專利名稱：：一種生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法。技術(shù)背景畢赤酵母已成為近年來發(fā)展最快的酵母表達(dá)系統(tǒng)，廣泛用于各種重組蛋白表達(dá)，尤其在疫苗生產(chǎn)中具有明顯優(yōu)勢。畢赤酵母與大腸桿菌相比，它可用于復(fù)雜蛋白表達(dá)，且表達(dá)蛋白具有天然生物活性或構(gòu)型。與其它酵母相比，它還具有外源蛋白分泌能力強(qiáng)、蛋白表達(dá)水平高和適合于高密度培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。與哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，它又具有生長快、便于基因操作、大規(guī)模培養(yǎng)和培養(yǎng)成本低廉等優(yōu)勢。畢赤酵母可以對其表達(dá)的蛋白進(jìn)行N-糖基化修飾，糖基化修飾對蛋白質(zhì)的正確折疊、穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要。但畢赤酵母的N-糖基化修飾與哺乳動物細(xì)胞有明顯區(qū)別，哺乳動物細(xì)胞的N-糖基修飾，一般每個糖基含10-20個單糖，分子量為1500-3000。而畢赤酵母的N-糖基化修飾常常為過度糖基化修飾，每個糖基可以含三十至上百個甘露糖，分子量為四千至數(shù)萬，糖蛋白分子量明顯增大，而且由于過度糖基化修飾往往不均一，因而糖蛋白分子量也不均一，SDS-PAGE分析時出現(xiàn)明顯"拖尾"。畢赤酵母用于糖蛋白疫苗生產(chǎn)時，這種過度糖基化修飾可遮蔽抗原表位，降低抗原的免疫原性。在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，簡單地通過將蛋白上的糖基化位點(diǎn)突變來去除蛋白過度糖基化修飾對抗原的遮蔽又可能會帶來新的問題如酵母表達(dá)的HBV的pre-Sl和pre-S2都會被過度糖基化修飾，形成含有30多個甘露糖殘基的糖鏈，將pre-Sl和pre-S2的糖基化位點(diǎn)都突變后，免疫原性雖然比過度糖基化修飾的要強(qiáng)，但卻出現(xiàn)了合成困難，易被蛋白酶降解的問題，難以用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)(JeewonLee，Jin-SeungPark,Je-YoungMoon，ets7.Theinfluenceofglycosylationonsecretion,stability,andimmunogenicityofrecombinantHBVpre-SantigensynthesizedinSaccharomycescerevisiae[J].BiochemBiophyResCommun，2003,303(2):427-432.)。ot-l，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶是酵母在高爾基體中向來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白N-糖基(N-GluNac2Man8)上加上第一個a-1，6-甘露苷的糖基轉(zhuǎn)移酶，其產(chǎn)物N-GluNac2Mang是后續(xù)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法，是將糖蛋白基因?qū)隺-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的畢赤酵母中構(gòu)建重組菌，用所述重組菌生產(chǎn)糖蛋白，以所述糖蛋白作為疫苗的活性成分。其中，本發(fā)明所述的糖蛋白可以是各種可作為疫苗的糖蛋白及其變異體，如流感神經(jīng)氨酸酶、流感血凝素、含preS的乙肝病毒表面大抗原、HIV病毒的GP120蛋白、丙肝的E1抗原、丙肝的E2抗原、SARS的刺突蛋白、單純皰疹病毒糖蛋白、狂犬病毒糖蛋白、嗜B細(xì)胞病毒gP340蛋白、日本腦炎病毒糖蛋白或典型豬瘟病毒糖蛋白E2等。優(yōu)選的糖蛋白為流感神經(jīng)氨酸酶或含preS的乙肝病毒表面大抗原。所述生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法中，還可包括將所述糖蛋白與佐劑混合。佐劑和糖蛋白混合使用，不但有助于注射物質(zhì)的沉積或匯集，而且能增強(qiáng)抗體反應(yīng)，所述佐劑可為現(xiàn)有的多種佐劑，如氫氧化鋁或MF59等。a-l,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的重組畢赤酵母可以是通過敲除部分或全部的a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因(序列表中序列3)序列，也可以通過誘變或篩選自發(fā)突變株獲得，其中較優(yōu)的是敲除部分或全部的基因序列，所述敲除部分的基因序列較優(yōu)的是指敲除至少10%的a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因序列，更好的是敲除其啟動子序列或編碼序列。一種優(yōu)選的a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的重組畢赤酵母是敲除了a-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因約1000bp編碼序列的畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853(簡稱為GJK)，其詳細(xì)構(gòu)建方法見實施例1。與誘變或自發(fā)突變株產(chǎn)生的點(diǎn)突變中的單個堿基的變化不同，這種a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶部分或全部基因序列的敲除，具有不易產(chǎn)生回復(fù)突變的優(yōu)勢，這在疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中具有重要的意義。因為在疫苗規(guī)模生產(chǎn)時，如果出現(xiàn)少量菌株的回復(fù)突變，由于回復(fù)突變后的菌株生長速度比cx-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶缺陷株快，因此隨著生長時間的延長，回復(fù)突變的野生表型菌株就會訊速增加，從而導(dǎo)致表達(dá)的糖蛋白上糖基結(jié)構(gòu)的改變。這樣就會導(dǎo)致生產(chǎn)過程的不穩(wěn)定和難以控制。所述通過敲除部分或全部的a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因序列滅活的重組畢赤酵母具體可用如下方法獲得1)在載體的多克隆位點(diǎn)插入a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上游同源區(qū)和下游同源區(qū)構(gòu)建a-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活載體；所述a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上游同源區(qū)為如下A)或B)的DNA片段，所述a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的下游同源區(qū)為如A)大小為至少200bp的DNA片段，該片段選自序列表中序列3;B)在嚴(yán)格條件下與A)限定的DNA片段雜交的片段；C)大小為至少200bp的DNA片段，該片段選自序列表中序列3，且該片段位于所述片段A)的下游，與所述片段A)相距至少10。/。a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因序列；D)在嚴(yán)格條件下與C)限定的DNA片段雜交的片段；2)將所述a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活載體導(dǎo)入畢赤酵母中獲得重組畢赤酵母。上述嚴(yán)格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。