專利名稱：：結腸癌的早期檢測和預后的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及癌癥診斷和治療的領域。特別地，它涉及在結腸癌和初癌(pre-cancer)中特定基因的異常甲基化模式(形式，pattern)。
背景技術：
：DNA甲基化和它在癌發(fā)生中的作用制造所有活生物的細胞的信息包含在它們的DNA中。DNA是由四個堿基的獨特序列組成，四個堿基為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。在形成DNA雙螺旋的兩條鏈上，這些堿基A與T和G與C配對。這些堿基對的鏈存儲制造分組成被稱為基因的區(qū)域的具體分子的信息。在每一個細胞里面，具有控制什么基因被開啟或表達的程序，從而確定每個細胞的獨特功能。這些控制機制之一是通過將甲基加到胞嘧啶(C)上而提供。甲基標記的C可以寫成mC。DNA甲基化在確定是否一些基因被表達或者不被表達中起到重要的作用。通過關閉不需要的基因，DNA甲基化是生物體正常發(fā)育和發(fā)揮功能的必不可少的控制機制?？蛇x地，異常的DNA甲基化是引起隨著老化和多種癌癥的發(fā)生而觀察到的變化的機制之一。癌癥在過去與在DNA內由染色體突變引起的基因變化聯系起來。突變一一遺傳性的或獲得性的——可以導致對于維持健康狀態(tài)至關重要的基因表達的喪失?，F在證據支持，相當大數量的癌癥由不適宜的DNA甲基化，頻繁接近的DNA突變所引起。在許多情況下，DNA的過度甲基化不正確地關閉至關重要的基因例如腫瘤抑制基因或者DNA修復基因，從而使得癌癥能夠發(fā)生和進展。這種控制基因表達的非突變過程被描述為外因遺傳學(或表觀遺傳學，epigenetics)。DNA甲基化是通過稱為甲基轉移酶的酶來進行的DNA化學修飾，在其中甲基基團(m)被加到DNA的某些胞嘧啶(C)。這種非突變的(外遺傳的)過程(mC)是基因表達調控中的關鍵因素，參見J.G.Herman,SeminarsinCancerBiology,9:359-67，1999。雖然基因甲基化的現象已經引起癌癥研究者的注意有一段時間，但是它在人的癌癥發(fā)展中的真正作用剛被認識到。在正常的細胞中，甲基化主要發(fā)生在具有很少CG堿基重復的DNA區(qū)域中，而CpG島，具有長CG堿基重復的DNA區(qū)域，仍然保持非(未)甲基化?？刂频鞍妆磉_的基因啟動子區(qū)域通常是富含CpG島的。在啟動子區(qū)域中這些正常的非甲基化CpG島的異常甲基化導致在人癌癥中某些腫瘤抑制基因表達的轉錄失活或者沉默。在腫瘤細胞中的過度甲基化的基因對于腫瘤來源的組織是非常特異的。所有類型癌癥的分子特征可以用于改進癌癥的檢測、癌癥風險的評估和對治療的反應。啟動子過度甲基化事件為這些目的提供了一些最有希望的標記。啟動子基因過度甲基化有希望的腫瘤標記關于特定啟動子基因的過度甲基化的信息可以有益于各種癌癥的診斷、預后和治療。特定基因啟動子區(qū)域的甲基化可以在早期和經常在癌發(fā)生中出現，使得這些標記成為癌癥診斷的理想靶標。甲基化模式是腫瘤特異的。陽性信號總是在基因的相同位置被發(fā)現。實時PCR為基礎的方法是高度靈敏的、定量的和適合于臨床使用。DNA是穩(wěn)定的和發(fā)現在容易獲得的流體(例如血清、痰、糞便、血液和尿)和石蠟包埋組織中是完整的。一系列有關的基因標記可以覆蓋大多數人類癌癥。診斷改善在癌癥患者中的臨床結果的關鍵是在癌癥的最早階段的診斷，在此期間癌癥仍然是局部的和容易治療的。上文提到的特征通過在分子基礎上鑒定較高風險患者提供了更準確地篩查和監(jiān)測計劃的手段。它也為對患者進行更明確的隨訪(followup)提供了理由，所述患者具有與惡性病相關的分子特征，但是還沒有與惡性病相關的所有病理或者臨床特征。在目前，結腸直腸癌的早期檢測是通過以下幾種方法來進行的(l)"糞便潛血試驗"(FOBT)，它具有非常低的靈敏度和特異性，(2)乙狀結腸鏡檢查和/或結腸鏡檢查，它具有侵入性并且是昂貴的(以及供應有限)，(3)在雙重對比鋇餐灌腸后的X射線檢査，其僅允許檢查相當大的息肉，或者CT-結腸鏡檢查(也被稱為虛擬結腸鏡檢查)，它仍然是實驗性的，和(4)稱為PreGen-Plus的基因突變分析試驗(ExactSciences;LabCorp)，它是昂貴的且靈敏度有限。預測治療反應[13]關于癌癥如何通過分子事件發(fā)展的信息將使得臨床醫(yī)生能夠更準確地預測這種癌癥對特定的化療劑可能怎樣反應。這樣，根據腫瘤的化學敏感性的知識可以理性地設計治療方案(regimen)。研究已經顯示，在神經膠質瘤患者中的MGMT啟動子的過度甲基化表明對治療的良好反應、更大的總生存率和進展需要更長時間?，F在充分確立了，在人的癌癥中正確基因功能的喪失可以通過遺傳和外遺傳機制來發(fā)生(1、2)。在人的腫瘤樣品中突變基因的數量正在被闡明。最近，Sj5blom等(3)測序了在結腸直腸癌(CRC)和乳腺癌中的13,023個基因，發(fā)現每個腫瘤平均11個突變，這提示了相對少量的遺傳事件可能足夠促使腫瘤發(fā)生。相比之下，外遺傳改變的整個圖譜沒有被充分描述。最詳細說明的癌基因外遺傳學改變涉及在與受影響基因的轉錄失活相關的啟動子區(qū)域中，成簇的CpG二核苷酸或者CpG島的DNA過度甲基化。這些啟動子接近所有基因的幾乎一半而定位(4)，并且認為這些啟動子在正常的體細胞組織中基本上保持無甲基化。在任何特定的腫瘤中的這種外遺傳損害的精確數量不是準確已知的，雖然不斷增加數量的隨機篩查方法正在鑒定不斷增加數量的候選基因(5-12)，但是這些方法中沒有一個方法有效覆蓋全基因組?？紤]到在基因組中存在大量潛在目標啟動子，我們假定還有很多過度甲基化的基因等待發(fā)現(13)。在本領域中有對改善患者護理管理的針對癌癥的新的診斷和預后標記以及治療耙標的持續(xù)的需求。發(fā)明概述依照本發(fā)明的一方面，提供鑒定結腸直腸癌或者它的前體、或結腸直腸癌傾向的方法。在含有結腸直腸細胞或者來自結腸直腸細胞的核酸的試樣中檢測外遺傳沉默。外遺傳沉默是選自以下的至少一個基因BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GP雇B、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。當外遺傳沉默被檢測到時，試樣被鑒定為含有細胞，所述細胞是瘤性的(增殖性的)、瘤的前體、或易于形成瘤，或者鑒定為含有來自細胞的核酸，所述細胞是瘤性的、瘤的前體、或易于形成瘤。依照本發(fā)明的另一個方面，提供了減少或者抑制細胞瘤性(增殖性)生13長的方法，所述細胞顯示了與癌癥相關的至少一種基因的外遺傳沉默的轉錄。外遺傳沉默的基因在細胞中被確定。所述基因選自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GP顧B、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。通過將細胞與一種或者多種試劑接觸恢復外遺傳沉默基因編碼多肽在細胞中的表達，所述試劑選自CpG二核苷酸脫甲基劑、DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑。不受調節(jié)的細胞生長因而被減少或者抑制。本發(fā)明的另一方面是減少或抑制細胞的瘤性生長，該細胞顯示了與癌癥相關的至少一種基因的外遺傳沉默轉錄。外遺傳沉默基因在細胞中被確定。所述基因選自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3禾nZNF655。編碼多肽的多核苷酸被引入到細胞中。多肽被所述基因表達。多肽在細胞中被表達，因而恢復多肽在細胞中的表達。本發(fā)明的還另一方面是治療癌癥患者的方法?；颊叩陌┘毎淮_定具有選自以下的外遺傳沉默的基因BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、F0XL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、祌經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、脂F182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。一種或者多種選自CpG二核苷酸脫甲基劑、DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑的試劑以足夠量給予患者，以恢復在患者的癌細胞中外遺傳沉默基因的表達。本發(fā)明的還另一方面是治療癌癥患者的方法?；颊叩陌┘毎淮_定具有選自在以下顯示的外遺傳沉默的基因BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、認F182、ICAM5、A腹CX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、IXR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEI、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPON1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。編碼多肽的多核苷酸被給予患者。多肽由外遺傳沉默的基因編碼。多肽在患者的腫瘤中進行表達，從而恢復多肽在癌癥中的表達。依照本發(fā)明的另一方面，提供了選擇治療癌癥患者的治療策略的方法?；虮昏b定，該基因在患者癌細胞中的表達通過CpG二核苷酸脫甲基劑、DNA甲基轉移酶抑制劑或者組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑再激活?；蜻x自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、F0XL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。為癌癥患者選擇治療劑，該治療劑增加基因的表達，用于治療所述癌癥患者。本發(fā)明的另一個實施方式是評估試樣中甲基化的試劑盒。試劑盒包括至少以下試劑(a)修飾甲基化的胞嘧啶殘基、但不修飾非甲基化的胞嘧啶殘基的試劑，或者(b)修飾非甲基化的胞嘧啶殘基、但不修飾甲基化的胞嘧啶殘基的試劑；和一對寡核苷酸引物，其在擴增條件下與大約lkb的所述基因轉錄起始位點內的基因區(qū)域特異性雜交，所述基因選自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GP畫B、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XE1、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655中顯示的基因。附圖簡述和表格圖1A-1E.在HCT116CRC細胞中鑒定人癌細胞的過度甲基化組(hypermethylome)的方法。(圖1A)來自標示細胞系的RNA被分離、標記、雜交、掃描，以及熒光點強度通過減去背景來歸一化和使用AgilentTechnologies44K人微陣列進行黃土轉變(Loesstransformation)。在我們的研究中比較了親本野生型HCT116細胞(WT)和DNA甲基轉移酶1(DNMTW-)或者3b(DNMT3b-/0的同基因敲除對應物。DKO細胞對于DNMT1和DNMT3b是雙重缺陷的。(圖IB)在具有各種DNA甲基轉移酶的遺傳中斷的HCT116細胞中，基因表達變化。三維散布圖以對數單位指出了在HCT116細胞中的基因表達水平，所述細胞具有DNMTs1(X軸)、3b(Z軸)和兩種DNMT(DKO;Y軸)的遺傳中斷。對于DKO細胞中具有大于4倍表達變化的那些基因，單個基因表達的變化為黑色，對三個實驗的平均值(紅色點)或者來自單個實驗(藍色點)。(圖1C)HCT116細胞用300nM曲古柳菌素A(TSA)處理18小時或者用5pM的5-脫氧氮雜胞苷(DAC)處理96小時，如前所述處理。(圖ID)對于用TSA(X軸)或者DAC(Y軸)處理的HCT116細胞的基因表達變化通過倍數變化來繪圖。黃色點指出來自DKO細胞具有2倍和2倍以上變化的基因。