié)果與結(jié)論圖5所示為與ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的對(duì)單鏈熒光DNA(16025，曲線a)或熒光RNA(16027，曲線b)隨時(shí)間進(jìn)行熒光測(cè)定的結(jié)果。在兩種情況下，與對(duì)照相比(曲線c和d)都可觀察到非常清楚的熒光增加。這種熒光的出現(xiàn)證明了DNA以及RNA都被片段化了且熒光的出現(xiàn)在反應(yīng)的最初瞬間是以相當(dāng)?shù)乃俾蔬M(jìn)行的。圖6所示為DNA/DNA雙鏈的片段化。在DNA/DNA雙鏈的形成過(guò)程中(曲線a和b)，我們觀察到與單鏈對(duì)照相比(曲線c和d)熒光水平升高6倍。這種升高并非由于ClipPhen-Cu，而是因?yàn)閮蓷l鏈之間的雜交。從抗壞血酸加入的瞬間開(kāi)始可觀察到在曲線b中熒光的下降，其達(dá)到了曲線d的熒光水平，對(duì)應(yīng)于全部切割的單鏈所釋放的熒光。與對(duì)照相比，熒光的修飾清楚地表明單鏈DNA和雙鏈DNA/DNA是以完全類似的方式進(jìn)行切割的。最終，我們?cè)u(píng)估了作為被片段化的核酸是雙鏈RNA或RNA或RNA/DNA異源雙鏈的函數(shù)的片段化速率的區(qū)別(圖7)。在這種情況下，對(duì)于3種對(duì)照及圖6所示，我們根據(jù)雙鏈的形成觀察到了熒光的增加，在隨后通過(guò)加入抗壞血酸誘導(dǎo)的片段化中觀察到了熒光的降低，達(dá)到了完全切割的單鏈的熒光水平。在所有情況下且不考慮雜合體的性質(zhì)時(shí)，片段化發(fā)生，說(shuō)明ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物完全適合于降解任意類型的核酸。實(shí)施例5:固定于固相支持物上片段化分子的去除污染作用目的為了將ClipPhen固定于固相支持物并證明其活性在固定于Tentagel聚苯乙烯珠(商品參考號(hào)碼MB250002，RappPolymers,德國(guó))之后依然能夠保持。操作程序?qū)?1.5mgTentagelNH2大珠(macrobead)(商品參考號(hào)碼MB250002，RappPolymers,德國(guó))放置于SnapFit柱(ABI，美國(guó))或Handee離心柱(參考號(hào)碼69705，Pierce,美國(guó))中，相當(dāng)于n=16.6pmol。用無(wú)水二甲亞砜(DMSO)洗滌珠從而去除任何可能存在的痕量水。萃取DMSO。將其放置于氬氣流。用于600pl無(wú)水DMSO中的14pl三乙胺(6eq，99pmol，-150mM)滲濾(l分鐘)。這一步驟確保胺基團(tuán)是以適當(dāng)?shù)腘H2形式而非NH/形式存在。所述溶液用三乙胺提取。用于400]Li1無(wú)水DMSO中的36.4mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)(6當(dāng)量，99pmol，-250mM，Pierce)滲濾(10分鐘)。萃取含有過(guò)量DSS的溶液。對(duì)在所述反應(yīng)這一階段的取出的幾個(gè)珠進(jìn)行了茚三酮檢測(cè)，從而確保所有胺官能團(tuán)都與連接物反應(yīng)了。如果不是這種情況，珠子會(huì)變成藍(lán)色。將含有以下成分的反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下滲濾至少1小時(shí)(1小時(shí)15分鐘-1小時(shí)30分鐘)于800^1DMSO中的3-ClipPhen(2.8叫，45pmol，56mM)，4-二甲基氨基吡啶(2.8eq，45|nmol，56mM)，6.3|il三乙胺(2.8eq，45|umol，56mM)。有可能在反應(yīng)之前和之后取出幾pl反應(yīng)混合物以在328nm在UV下的微分分析來(lái)確定珠官能化的程度。由于3-ClipPhen，所述反應(yīng)混合物具有棕色。用無(wú)水DMSO進(jìn)行洗滌直到洗滌溶液中的這種棕色消失。初始黃色的珠所具有的黃色在反應(yīng)之后略微變暗。將于SO(HiI無(wú)水DMSO中的5.9^1乙醇胺(10eq，99nmol，-130mM)加入以滅活所有未反應(yīng)的NHS基團(tuán)。允許反應(yīng)10分鐘。用1mlDMSO洗滌珠5次，然后用DMSO提取。用乙腈重復(fù)相同的操作(為了能夠干燥珠)。用氬沖洗，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)。與銅絡(luò)合用于50/50DMSO/水中的lml的1MCuCV溶液滲濾(對(duì)55mg珠，即相對(duì)于官能化程度的145當(dāng)量)10分鐘。用DMSO和水洗滌直到洗滌液無(wú)色(如果初始CuCl2溶液有色)，然后用乙腈洗。用氬沖洗。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)。切割檢測(cè)如下進(jìn)行向Eppendorf管(最大容量200nl)中加入需要量的樹(shù)脂，于lmg與單個(gè)珠之間，即引入125nmol的ClipPhen/12.5mMTentage的量(即引入1.25-2.5nmol的ClipPhen/125uM-250uM的量)。向所述樹(shù)脂中加入靶RNA(1600堿基16sRNA轉(zhuǎn)錄物，根據(jù)實(shí)驗(yàn)濃度介于6-70ng/pL)，類似地以所需的濃度(5mM)加入抗壞血酸。樣本的總體積為IO^iL;所使用的緩沖液是pH7.4的tris緩沖液，終濃度為20mM。一個(gè)Tentagd樹(shù)脂珠就足以觀察切割。