為了便于篩選，在上游同源區(qū)和下游同源區(qū)中間可以帶有作為篩選標(biāo)記的基因，如抗生素抗性基因(如Zeo、Kan等)、營養(yǎng)缺陷補(bǔ)償基因(如His4、Arg、ADE、URA3等)。這種用于重組的核酸片段可以通過PCR的方法獲得或著用人工合成的方法獲得。相應(yīng)的序列可以從公開的數(shù)據(jù)庫獲得，如畢赤酵母的a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因序列，在美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的GenBanK中已經(jīng)公開(收錄號E12456)。畢赤酵母可以從商業(yè)化的或各菌種保藏中心獲得，如畢赤酵母GS115可以從美國invitrogen公司購買。將重組滅活載體或片段導(dǎo)入酵母中可以用電轉(zhuǎn)化、PEG轉(zhuǎn)化法(如J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第三版，科學(xué)出版社，2002)，將轉(zhuǎn)化后的菌體涂布在與質(zhì)粒中選擇性標(biāo)記相對應(yīng)的篩選培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。可以通過PCR、Southern雜交等方法確證敲除是否正確。本發(fā)明實施例l提供了一種敲除部分a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因序列滅活該酶的重組畢赤酵母構(gòu)建的詳細(xì)方法。所述將糖蛋白基因?qū)隺-l,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的重組畢赤酵母中生產(chǎn)糖蛋白的方法，可以用各種酵母表達(dá)載體，具體可為pPIC9、pPICZ、pHIL-D2或pHIL-Sl。這些基因在畢赤酵母中的表達(dá)可以用與該酵母相適應(yīng)的各種啟動子控制，優(yōu)選的是醇氧化酶啟動子A0X1。這些糖蛋白的氨基酸序列及編碼這些氨基酸序列的核酸序列可以從各種公開的文獻(xiàn)、書籍和公共數(shù)據(jù)庫中獲得，如從美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的GenBank獲得，根據(jù)這些序歹ij，可以用本領(lǐng)域周知的方法如PCR(Saiki等Science.239:487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法和構(gòu)建篩選cDNA文庫的方法等獲得相應(yīng)的基因，用作PCR模板和用于構(gòu)建cDNA文庫的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的病毒、細(xì)胞及文庫等，這些病毒、細(xì)胞可以從各種菌、毒種庫獲得，細(xì)胞和文庫也可以從一些公司購得。較優(yōu)的方法是采用人工合成的方法獲得，在人工合成時可以通過選用酵母偏愛密碼子、優(yōu)化mRNA二級結(jié)構(gòu)等方法優(yōu)化設(shè)計相應(yīng)蛋白的編碼序列，從而提高其在畢赤酵母中的表達(dá)水平。若需要可用本領(lǐng)域公知的方法對多聚核苷酸進(jìn)行突變、缺失、插入和與其它多聚核苷酸連接等。如果需要可在編碼基因的兩側(cè)引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。可用本領(lǐng)域公知的方法將含編碼序列的核酸克隆到各種表達(dá)載體中去。所用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆過程見J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995.)的敘述。本方法制備的糖蛋白可以用各種方法分離如離心、鹽析、沉淀、超濾和液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。其中液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水和反相等層析技術(shù)。本發(fā)明方法生產(chǎn)的糖蛋白還可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形式的鹽和修飾產(chǎn)物等。如在多肽的氨基、羧基、羥基或巰基上再進(jìn)行修飾。所用修飾劑可以但不局限于聚乙二醇或葡聚糖等。本發(fā)明的生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法生產(chǎn)的疫苗也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述疫苗中的活性成分是低糖基化的糖蛋白，所述低糖基化糖蛋白的50%以上的N-糖鏈上的單糖數(shù)不大于20個，糖含量小于30%。所述疫苗可由所述糖蛋白單獨(dú)組成，也可由所述糖蛋白與其它抗原聯(lián)合組成，還可由所述糖蛋白與佐劑聯(lián)合使用。本發(fā)明用a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的重組畢赤酵母生產(chǎn)糖蛋白，即具有畢赤酵母生長快，適合于規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化成本低等優(yōu)點(diǎn)，又避免了普通畢赤酵母存在的對蛋白進(jìn)行過度糖基化修飾的問題。普通畢赤酵母表達(dá)的過度糖基化修飾的糖蛋白常表現(xiàn)為分子量不均一，SDS-PAGE分析出現(xiàn)明顯"拖尾"，且其中大部分蛋白的分子量明顯大于根據(jù)其氨基酸序列計算的理論分子量，糖含量常大于30%。每個糖基可以含30至上百個甘露糖，分子量為4000至數(shù)萬。而用a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的重組畢赤酵母表達(dá)的糖蛋白，為低糖基化修飾的糖蛋白，分子量基本均一。SDS-PAGE分析"拖尾"現(xiàn)象消失，糖含量小于30%。本發(fā)明生產(chǎn)的糖蛋白疫苗中的活性成分是低糖基化的糖蛋白，其免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力明顯優(yōu)于普通酵母生產(chǎn)的過度糖基化修飾糖蛋白和大腸桿菌生產(chǎn)的非糖蛋白，本發(fā)明生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法生產(chǎn)的疫苗可以提高抗體滴度、降低抗原用量和減少免疫次數(shù)。圖l為畢赤酵母GS115生產(chǎn)的NA(GS115-NA)的SDS-PAGE。圖2為畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)的NA(GJK-NA)的SDS-PAGE。圖3為大腸桿菌生產(chǎn)的非糖基化NA蛋白(E.coli-NA)的SDS-PAGE。圖4為GJK-NA、GS115-NA和E.coli-NA分別免疫小鼠二次后的血清抗體水平。圖5為GJK-NA、GS115-NA和E.coli-NA分別免疫小鼠三次后的血清抗體水平。圖6為畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)的HBV-L抗原(GJK-L)和畢赤酵母GS115生產(chǎn)的HBV-L抗原(GS115-L)的SDS-PAGE分析1:GJK-L;2、3:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；4:GS115-L。圖7為GJK-L和GS115-L分別免疫小鼠三次后的血清抗體水平。具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。丄、'土廠wi"歐T甲ai安、敗鵬鵬'蟲口;5t田一、a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶滅活的畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853的構(gòu)建1.敲除質(zhì)粒的構(gòu)建用玻璃珠制備法(A.