當與在DKO細胞中看到的基因表達增加比較時(在DKO細胞中大于2倍現在變成了在DAC處理的細胞中大于1.3倍)，注意到敏感性的喪失。綠色點指出了隨機選擇的基因，其已被證實在野生型細胞中具有完整的啟動子甲基化、在DKO細胞中和在AZA處理后的重新表達，而紅色點指出了經鑒定為假陽性的選擇基因(參見確認結果的圖5(S2))。藍色點指出了11種引導基因的位置——這11種引導基因在先前表現為過度甲基化的和在這個研究中使用的HCT116細胞中為完全沉默的(參見圖4(SI)的描述)。包括11種引導基因中的5種的獨特組的基因顯示了在用DAC處理后大于2倍的增加、而用TSA處理后沒有增加。這些基因形成了在文本中討論的候選過度甲基化基因的頂部列。(圖IE)通過樹狀圖分析來鑒定全轉錄物組表達型的關聯性。DNMT1和3b、DKO的個體單個遺傳中斷以及DAC處理和TSA處理各自形成三個不同類別的基因表達變化。16[24]圖2A-2C.在不同的人CRC細胞系中表征人癌細胞過度甲基化組。(圖2.A)用TSA(X軸)或者DAC(Y軸)處理的指示細胞的基因表達變化通過倍數變化來繪圖，單個基因用黑色來顯示。(圖2B)DNA過度甲基化組的確認。由用DAC或者TSA處理細胞來限定的過度甲基化基因的特有峰(spike)由2個具有不同特征的層組成。上層基因鑒定為這樣的區(qū)域，在該區(qū)域中，基因表達不隨著TSA增加(<1.4倍)，并且在野生型細胞中沒有顯示出可檢測的表達，但是用DAC處理后有大于2倍的增加。下層的基因被鑒定為一組基因，其表達變化與在上層中的相同、但是用DAC處理增加1.4倍至2倍之間。通過RT-PCR和MSP確認基因表達，表明在HCT116細胞中上層基因86%的確認頻率，包括在DKO細胞中增加2倍以上的基因。在HCT116細胞中下層基因被確認在49%的頻率，和在SW480上層中具有65%的頻率。(圖2C)在CRC細胞系中共有的候選過度甲基化基因。我們鑒定了在所有6個細胞系中具有落入上層或者下層類別標準的表達變化的總共5,906個基因。指出了在2、3、4、5或者6細胞系當中基因表達變化的重疊；這些的范圍從2個細胞系中共有的1414個基因，到6個細胞系中共有的78個基因。圖3A-3E.在人腫瘤樣品中過度甲基化和基因突變頻率的比較。(圖3A)在人組織樣品中驗證的過度甲基化組基因的甲基化分析。來自驗證的基因清單的二十種基因從HCT116上層(BOLL、DDX43、DKK3、FOXL2、HoxDl、JPH3、Nef、神經化的、PPPlR14a、RAB32、STK31、TLR2)、HCT116下層(SalL4、TP53AP1)或者SW480上層(ZFP42)中隨機地選擇，并且分析在CRC細胞系(白色柱)、正常結腸(紅色柱)或者原發(fā)性腫瘤(綠色柱)中的甲基化。甲基化的百分比在Y軸上示出，和縮寫的基因名稱在X軸上。我們測試了至少6種不同的細胞系、來自非癌癥患者的16到40個結腸樣品和18到61個之間的原發(fā)性CRC樣品的每種基因。(圖3B)CAN基因的甲基化分析。56種基因鑒定為重疊了過度甲基化組和CAN基因列單，包括含有CpG島的45種基因。來自這個列單的、在細胞系中具有甲基化的選擇的基因(26種基因)，被在分析在正常結腸(圖3B)和原發(fā)性CRC(圖3C)中的甲基化。這些基因的甲基化頻率以百分比顯示。(圖3D)重疊了CAN和過度甲基化組基因列單的13種基因的甲基化和突變之間的關系。(圖3E)在人癌癥中基因失活機制的模型。圖4A-D.(Sl).在這個研究中使用的引導基因。(圖4A)先前顯示在HCT116細胞中被過度甲基化和完全沉默的U種引導基因的基因名稱、AgilentTechnologies探針名稱、Genbank登錄號和參考。(圖4B)藍色點和基因名稱指出在TSA(X軸)對DAC(Y軸)基因表達變化圖中或者在(圖4C)DKO(X軸)對單個敲除(Y軸)基因表達變化的圖中的ll種引導基因的位置，以對數表示。用綠色圈出的11種引導基因中的5種在用AZA處理后顯示了大于2倍的增加，但是用TSA處理后沒有增加，這些同樣的基因并且在DKO細胞中(綠色圓圈)中有大于3倍的增加。(圖4D)在DKO和DAC圖中引導基因的直接比較。由綠色圓圈示出的不同組的5種引導基因限定了如在本文中所討論的候選過度甲基化基因的上層，5種引導基因在DKO細胞中顯示出大于3倍的表達變化和在DAC處理的細胞中顯示出大于2倍的表達變化。在用DAC處理后增加1.3倍的另外三種基因和未增加的3種基因允許基因表達的下層的標準建立起來，如在文中所述。[27]圖5.(S2).在HCT116細胞中35種上層基因的基因表達和甲基化確證。HCT116候選過度甲基化基因的清單，其被選擇用于表達(通過HCT116和DKO細胞的RT-PCR)和啟動子甲基化(通過HCTU6和DK0細胞的MSP)狀況的確證?；蛎枋鲈趫D的左邊示出，基因名稱在PCR結果后示出。水(RT-PCR和MSP)、在體外甲基化DNA(MSP的IVD)和肌動蛋白B(ACTB)用為每一單個基因的對照；顯示了代表性的樣品。綠色箭頭鑒定驗證了陣列結果的基因，紅色箭頭鑒定那些沒有驗證陣列結果的基因。圖6.(S3.)35種HCT116候選下層基因的清單，其被選擇用于確證表達(通過HCT116和DKO細胞的RT-PCR)和啟動子甲基化(通過HCT116禾nDKO細胞的MSP)狀況。在圖的左邊示出了基因名稱，基因名稱在PCR結果后面顯示。水(RT-PCR和MSP)、體外甲基化DNA(MSP的IVD)和肌動蛋白B(ACTB)用作每一單個基因的對照；顯示了代表性的樣品。綠色箭頭鑒定驗證了陣列結果的基因，紅色箭頭鑒定那些沒有驗證陣列結果的基因，如文中所論述地。圖7.(S4.)48種SW480候選上層基因的清單，其被選擇用于確證表達(通過SW480禾PDAC處理的SW480細胞的RT-PCR)和啟動子甲基化(通過SW480和DAC處理的SW480細胞的RT-PCR)狀況。在圖的左邊指出了基因名稱，基因名稱在PCR結果后面顯示。水(RT-PCR)、體外甲基化DNA(MSP的IVD)和肌動蛋白B(ACTB)用作每一單個基因的對照；顯示了代表性的樣品。綠色箭頭鑒定驗證了陣列結果的基因，紅色箭頭鑒定那些沒有驗證陣列結果的基因，如文中所論述地。圖8.(表S1.)過度甲基化組大小的定量估計。細胞系和層在左邊指出，和每層中鑒定的基因表達變化的數量也被示出。關于每層候選過度甲基化基因庫的大小的計算通過每層鑒定的基因表達變化乘以0.86(HCT116的上層)、0.65(SW480、CaC02、HT29、COLO320和RKO的上層)或者0.49(HCT116、SW480、CaC02、HT29、COLO320和RKO下層)來進行。這些分數代表了實驗所確定的確認頻率，如在本文所描述的。HCT116過度甲基化組大小的估計源于如下532的86%=457上層基因加上1190的49%=583下層基因；457+583=1040。依照如下計算，SW480過度甲基化組估計在579個基因318上層的66%=207和759下層的49%=372;207+372=579。過度甲基化組基因清單和在乳腺癌或者結腸癌中突變的基因之間的重疊在右邊顯示。18[31]圖9.(表l)關于在序列表中的序列的信息?；蚓幪柣蛄魉?。基因名稱在專利中使用的基因名稱?；騃D:NCBI系統(tǒng)的基因ID。與基因ID相關的轉錄物ID:來自ENSEMBL注釋系統(tǒng)的所有轉錄物IDs，與具有相同TSS[轉錄起始位置；注意，基因ID可以具有多個TSS，因而多轉錄物IDs通過它們的TSS來分組]的特定基因ID相關。SEQIDNO:l-125:基因組序列前后序列(從轉錄物TSS的5'1000bp，到轉錄物TSS3'的200bp);如在NCBIbuild36中發(fā)現的基因組DNA序列。SEQIDNO:126-250:亞硫酸氫鹽轉化形式的序列，假設所有CpG二核苷酸的全甲基化存在。圖10-截止比(ratiocut-off)20的散射圖BNIP3。圖11-截止比20的散射圖F0XE1。圖12-截止比100的散射圖SYNE1。圖13-截止比300的散射圖SOX17。圖14-截止比20的散射圖JAM3。圖15-截止比150的散射圖MMP2。說明這個標記在76個對照和卯個病例中進行了測試。圖16-截止比150的散射圖GPNMB。說明這個標記在76個對照和90個病例中進行了測試。發(fā)明詳述我們描述了人類全轉錄物組微陣列篩査來鑒定在人類CRC中被啟動子過度甲基化所沉默的基因。這種方法容易以高的證實效率在單個腫瘤中鑒定候選癌基因。通過比較一系列候選過度甲基化基因與最近在CRC(3)中鑒定的突變基因，我們建立了改變的腫瘤基因組和基因過度甲基化組之間關鍵的關系。我們的研究提供了理解表觀和遺傳的改變如何促使人腫瘤發(fā)生的平臺。我們描述了基因表達方法，對于可獲得代表性細胞培養(yǎng)系的任何人類癌癥類型，該方法具有確定大部分癌基因啟動子CpG島DNA過度甲基化組的能力。對這些基因的研究將有助于理解促使腫瘤發(fā)生的分子通路、提供有用的新DNA過度甲基化生物標記來監(jiān)測癌癥風險評估、早期診斷和預后，并且允許在癌癥預防和/或治療策略期間更好地監(jiān)測基因再表達(13,22)。通過由我們方法發(fā)現的過度甲基化組基因與由基因組廣泛測序策略(genomewidesequencingstrategy)鑒定的突變基因的直接比較，我們證明了在任何特定的腫瘤中存在比遺傳變化基因多許多的外遺傳(表觀)變化基因。這個事實的重要性在我們的發(fā)現中顯現對于受兩種機制影響的新發(fā)現的基因，在結腸癌中任何特定基因的過度甲基化的發(fā)生率顯得比突變高得多。因此，在特定的癌類型中，由于未能篩査遺傳和表觀遺傳異常，本領域技術人員可能明顯地低估全范圍的基因改變和相關的細胞通路異常。數據也指出，比單獨遺傳分析所預測的，評估基因功能喪失的兩種機制對于通路中斷在個體結腸腫瘤中顯示出更多的共性(sharing)。我們的發(fā)現強調，依照在關鍵通路中的分子改變對腫瘤分類的最佳方法應該依賴于確定遺傳和表觀基因變化。因此，我們的發(fā)現應該促進在癌癥中繪制異?；蜃兓娜魏位驈V泛策略，從而考慮應該檢査突變基因的啟動子DNA過度甲基化和DNA過度甲基化基因應該放在進行測序以發(fā)現突變的優(yōu)先位置。使用這種技術，我們已經發(fā)現了一組基因，它們的轉錄在癌、癌前體和初癌中被外遺傳沉默。這些基因包括BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化的(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。檢測到這些基因的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個的外遺傳沉默可以用作癌或者初癌或者發(fā)展癌的風險的指示?；虻耐膺z傳沉默可以通過在本領域中任何已知的方法確定。一種方法是確定在正常細胞或者其它對照細胞中表達的基因在腫瘤細胞中較少表達或者不表達。然而這種方法本身不能夠指出沉默是外遺傳性的，因為沉默的機制可能是遺傳的，例如通過體細胞突變。一種確定沉默是外遺傳的方法是用試劑如DAC(5'-去氮雜胞苷)(5'-deazacytidine)或者用改變細胞DNA的組蛋白乙?；癄顩r的試劑來處理，或者影響在細胞中的外遺傳機制的任何其它處理，并且觀察沉默被逆轉，也就是基因的表達被再激活或者恢復。另一種確定外遺傳沉默的方法是確定在沉默基因中甲基化的CpG二核苷酸基序的存在。典型地，這些存在于轉錄起始位置的附近，例如在大約lkbp之內、大約在750bp之內或者大約在500bp之內。一旦基因被鑒定為在腫瘤細胞中外遺傳沉默的靶標，減少表達的確定可以用作外遺傳沉默的指示物。基因的表達可以使用本領域已知的任何方法來評估。典型地，表達可以在試樣和對照樣品中評估和比較，對照樣品是正常的、非惡性的細胞。試樣可以含有癌細胞或者初癌細胞或者來自它們的核酸。例如，樣品可以含有結腸腺瘤細胞、結腸晚期腺瘤細胞或者結腸癌細胞。mRNA(核酸)或者蛋白可以被測量。可以使用應用與核酸探針雜交的方法測量具體的mRNAs。這些方法包括使用核酸探針陣列(微陣列技術)、原位雜交和使用Northern印跡。信使RNA也可以使用擴增技術如RT-PCR來評估?；蚪M技術中的進步現在允許同時分析數千個基因，雖然許多是根據特定探針-靶標雜交的相同概念。測序為基礎的方法是可選的；這些方法開始時使用表達的序列標簽(EST)，并且現在包括基于短標簽的方法，例如基因表達系列分析(SAGE)和大規(guī)模平行特征測序(MPSS)。