專利名稱：一種新的基于腺病毒復(fù)制重組的腫瘤靶向基因治療系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與基因治療領(lǐng)域相關(guān)，具體地講，本發(fā)明涉及一套高效低毒的基因
轉(zhuǎn)移載體；其是具有特定結(jié)構(gòu)的重組和/或經(jīng)修飾的腺病毒載體。作為靶向目的 細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移的載體，并利用其在宿主細(xì)胞中的復(fù)制重組產(chǎn)生子代腺病毒， 表達(dá)所攜帶外源基因，達(dá)到基因治療，特別是各種癌癥的基因治療的目的。
背景技術(shù)：
目前作為基因治療的常見載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體和腺相關(guān)病 毒載體，其中作為腫瘤基因治療較為常用的是腺病毒載體。
腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，其基因長度約為36kb，分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚 期轉(zhuǎn)錄區(qū)，目前的研究發(fā)現(xiàn)，人腺病毒有47個(gè)血清型，分屬A-F6個(gè)亞屬，其 中C亞屬的5型腺病毒是目前人們研究最為詳細(xì)的一種。
將腺病毒刪除El區(qū)和E3區(qū)所得到的腺病毒載體常被稱為第一代腺病毒載 體，這種載體可以插入并表達(dá)長度約為8kb以內(nèi)的外源基因，這種腺病毒載體 本身不能復(fù)制產(chǎn)生子代病毒，腺病毒載體DNA也不整合進(jìn)入宿主基因組中。
對于惡性腫瘤的基因治療，要求病毒載體可以高效靶向地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞， 表達(dá)治療基因或靶向性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。腺病毒載體 能感染多種腫瘤細(xì)胞，包括靜止期細(xì)胞，腺病毒載體可以較為容易的大規(guī)模培 養(yǎng)并獲得高滴度的病毒純品。這些特點(diǎn)使得腺病毒作為常用的腫瘤基因治療載 體。腺病毒作為腫瘤基因治療的載體，提高其對腫瘤細(xì)胞的感染效率和耙向性 是十分必要的。目前主要通過轉(zhuǎn)導(dǎo)水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控等 途徑來進(jìn)行。
基于轉(zhuǎn)導(dǎo)水平調(diào)控的腫瘤靶向腺病毒載體。多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面腺病毒受體 (CAR)表達(dá)不足(Jee. YS， et. al. Anticancer Res. 2002， 22:2629-34)，因而 降低了 2型或5型腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。為了提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率而改變腺病毒外 殼蛋白的結(jié)構(gòu)(如鞭毛修飾型AdF35載體(ShayakhmetovDM. et. al. J. Virol. 2000, 74: 2567-83))，使得腺病毒通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的受體，如CD46 膜蛋白(Gaggar A. et. al. Nat. Med. 2003,9:1408-12)進(jìn)入細(xì)胞，改善其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
基于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要應(yīng)用外源的腫瘤特異性啟動子重組腺病毒腫瘤靶
向復(fù)制表達(dá)(YeX. et. al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 2003， 307: 759—64)， 然而該方法雖然有較高的耙向性，但表達(dá)水平偏低，并且特異性啟動子僅能應(yīng) 用于一種腫瘤，隨著其分化外源基因的表達(dá)水平會降低或消失。
通過成熟mRNA翻譯水平的調(diào)控獲得靶向性基因表達(dá)，對外源插入基因進(jìn)行 適當(dāng)?shù)母脑欤沟闷滢D(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的5'非編碼區(qū)或3'非編碼區(qū)增加一段 調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，通過基因翻譯水平調(diào)節(jié)將會獲得一種針對多種腫瘤細(xì)胞的靶向表達(dá) 系統(tǒng)。
復(fù)制溶瘤型靶向腺病毒載體，其部分病毒基因被完全或部分刪除貨部分突 變，現(xiàn)有產(chǎn)品應(yīng)用。