亞當(dāng)斯等，《酵母遺傳學(xué)方法實驗指南》，科學(xué)出版社，2000)提取畢赤酵母GS115(購自Invitrogenlifetechnologies,caxlsbad，California92008，USA)的基因組，以該基因組為模板擴(kuò)增a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(0CH1)兩側(cè)的同源臂、URA3基因和ADE基因(PCR反應(yīng)所用的pyrobest酶購自寶生物工程有限公司，大連；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，北京)，0CH1兩側(cè)的同源臂為900bp，中間缺失約1000bp的編碼基因，擴(kuò)增0CH15'端同源臂所用的引物為pll05:5'-acggatccccggaaaaccgagagaactct-3'和pll06:5'-acgcggccgcagagcgatagagaatgttccagg-3，，擴(kuò)增0CH13，端同源臂所用的引物為pll03:5，-acgcggccgcggatcctaatgaggccaaggaattggagctggct-3，禾口pll04:5，-agggtacctgggaagagatgtcttgtgcac-3，。兩個同源臂的PCR擴(kuò)增條件如下94i:變性5min后，按照94"C變性30sec、55。C復(fù)性30sec、72。C延伸lmin進(jìn)行30次循環(huán)，最后72延伸10min。以畢赤酵母GS115基因組為模板，擴(kuò)增URA3基因的引物為pURA3-5:5，-aaccaactgcagtggggagataaccacctttgac-3，禾口pURA3-3:5，-tttcggtaccttgctggctactccttgagtctg-3，，PCR擴(kuò)增條件如下94。C變性5min后，按照94。C變性30sec、55。C復(fù)性30sec、72。C延伸2min,進(jìn)行30次循環(huán)，最后72延伸10min，目的片斷大小在2kb左右；以釀酒酵母基因組為模板，擴(kuò)增ADE基因所用的弓l物為pADE-5:5，-atttgcggccgctattcacgagtcagtctgactct-3，禾口pADE-3:5，-atttgcggccgcaatcctcgagaagcaagctattg-3，，PCR擴(kuò)增條件如下94。C變性5min后，按照94。C變性30sec、55。C復(fù)性30sec、72。C延伸lmin30sec進(jìn)行30次循環(huán)，最后72延伸10min，目的片斷大小在l.5kb左右。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收(購自鼎國生物技術(shù)有限公司，北京)。以質(zhì)粒pYes2(購自Invitrogenlifetechnologies,caxlsbad，California92008，USA)為模板，pll01:5，-atagatctagaacatgtgagcaaaaggc-3'禾口pll02:5'-acagatctggcccgataggccatcccgggcgcggccgcggtaccctagcttttcaattcaattcatca-3，為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件如下94"C變性5min后，按照94'C變性30sec、55。C復(fù)性30sec、72。C延伸3min，進(jìn)行30次循環(huán)，最后72延伸10min，目的片斷在3kb左右。反應(yīng)產(chǎn)物回收后以限制性內(nèi)切酶BglII(本試驗所用的限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程有限公司，大連)酶切回收，回收產(chǎn)物中加入T4連接酶(購自寶生物工程有限公司，天連T716匸反應(yīng)過夜，酶切產(chǎn)物自連生成質(zhì)粒pGE1201，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct(購自鼎國生物技術(shù)有限公司，北京)，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆。將PCR擴(kuò)增的5，同源臂以BaraHI和NotI酶切，克隆到用BamHI/Notl酶解的上述制備的pGE1201質(zhì)粒上，形成pGE1202，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆。酶切鑒定正確。再將PC財廣增的3'同源臂以NotI和KpnI酶切，克隆到用Notl/Kpnl酶解的pGE1202上，形成pGE1203,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆。酶切鑒定正確。再以Pstl和Kpnl酶切PCR擴(kuò)增的URA3基因，克隆到用Pstl/Kpnl酶解的pGE1203上，形成pGE1203-URA3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆。酶切鑒定正確。將pGE1203-URA3以Not頂每切，再用CIAP(購自寶生物工程有限公司)去磷酸化，與同樣用Notl酶切的ADE基因以T4連接酶連接，形成pGE1203-ADE-URA3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定表明篩選出的克隆在NotI位點(diǎn)處插入了兩個串聯(lián)的ADE基因。2.敲除質(zhì)粒對畢赤酵母的轉(zhuǎn)化用畢赤酵母GS115(貝勾自Invitrogenlifetechnologies,carlsbad，California92008，USA)，通過LinCereghino，G.P.等(Newselectablemarker/auxotrophichoststraincombinationsformoleculargeneticmanipulationofPichiapastoris.2001，6"匿,263，159-69.)提供的方法構(gòu)建獲得含有(ade一、ura3—、arg—、his-)標(biāo)記的畢赤酵母JC308。采用電轉(zhuǎn)化法將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母JC308中，電轉(zhuǎn)化的方法為本領(lǐng)域所共知的(如A.亞當(dāng)斯等，《酵母遺傳學(xué)方法實驗指南》，科學(xué)出版社，2000)。電轉(zhuǎn)化前，先將敲除質(zhì)粒用3'同源臂上BglII酶切位點(diǎn)線性化，然后電轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有精氨酸和組氨酸的MD培養(yǎng)基(YNB1.34g/100ml，生物素4X10、g/100ml，葡萄糖2g/100ml，瓊脂1.5g/100ml，精氨酸100mg/ml，組氨酸100mg/ml)上。待培養(yǎng)基上長出克隆后，隨機(jī)挑取幾個克隆提取基因組，通過PCR的方法鑒定敲除質(zhì)粒是否正確整合到了染色體上的目標(biāo)位點(diǎn)，PCR反應(yīng)所用的兩對引物分別是0CH1基因3'同源臂外的引物序列pll08:5，-tcttgtcaattcggaaagtgtc-3，禾口ADE基因的5，端弓l物pADE-5:5'-atttgcggccgctattcacgagtcagtctgactct-3，，以及弓l物pll08禾口0CHl基因5'同源臂外的引物序列pll07:5，-gcctgacagccttaaagagcc-3，。PCR反應(yīng)所用的酶為rTaq(購自寶生物工程有限公司)，PCR擴(kuò)增條件如下94。C變性5min后，按照94。C變性30sec、55。C復(fù)性30sec、72。C延伸3min進(jìn)行30次循環(huán)，最后72延伸10min。通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物條帶的大小，以pll08和pADE-5為引物所擴(kuò)增的條帶在2.4kb左右，以pll07和pll08為引物不能擴(kuò)增出條帶，說明隨機(jī)挑選的幾個克隆中，敲—除質(zhì)粒已經(jīng)正確整合到了染色體上的目標(biāo)位點(diǎn)。