差別顯示技術提供了分析基因表達的另外方法；這類技術基于由限制性消化產生的cDNA片段的隨機擴增，以及在兩種組織之間不同的帶鑒定感興趣的cDNA。特定的蛋白可以使用任何常規(guī)方法來評估，包括但不限于免疫測定和免疫細胞化學術。大部分這些方法將使用對特定的蛋白或者蛋白片段特異的抗體。本發(fā)明的標記的mRNA(cDNA)和蛋白的序列在本領域是已知的和可以公開得到的。甲基化敏感的限制性內切核酸酶可以用于檢測甲基化的CpG二核苷酸基序。這種核酸內切酶可以相對于非甲基化識別位點而優(yōu)先剪切甲基化識別位點，或者相對于甲基化識別位點而優(yōu)先剪切非甲基化的識別位點。前者的例子是AceIII、Banl、BstNI、MspI和XmaI。后者的例子是AceII、Aval、BssHII、BstUI、Hpall和NotI?？蛇x地，可以使用選擇性地修飾甲基化的或者非甲基化形式的CpG二核苷酸基序的化學試劑。修飾產物可以直接檢測或者在產生容易辨別的產物的進一步反應之后進行檢測。檢測改變的大小和/或電荷的方法可以用于檢測修飾的產物，方法包括但不限于電泳、色譜和質譜。這種選擇性修飾的化學試劑例子包括肼和亞硫酸氫鹽離子。肼修飾的DNA可以使用哌啶處理來剪切它。亞硫酸氫鹽離子處理的DNA可以用堿來處理。其它依賴特定序列的方法也可以使用，包括但不限于雜交、擴增、測序和連接酶鏈反應。如果期望，可以使用這些技術的組合。電泳的原理是通過它們的大小和電荷來分離核酸。存在用于檢測甲基化的許多測定方法，并且大部分依賴于確定特定核酸產物的有無。在實驗室中為了此目的經常使用凝膠電泳。本領域技術人員可以使用MALDI質譜結合甲基化檢測分析來觀察核酸產物的大小。質譜的原理是對核酸進行離子化和依照它們的質荷比來分離它們。類似于電泳，本領域技術人員可以使用質譜來檢測在實驗中產生的特定核酸以確定甲基4fc。參見Tost,J.等，AnalysisandaccuratequantificationofCpGmethylationbyMALDImassspectrometry.NucAcidRes,2003,31,9。一種形式的色譜，高效液相色譜用于根據被分析物質與色譜柱之間的各種化學相互作用來分離混合物的成分。DNA首先用亞硫酸氫鈉來處理，其將未甲基化的胞嘧啶轉化成為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶殘基保持不受影響。本領域技術人員可以經過PCR擴增含有潛在甲基化位置的區(qū)域和通過變性高效液相色譜(DHPLC)來分離產物。DHPLC具有區(qū)別甲基化的(含有胞嘧啶)和沒有甲基化的(含有尿嘧啶)DNA序列的分辨能力。參見Deng,D,等，SimultaneousdetectionofCpGmethylationandsinglenucleotidepolymorphismbydenaturinghighperformanceliquidchromatography.2002NucAcidRes,30,3。[50]雜交是根據兩條互補核酸鏈的退火形成雙鏈分子來檢測特定核酸序列的技術。雜交使用的一個例子是用于確定DNA甲基化狀況的微陣列分析。在亞硫酸氫鈉處理DNA之后——其將未甲基化的胞嘧啶轉變成為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶殘基保持不受影響，與潛在甲基化位點互補的寡核苷酸可以與亞硫酸氫鹽處理的DNA雜交。寡核苷酸被設計成與含有尿嘧啶的序列或者含有胞嘧啶的序列互補，其分別代表了未甲基化的和甲基化的DNA。以計算機為基礎的微陣列技術可以確定哪個寡核苷酸與DNA序列雜交，并且本領域技術人員可以推斷DNA的甲基化狀況。確定在亞硫酸氫鈉處理后結果的另外的方法將會是對DNA測序，以直接觀察任何亞硫酸鹽的修飾。焦磷酸測序(Pyrosequecing)技術是通過合成測序的實時方法。它基于焦磷酸鹽(PPi)的間接生物光度計分析(bioluminometricassay)，焦磷酸鹽(PPi)是當DNA鏈延伸時從每個脫氧核苷酸(dNTP)中釋放。這種方法在核酸外切酶缺陷的KlenowDNA聚合酶存在的情況下呈現帶有dNTP的DNA模板-引物復合體。四種核苷酸以預先確定的順序依次加到反應混合物中。如果核苷酸與模板堿基互補并因而被加入，那么PPi被釋放。PPi和其它試劑用作在熒光素酶反應中的底物，熒光素酶反應產生通過光度計或者電荷耦合裝置檢測的可見光。產生的光與加到DNA引物的核苷酸數量成比例，并且產生以熱解圖的形式存在的指示核苷酸數量和類型的峰。焦磷酸測序可以利用在DNA的亞硫酸氫鈉轉化后產生的序列差異。各種擴增技術可以在產生可辨別產物的反應中使用。這些技術的一些利用PCR。其它合適的擴增方法包括連接酶鏈反應(LCR)(Barringer等，1990)、轉錄擴增(Kwoh等.1989;WO88/10315)、目標多核苷酸序列的選擇性擴增(美國專利6,410,276)、共有序列引發(fā)的聚合酶鏈反應(美國專利4,437,975)、隨機引發(fā)的聚合酶鏈反應(WO90/06995)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)(美國專利5,409,818;5,554,517;6,063,603)、切口置換擴增(nickdisplacementamplification)(WO2004/067726)。反映原始基因組DNA中CpG二核苷酸處的甲基化狀況的序列變化提供了PCR引物設計的兩種方法。在第一種方法中，引物自身不"覆蓋"任何潛在的DNA甲基化位點或者不與任何潛在的DNA甲基化位點雜交；在不同甲基化的位點處的序列變化位于兩引物之間。這種引物被用在亞硫酸氫鹽基因組測序、COBRA、Ms-SNuPE中。在第二種方法中，引物設計為特異地與甲基化的或者未甲基化形式的轉化序列退火。如果與靶標具有足夠的互補性區(qū)域，例如12、15、18或20個核苷酸，那么引物也可以含有另外的不干擾雜交、但對于其它操作有用的核苷酸殘基。這種其它殘基的例子可以是限制性內切核酸酶剪切、配體結合或者因子結合或連接體或重復序列的位點。寡核苷酸引物可以是或者可以不是這種對修飾的甲基化殘基特異的。22200880010320.8區(qū)別修飾和未修飾的DNA的一種方式是雜交寡核苷酸引物，該寡核苷酸引物特異地結合到DNA的一種形式或者另一種形式。在雜交后，可以進行擴增反應和測定擴增產物。擴增產物的存在表明與引物雜交的樣品。引物的特異性表明DNA是否已經被修飾或未被修飾，其轉而表明DNA是否已經被甲基化或未甲基化。例如，亞硫酸氫鹽離子修飾非甲基化的胞嘧啶堿基，將它們變?yōu)槟蜞奏A基。在雜交條件下，尿嘧啶堿基與腺嘌呤堿基雜交。因此，包含替代鳥嘌呤堿基的腺嘌呤堿基的寡核苷酸引物會與亞硫酸氫鹽修飾的DNA雜交，而含有鳥嘌呤堿基的寡核苷酸引物會與DNA中未修飾的(甲基化的)胞嘧啶殘基雜交。使用DNA聚合酶和第二引物的擴增產生能夠容易被觀察到的擴增產物。這種方法被稱為MSP(甲基化特異性PCR;專利5,786,146;6,017,704;6,200,756)。擴增產物可以任選地雜交特異的寡核苷酸探針，而特異的寡核苷酸探針對某些產物也可以是特異的。可選地，可以使用將與來自修飾和未修飾DNA的擴增產物雜交的寡核苷酸探針。區(qū)別修飾和未修飾的DNA的另一種方式是使用對于某些產物也可以是特異的寡核苷酸探針。這類探針可以直接與修飾的DNA或者修飾的DNA的擴增產物雜交?？梢允褂帽绢I域已知的任何檢測系統(tǒng)來標記寡核苷酸探針。這些包括但不限于熒光部分、放射性同位素標記的部分、生物發(fā)光部分、發(fā)冷光的部分、化學發(fā)光的部分、酶、底物、受體或者配體。鑒定甲基化的CpG二核苷酸的還有另外一種方式是利用McCP2蛋白的MBD結構域選擇性地結合到甲基化DNA序列的能力(Cross等，1994;Shiraishi等，1999)。限制性內切核酸酶消化的基因組DNA被加載在表達的His標記的甲基CPG結合結構域上，CPG結合結構域被固定到固體基質和用于制備型柱層析來分離高度甲基化的DNA序列。實時化學術使得能在反應的早期階段期間檢測PCR擴增，和使得DNA和RNA的定量更容易和更準確。實時PCR的少數變化是已知的。它們包括TaqManTM系統(tǒng)和MolecularBeacon(分子信標)TM系統(tǒng)，它們具有分開的用熒光團和熒光淬滅劑標記的探針。在ScorpionTM系統(tǒng)中，發(fā)夾結構形式的標記的探針被連接到引物。用許多技術已經成功進行了DNA甲基化分析，其包括MALDI-TOFF、MassARRAY、MethyLight、乙基化等位基因的定量分析(QAMA)、酶區(qū)域甲基化測定(ERMA)、HeavyMethyl、QBSUPT、MS-SNuPE、MethylQuant、定量PCR測序和寡核苷酸為基礎的微陣列系統(tǒng)。其沉默被測試和/或檢測的基因數量可以變化一、二、三、四、五或者更多種基因可以被測試和/或檢測。在一些情況下，選擇至少兩種基因。在另外的實施方式中，選擇至少三種基因。[60]可以進行診斷性測試或者結合治療方案進行測試。測試可以用于監(jiān)測治療方案的效力，無論是化學治療劑或者生物試劑如多核苷酸。測試也可以用于確定什么樣的治療或者預防方案應用到患者上。而且，測試也可以用于把患者分成幾組用于測試試劑和確定它們在各組患者上的效力。用于診斷、預后或者個體化醫(yī)學用途的測試樣品可以從以下獲得外科手術樣品如活組織檢查或者細針抽出液，石蠟包埋結腸、直腸、小腸、胃、食管、骨髓、乳腺、卵巢、前列腺、腎、肺、腦等器官組織，體液如血液、血清、淋巴、腦脊液、唾液、痰、支氣管灌洗液、導管流體糞便、尿液、淋巴結或精液。這些來源不是意欲窮盡性的，而是示例性的。從這些樣品或者流體中獲得的測試樣品包括分離的腫瘤細胞和/或從死亡或者損傷腫瘤細胞中釋放的游離核酸。核酸包括RNA、基因組DNA、線粒體DNA、單或雙鏈和蛋白結合的核酸。從這種樣品細胞獲得的純化或未純化形式的任何核酸樣品可以用作起始核酸(一種或多種)。脫甲基劑可以與細胞在體外或者體內接觸，目的是恢復細胞的正?；虮磉_。合適的脫甲基劑包括但不限于5-氮雜-2'-脫氧胞苷、5-氮雜-胞苷、澤布拉恩(Zebularine)、普魯卡因和L-乙硫氨酸。這個反應可以用于診斷、用于確定傾向和用于確定合適的治療方案。如果脫甲基劑用于治療結腸癌、頭頸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌或肝癌，可以測試基因的表達或者甲基化，所述基因選自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3禾口ZNF655。恢復外遺傳性沉默的基因表達的可選方式是將非甲基化的多核苷酸引入細胞，這樣它將在細胞中表達。各種基因治療載體和媒介物在本領域中是已知的和任何一種可使用的適合于特定的情況。某些載體適合于短期表達，而某些載體適合于長時間表達。某些載體對于某些器官是有關營養(yǎng)的并且這些載體可以在特定情況下適當使用。載體可以是病毒的或者非病毒的。多核苷酸可以但不是必要的包含在載體例如病毒載體中，并且其可以配制在例如基質中，如脂質體、微泡。通過將多核苷酸給予對象使得其接觸細胞并被細胞吸收，多核苷酸可以被引入細胞，并且編碼的多肽被表達。優(yōu)選地，特定多核苷酸將是患者已經被對其測試和被發(fā)現攜帶沉默形式的多核苷酸。用于治療結腸癌、頭頸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌的多核苷酸將典型地編碼選自以下的基因BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、F0XL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XE1、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SAIX4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。通過將脫甲基劑給予對象，將通常顯示出甲基化沉默基因表達的細胞與與脫甲基劑體內接觸。如果方便，可以使用例如導管插入術方法給予脫甲基劑，給予的地方在對象中顯示不受調節(jié)生長的細胞的位置或者附近，或者給予進入到血流到細胞位置的血管中。