腺病毒載體早期基因編碼蛋白E1A(E1A-12S和Ela-13)和E1B (E1B — 55K 和E1B —19K)通過激活病毒基因表達(dá)和解除調(diào)控細(xì)胞周期來介導(dǎo)病毒復(fù)制。因 此用于基因治療的第一代腺病毒載體(E1A區(qū)蛋白表達(dá)缺陷型腺病毒)被認(rèn)為不 能在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制(Jones，N. et. al. PNAS. 1979， 76: 3665-9)。然而大量 研究表明，第一代腺病毒感染的腫瘤細(xì)胞中有病毒早晚期蛋白的表達(dá) (Steinwaerder， DS. et. al. Hum. Gene. Ther. 2000， 11:1933—48; Jane SM. et. al. AnrMMed. 1998, 30: 413—5; Lieber ， A. et. al. J. Virol. 1996,70: 8944-60)，而正常肝臟細(xì)胞中沒有檢測導(dǎo)病毒DNA的復(fù)制和早晚期蛋白的表達(dá) (Nelson JE. Et. al. J. Virol. 1997， 71: 8902-7)。某些腫瘤細(xì)胞蛋白可能 代替E1區(qū)蛋白的功能，激活了病毒的復(fù)制(Jones，N. et. al. PNAS. 1979， 76: 3665_9 ; Stei腿erder， DS. et. al. Hum. Gene. Ther. 2000， 11:1933-48; Jane SM. et. al. Ann. Med. 1998， 30: 413-5)。腺病毒DNA的復(fù)制導(dǎo)致基因重組， 基因重組程度和復(fù)制頻率成比例，直到感染周期的晚期，腺病毒的基因組都能 進(jìn)行重組(Young CS. Et. al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995， 199: 89-108)。
基于上述討論，目前需要改進(jìn)腺病毒使其能夠高效的靶向一系列的細(xì)胞和 組織，同時(shí)保持能夠高效、穩(wěn)定的表達(dá)外源基因，并為提高基因治療的安全性， 須使腺病毒載體在宿主中有最小的抗原性，特異性的在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基 因。
4我們曾申請了一種復(fù)制重組腺病毒系統(tǒng)，構(gòu)建了具有位于外援基因兩側(cè)的 反向重復(fù)序列的重組腺病毒，改重組腺病毒載體在具有復(fù)制活性的宿主細(xì)胞內(nèi) 涇復(fù)制重組激活所攜帶外援基因的表達(dá)，達(dá)到在宿主細(xì)胞中靶向表達(dá)的目的
(Stei腿erder DS. et. al. Nat Med. 2001， 7:240-3; Bernt K. et. al. J.Virol. 2002， 76: 10994-1002; Sova P. et. al. Mol. Ther. 2004， 9:496-509; Ye X, et. al. Int. J. Mol. Med. 2005， 16:1179-84)。但該病毒由于自身問題，難 以得到單一純病毒，從而阻礙了該系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述
本發(fā)明是一種基于腺病毒復(fù)制重組的腫瘤靶向基因治療系統(tǒng)；應(yīng)用外源插 入片段中存在同源序列的兩個(gè)腺病毒，同時(shí)感染腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制重組。 親代腺病毒為第一代腺病毒載體，沒有外源基因表達(dá)框，DNA重組后，子代腺病 毒獲得外源基因表達(dá)框，表達(dá)報(bào)告基因(EGFP)、復(fù)制基因(Ela)和治療基因 (IL-24)，通過腺病毒介導(dǎo)的復(fù)制溶瘤引發(fā)細(xì)胞壞死[20]，同時(shí)表達(dá)IL一24誘 導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)病毒分散(Mi J. et. al. Hum. Gene. Ther. 2001， 12(10) :1343-52)，加快病毒從感染細(xì)胞中的釋放，進(jìn)一步感染周圍腫瘤細(xì)胞。 重組所采用內(nèi)含子，內(nèi)部翻譯終止子，在mRNA成熟過程中被剪切除去。在正常 細(xì)胞內(nèi)，親代腺病毒沒有復(fù)制，也不發(fā)生重組，不表達(dá)復(fù)制基因和IL-24基因。
本發(fā)明提供了經(jīng)改造的重組腺病毒載體，在宿主細(xì)胞中進(jìn)行特定的同源重 組以產(chǎn)生預(yù)設(shè)的基因組重排衍生物，達(dá)到改變遺傳信息的作用。
對于腫瘤基因治療的載體， 一方面要求其可以針對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性； 另一方面，也希望具有抗腫瘤基因，特異性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，提高對腫瘤 細(xì)胞的殺傷效果。同時(shí)要求其在正常細(xì)胞中盡可能不復(fù)制，減低對正常細(xì)胞的 殺傷。為達(dá)到這兩個(gè)目的，將A5型腺病毒Ela基因和人mda7/IL-24基因結(jié)合 入病毒基因組中會產(chǎn)生一個(gè)理想的結(jié)果。
5型腺病毒Ela基因位于病毒基因組左端，具有84%的保守性。Ela編碼兩 個(gè)主要蛋白， 一個(gè)有243個(gè)氨基酸(12S， 243R), —個(gè)有289個(gè)氨基酸(13S， 289R)。 Ela-12S和Ela_13S蛋白通過激活病毒基因的表達(dá)促使病毒復(fù)制 (Shenk，T。 1996。 Ade麗iridea， P。 2111—2148)。 Ela-12S和Ela-13S蛋白是腺病毒最初表達(dá)的兩個(gè)蛋白，具有激活腺病毒其他基因，特別是E2區(qū)和E4區(qū)基因轉(zhuǎn)錄的功能，而這兩個(gè)區(qū)的功能是有關(guān)腺病毒的復(fù)制。