將其中一個克隆接種于YPD培養(yǎng)基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ral蛋白胨，2g/100ml葡萄糖)中，25'C搖床培養(yǎng)12小時后，將菌液涂布于腺嘌呤缺陷的5-F0A培養(yǎng)基(YNB1.34g/100ml，生物素4X10—5g/100ml，葡萄糖2g/100ml，瓊脂1.5g/100ml，精氨酸100mg/ml,組氨酸100mg/ml，尿嘧啶100mg/ml，5-FOA0.1g/100ml)(其中，YNB，為無氨基酸酵母氮源，購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司，5-F0A為5-氟尿嘧啶，購自Sigma-aldrichP.0.B0X14508，St.Louis，MO63178USA)，置于25。C培養(yǎng)。3.PCR鑒定陽性克隆待腺嘌呤缺陷的5-FOA培養(yǎng)基上長出克隆后，提取這些克隆的基因組，進(jìn)行PCR鑒定以基因組為模板，鑒定引物為染色體上OCHl基因同源臂外的序列pll07:5，-gcctgacagccttaaagagcc-3，禾口pll08:5，-tcttgtcaattcggaaagtgtc-3。同時將以JC308菌株的基因組為模板的PCR反應(yīng)體系設(shè)為對照。PCR反應(yīng)所用的酶為LATaq(購自寶生物工程有限公司)，PCR擴(kuò)增條件如下94""C變性5min后，按照94"變性30sec、55。C復(fù)性30sec、72。C延伸3min30sec進(jìn)行30次循環(huán)，最后72延伸10min。將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以JC308菌株基因組為模板的PCR產(chǎn)物大小在2.8kb左右，以待鑒定克隆基因組為模板的PCR產(chǎn)物大小在4.8kb左右，證明了d-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶敲除的菌株構(gòu)建正確。其相應(yīng)位置已經(jīng)被ADE基因取代。這個通過二次同源重組后，用ADE基因替代JC308菌株基因組中0CHl基因約lKb編碼序列后獲得的畢赤酵母菌株被命名為GK0601。畢赤酵母GJK0601已于2006年10月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京巿朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCCNo.1853。二、用畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)流感神經(jīng)氨酸酶糖蛋白制備疫苗1)流感神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建流感病毒H1N1的神經(jīng)氨酸酶基因序列見序列表中序列1，根據(jù)該序列分段合成，即先合成序列1的DNA正向片段，每段58bp，及其反向互補(bǔ)序列58bp/段，每條反向片段分別與正向序列前一段和后一段各有29bp互補(bǔ)，所有DNA片段各取lpmol混合，然后用上游引物ATGAATCCAAATCAAAAAATAATAACC和下游引物CTACTTGTCAATGGTGAACGGCAAC為正向和反向引物，PCR擴(kuò)增拼接，獲得NA基因。NA基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。NA的N端為跨膜區(qū)，為形成分泌型表達(dá)，去掉N端的120個堿基，同時在C端帶6聚組氨酸(6XHis)標(biāo)簽編碼序列，以NA基因為模板，以NA5和NA3發(fā)引物，硬甩pyrobestDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增弓l物NA5和NA3的核苷酸序列如下廳GTGCTCGAGAAAAGAAGTCACTCAATCCAAACTGGANA3:TTGTCGACGAATTCCTAGTGATGGTGATGGTGGTGACCTCCACCCTTGTCAATGGTGAACGG.PCR反應(yīng)條件為:94。C預(yù)變性5min;94。C變性30s，52。C退火30s，72。C延伸90s，共30個循環(huán)；72。C延伸10min?；厥誔CR擴(kuò)增獲得的約1.2kb片段，Xhol和EcoRl雙酶切后與Xhol和EcoRl雙酶切的pPIC9載體相連，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9-NA(實驗中的pyrobestDNA聚合酶、內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，pPIC9購自美國Invitrogen公司)。重組表達(dá)載體pPIC9-NA用于轉(zhuǎn)化酵母。2、畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)流感神經(jīng)氨酸酶糖蛋白疫苗a)畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)流感神經(jīng)氨酸酶糖蛋白pPIC9-NA用Sail線性化后分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853和畢赤酵母GS115(Irwitrogen公司)，待長出單克隆后，PCR鑒定陽性克隆。方法為分別挑取單克隆接于2mLYPD培養(yǎng)基中，在3(TC下以200rpm培養(yǎng)20-24h，轉(zhuǎn)移至離心管，12000rpm離心5min，棄上清。加入50yL裂解緩沖液(0.1MTris-HC1(pH8，0)，5mMEDTA,lg/100mlSDS)懸浮菌體，并加入少量0.5mm的玻璃珠和20uLTE(0.1MpH8.0的Tris-HC1，lmMEDTA)，高速振蕩2min。12000rpm離心5min，上清移至一新離心管中，加入等體積的苯酚，充分振蕩，離心，將水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)溶液，高速振蕩2min，離心抽提取水相。水相中加入2倍體積的95%的冷乙醇和0.1倍體積的3mol/L的乙酸鈉-乙酸溶液，-2(TC放置15min，4'C高速離心沉淀DNA，棄上清，用70%乙醇清洗，最后懸浮于100uL左右的無菌水中。取1"L作為模板，NA5和NA3為引物，PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min;94。C變性30s，53。C退火30s，72。C延伸2min，共30個循環(huán)。取10uLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖電泳分析。PCR產(chǎn)物約1.3Kb的克隆為陽性克隆。pPIC9-NA轉(zhuǎn)化畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853的陽性克隆命名為GJK(pPIC-NA)，pPIC9-NA轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115的陽性克隆命名為GS115(pPIC-NA)。GJK(pPIC-NA)和GS115(pPIC-NA)分別接種于50mlYPD培養(yǎng)基，GS115(pPIC-NA)在3(TC培養(yǎng)，GJK(pPIC-NA)在25。C培養(yǎng)，培養(yǎng)24-48h后，以5ml/100ml的接種量接種到1000mlBMGY培養(yǎng)基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，YNB1.34g/100ml，生物素4X10—5g/100ml，100鵬o1/LpH6.0的磷酸鹽緩沖液，2g/100ml甘油)中，24h后加入0.5ml/100ml甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每12h補(bǔ)加一次甲醇(0.5ml/100ml)，誘導(dǎo)72后離心取上清，用于純化。上清600ml，分別用53g/100ml(順4)2504沉淀45min，10000r/m，20min離心收沉淀，100raL20mMpH7.5的Tris-HCl溶解，10000r/m，10min離心收上清，棄殘渣。