類似地，如果待被處理的器官或者其部分可以通過分路方法被分離，試劑可以通過分路給予，因而實質上將試劑提供到含有細胞的位置。試劑也可以全身給予或者通過本領域已知的其它途徑給予。除了多肽編碼序列外，多核苷酸可以包括可操作地連接的轉錄調控元件、翻譯調控元件等，和多核苷酸可以是裸露DNA分子的形式，其可以包含在載體中或者其可以配制在基質如脂質體或微泡中，這幫助多核苷酸進入特定的細胞中。術語"可操作地連接的(operativdylinked)"指的是兩個或者多個相互放置的分子，這樣它們作為單一的單元起作用和實現可歸因于一個或者兩個分子或者其組合的功能。編碼期望多肽的多核苷酸序列可以可操作地連接到調控元件，在這種情況下，調控元件以類似于這樣的方式在多核苷酸上賦予它的調控作用，在該方式中，調控元件會影響在細胞中其與之正常聯系的多核苷酸序列。編碼待被給予哺乳動物或者人或待與細胞接觸的期望多肽的多核苷酸可以含有啟動子序列——啟動子序列可以提供多核苷酸的組成型，或者如果期望，誘導型或者組織特異性或者發(fā)育階段特異性表達、多聚腺苷酸(polyA)識別序列和核糖體識別位點或者內部核糖體進入位點或者其它調控元件如增強子，其可以是組織特異的。載體也可以含有在原核或者真核宿主系統(tǒng)或兩者中復制所需要的元件，如所期望的。這種載體一一包括質粒載體和病毒載體如噬菌體、桿狀病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)和腺病相關病毒載體——是眾所周知的和可以從商業(yè)來源購買(Promega,MadisonWL;Stratagene,LaJollaCA.;GIBCO/BRL,GaithersburgMD.)或者可以由本領域技術人員來構建(參見例如Meth.Enzymol,，Vol.185,Goeddel，ed.(AcademicPress,Inc.,1990);Jolly,Cane.Gene.Ther.1:51-64,1994;Flotte,J.Bioenerg.Biomemb.25:37-42,1993;Kirshenbaum等.，J.Clin.Invest.92:381-387,1993;它們中的每一個在此引入作為參考)。[67]四環(huán)素(tet)誘導型啟動子可以用于促使編碼期望多肽的多核苷酸的表達。當將四環(huán)素或者四環(huán)素類似物給予含有可操作地連接到tet誘導型啟動子的多核苷酸的對象時，編碼多肽的表達被誘導。多核苷酸可選地可以被可操作地連接到組織特異性調控元件，例如肝細胞特異性調控元件如a胎蛋白啟動子(Kanai等.,CancerRes.57:461-465，1997;He等.，J.Exp.Clin.CancerRes.19:183-187,2000)或者白蛋白啟動子(Power等.，Biochem,Biophys.Res.Comm.203:1447-1456，1994;Kuriyama等.，Int.J.Cancer71:470-475,1997);肌細胞特異性調控元件如肌紅蛋白啟動子(Devlin等.，J.Biol.Chem.264:13896-13901,1989;Yan等.，J.Biol.Chem.276:17361-17366，2001);前列腺細胞特異性調控元件如PSA啟動子(Schuur等.,J.Biol.Chem.271:7043-7051,1996;Latham等.，CancerRes.60:334-341，2000);胰腺細胞特異性調控元件如彈性蛋白酶啟動子(Ornitz等.，Nature313:600-602,1985;Swift等.，GenesDevel.3:687-696,1989);白細胞特異性調控元件如增白細胞蛋白(leukosialin)(CD43)啟動子(Shelley等.，Biochem.J.270:569-576,1990;Kudo和Fukuda,J.Biol.Chem.270:13298-13302，1995)等，這樣多肽的表達限制于個體中的特定細胞或者限制于在培養(yǎng)中，例如在器官培養(yǎng)中的混合細胞群中的特定細胞。包括組織特異性調控元件在內的調控元件在本領域中是眾所周知的(參見例如InvivoGen;SanDiegoCalif.)，許多組織特異性調控元件是商業(yè)可獲得的。病毒表達載體可以用于將多核苷酸引入細胞中，特別是受試者的細胞中。病毒載體提供了它們能夠以相對高的效率感染宿主細胞和能夠感染特定細胞類型的優(yōu)勢。例如，編碼期望多肽的多核苷酸可以被克隆進入桿狀病毒載體，其隨后可以用于感染昆蟲宿主細胞，由此提供了產生大量的編碼多肽的方法。病毒載體已被開發(fā)用在特定宿主系統(tǒng)，特別是哺乳動物系統(tǒng)中，病毒載體包括例如逆轉錄病毒載體、其它慢病毒載，如那些基于人類免疫缺陷病毒(HIV)的載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體、肝炎病毒載體、牛痘病毒載體等(參見Miller和Rosman,BioTechniques7:980-990,1992;Anderson等.，Nature392:25-30Suppl.,1998;Verma和Somia,Nature389:239-242,1997;Wilson,NewEngl.J.Med.334:1185-1187(1996)，它們中的每一篇在此引入作為參考)。多核苷酸——其可以任選地包含在載體中——可以通過在本領域中已知的各種方法中的任一種被引入細胞(Sambrook等.，supra，1989;Ausubel等.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Md.(1987禾口supplementsthrough1995)，它們中的每一篇在此引入作為參考)。這些方法包括例如轉染、脂轉染、顯微注射、電穿孔和用病毒載體進行的感染；和可以包括應用脂質體、微乳液等，脂質體、微乳液等可以幫助將多核苷酸引入細胞和可以保護多核苷酸在引入細胞之前免于降解。特別有用的方法包括使多核苷酸并入微泡，微泡可以注射入循環(huán)中?？梢苑胖贸曉?，這樣超聲被傳送給腫瘤，其中由于超聲，含有多核苷酸的循環(huán)微泡在腫瘤位置被破裂，因此在癌癥的位置提供多核苷酸。特定方法的選擇將依賴于例如多核苷酸被引入的細胞以及細胞是否在培養(yǎng)中或在體內原位位置。通過用病毒載體感染而將多核苷酸引入細胞可以有效地將核酸分子引入細胞。而且，病毒是非常特異的，并可以根據在一種或者幾種特定細胞類型中的感染和繁殖的能力，來選擇病毒作為載體。因此，它們天然的特異性可以用于將包含在載體中的核酸分子靶向特定的細胞類型?；贖IV的載體可以用于感染T細胞、基于腺病毒的載體可以用于例如感染呼吸道上皮細胞、基于皰疹病毒的載體可以用于感染神經細胞等。其它載體，如腺相關病毒可以具有更大的宿主細胞范圍，因而可以用感染各種細胞類型，雖然病毒或者非病毒載體也可以用特定的受體或者配體修飾，以通過受體介導的事件來改變靶標特異性。本發(fā)明的多核苷酸或者含有多核苷酸的載體可以包含在細胞，例如宿主細胞中——宿主細胞使得含有多核苷酸的載體得以繁殖，或者輔助細胞中——輔助細胞使得含有多核苷酸的病毒載體得到包裝。多核苷酸可以短暫地包含在細胞中，或者可以由于例如整合進入細胞基因組中而被穩(wěn)定維持。由基因(BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、A函CX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345或ZNF655)編碼的多肽可以直接給予到在受試者中顯示出不受調節(jié)的生長的細胞部位。如果期望的話，多肽可以使用本文公開的方法產生、分離和配制，并且多肽可以與細胞接觸，這樣多肽可以穿過靶細胞的細胞膜。多肽可以作為融合蛋白的一部分提供，融合蛋白包括有利于轉運通過細胞膜的肽或者多肽成分。例如，人類免疫缺陷病毒(HIV)TAT蛋白轉導結構域或者核定位結構域可以融合到感興趣的標記。給予的多肽可以配制在基質中，基質幫助多肽進入細胞。雖然在這里提到了特定多核苷酸和多肽序列作為已知基因和蛋白的代表，但是本領域技術人員會理解，在數據庫中的序列代表了在特定個體中存在的序列。來自其它個體的任何等位基因序列也可以使用。這些典型地與公開的序列變化1-10殘基、l-5個殘基或者l-3個殘基。而且，等位基因序列與數據庫序列典型地具有至少95、96、97、98或者99%的同一性，同一性如使用運算法則如BLAST同源性工具進行測量。27[73]試劑如脫甲基劑、多核苷酸或多肽典型地配制在適合給予受試者的組合物中。因此，本發(fā)明提供了含有試劑的組合物，該試劑可用于恢復細胞受調節(jié)的生長，該細胞由于一種或者多種基因的甲基化沉默轉錄而顯示出不受調節(jié)的生長。試劑作為治療患有與這種不受調節(jié)生長相關的病理狀況的受試者的藥物是有用的。這種藥物通常包括載體?？山邮艿妮d體在本領域中是眾所周知的和包括例如水溶液諸如水或者生理緩沖鹽水或者其它溶劑或者媒介物如乙二醇、丙三醇，油如橄欖油或者可注射的有機酯。可接受的載體可以含有生理上可接受的化合物，化合物起例如穩(wěn)定或者增加結合物的吸收的作用。這種生理上可接受的化合物包括例如糖類如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽，螯合劑、低分子量蛋白或者其它穩(wěn)定劑或者賦形劑。本領域技術人員會知道或者能夠容易地確定可接受載體，包括生理上可接受的化合物。載體的性質依賴于治療劑的物化性質和組合物的給藥途徑。治療劑或者藥物的給予可以通過口服途徑或腸胃外途徑例如靜脈內、肌內、皮下、經皮、鼻內、支氣管內、陰道、直腸、瘤內途徑或者在本領域中已知的其它方法進行。藥物組合物也可以含有一種或者多種另外的治療劑。治療劑可以包含在封裝材料里面，例如包含在水包油乳液、微乳液、膠束、混合膠束、脂質體、微球體、微泡或者其它聚合物基質中(參見例如Gregoriadis，LiposomeTechnology,Vol,1(CRCPress,BocaRaton,Fla.1984);Fraley,等.，TrendsBiochem.Sci.,6:77(1981)，它們中的每一個在此引入作為參考)。例如由磷脂或其它脂類組成的脂質體是無毒的、生理上可接受的可代謝載體，其制備和施用相對簡單。"隱形(Stealth)"脂質體(參見例如美國專利5,882,679;5,395,619;和5,225,212，它們中的每一篇在此引入作為參考)是這種封裝材料的例子，其對于制備在本發(fā)明方法中有用的組合物特別有用，另外其它"掩蔽(masked)"脂質體可以類似地使用，這種脂質體延長治療劑停留在循環(huán)中的時間。例如陽離子脂質體也可以用特定的受體或者配體進行修飾(Morishita等.，J.Clin.Invest,91:2580-2585(1993)，其在此引入作為參考)。另夕卜，多核苷酸劑可以使用例如腺病毒多聚賴氨酸DNA復合物引入細胞中(參見例如Michael等.，J.Biol.Chem.268:6866-6869(1993),其在此引入作為參考)。含有治療劑的組合物的給藥途徑將部分依賴于分子的化學結構。多肽和多核苷酸例如口服輸送不是有效的，因為它們在消化道中可被降解。然而，例如可以使用化學修飾多肽的方法，使它們更不易被內源性蛋白酶降解，或者使它們更容易通過消化道吸收(參見例如Blondelle等.，supra,1995;Ecker和Crook,supra,1995)。在實施本發(fā)明的方法中給予的試劑總量可以作為單劑量——或者作為大丸劑或推注劑(彈丸，bolus)或者通過在相對短的時間段中輸注——給予受試者，或其可以使用分次治療方案進行給予，在分次治療方案中多劑量在長時間段中給予。本領域技術人員會知道，在受試者中治療病理癥狀的組合物的量依賴于多種因素，包括受試者的年齡和總體健康以及給藥途徑和給予的治療次數。考慮到這些因素，本領域技術人員會根據需要調整具體的劑量。一般而言，最初使用I期和II期臨床試驗來確定組合物的配方和給藥的途徑及頻率。組合物可以配制用于口服制劑，例如片劑或者溶液或者懸浮液的形式；或者組合物可以包含與適合于腸內或者非腸道應用的有機或者無機載體或者賦形劑的混合物，和可以例如與常用、無毒、藥學上可接受的載體化合，用于制備片劑、丸劑、膠囊、栓劑、溶液、乳劑、懸浮劑或者其它適合應用的形式。