Ela直接活化細(xì)胞基因，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA復(fù)制，與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白pRb， pRb相關(guān)蛋白(P107/pl30)或P300相互左右。
Ela與pRb家族蛋白分子的結(jié)合，釋放出E2F家族的轉(zhuǎn)錄因子，造成宿主細(xì)胞中一些有關(guān)腦A合成的基因被正向調(diào)控，使靜止期細(xì)胞進(jìn)入S期。這些和一些其它在S期激活的細(xì)胞因子，產(chǎn)生了一個(gè)適合病毒DNA合成的環(huán)境。在正常細(xì)胞中，Ela誘導(dǎo)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控，造成P53蛋白的積累，刺激P53介導(dǎo)G1期細(xì)胞停滯(el-Deiry， W. S. et. al. , 1993， Cell, 75: 817-25;Xiong， Y. et. Al.1993. Nature, 366:701-4)或進(jìn)入西巴凋亡途徑。另外，Ela誘導(dǎo)的凋亡也能通過不依賴P53途徑發(fā)生(Teodoro， J。 G。 et。 al。 1995。 0ncogene。 11: 467 —74)。
Ela基因過去被曾認(rèn)為使一個(gè)癌基因，可使動物胚胎細(xì)胞發(fā)生永生化，并可與其它病毒或細(xì)胞的癌基因相互作用。
在動物試驗(yàn)中，Ela并不能單獨(dú)誘發(fā)癌變，而需與Elb等其他基因共同起作用。5型腺病毒本身沒有致癌性，其它型有致癌性的腺病毒與其單獨(dú)的Ela基因沒有必然的聯(lián)系。近十年來，許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5型腺病毒Ela基因不但對人體細(xì)胞沒有致癌性，而且實(shí)際上可以有抑制腫瘤生長的作用。Ela的腫瘤抑制作用可能與Ela對多種基因的調(diào)控有關(guān)。主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面
neu基因過度表達(dá)與人體惡性腫瘤特別是頭頸口腔鱗癌密切相關(guān)，也與腫瘤的預(yù)后及耐藥性相關(guān)。而有證據(jù)顯示，Ela基因在轉(zhuǎn)錄水平可以特異性的抑制neu基因的表達(dá)，可以抑制如粘附、侵襲等與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的特性，Ela基因也能抑制癌基因誘導(dǎo)的包括細(xì)胞多形性等在內(nèi)的癌變特性，也可提高表達(dá)neu基因的乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性(Yu， DH， et。 al。 Molecular basis ofoncology. 1995:131-162; Ueno， NT. et. al. Proc AACR， 1998,39:360)。
Ela通過提高細(xì)胞P53水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生抗腫瘤作用。Ela可以提高細(xì)胞對5-氟尿嘧啶、順鉑等化療藥及輻射所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。
Ela可以在宿主細(xì)胞表面表達(dá)，提高機(jī)體對細(xì)胞表達(dá)Ela基因的細(xì)胞殺傷、清除，達(dá)到抗腫瘤效果。
6黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)，又稱為白介素24(IL-24)，首先是在被IFN- e和MEZ處理的HO-1人類黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，隨后在許多免疫細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)劑處理的腫瘤細(xì)胞中也相繼發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的mda-7/IL-24表達(dá)，其作用主要包括以下幾點(diǎn)
直接抑瘤作用將mda-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和集落形成并使腫瘤細(xì)胞喪失腫瘤原性，包括黑素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、鼻咽癌和前列腺癌等；但將mda-7/IL-24轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞并不影響細(xì)胞的生長[Madireddi MT et al. Adv Exp Med Biol 2000 465，239 - 261; Pataer A et al. Cancer Res. 2002， 62: 2239-43;Fisher PB etal.Cancer Biol Ther 2003，2:S23-S37]。
誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的MDA-7/IL-24蛋白，通過上調(diào)促凋亡因子Bax與抑制凋亡因子Bcl-2的比例及激活caspase-3和增加表達(dá)量等方式達(dá)到選擇性的使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；但MDA-7蛋白不引起正常細(xì)胞發(fā)生凋亡[Su ZZ et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998， 95: 144002-5， LebedevaIV et.al. Oncogene 2002， 21: 708-18]。