上清用金屬離子親和層析柱Chelationss印harosefastflow①1.6X20cm柱純化(介質(zhì)購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)，層析柱先用O.1M的硫酸鎳以4m1/分鐘的流速沖洗60分鐘，使介質(zhì)充分吸附鎳離子，再用A液20raMpH7.5的Tris-HCl+0.5MNaCl，平衡30分鐘后，將上述含NA的上清以4ml/分鐘的流速流過金屬離子親和層析柱，再用A液平衡30分鐘，96ml/100mlA液+4ml/100mlB液(B液20mMpH7.5的Tris-HC1+0.5MNaCl+O.5M咪唑)預(yù)洗脫雜蛋白20分鐘，然后直接用100%B液洗脫，分別收集洗脫峰，即為純化的畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)的流感神經(jīng)氨酸酶糖蛋白(GJK-NA)和畢赤酵母GS115生產(chǎn)的流感神經(jīng)氨酸酶糖蛋白(GS115-NA)，SDS-PAGE分析純度。為了使純化的GJK-NA和GS115-NA有利于免疫動物，將上述純化的GJK-NA和GS115-NA用S印hadexG-25，02.5X40cm柱脫鹽(介質(zhì)購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)，流動相為50raM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)。收集蛋白峰，用Bradford蛋白定量試劑盒(試劑盒購自北京天為時代科技有限公司)，按試劑盒說明的方法進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)測定的蛋白濃度，用50rnM磷酸鹽緩沖液將蛋白濃度調(diào)整為30Pg/ml。圖1為GS115(pPIC-NA)生產(chǎn)的NA的SDS-PAGE分析，"1"為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，"2-5"為GS115(pPIC-NA)生產(chǎn)的GS115-NA。圖2為GJK(pPIC-NA)生產(chǎn)的NA的SDS-PAGE分析，"1"為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，"2-5"為GJK(pPIC-NA)生產(chǎn)的GJK-NA。b)大腸桿菌生產(chǎn)流感神經(jīng)氨酸酶蛋白E.coli-NA5和E.coli-NA3作為正反向引物，NA基因為模板，pyrobestDNA聚合酶PCR擴(kuò)增用于大腸桿菌表達(dá)的NA基因，引物序列如下E.coli-NA5:tgAGTCACTCAATCCAAACTGGA;E.coli-NA3:ATACTCGAGCTTGTCAATGGTGAACGG。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5inin;94"變性30s，55t:退火30s，72匸延伸2min，共25個循環(huán)。電泳回收PCR擴(kuò)增片段，Xhol單酶切。PET22b載體(購自Novagen公司)用Ndel單切后用Klenow酶補(bǔ)平，再用XhoI酶單切，回收后與上述Xhol單酶切的PCR擴(kuò)增片段連接，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性LB平板培養(yǎng)，取陽性克隆測序，序列正確的克隆命名為BL21(DE3)(PET22b-NA)。挑取該菌單克隆接于50mLLB(0.5g/100ral酵母提取物，lg/100ml蛋白胨，lg/100mlNaCl，100mg/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)基中37"培養(yǎng)過夜，5ml/100ml接種量接種1LLB培養(yǎng)基，待菌生長至OD600為0.4-0.6時，加入2g/L乳糖后誘導(dǎo)培養(yǎng)6個小時，離心取菌體。用30raL20mMpH7.5的Tris-HCl重懸菌體，超聲破碎30分鐘后，10000轉(zhuǎn)/分鐘，IO分鐘離心收沉淀，lml/100mlTritonX-100洗滌一遍，10000轉(zhuǎn)/分鐘，10min離心收沉淀，20mMpH7.5的Tris-HC1+8M脲+20mMDTT溶解，變性1小時。用乙酸調(diào)pH至5.0后SP-S印haroseFastFlowOl.6X20cm柱純化(介質(zhì)購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)。A液20raMpH5.0的NaAc+8M脲，B液20mMpH5.0的NaAc+8M脲+lMNaCl。用A液平衡柱，上樣后，10ml/100ml，40ml/100ml，100ml/100mlB洗脫液階段洗脫，收集40ml/100mlB洗脫峰為純化的大腸桿菌生產(chǎn)流感神經(jīng)氨酸酶糖蛋白(E.coli-NA)，SDS-PAGE分析純度。圖3為大腸桿菌生產(chǎn)的非糖基化NA蛋白(E.coli-NA)的SDS-PAGE分析，"1-5"為純化的E.coli-NA，"6"為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。為了使純化的E.coli-NA有利于免疫動物，用S印hadexG-25脫鹽方法，去除E.coli-NA中的鹽和尿素，換成50raMpH7.4的磷酸鹽緩沖液體系。c)畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)的低糖基化流感神經(jīng)氨酸酶糖蛋白、畢赤酵母生產(chǎn)的過度糖基化流感神經(jīng)氨酸酶糖蛋白和大腸桿菌生產(chǎn)的非糖基化流感神經(jīng)氨酸酶制備疫苗及其免疫原性比較GJK-NA、GS115-NA和E.coli-NA分別用生理鹽水稀釋成10Pg/ml和2Pg/ral，分別與等體積的AL(0H)3佐劑混合，制成疫苗GJK-NA10、GS115-NA10、E.coli-NA10、GJK-NA2、GS115-NA2和E,coli-NA2。每種疫苗設(shè)兩個劑量組(1Pg/只/次和0.2^/只/次)，用于免疫小鼠。Balb/c小鼠，雌性，6-8周，42只，分成7組，每組6只，每只小鼠每次腹腔注射，7組分別為1Pg的GJK-NA組注射GJK-NA10疫苗200W;lPg的GS115-NA組注射GS115-NA10疫苗200W;lPg的E.coli-NA組注射E.coli-NA10疫苗0.2Pg的GJK-NA組注射GJK-NA2疫苗200W;0.21Hg的GS115-NA組注射GS115-NA2疫苗200W;0.2Pg的E.coli-NA組注射E.coli-NA2疫苗20(M;對照組注射生理鹽水與AL(0H)3佐劑混合液200W。每間隔3個星期腹腔注射免疫一次，共免疫3次。每次免疫后兩星期尾靜脈采血，ELISA檢測抗體產(chǎn)生水平。ELISA檢測抗體方法如下用包被液(0.15g/100mlNa線，0,293g/100mlNa跳，pH9.6)稀釋含NA1抗原的流行性感冒病毒裂解疫苗(凡爾靈VAXIGRIP2006/2007株流行性感冒病毒裂解疫苗，深圳賽諾菲巴斯德生物制品有限公司生產(chǎn))至0.3Pg/ml包被酶聯(lián)板，不同稀釋度的免疫后小鼠血清作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(l:500)(購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司)為二抗，0PD顯色(顯色液1.84g/100mlNa2HP04.12H20，0.5g/100ml擰檬酸，臨用前再力口0.04g/100mlOPD和0.15ml/100mlHA)，于492nra處比色。ELISA檢測結(jié)果顯示除對照組外，其他組在二、三次免疫后，均可以檢測到抗體的產(chǎn)生。以對照組的最高吸光度值的兩倍為抗體產(chǎn)生陽性值，計算每組血清的抗體滴度?？贵w滴度結(jié)果如圖4和圖5所示，表明隨著免疫劑量和次數(shù)的增加，抗體滴度增加。二次免疫后，WgGJK-NA免疫產(chǎn)生的抗體水平(1:5500)明顯高于相同劑量的GS115-NA的抗體水平(1:10)和E.coli-NA的抗體水平(1:13)，分別是后兩者的550倍和400倍(P^.004和Pi.01，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義)。