除了在以上所公開的那些載體外，載體可以包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯膠、明膠、甘露醇、淀粉糊、三硅酸鎂、滑石、玉米淀粉、角蛋白、膠體二氧化硅、馬鈴薯淀粉、尿素，中鏈長度甘油三酯、葡聚糖和適合用于制造固體、半固體或液體形式的制備物的其它載體。另外，輔助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑或者著色劑和香料也可以應用，例如穩(wěn)定干燥試劑如丙酮糖(triulose)(參見例如美國專利5,314,695)。雖然通過使用標記的組合可以獲得診斷和預后的準確性和靈敏性，例如5或者6種標記、或者9或10種標記、或者14或15種標記的組合，但是實際考慮可能決定使用更小的組合。特定癌癥的標記的任何組合可以被使用，所述組合包含2、3、4或5種標記?？紤]到本文提供的單個標記的具體公開，可以容易地想到2、3、4或5種標記的組合。差別甲基化GpG島的甲基化水平可以提供關于疾病或者癌癥的各種信息。它可以用于在個體中診斷初癌或者癌癥。初癌或者癌癥前體是癌癥的非常早的階段，它在結腸的最里(腔層)層中發(fā)現。它有時稱為淺表癌(superficialcancer)?？蛇x地，它可以用于預測在個體中疾病或者癌癥的過程，或者預測在個體中對疾病或者癌癥的易感性，或者對個體中疾病或者癌癥的進展進行分級。它可以幫助預測整體存活的可能性或預測疾病或癌癥再次發(fā)生的可能性，并確定個體所經歷的療程的有效性。當檢測時，與參考水平相比的甲基化水平增加或者減少和增加/減少的改變提供了有用的預后和診斷價值。預后的方法可以用于鑒定可能發(fā)展為癌的腺瘤患者。這種預測可以根據在腺瘤中相對于正常的組織在表1(圖9)中所鑒定的至少一種基因的外遺傳沉默來進行。這些患者可以被提供另外合適的治療或者預防選擇，包括內鏡息肉切除術或者切除術，和當指出時，包括外科手術、化療、放療、生物反應調節(jié)劑或其它療法。這些患者也可以接受進一步診斷或者監(jiān)測程序的建議，診斷或者監(jiān)測程序包括但不限于增加頻率的結腸鏡檢查、乙狀結腸鏡檢查、虛擬結腸鏡檢查、視頻囊內鏡檢查、PET-CT、分子成像或其它成像技術。治療癌癥患者的治療策略可以根據外遺傳沉默基因的再激活進行選擇。首先鑒定選自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TXR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XE1、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655的基因，所述基因在患者癌細胞中的表達通過去甲基化試劑再激活或者外遺傳沉默。隨后選擇增加基因表達的治療。這種治療可以包括給予再激活劑或者多核苷酸?？蛇x地可以給予多肽。依照本發(fā)明的試劑盒是用于測定甲基化的試劑的集合體。它們典型地在含有所有成分的包裝中，任選地包括說明書。包裝可以分開，以便各成分不混合，直到希望混合時。成分可以處于不同的物理狀態(tài)。例如，一些成分可以是凍干的，而一些在水溶液中。一些成分可以是冷凍的。在試劑盒內，單個的成分可以分開包裝。試劑盒可以含有如上描述的用于差異性修飾甲基化和非甲基化胞嘧啶殘基的試劑。理想地，試劑盒將含有寡核苷酸引物，該寡核苷酸引物與基因/標記的轉錄起始位置的lkb內的區(qū)域特異性雜交，所述基因/標記為BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。典型地，試劑盒將包含單個基因或者標記的正向和反向引物。如果具有足夠的互補區(qū)域，例如12、15、18或20個核苷酸，那么引物也可以包含另外的核苷酸殘基，這些核苷酸殘基不干擾雜交，但是對其它操作可能是有用的。這種其它殘基的例子可以是限制性內切核酸酶剪切的位點，用于配體結合或者用于因子結合或者連接體或者重復序列的位點。寡核苷酸引物可以或者可以不對修飾的甲基化殘基是特異的。試劑盒可任選地含有寡核苷酸探針。探針可以對含有修飾的甲基畫殘基的序列或者對含有非甲基化殘基的序列是特異的。試劑盒可以任選地含有修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑。試劑盒也可以含有用于進行擴增的成分，例如DNA聚合酶和脫氧核糖核苷酸。檢測工具也可以在試劑盒中提供，包括在引物或者探針上的可檢測的標記。試劑盒也可以含有用于檢測本發(fā)明的一種標記(表l;圖9)的基因表達的試劑。這些試劑可以包括例如探針、引物或者抗體。在酶或者配體的情況下，底物或者結合伴侶可以用于評估標記的存在。在這個實施方式的一方面，基因與肼接觸，肼修飾胞嘧啶殘基，但是不修飾甲基化的胞嘧啶殘基，隨后肼處理的基因序列與試劑如哌啶接觸，該試劑在肼修飾的胞嘧啶殘基處剪切核酸分子，由此產生包含片段的產物。通過使用例如電泳、色譜或者質譜的方法依照分子量分離片段，并比較該分離形式與類似處理的相應非甲基化基因序列的分離形式，缺口在含有甲基化胞嘧啶殘基的測試基因中的位置上是明顯的。因此，缺口的存在指示了在測試細胞的耙基因的CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基的甲基化。亞硫酸氫鹽離子例如亞硫酸氫鈉將非甲基化的胞嘧啶殘基轉化為亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基。亞硫酸氫鹽離子處理的基因序列可以被暴露于堿性條件，堿性條件將亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基轉化為尿嘧啶殘基。亞硫酸氫鈉容易與胞嘧啶的5,6-雙鍵反應(但是與甲基化的胞嘧啶反應很差)形成磺酸化的胞嘧啶反應中間產物，中間產物易于脫氨基，產生磺酸化的尿嘧啶?；撬猁}基團可以通過暴露于堿性條件來除去，引起尿嘧啶的形成。DNA可以例如通過PCR擴增，并進行測序來確定在樣品的DNA中CpG位置是否被甲基化。尿嘧啶被Taq聚合酶識別為胸腺嘧啶，而當PCR時，生成的產物僅在起始模板DNA中5-甲基胞嘧啶存在的地方含有胞嘧啶。本領域技術人員可以比較在測試細胞的亞硫酸氫鹽離子處理的基因序列中尿嘧啶殘基的量或者分布與類似處理的相應非甲基化基因序列中的尿嘧啶殘基的量或者分布。在測試細胞的基因中尿嘧啶殘基的量或者分布的減少表明在測試細胞基因的CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基的甲基化。尿嘧啶殘基的量或者分布也可以通過如下步驟檢測將亞硫酸氫鹽離子處理的目標基因序列與寡核苷酸接觸、隨后暴露于堿性條件并檢測寡核苷酸的選擇性的雜交(或者其不存在)，所述寡核苷酸選擇性地與目標基因的核苷酸序列雜交，該目標基因或者含有尿嘧啶殘基或者缺少尿嘧啶殘基，但不是兩者。測試化合物可以被測試它們治療癌癥的潛力。用于測試的癌細胞可以選自前列腺癌、肺癌、乳腺癌和結腸癌。確定選自那些在表l(圖9)中列出的基因的表達，如果表達在細胞中被化合物增加，或者如果基因的甲基化在細胞中被化合物減少，本領域技術人員可以鑒定該化合物具有作為治療癌癥的潛力。可選地，這些測試可以用于確定食管癌、頭頸癌、胃癌、小腸癌、胰腺癌、肝癌患者對化療劑的反應?；颊呖梢杂没焺┻M行治療。如果選自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、31ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XE1、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3禾PZNF655的基因的表達在癌細胞中被化合物增加，或者如果基因的甲基化在癌細胞中被化合物減少，該化合物可以被選擇用于治療患者。以上公開總體描述了本發(fā)明。所有在本文公開的參考文獻通過引用明確并入。更完整的理解可以通過參考以下具體的例子來獲得，其在本文提供僅僅為了舉例說明的目的，而不是意欲限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例l材料和方法細胞培養(yǎng)和處理。HCT116細胞和等基因遺傳敲除衍生物如在以前描述(14)地來維持。對于藥物處理，對數期CRC細胞在McCoys5A培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)96小時，McCoys5A培養(yǎng)基含有10%BCS和lx青霉素/鏈霉素與5的5氮雜-脫氧胞苷(DAC)(Sigma;儲液lmM，在PBS中)，每24小時更換培養(yǎng)基和DAC。用300nM曲古柳菌素A(Sigma;儲液溶解在乙醇中的1.5mM)處理細胞18小時。對照細胞平行進行模擬處理，加入沒有藥物的等體積PBS或者乙醇。微陣列分析。依照制造商的指導——包括DNA酶消化步驟，使用Triazol(Invitrogen)和RNeasy試劑盒(Qiagen)從對數期細胞收獲總RNA。使用NanoDr叩ND-100，接著用2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies)進行質量評價，對RNA定量。個體樣品的RNA濃度大于200ng/ul、28s/18s比率大于2.2,和RNA完整值為10(10為最高分)。使用低RNA輸入熒光線性擴增試劑盒(LowRNAInputFluorescentLinearAmplificationKit)(AgilentTechnologies)，依照制造商的指導，進行樣品擴增和標記過程。標記的cRNA用RNeasy小型試劑盒(Qiagen)純化和定量。在擴增之前，RNA示蹤對照(RNAspike-incontrol)(AgilentTechnologies)加入到RNA樣品中。標記有Cy3或Cy5的0.75微克樣品與對照靶標(AgilentTechnologies)混合，依照Agilent微陣列方案聚集在寡微陣列(OligoMicroarray)上、雜交和處理。用AgilentG2565BA微陣列掃描儀，使用AgilentTechnologies推薦的設置進行掃描。數據分析。所有陣列進行制造商所推薦的質量檢查。視覺檢查圖像的假象，檢測信號的分布和紅和綠兩個通道的背景強度以鑒定異常的陣列。沒有觀察到不規(guī)則，并且保留和使用所有陣列。使用R統(tǒng)計計算平臺(23)和來自Bioconductor生物信息軟件項目(24)的程序包進行所有的計算。紅信號與綠信號的對數比在減去背景和LoEss歸一化后進行計算，如在Bioconductor(25、26)的半度軟件包(limmapackage)中所執(zhí)行地。單個陣列換算到有相同的四分位數(inter-quartile)范圍(第75個百分位數-第25個百分位數)。對于染色交換重復(dye-swapreplicate)微陣列，對數倍數變換進行平均，以產生每種條件的單一的一組表達值。甲基化和基因表達分析。依照制造商的指導，用TRIzol試劑(Invitrogen)分離RNA。對于反轉錄-PCR(RT-PCR)，1嗎的總RNA通過使用Ready-To-GoTMYou-PrimeFirst-StrandBeads(AmershamBiosciences)進行反轉錄，力口入隨豐幾六聚體(每個反應0.2嗎)。對于RT-引物設計，我們使用Primer3(http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)。對于MSP分析，依照標準的酚-氯仿提取方法提取DNA。使用EZDNA甲基化試劑盒(ZymoResearch)進行基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾。使用MSPPrimer(http:ASvww.mspprimer.org)，設計對未甲基化和甲基化啟動子序列特異的引物序列。MSP如以前描述(20)進行。所有PCR產物(50|al總體積的15^1用于RT-PCR和25^1總體積的7.5|_d用于MSP)直接加樣在含有GelStarNucleicAcidGelStain(CambrexBioScience)的2%瓊脂糖凝膠上，并在紫外線照射下可視化。根據要求，用于MSP、亞硫酸氫鹽測序和RT-PCR的引物序列和條件可從作者得到。人腫瘤分析。