制備了與ClipPhen-Cu絡(luò)合物對(duì)照樣本偶聯(lián)的"單獨(dú)靶"(圖8電泳圖A)，"存在有抗壞血酸的靶(電泳圖B)"，"存在有樹(shù)脂的靶"。"存在有樹(shù)脂的靶"對(duì)照意味著所使用抗壞血酸的量對(duì)熒光沒(méi)有作用這一事實(shí)可以被檢測(cè)。根據(jù)所使用的靶，在放入AgilentRNA6000Nanochip(商業(yè)參考號(hào)碼為5067-1512的商業(yè)試劑盒，Agilent,美國(guó))之前將所制備的樣本在環(huán)境溫度攪動(dòng)30分鐘(lOOOrpm)。lpl上清液足以在生物分析儀(Agilent,美國(guó))上進(jìn)行分析。結(jié)果與結(jié)論所得結(jié)果與圖8所示(電泳圖C)表明只有在存在抗壞血酸，最少量樹(shù)脂(僅僅1珠Tentagd，即假定lmg樹(shù)脂含有50-100珠，支持ClipPhen的量為1.25-2.5nmol，即濃度范圍為125-250^M)的情況下，在半小時(shí)之內(nèi)確實(shí)發(fā)生了對(duì)靶的切割。在RNA模型上這樣的切割是非常容易觀察到的，因?yàn)樗a(chǎn)生的片段在電泳圖上是可見(jiàn)的(電泳圖C)。因此，證明了固化的ClipPhen依然具有活性并保持了其核酸降解性質(zhì)。實(shí)施例6:去除含有污染核酸和感興趣核酸的溶液的污染的證明目的為了消除以較少量存在且由病毒衣殼保護(hù)的沒(méi)有降解存在的病毒核酸的病毒培養(yǎng)物上清中發(fā)現(xiàn)的"基因組細(xì)胞DNA"污染物，其目的在于在不抑制感興趣靶的特異性擴(kuò)增條件下降低從細(xì)胞DNA發(fā)生的非特異性擴(kuò)增。為此，在ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用之前和之后，對(duì)上清中的基因組18SDNA濃度進(jìn)行了分析(SearchLC+基因組DNA商業(yè)分析試劑盒，Promega，商業(yè)參考號(hào)碼G3041，美國(guó))以產(chǎn)生一定范圍的稀釋。同時(shí)，在ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用之前和之后的病毒RNA的濃度也通過(guò)PCR用特異性異物和用LightCycler，SybrGreen(Roche，美國(guó))進(jìn)行了分析。操作程序?qū)⒏腥玖瞬《镜募?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，使用KitSearchLC對(duì)上清中殘留的基因組DNA(18S)進(jìn)行分析(下表中的條目B)。還使用LightCycler(Roche)測(cè)定了相應(yīng)于所述病毒的核酸的量(使用特異性引物的擴(kuò)增技術(shù))(下表中的條目B)。在其他實(shí)驗(yàn)中(下表中的條目A)，將上清用于ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物(ClipPhen-CuIOO一，抗壞血酸50mM，30分鐘，用2.5M終濃度DTT滅活)作用30分鐘，然后測(cè)定殘留基因組DNA(18S)的量以及相應(yīng)于所述病毒的核酸的量。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>結(jié)果與結(jié)論在該情況中可觀察到在病毒核酸的濃度基本未受到影響的條件下，采用切割物質(zhì)處理的上清中基因組DNA的濃度降低了10倍(條目A)。通過(guò)基本上降低背景噪音，這項(xiàng)技術(shù)因此能夠增強(qiáng)分析病毒核酸的靈敏度。權(quán)利要求1.一種去除溶液中存在的任意核酸的污染的方法，所述方法包括以下步驟-將所述溶液與由形成雙(1，10-菲咯啉)/金屬絡(luò)合物的結(jié)合于金屬原子的兩個(gè)1，10-菲咯啉分子所構(gòu)成的絡(luò)合物所形成的至少一種片段化分子作用充分時(shí)間，直到所述核酸完全降解；以及-通過(guò)加入以下物質(zhì)終止所述片段化分子的活性●過(guò)量的有機(jī)還原劑；或●絡(luò)合物質(zhì)，例如EDTA。2.—種去除含有污染核酸及感興趣核酸的溶液的污染的方法，包括以下步驟-將所述溶液與由形成雙(1，10-菲咯啉)/金屬絡(luò)合物的結(jié)合于金屬原子的兩個(gè)l,10-菲咯啉分子所構(gòu)成的絡(luò)合物形成的至少一種片段化分子作用充分的時(shí)間，直到所述污染核酸完全降解，同時(shí)保留感興趣的核酸；以及-通過(guò)加入以下物質(zhì)終止所述片段化分子的活性*過(guò)量的有機(jī)還原劑；或*絡(luò)合物質(zhì)，例如EDTA。3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于在終止所述片段化分子的活性之后，所述方法還含有由擴(kuò)增反應(yīng)組成的補(bǔ)充步驟。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述金屬是過(guò)渡金屬，例如銅，釕，鎳，鐵，鋅，銠，鈷或錳。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述片段化分子的兩個(gè)菲咯啉核通過(guò)連接臂相互連接形成ClipPhen分子。6.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于兩個(gè)菲咯啉核之間的連接臂是由三個(gè)連續(xù)碳原子的鏈構(gòu)成的，其中在中間位置的碳原子是取代的且其中每個(gè)末端碳原子都通過(guò)氧原子連接于菲咯啉核。