0.2Pg各組抗原免疫產(chǎn)生的抗體水平均明顯低于Wg各組，其中GJK-NA組抗體水平(1:71)略高于GS115-NA-NA組抗體水平(1:14)，但統(tǒng)計學(xué)差異不顯著。三次免疫后，0.2Pg劑量組的GJK-NA免疫產(chǎn)生的抗體水平上升(1:4900)，明顯高于同劑量的GS115-NA和E.coli-NA免疫產(chǎn)生的抗體水平(1:3和1:17)(P=0.0002和P=0.01，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義)。0.2Pg劑量組的GJK-NA三次免疫產(chǎn)生的抗體水平基本達(dá)到了其二次免疫1Pg劑量組的水平。而GS115-NA和E.coli-NA三次免疫產(chǎn)生的抗體水平增加不明顯；1Pg劑量組三次免疫后，GJK-NA免疫產(chǎn)生的抗體水平已經(jīng)進(jìn)入平臺，抗體水平變化不明顯(1:4700)，GS115-NA和E.coli-NA免疫產(chǎn)生的抗體水平有所增加(1:19和1:630)，但依然低于GJK-NA。上述結(jié)果說明GJK-NA免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力明顯優(yōu)于GS115-NA和E.coli-NA，作為疫苗時，可以提高抗體滴度、降低抗原用量和減少免疫次數(shù)。實施例2、畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)乙肝表面抗原糖蛋白制備疫苗1)含pre-S的乙肝病毒表面大抗原一L抗原的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建現(xiàn)在已經(jīng)上市的乙肝疫苗的抗原是乙肝病毒表面抗原中的小抗原(smallantigen,S)，這種疫苗對大部分人群產(chǎn)生免疫保護(hù)，但仍有約10%的人對這種疫苗不能產(chǎn)生抗體。研究表明，含pre-S的乙肝病毒表面抗原一大抗原(Largantigen，L)可以產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，但pre-S上含有兩個N-糖基化位點(diǎn)，在普通酵母中表達(dá)易產(chǎn)生過度甘露糖化修飾，影響其免疫原性。用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)雖然可以得到低糖基化修飾的抗原，但生產(chǎn)成本較高。含pre-S的乙肝病毒表面抗原一大抗原基因序列見序列表中序列2，根據(jù)該序列分段合成，即先合成序列2的DNA正向片段，每段58bp，及其反向互補(bǔ)序列58bp/段，每條反向片段分別與正向序列前一段和后一段各有29bp互補(bǔ)，所有DNA片段各取lpmol混合，然后以HBL5和HBL3為引物pyrobestDNA聚合酶PCR擴(kuò)增該基因。HBL5和HBL3引物序列如下HBL5:GAAAAGAATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCT;HBL3:TATGCGGCCGCTTAAATGTATACCCAGAGACAAAAG。PCR反應(yīng)條件為:94。C預(yù)變性5min;94。C變性30s，52。C退火30s，72。C延伸120s，共40個循環(huán)；72。C延伸10min?；厥誔CR擴(kuò)增獲得的約1.2kb片段，Notl單切后回收。pPIC9載體先用Xhol單切后，用Klenow酶補(bǔ)平后回收該載體，再用Notl單切，將該載體與上述Notl單切后回收的1.2kb的片段連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。涂布于氨芐青霉素LB平板，挑陽性克隆測序。測序結(jié)果表明插入片段的核苷酸序列如序列表中序列2所示的重組表達(dá)載體命名為pPIC9-HBL。實驗中的pyrobestDNA聚合酶、內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，pPIC9購自美國Invitrogen公司。2)畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)乙型肝炎病毒L抗原糖蛋白pPIC9-HBL用Sail線性化后分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GJK01CGMCCNo.1853和畢赤酵母GS115(Invitrogen公司)待長出單克隆后，PCR鑒定陽性克隆。PCR鑒定以HBL5和HBL3為引物，陽性克隆命名為GJK(pPIC-L)和GS115(pPIC-L)。GJK(pPIC-L)和GS115(pPIC-L)分別接種于50mlYPD培養(yǎng)基，GS115(pPIC-L)在30'C培養(yǎng)，GJK(pPIC-L)在25i:培養(yǎng)，培養(yǎng)24-48h后，以5ml/100ml的接種量接種到1000mlBMGY培養(yǎng)基(lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，1.34g/100mlYNB，4X10—5g/100ml生物素，100mmo1/LpH6.0的磷酸鹽緩沖液，2g/100ml甘油)中，24h后加入0.5ml/100ml甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每12h補(bǔ)加一次甲醇(0.5ml/100ml)，誘導(dǎo)72后離心收集菌體，高壓勻漿法破菌，離心收集上清，分別加入1M硫酸銨后，用Butyls印haroseFastflow①1.6X20cm柱純化(介質(zhì)購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)，A液lM硫酸銨+20mMpH7.0的Tris-HC1，B液20raMTris-HC1，柱先用A液平衡，上樣后用0—10(mB線性梯度洗脫，280nm紫外檢測，分段收集各級份，用H印atitisBsurfaceantigen(HBsAg)BioAssayTMELISAkit(自北京華美生物工程有限公司)檢測各級份中L抗原含量，收集80-100。/。B洗脫的組分為乙型肝炎病毒L抗原糖蛋白，分別將畢赤酵母GJK(pPIC-L)和GS115(pPIC-L)制備的L抗原糖蛋白命名為GJK-L和GS115-L。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖6所示，表明畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853生產(chǎn)的乙型肝炎病毒L抗原糖蛋白(GJK-L)分子量約為46KD，畢赤酵母GS115生產(chǎn)的乙型肝炎病毒L抗原糖蛋白(GS115-L)分子量約為55KD，而根據(jù)氨基酸序列計算未糖化L抗原的蛋白分子量為43KD，因此GJK-L的L抗原為低糖基化的乙肝表面糖蛋白抗原。GS115-L為過度糖計化的乙肝表面糖蛋白抗原。3)用畢赤酵母GJKOlCGMCCNo.1853生產(chǎn)的乙肝表面抗原糖蛋白制備疫苗將步驟2)中制備的GJK-L抗原糖蛋白用生理鹽水稀釋至l(^g/ml和2^/ml，分別加入等體積的鋁佐劑混合，獲得a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的重組畢赤酵母制備的低糖化的乙肝表面抗原糖蛋白疫苗GJK-L10和GJK-L2將步驟2)中制備的GS115-L抗原糖蛋白用生理鹽水稀釋至lOPg/ml和2Pg/ml，分別加入等體積的鋁佐劑混合，獲得普通畢赤酵母制備的過度糖基化的乙肝表面抗原糖蛋白疫苗GS115-L10和GS115-L2。每種疫苗設(shè)兩個劑量組(1Pg/只/次和0.2^/只/次)，用于免疫小鼠。balb/c小鼠，雌性，6-8周，30只，分成5組，每組6只，每只小鼠每次腹腔注射如下抗原0.2Pg的GJK-L組注射GJK-L2疫苗200W;0.2Pg的GS115-L組注射GS115-L2疫苗200W;Wg的GJK-L組:注射GJK-L10疫苗200W;1Pg的GS115-L組注射GS115-L疫苗200W;對照組注射生理鹽水與AL(0H)3佐劑混合液200W。每間隔3個星期腹腔注射免疫一次，共免疫3次。每次免疫后兩星期尾靜脈采血，ELISA檢測抗體產(chǎn)生水平。