來自原發(fā)性CRC的福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織從DepartmentofPathologyoftheUniversityHospitalMaastricht的檔案庫獲得。獲得了馬斯特里赫特大學(MaastrichtUniversity)、馬斯特里赫特大學醫(yī)院(UniversityHospitalMaastricht)和美國約翰霍普金斯大學醫(yī)院(JohnsHopkinsUniversityHospital)的醫(yī)學倫理委員會的批準。使用PuregeneDNA分離試劑盒(GentraSystems)分離DNA。實施例2對于過度甲基化依賴基因表達變化的綜合鑒定，我們的第一步通過在基因組寬表達陣列為基礎的方法中比較野生型HCT116CRC細胞與攜帶兩種主要人類DNA甲基轉移酶的單獨和組合的基因刪除的等基因伴侶細胞來進行(圖1A，14)。重要地是，在""Z)iVMn6"A)雙敲除(DKO)HCT116細胞中——其實際上完全喪失了全部的5-甲基胞嘧啶，所有以前單個檢查的過度甲基化基因——在野生型細胞中缺少基本表達——經受了伴隨基因重新表達的啟動子脫甲基化(14-17)。通過依照在44KAgilentTechnologies陣列平臺上的改變的信號強度將基因分級，當與等基因野生型親代細胞或者等基因細胞系比較時，我們觀察到了在DKO細胞中基因表達增加的獨特峰，在等基因野生型親代細胞或者等基因細胞系中DNMT的1或3b已經被個別地刪除，其包含在DNA甲基化中最小的變化(圖IB)。[94]根據我們以前的方法，我們使用藥理學策略測試了我們的方法，但是現在被明顯地改良以提供全轉錄物組覆蓋(19),以鑒定在任何癌細胞系中沉默的過度甲基化基因。對于致密的過度甲基化的和轉錄無活性的基因，DNA脫甲基劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(DAC)具有充分確立的誘導基因重新表達的能力(18)。另一方面，對于這些相同的基因，I和II類HDAC抑制劑曲古柳菌素A(TSA)將不單獨誘導重新表達(19)。在用DAC或者TSA處理HCT116細胞后(圖1C)，我們鑒定到這樣的區(qū)域，在其中基因表達沒有隨著TSA增加(<1.4倍)和在模擬處理的細胞中沒有顯示可檢測的表達。在這個區(qū)域內，我們觀察到了DAC誘導的基因表達的特征峰，其與在DKO細胞中所看見的基因表達增加相重疊(比較在圖1D中黃色點與在圖1B中的藍色點)。由于DAC整合入分裂細胞的DNA，而我們的處理僅僅進行了96小時，與DKO細胞相比，在藥理學方法中檢測基因增加的靈敏性被降低。這個基因峰的鑒定完全依賴于對沒有對HDAC抑制作出反應的唯一的基因進行分析，被簇分析加強，簇分析顯示了在DKO和DAC處理細胞的基因之間的親密關系，在TSA單獨處理后，DKO和DAC處理的細胞具有單獨分組的基因表達變化(圖1E)。這些數據確認了覆蓋很少基因組的先前研究，在其中，帶有致密CpG島的被TSA再表達的基因沒有包含可檢測的甲基化(19)?；虮磉_增加的類似峰可以在5種另外的人CRC細胞系(SW480、CaC02、RKO、HT29和COL0320)中看見，確認了這種方法在癌細胞系中普遍起作用(圖2A)。實施例3為了說明我們新陣列方法鑒定CpG島過度甲基化基因的靈敏性，我們首先檢查了在HCT116細胞中11種已知被過度甲基化、完全沉默和在DAC處理后重新表達的基因(圖4(S1A))(14-17)。所有測試的基因保持在TSA未反應區(qū)內(圖4(S1B和C))，在DAC處理和DKO細胞中，表達變化的方向充分關聯(圖4(S1D))。重要地是，對于DAC增加，5種指導基因(45%)增加2倍或者2倍以上，以及另外3種基因或者總共73%的基因增加1.3倍或者1.3倍以上。根據在DKO與DAC誘導基因增加之間所觀察到的靈敏性差異和指導基因在陣列平臺中的行為，在TSA陰性區(qū)域內，我們指定了基因的上層(2倍增加或者以上)和下層(1.4倍至2倍之間的增加)來鑒定過度甲基化癌基因(圖2B)。我們也從這些區(qū)域中根據它們在未處理的細胞中沒有基本表達來挑選基因。事實上，在HCT116細胞中，總共532個基因的上層反應區(qū)中35個隨機挑選的基因中的30個基因(86%)，和來自318個上層基因的48個這樣的SW480細胞基因的31個基因(65%)證明被CpG過度甲基化——如通過MSP(20)所測量的，和在來源的細胞系中被沉默——如通過RT-PCR測量的(圖5、7(S2、S4)。我們也檢測了在DAC處理的HCT116細胞的下層中過度甲基化基因的發(fā)現效率。在這個區(qū)域中的鑒定的1190個基因中，35個隨機挑選的含有CpG島的基因中的17個(49%)被過度甲基化，具有一致的基因沉默(圖6(S3))。這說明了與以前鑒定新的癌過度甲基化基因的篩査相比(7、21),我們的方法是特別有效的。以這種證實的過度甲基化的水平，我們計算在HCT116細胞中過度甲基化組由估計的1040個基因組成和對于SW480細胞由估計的579個基因組成(對于計算的詳細描述，參見圖8(表Sl))。過度甲基化組估計為從在CaC02中的532個基因到RKO細胞中的1389個基因的范圍(圖8(表S1))。在6個細胞系的所有層中鑒定到總共5906個獨特的基因，每個細胞系產生平均大約1000個過度甲基化組基因。實施例4在細胞培養(yǎng)為基礎的方法中根本的問題為是否它們鑒定了在原發(fā)性腫瘤中作為失活靶標的基因。為了解決這個問題，來自證實的基因清單的含有CpG島的20個基因被從HCTU6上層(17個基因)、HCT116下層(2個基因)或SW480上層(l個基因)中隨機選擇，和分析在一組CRC細胞系中的甲基化。所有測試的基因在2個或多個細胞系中被過度甲基化(圖3A)。隨后我們檢測了在一組20個到61個原發(fā)性結腸癌和20個到40個正常出現的結腸組織樣品中的這20個基因的狀況，正常出現的結腸組織樣品從無癌的個體中獲得。在正常結腸組織樣品中，大部分基因(65%)完全沒有被甲基化或者很少甲基化，但在絕大多數原發(fā)性腫瘤中(86%)被甲基化(圖3A)。分析的20個基因中，13個基因(65%)滿足在細胞系中具有高頻率甲基化的"腫瘤特異性甲基化"的標準，在正常結腸中低的或者未檢測到的甲基化和在腫瘤樣品中頻繁的甲基化。我們策略的效率揭示在細胞系中對于鑒定過度甲基化基因至少二分之一(l/2)的發(fā)現率，和對于鑒定癌癥特異性過度甲基化基因至少三分之一(l/3)的發(fā)現率。實施例5雖然清楚的是，遺傳和外遺傳機制對人類腫瘤發(fā)生的起始和進展都是重要的，但是對這些改變的每個的相對貢獻了解不多。對少數癌基因甲基化和突變頻率之間的比較還沒有令人信服地證明任一途徑的普遍性。重要地是，還沒有進行全基因組分析來質疑這個問題。在最近的癌基因全基因組測序中，Sj6blom等(3)觀察到突變一般而言具有低的發(fā)生率，鑒定的90%的基因包含小于10%的突變頻率。此外，典型的結腸或者乳腺癌每個單個腫瘤僅含有平均11個突變,單個腫瘤之間具有很少的重疊。這些低頻率提出了這樣的問題是否可選的機制可能在另外的腫瘤中導致這些基因的失活。顯然，我們現在在個體腫瘤中鑒定到數量大得多的候選過度甲基化基因(圖2C)，這表示這種外遺傳改變可能為許多腫瘤抑制基因的突變提供了可選的失活途徑。35[100]當我們搜索候選過度甲基化基因和189種突變癌(CAN)基因之間的匹配時，篩査腫瘤的遺傳和外遺傳變化的重要性被顯著加強。我們首先質疑我們5906個過度甲基化組基因清單與在乳腺和CRC腫瘤中鑒定的CAN基因清單。這鑒定了這56種共有基因，其中45種含有CpG島。這些45種基因中的26種(58%)——類似于如上所述鑒定的所有候選基因的證實率——證明在6個細胞系的至少1個中被過度甲基化，并被選擇用于進一步研究。重要地是，正好一半的基因(13種基因)在正常結腸中未被甲基化，但是在原發(fā)性CRC腫瘤中被甲基化(圖3B、C)，給出了鑒定腫瘤特異性甲基化的50%的頻率。對于事實上每種檢查的基因，過度甲基化的發(fā)生率顯著高于突變的發(fā)生率(圖3D)。因此，不同于突變的基因，大多數基因的過度甲基化在許多腫瘤之間是共有的性質。在先前未表征的基因中這些外遺傳沉默和突變的發(fā)現鞏固了它們作為腫瘤抑制基因的可能作用。(圖3E)。實施例6—收集的BNIP3、F0XE1、SYNE1、S0X17、JAM3、MMP2和GPNMB的另外組織數據材料和方法賴f資織據W游游尿存^對應于77個正常組織和94個癌樣品，總共171個結腸石蠟包埋的組織樣品使用實時MSP進行處理。表2給出了用于組織確認的樣品組的概述。表2-臨床樣品組的詳細資料<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>石微微辦，磨微福爾馬林固定的石蠟包埋樣品首先在750pl的二甲苯中去除石蠟2小時。然后，在以13000rpm離心15分鐘之前，加入250pl的70%的乙醇。除去上清液，并在室溫下空氣干燥樣品20分鐘。使用經典的酚/氯仿提取方法提取DNA，并在50^il的LoTe(3mMTRIS，0.2mMEDTA，pH8.0)中重懸浮。隨后，使用PicogreendsDNA定量試劑盒(MolecularProbes,Invi加gen)，依照制造商的推薦對DNA定量。隨試劑盒提供的XDNA用于制備標準曲線(從1到800ng/ml)。使用FluoStarGalaxy平板讀取器(BMGLabtechnologies,德國)收集數據。ZW」參欲使用EZ-96DNA甲基化試劑盒(ZymoResearch)，依照制造商的方案，1嗎的DNA在移液自動機(Tecan)上以96孔形式進行亞硫酸氫鹽修飾?；旧希确莸?5^與5^的M-稀釋緩沖液(M-DilutionBuffer)混合，并在37°C以1100rpm搖動溫育15分鐘。接著加入100Hl的稀釋的CT轉化試劑，樣品在70'C、在黑暗中以1100rpm搖動溫育3小時。在轉化后，通過在冰上溫育10分鐘進行和加入400^的M-結合緩沖液對樣品脫鹽。樣品加樣到收集盤中的Zymo-Spinl柱上，并離心后，用200^1的M-洗滌緩沖液(M-WashBuffer)洗滌。200pl的M-去磺化緩沖液(M-DesulphonationBuffer)放置在柱上并在室溫溫育15分鐘。在柱子離心后，它們用200m1的M-洗滌緩沖液洗漆2次。最后，DNA在125)ilTris-HClmMpH8.0中從柱上洗脫和儲存在-8(TC，直到進一步的處理。藩jf譜在7900HT快速實時PCR系統(tǒng)上(AppliedBiosystems)應用實時MSP。5pl修飾的DNA加到PCR混合物(總體積10pl)中，PCR混合物含有緩沖液(16.6mM(NH4)2S04、67mMTris(pH8.8)、6.7mMMgC12、10mMp-巰基乙醇)、dNTPs(5mM)、正向引物(6ng)、反向引物(18ng)、分子信標(0.16pM)和JumpstartDNATaq聚合酶(0.4單位；SigmaAldrich)。用于每個基因的引物序列和分子信標序列總結在表3中。使用如下循環(huán)程序5分鐘95°C，接著45個30秒95°C、30秒57。C和30秒72。C的循環(huán)。包括標準曲線(2><106—2()拷貝)以通過內插它們的Ct值到標準曲線來確定未知樣品的拷貝數。表3-引物序列和信標序列BNIP3正向引物5'-TACGCGTAGGTTTTAAGTCGC-3'(SEQIDNO:251)反向引物5'-TCCCGAACTAAACGAAACCCCG-3'(SEQIDNO:252)信標5'-FAM-CGACATGCCTACGACCGCGTCGCCCATTAGCATGTCG-3'-DABCYL(SEQIDNO:253)FOXE1正向引物5'-TTTGTTCGTTTTTCGATTGTTC-3，(SEQIDNO:254)反向引物5'-TAACGCTATAAAACTCCTACCGC-3'(SEQIDNO:255)信標5'-FAM-CGTCTCGTCGGGGTTCGGGCGTATTTTTTTAGGTAGGCGAGACG-3'-DABCYL(SEQIDNO:256)JAM3正向引物5'-GGGATTATAAGTCGCGTCGC-3'(SEQIDNO:257)37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>測量值表示為甲基化比率，定義為與ACTB比較每個基因的熒光強度值的比率，乘以IOOO，以便容易作表。