7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于在中間位置的碳原子是由-NH2或-NH-CO-CH3取代的且每個(gè)末端碳原子都通過(guò)所述核上的2位或3位的氧原子連接于菲咯啉核。8.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述ClipPhen分子是3-ClipPhen(1,3-雙(1,10-菲咯啉-3-基氧基)丙-2-胺)。9.一種去除溶液中存在的任意核酸的污染的方法，所述方法包括將所述溶液與ClipPhen/金屬分子作用充分時(shí)間，直到稱為污染核酸的所述核酸完全降解。10.—種去除含有污染核酸和感興趣核酸的溶液的污染的方法，包括將所述溶液與ClipPhen/金屬分子作用充分的時(shí)間，直到所述污染核酸完全降解，而保留感興趣的核酸。11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述片段化分子是結(jié)合過(guò)氧化氫1^202的1型銅絡(luò)合物，并任選具有其他還原劑，優(yōu)選有機(jī)還原劑。12.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述片段化分子是優(yōu)選結(jié)合于其他有機(jī)還原劑的II型銅絡(luò)合物。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)中所述的還原劑或權(quán)利要求11或12中所述的其他還原劑是有機(jī)還原劑，由以下組成*硫醇如二硫蘇糖醇(DTT)，硫代酸如巰基丙酸；或*羧酸；或*羧酸的衍生物如抗壞血酸；或*磷化氫如三羧乙基磷化氫(TCEP);或*至少兩種所述有機(jī)還原劑的組合。14.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述片段化分子被固定于固相支持物上。15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)中所述的還原劑或權(quán)利要求11或12中所述的其他還原劑被固定于固相支持物上。16.權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于所述固相支持物是顆粒，膜，條，薄膜或?yàn)V器。17.權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于所述片段化分子與由羧酸或羧酸衍生物組成的其他有機(jī)還原劑之間的比例在1比1到1比100的范圍內(nèi)。18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段化分子與權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)中所述的、由硫醇組成的還原劑之間的比例大于l比100，優(yōu)選地大于1比1000。19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于除了核酸外，所述溶液含有用于擴(kuò)增反應(yīng)必需的全部成分，艮口*靶；*擴(kuò)增引物；以及*檢測(cè)探針。20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于被處理的所述核酸是單鏈或雙鏈形式的RNA或DNA、以及RNA/DNA異源雙鏈。21.權(quán)利要求l-19任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于對(duì)于ClipPhen/金屬的濃度范圍為l(iM到100pM而言，所述被處理的核酸所經(jīng)受的處理時(shí)間范圍為5到60分鐘，優(yōu)選范圍為10到30分鐘。22.采用權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述方法處理的溶液的用途，其特征在于在權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)中所述的有機(jī)還原劑存在的條件下，將所述溶液與含有擬進(jìn)行擴(kuò)增的耙核酸、以及所述靶核酸特異性的擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針的生物學(xué)樣品混合，從而產(chǎn)生終止所述片段化分子活性的過(guò)量有機(jī)還原劑。23.權(quán)利要求22所述的用途，其特征在于權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)中所述的有機(jī)還原劑與權(quán)利要求11或12中所述的其他有機(jī)還原劑相同。24.權(quán)利要求22所述的用途，其特征在于權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)中所述的有機(jī)還原劑不同于權(quán)利要求11或12中所述的其他有機(jī)還原劑。全文摘要本發(fā)明涉及去除溶液中含有的任意核酸的污染的方法，包括以下步驟將所述溶液與具有通過(guò)片段化降解核酸即片段化分子的性質(zhì)的至少一類分子相作用充分的時(shí)間，直到所述核酸完全降解，即產(chǎn)生污染核酸，并終止所述片段化分子的活性。本發(fā)明還涉及以這種方法處理的此類溶液的用途。本發(fā)明優(yōu)選用于診斷領(lǐng)域。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101646785SQ200880010629公開(kāi)日2010年2月10日申請(qǐng)日期2008年3月28日優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日發(fā)明者A·勞倫特,A·拉尤,G·帕拉尼奧斯-巴卡拉申請(qǐng)人:生物梅里埃公司