ELISA檢測抗體方法如下用包被液(0.15g/100mlNa2C03，0.293g/100mlNaHC03，pH9.6)稀釋含乙型肝炎抗原的重組乙型肝炎疫苗(華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，河北石家莊)至0.3Pg/ml包被酶聯(lián)板，不同稀釋度的免疫后小鼠血清作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1:500)(購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司)為二抗，OPD顯色(顯色液:1.84g/100ralNa2HP04'12H20，0.5g/100ml檸檬酸，臨用前再加O.04g/100mlOPD和O.15ml/100mlH202)，于492nm處比色。ELISA檢測結(jié)果顯示除對照組外，其他組在三次免疫后，均可以檢測到抗體的產(chǎn)生。以對照組的最高吸光度值的兩倍為抗體產(chǎn)生陽性值，計算每組血清的抗體滴度?？贵w滴度結(jié)果如圖7所示，1Pg和0.2HgGJK-L免疫產(chǎn)生的抗體水平分別為(1:1500和1:(1:1100)明顯高于相同劑量的GS115-L免疫產(chǎn)生的抗體水平(1:280和1:54)，分別提高5倍和20倍(Pi.04和P二O.02，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。上述結(jié)果說明GJK-L免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力優(yōu)于GS115-L，作為疫苗時，可以提高抗體滴度。序列表〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所〈120〉一種生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法<130〉CGGNARW81898<160〉3〈210〉1<211>1413<212>DNA<213〉畢赤酵母(pichiapastoris)<400>1atgaatccaaatcaaaaaataataaccattggatcaatca^gtatagcaatcggaataatt60agtctaMgttgca^ta^ggaaatat*tat"ttcaatatgggctagtcactcaatccaaact1203ccacactggagtatgcaac180tgggtg3￡LtCtaatattaacaacact^tgttgttgctggaaaggacaaa240acttcagtgacattggccggcaattxatctctttgttctatcagtggatgggctatatac300acagca^taa^gaattggctcca卿g卿tgtttttgtcataagagaacct360ttcatatcatgttctcacttggaatgc卿accttttttctga^cccaaggtgctctatta420aatgacaaaca"ttca犯tgggaccgttaaggacagaagtccttatagggccttaatgagc480tgtcctctaggtgaagctccgtccccatacttgaatcagttgcatggtca540gcagtgcgcatgccatgatggcatgggctggttaacaatcggaatttctggtcc6igacaat600ggagctgtggctgtactaaaatacaacggcata8t8actgaaaccataaaaagttggaaa660aagcgaatatteLagaacacaagagtctgaatgtgtctgtgtgascgggtcatgtttcacc720ataatgaccgatggcccgagtaatggggccgcctcgtacaaaatcttcaagatcgaaaag780ggga鄉(xiāng)ttactaaatcaatgcacccaattttcattatgaggaatgttcc840tgttacccagacactggcacagtgatgtgtgtatgcagggacaactggcatggttcaaat900cgaccttgggtgtcttttaatcaaaacctggattatcaaataggatacatctgcagtggg960gtgttcggtgacaatccgcgtCCC￡L￡L￡Lga<tgg卿gggC3gctgtaatccagtgactgtt1020gatggagcagggggttttcatacaaatatggtaatggtgtttggatagga1080aggactaaaagtaacagacttaga鄉(xiāng)gggtttgagatgatttgggatcct組ggatgg1140acagataccgacagtgatttctcagtgaa^caggatgttgtggcaataactgattggtca1200gggtacagcggMgtttCgttcaacatcctgagttaacaggattggactgtst^gacct1260tgcttctgggttgsgttagtc卿ggactgatacaacaatctggactagt1320gggagcagcaUtctttttg"tggcgta犯tagtgatactgc犯actggtcttggccagac1380ggtgctgagttgccgttcactag1413<210>2<211>1203〈212〉DNA〈213〉畢赤酵母(pichiapastoris)〈400〉2atgggaggttggtcttccaaa^cctcgaa^aggcatggggacaaatctttctgtccccaat60cccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagcca^120cc卿ttggg3cctca^cccacacaagggcaactggccgg3cgcccaca^ggtggg敏g180ggagcattcgggccagggttcacccctccccatgggggactgttggggtggagccctcag240gctcagggcatactcacatctgtgcc3gcagctcctcctcctgcctccsccaMcggcag300tcaggaaggcagcctactcccttatxtxcacctctaagggacactcatcctcaggccata360CELgtgg認(rèn)gccaccactttcc3cca^actcttcaagatccc8gagtcagggctctgtac420tttcctgctggtggctccagttcagga^cagtaagccctgctcagaatactgtctcagcc■atatcgtcaatctcatcgaagactggggaccctgtgccgaaC8ltgg￡lg￡t￡lcatcgcatca540ggactxctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttctcgttgacaaaaatcctc600acaataccacagagtctagactcgtggtggacttctxtcaattttctagggggaacaccc660gtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtc3ctcacca^cttgttgtcct720ccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctctgcatc780ctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggta^:gttgcccgtt840tgtcctctgattccaggatc3tca^ccaccagcacgggax:catgcaagacctgcacaact900<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>aggtattacttctacatggctatattcgccgtttctgtcatttgcgttttgtacggaccc1140tcacaacaattatcatctccaaaaatagactatgatccattgacgctccgatcacttgat1200ttgaagactttggaagctccttcacagttgagtccaggcataatcttcga1260agaca^ttggagtttcattttccttaccgc€Lgtta_Cg^LCcttttccccaacatatttgg1320caaacgtggaaagtttctccctctgatagttcctttccgaaaaac11caaagacttaggt1380gaa^gttggctgca