如在圖10-16中所指出，在調查的對照和病例組之間，觀察到清楚的比率差異。參考文獻1.PonderB.A.Cancergenetics.淑置411，336-41(2001).2.Herman,J.G.&Baylin，S.B.Genesilencingincancerinassociationwithpromoterhypermethylation,iVE"g/JAfed349，2042-54(2003).3.Sj5blomT.etal.Theconsensuscodingsequencesofhumanbreastandcolorectalcancers.5Wem:e314,268-74(2006).4.Antequera,R&Bird，A.Numberofcpgislandsandgenesinhumanandmouse.^90,11995-11999(1993).5.Costello，J.F.etal.AberrantCpG-islandmethylationhasnon-randomandtumour-type-specificpatterns,AtoGe贈.24,132-138(2000),6.Suzuki,H.etal.Agenomicscreenforgenesupregulatedbydemethylationandhistonedeacetylaseinhibitioninhumancolorectalcancer,AtoG^贈31，141-9(2002),7.Gius，D.etal.Distincteffectsongeneexpressionofchemicalandgeneticmanipulationofthecancerepigenomerevealedbyamultimodalityapproach.Ce〃6，361-71(2004).8.Paz，M,F.etal.GeneticunmaskingofepigeneticallysilencedtumorsuppressorgenesincoloncancercellsdeficientinDNAmethyltransferases.Afo/Ge"ef12,2209-19(2003).9.Weber，M,etal.Chromosome-wideandpromoter-specificanalysesidentifysitesofdifferentialDNAmethylationinnormalandtransformedhumancells.iVaf37,853-62(2005).10.Hu，M.etal.Distinctepigeneticchangesinthestromalcellsofbreastcancers.Ge""37,899-905(2005).11.Toyota,M.etal.IdentificationofdifferentiallymethylatedsequencesincolorectalcancerbymethylatedCpGislandamplification.CVmcer7^y59，2307-12(1999).12.Keshet,I.etal.Evidenceforaninstructivemechanismofdenovomethylationincancercells.淑G匿f38,149-53(2006).13.Ushijima，T.Detectionandinterpretationofalteredmethylationpatternsincancercells,A^7evCawcer5,223-31(2005).14.Rhee,I.etal.DNMT1andDNMT3bcooperatetosilencegenesinhumancancercells.胸贓416,552-6(2002),15.Toyota,M.etal.EpigeneticinactivationofCHFRinhumantumors./VocA^"a7j&/"5^100,7818-23(2003).16.Suzuki，H.etal，EpigeneticinactivationofSFRPgenesallowsconstitutiveWNTsignalingincolorectalcancer,7Va/Gew"36，417-22(2004).17.Akiyama,Y.etal.GATA-4andGATA-5transcriptionfactorgenesandpotentialdownstreamantitumortargetgenesareepigeneticallysilencedincolorectalandgastriccancer.Mo/Ce〃5zW23,8429-39(2003).18.ChristmanJ.K,5-Azacytidineand5-aza-2'-deoxycytidineasinhibitorsofDNAmethylation:mechanisticstudiesandtheirimplicationsforcancertherapy.(9腳g匿21,5483-95(2002).19.Cameron,E,E.，Bachman,K.E.,Myohanen，S.,Herm叫J.G,&Baylin,S.B.Synergyofdemethylationandhistonedeacetylaseinhibitioninthere-expressionofgenessilencedincancer.AtoGW/ef21，103-7(1999).20.Herman,J.G,Graff,J.R.，Myohanen,S.，Nelkin,B.D.&Baylin，S.B.Methylation-specificPCR:anovelPCRassayformethylationstatusofCpGislands,A^W^c^/5W"S」93，9821-6(1996).21.YamashitaK,UpadhyayS,OsadaM，HoqueMO,XiaoY,MoriM,SatoF,MeltzerSJ,SidranskyD.Pharmacologicunmaskingofepigeneticallysilencedtumorsuppressorgenesinesophagealsquamouscellcarcinoma.CW/2485-95(2002).22.Egger,G,,Liang，G，Aparicio,A.&Jones,P.A.Epigeneticsinhumandiseaseandprospectsforepigenetictherapy.Atowre429,457-63(2004).23.Ihaka,R.&Gentleman,R.C.R:Alanguagefordataanalysisandgraphics,c/oww"/Cb呼w加細"/awdCrap/z/c"/5toto/to5,299-314(1996).24.Gentleman,R.C.etal.Bioconductor:opensoftwaredevelopmentforcomputationalbiologyandbioinformatics.G^wo附e5z》/5,R80(2004).25.Smyth,G.K.&Speed,T.NormalizationofcDNAmicroarraydata.M"/2oA31，265-73(2003).26.Smyth,G.K.，Yang,Y.H.&Speed,T.StatisticalissuesincDNAmicroarraydataanalysis,M"/70AMo/歷o/224，111-36(2003)。權利要求1.鑒定結腸直腸癌或它的前體、或結腸直腸癌的傾向的方法，包括在含有結腸直腸細胞或者來自結腸直腸細胞的核酸的試樣中，檢測至少一種基因的外遺傳沉默，所述至少一種基因選自FOXE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxD1、Jph3、神經化(NEURL)、PPP1R14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPON1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655；鑒定所述試樣含有細胞，所述細胞是瘤性的、瘤的前體、或易于形成瘤，或者鑒定所述試樣含有來自細胞的核酸，所述細胞是瘤性的、瘤的前體、或易于形成瘤。2.權利要求l所述的方法，其中所述試樣含有腺瘤細胞。3.權利要求l所述的方法，其中所述試樣含有來自腺瘤細胞的核酸。4.權利要求1所述的方法，其中所述試樣含有癌細胞或者來自癌細胞的核酸。5.權利要求l所述的方法，其中所述至少一種基因是選自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。6.權利要求l所述的方法，還包括步驟在所述含有結腸直腸細胞或者來自結腸直腸細胞的核酸的試樣中，檢測至少一種基因中的突變，所述至少一種基因選自FOXEl、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、A畫CX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHU、ZFP42、AS(X2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。7.權利要求l所述的方法，其中所述試樣來自新鮮或冷凍組織樣品。8.權利要求l所述的方法，其中所述試樣來自活檢樣品。9.權利要求l所述的方法，其中所述試樣來自手術樣品。10.權利要求l所述的方法，其中所述試樣來自細胞學樣品。11.權利要求1所述的方法，其中所述試樣從體液中分離，所述體液選自全血、骨髓、腦脊髓液、腹腔液、胸膜液、淋巴液、血清、粘液、血漿、尿液、乳糜、糞便、精液、痰、乳頭抽吸液、唾液、拭樣、結腸清洗樣品和刷樣。12.權利要求8所述的方法，其中向所述患者推薦外科手術去除瘤性組織。13.權利要求8所述的方法，其中向所述患者推薦輔助化療。14.權利要求8所述的方法，其中向所述患者推薦輔助放射治療。15.權利要求ll所述的方法，其中向所述患者推薦結腸鏡檢査或者乙狀結腸鏡檢查。16.權利要求8所述的方法，其中向所述患者推薦增加頻率的結腸鏡檢査。17.權利要求ll所述的方法，其中向所述患者推薦所述結腸的成像研究。18.權利要求l所述的方法，其中檢測至少兩種基因的外遺傳沉默。19.權利要求l所述的方法，其中通過檢測在所述基因中CpG二核苷酸基序的甲基化來檢測外遺傳沉默。20.權利要求l所述的方法，其中通過檢測在所述基因啟動子中CpG二核苷酸基序的甲基化來檢測外遺傳沉默。21.權利要求1所述的方法，其中通過檢測所述基因減少的表達來檢測外遺傳沉默。22.權利要求21所述的方法，其中通過檢測所述基因減少的mRNA來檢測外遺傳沉默。23.權利要求21所述的方法，其中通過與對照樣品比較來測定所述基因減少的表達。24.權利要求22所述的方法，其中通過與核苷酸探針雜交來檢測所述基因減少的mRNA。25.權利要求21所述的方法，其中通過核苷酸測序來檢測減少的表達。26.權利要求21所述的方法，其中通過反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來檢測減少的表達。27.權利要求26所述的方法，其中所述RT-PCR是以非定量的方式進行。28.權利要求26所述的方法，其中所述RT-PCR是以實時和定量的方式進行。29.權利要求21所述的方法，其中通過檢測所述基因編碼的減少的蛋白質來檢測外遺傳沉默。30.權利要求19所述的方法，其中甲基化通過將所述基因的至少一部分與甲基化敏感的限制性內切核酸酶接觸來檢測，所述內切核酸酶相對于非甲基化的識別位點優(yōu)選地剪切甲基化的識別位點，由此所述基因的所述部分的剪切表明所述基因的所述部分的甲基化。31.權利要求19所述的方法，其中甲基化通過將所述基因的至少一部分與甲基化敏感的限制性內切核酸酶接觸來檢測，所述內切核酸酶相對于甲基化的識別位點優(yōu)選地剪切非甲基化的識別位點，由此所述基因的所述部分的剪切表明所述基因的所述部分的非甲基化，條件是所述基因包括所述甲基化敏感的限制性內切核酸酶識別位點。32.權利要求19所述的方法，其中甲基化通過如下檢測將所述測試細胞的基因的至少一部分與化學試劑接觸，所述化學試劑相對于甲基化胞嘧啶殘基選擇性地修飾非甲基化的胞嘧啶殘基，或相對于非甲基化胞嘧啶殘基選擇性地修飾甲基化的胞嘧啶殘基；和檢測由于所述接觸所產生的產物。