^aggtcgalxattttgtgatacccgatgatgcagca1440tgggaacttattcaccatgagt￡LCC3g3agtcttggaagctttccacctg1500ctaccagagcccattctaaaggccgattttttcaggtatttgattctttttgcccgtgga1560gg3Ctgt3tgCtg3C￡L"tggacactatgtta11aaaaccaatagaatcgtggctgactttc1620a^tgaaactattggtgg3gtgctgggttggtcattggtattgaggctgat1680cctgatagacctgattggcacgactggtatgct,aggatac犯ttttgcc^tgggca1740attcagtccacccagcactgcgtgaactgattgtaagagttgtcagcacg1800actttacggacggttacttg認(rèn)atggtggtcgtggaagt1860gatgtgatggactggacgggtccsggaatactctatttgattatatgact1920aatgtcaatacaacaggccactcaggccaagga3ttgg3gctggctcagcgtattacaat1980gccttatcgttgga卿acgtgatgccctctctgcccgcccgaacggagsi2040gagaaagtcccaggta^ata^tgca^gcaggttgttttatgggaacaatttaccaacctg2100cgctcccccaaattaatcgacgatattcttattcttccgatcaccagcttcagtccaggg2160attggccacagtggagctggagatttgaaccatcaccttgcatatattaggcatacattt2220g卿g鄉(xiāng)ttgagtaaaa^gatatagcga2280tgaataccttcttctaagcgatcgtccgtcatcatagaatatcatggactgtatagtttt2340ttttttgtactaa^cggtcaitccaacatctcgttgacagatctctcagta2400cgcgaaatccctgactatcacgatg^g^gta^ccc3aa2460caccacaaca^cactttatcttctcccccccaacaccaatwtcaa^gagatgtxggaa2520cacaaacacc犯cta^ccccatataaaaacatcctggtagataatgctgg2580taacccgctctccttccatattctgggctacttcacg犯gtctgaccggtctcagttgat2640caacatgatcCtCg3￡L￡Ltgggtggcaagcatcgttccagacctgcctcctctggt卿tg2700gagtgttgtttttg￡lC￡lggggattacaagtctattgatgaagataccctad8lgC￡l￡lCtgg2760gggacgttccgactccttcatctdccagtgttttgtgcac犯gac3tctc2820ttcccattgacactttccgaattgaca^gaacgtcgacc2859權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法，是將糖蛋白基因?qū)毽?1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的畢赤酵母中構(gòu)建重組菌，用所述重組菌生產(chǎn)糖蛋白，以所述糖蛋白作為疫苗的活性成分。2、根據(jù)權(quán)利要求l中生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法，其特征在于所述a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的畢赤酵母是缺失至少10%的a-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因序列的重組菌。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的畢赤酵母是按照如下方法獲得的1)在載體的多克隆位點(diǎn)插入a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上游同源區(qū)和下游同源區(qū)構(gòu)建a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活載體；所述a-l,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的上游同源區(qū)為如下A)或B)的DNA片段，所述a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的下游同源區(qū)為如下C)或D)的DNA片段；A)大小為至少200bp的DNA片段，該片段選自序列表中序列3;B)在嚴(yán)格條件下與A)限定的DNA片段雜交的片段；C)大小為至少200bp的DNA片段，該片段選自序列表中序列3，且該片段位于所述片段A)的下游，與所述片段A)相距至少10%的a-l,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因序列；D)在嚴(yán)格條件下與C)限定的DNA片段雜交的片段；2)將所述a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活載體導(dǎo)入畢赤酵母中獲得重組畢赤酵母。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述a-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的畢赤酵母為畢赤酵母GJK0601CGMCCNo.1853。5、根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一所述生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法，其特征在于所述糖蛋白基因由醇氧化酶啟動子A0X1控制。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法，其特征在于所述糖蛋白為流感神經(jīng)氨酸酶或含preS的乙肝病毒表面大抗原。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法，其特征在于所述生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法中，還包括將所述糖蛋白與佐劑混合。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法，其特征在于所述佐劑為氫氧化鋁或MF59。9、由權(quán)利要求1至8中任一所述生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法生產(chǎn)的疫苗。全文摘要本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法。本發(fā)明生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法是將糖蛋白基因?qū)毽?1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因滅活的重組畢赤酵母中生產(chǎn)糖蛋白，以所述糖蛋白作為疫苗的活性成分。本發(fā)明生產(chǎn)的糖蛋白疫苗中的活性成分是低糖基化的糖蛋白，其免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力明顯優(yōu)于普通酵母生產(chǎn)的過度糖基化糖蛋白和大腸桿菌生產(chǎn)的非糖蛋白，本發(fā)明生產(chǎn)糖蛋白疫苗的方法生產(chǎn)的疫苗可以提高抗體滴度、降低抗原用量和減少免疫次數(shù)。文檔編號C12N1/19GK101402961SQ20081022661公開日2009年4月8日申請日期2008年11月17日優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日發(fā)明者波劉,軍吳,唱韶紅,新鞏,馬清鈞申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所