33.權利要求32所述的方法，其中所述檢測步驟包括與至少一種探針雜交，所述探針與包括修飾的非甲基化的CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括非修飾的甲基化CpG二核苷酸的序列雜交。34.權利要求32所述的方法，其中所述檢測步驟包括與至少一種探針雜交，所述探針與包括非修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括修飾的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交。35.權利要求32所述的方法，其中所述檢測步驟包括用至少一種引物擴增，由此形成擴增產物，所述引物與包括修飾的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括非修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交。36.權利要求32所述的方法，其中所述檢測步驟包括用至少一種引物擴增，由此形成擴增產物，所述引物與包括非修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括修飾的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交。37.權利要求32所述的方法，其中所述產物通過選自電泳、雜交、擴增、引物延伸、測序、連接酶鏈反應、色譜、質譜和其組合的方法來檢測。38.權利要求37所述的方法，其中所述方法是絕對檢測方法。39.權利要求37所述的方法，其中所述方法是實時檢測方法。40.權利要求37所述的方法，其中所述方法對至少兩種基因進行和比較所述至少兩種基因產生的產物。41.權利要求32所述的方法，其中所述化學試劑是肼。42.權利要求41所述的方法，還包括用哌啶剪切所述肼接觸的至少一部分的所述基因。43.權利要求32所述的方法，其中所述化學試劑包括亞硫酸氫鹽離子。44.權利要求43所述的方法，還包括用堿處理所述亞硫酸氫鹽離子接觸的至少一部分的所述基因。45.減少或者抑制細胞瘤性生長的方法，所述細胞顯示了與癌癥相關的至少一種基因的外遺傳沉默轉錄，所述方法包括確定細胞具有外遺傳沉默的基因，所述基因選自F0XE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TXR2、UCHU、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655;通過將所述細胞與一種或者多種試劑接觸，恢復在所述細胞中由所述外遺傳沉默基因編碼的多肽的表達，所述試劑選自CpG二核苷酸脫甲基劑、DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑，由此減少或抑制所述細胞不受調節(jié)的生長。46.權利要求45所述的方法，其中所述基因選自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。47.權利要求45所述的方法，其中所述接觸在體外進行。48.權利要求45所述的方法，其中通過將所述試劑給予含有所述細胞的哺乳動物對象在體內進行所述接觸。49.權利要求45所述的方法，其中所述試劑是脫甲基劑，并且所述試劑選自5-氮雜-2，-脫氧胞苷、5-氮雜-胞苷、澤布拉恩、普魯卡因和L-乙硫氨酸。50.減少或者抑制細胞瘤性生長的方法，所述細胞顯示了至少一種與癌癥相關的基因的外遺傳沉默轉錄，所述方法包括確定細胞具有外遺傳沉默的基因，所述基因選自F0XE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTBl、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCX1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655;將編碼多肽的多核苷酸引入所述細胞，其中所述多肽由所述基因編碼，其中所述多肽在所述細胞中表達，由此恢復所述多肽在所述細胞中的表達。51.權利要求50所述的方法，其中所述基因選自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。52.治療癌癥患者的方法，所述方法包括確定在所述患者中的癌細胞有外遺傳沉默的基因，所述基因選自FOXEl、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHU、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655;以足夠量將一種或者多種選自CpG二核苷酸脫甲基劑、DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑的試劑給予所述患者，以恢復所述外遺傳沉默基因在所述患者癌細胞中的表達。53.權利要求52所述的方法，其中所述試劑是脫甲基劑，和所述試劑選自5-氮雜-2，-脫氧胞苷、5-氮雜-胞苷、澤布拉恩、普魯卡因和L-乙硫氨酸。54.權利要求52所述的方法，其中所述基因選自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。55.治療癌癥患者的方法，所述方法包括確定在所述患者中的癌細胞具有外遺傳沉默的基因，所述基因選自F0XE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCUA、TFPI-2、TLR2、UCHU、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655所示的基因；給予所述患者編碼多肽的多核苷酸，其中所述多肽由所述外遺傳沉默的基因編碼，其中所述多肽在所述患者的腫瘤中表達，由此恢復所述多肽在所述癌中的表達。56.權利要求55所述的方法，其中所述外遺傳沉默的基因選自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。57.選自治療癌癥患者的治療策略的方法，包括鑒定基因，所述基因在所述患者的癌細胞中的表達被選自CpG二核苷酸脫甲基劑、DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑的一種或者多種試劑再激活，其中所述基因選自FOXEl、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GP畫B、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、A腹CX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCUA、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C麗3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPON1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655;禾口選擇增加所述基因表達以治療所述癌癥患者的治療劑。58.權利要求57所述的方法，其中所述基因選自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、脂F182、ICAM5。59.權利要求57所述的方法，還包括為所述癌癥患者開處所述治療劑的步驟。60.權利要求57所述的方法，還包括給予所述癌癥患者所述治療劑的步驟。61.權利要求57所述的方法，其中所述治療劑包括編碼所述基因的多核苷酸。62.權利要求57所述的方法，其中所述脫甲基劑是5-氮雜-2'-脫氧胞苷。63.權利要求57所述的方法，其中所述治療劑是5-氮雜-2'-脫氧胞苷。64.權利要求57所述的方法，其中所述癌細胞從手術樣品獲得。65.權利要求57所述的方法，其中所述癌細胞從活檢樣品獲得。66.權利要求57所述的方法，其中所述癌細胞從細胞學樣品獲得。67.權利要求57所述的方法，其中所述癌細胞從糞便、粘液、血清、血液或尿獲得。68.評定在試樣中的甲基化的試劑盒，在包裝中包括試劑，其(a)修飾甲基化的胞嘧啶殘基，但是不修飾非甲基化的胞嘧啶殘基，或(b)修飾非甲基化的胞嘧啶殘基，但是不修飾甲基化的胞嘧啶殘基；和一對寡核苷酸引物，其在擴增條件下與基因的區(qū)域特異性雜交，所述基因選自F0XE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神經化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、函RTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655所示的基因，其中所述區(qū)域在大約lkb的所述基因的轉錄起始位點內。69.權利要求68所述的試劑盒，其中所述基因選自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。70.權利要求68所述的試劑盒，其中所述寡核苷酸引物對中的至少一個引物與包括修飾的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括未修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，或者其中所述寡核苷酸引物對中的至少一個引物與包括未修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括修飾的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交。71.權利要求68所述的試劑盒，還包括(a)第一寡核苷酸探針，其與包括修飾的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括未修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，(b)第二寡核苷酸探針，其與包括未修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括修飾的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，或(c)所述的第一和第二寡核苷酸探針兩者。72.權利要求68所述的試劑盒，還包括(a)第一寡核苷酸探針，其與包括修飾的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括未修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，(b)第二寡核苷酸探針，其與包括未修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，但是不與包括修飾的甲基化CpG二核苷酸基序的序列雜交，或(c)所述第一和第二寡核苷酸探針兩者。73.權利要求68所述的試劑盒，還包括寡核苷酸探針。74.權利要求68所述的試劑盒，還包括用于擴增DNA的DNA聚合酶。全文摘要我們已經開發(fā)了全轉錄物組方法來鑒定在結腸直腸癌(CRC)中受到啟動子CpG島過度甲基化和轉錄沉默影響的基因。通過在一組原發(fā)性人類CRC樣品中篩查細胞系和確認腫瘤特異性過度甲基化，我們估計在個體腫瘤中所有已知基因的幾乎5％可能被啟動子甲基化。當直接與基因突變比較時，我們在個體腫瘤中發(fā)現數量大得多的基因被過度甲基化，和在包含遺傳或者外遺傳變化的個體基因內高得得多的過度甲基化頻率。因此，為了列舉人類癌癥基因組中的全變化譜，和有助于對腫瘤進行最有效的分組從而鑒定癌癥生物標記并調整治療方法，應該進行遺傳和外遺傳兩種篩查。我們鑒定的基因可以用于診斷性地檢測癌癥、初癌和發(fā)展癌的可能性等等。文檔編號C12P19/34GK101688239SQ200880010320公開日2010年3月31日申請日期2008年2月12日優(yōu)先權日2007年2月12日發(fā)明者K·E·舒貝爾,S·B·拜林,W·V·克里金格申請人:約翰·霍普金斯大學;昂卡姆塞羅姆科學公司