抗血管生成MDA-7具有顯著的抗腫瘤血管生成作用，主要通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(V-EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外的分化和遷移，和抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長和遷移而發(fā)揮作用[Saeki T et al. Oncogene 2002, 21: 4558—66 Nishikawa， T et al. Molec Ther2004,9， 818 - 928]
旁觀者抗瘤效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的MDA-7以自分泌和旁分泌兩種形式進(jìn)入機(jī)體抑制遠(yuǎn)端腫瘤生長[Su ZZ et al. Oncogene 2005, 24: 7552-6628]。
刺激免疫反應(yīng)MDA-7蛋白能夠活化免疫細(xì)胞，能夠刺激PBMC分泌高水平的白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素(IFN)，同時(shí)能夠抑制白介素1(IL-1 )、白介素12(IL-12)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的活性，作為一種免疫刺激劑發(fā)揮抗瘤作用[SarkarDetal. Proc. Natl. Acad。 Sci,USA, 2005， 102: 14034-9 ; Caudell EG et al, J. Immunol. ,2002， 168: 6041-6]
增加放化療的敏感性:MDA-7蛋白能夠增加腫瘤細(xì)胞對放射療法和化學(xué)療法的敏感性，可以作為放化療增敏劑發(fā)揮作用[Su ZZ et al. Oncogene ， 2003， 22:1164-80; Chada S et al. Cancer Gene Ther. 2006 ，13:490-502 ]。作為腫瘤基因治療，現(xiàn)有問題是提高基因特異性地在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，
本發(fā)明中的腺病毒載體具有這一特征，而Ela基因作為抗腫瘤基因近年來已應(yīng) 用于臨床試驗(yàn)中。本發(fā)明人經(jīng)過研究實(shí)驗(yàn)，將5型腺病毒E1區(qū)啟動子刪除，代 之以非特異性的強(qiáng)啟動子CMV，并在CMV后面連接外源性的內(nèi)含子Intron，構(gòu)建 出新的腫瘤基因治療腺病毒載體系統(tǒng)中病毒載體MOOl，將5型腺病毒E1區(qū)啟動 子刪除，在相應(yīng)位置放入外源性的內(nèi)含子Intron，后面連接綠色熒光蛋白基因 EGFP，在EGFP基因的后面再連接腺病毒Ela基因，構(gòu)建出另一病毒載體M002。為 進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用，將M002病毒載體中的綠色熒光蛋白基因去除，代之以黑色素瘤 分化相關(guān)基因mda7/IL-24，形成病毒載體M003，目的是提供一種腺病毒載體系 統(tǒng)，可以特異性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制重組，產(chǎn)生子代腺病毒，形成相應(yīng)的表達(dá) 框，表達(dá)EGFP基因或mda7/IL-24基因，從而特異高效的殺死腫瘤細(xì)胞。具體 原理見圖2。
本發(fā)明還提供了含有此腫瘤特異載體病毒及可藥用載體的藥物組合物。 本發(fā)明還提供了此腫瘤特異性載體在制備用于治療腫瘤藥物組合物中的用途。
發(fā)明詳述 定義
除非另有不同定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬 領(lǐng)域中一般技術(shù)人員通常所理解的一樣。盡管任何與在此描述的相似或相同的 任何方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或試驗(yàn)。在此僅對優(yōu)選的方法和材料予以 描述。為本發(fā)明現(xiàn)就以下術(shù)語予以定義。
在此使用的"外源基因"這一術(shù)語插入本發(fā)明中所用腺病毒載體中的編碼 任何感興趣的蛋白的DNA序列。插入外源基因長度的上限取決于腺病毒載體的 包裝限度。插入的外源基因可編碼任何研究所需的蛋白，可以具有藥用或其它 特征。外源基因可用常規(guī)方法制備得來，如合成，及由天然來源提取、克隆等 得來。
本發(fā)明主要包括如下幾個(gè)方面 1.本發(fā)明提供一種至少缺少E1和/或者E3基因的重組腺病毒載體，其含有 強(qiáng)啟動子CMV序列；
內(nèi)含子Intron序列，連接于所述CMV啟動子序列的后面。2. 本發(fā)明還提供一種至少缺少E1和/或者E3基因的重組腺病毒載體，其含有
內(nèi)含子Intron序列；
外源DNA序列，連接于所述內(nèi)含子Intron序列的后面。
3. 本發(fā)明提供一種獲得子代的重組腺病毒載體的方法，包括在適合的環(huán)境條 件下，將至少兩個(gè)以上第一和二項(xiàng)所述的親本重組腺病毒載體導(dǎo)入一個(gè)復(fù)制活 性細(xì)胞中，這樣兩個(gè)載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)制活性細(xì)胞中可以發(fā)生同源重組，進(jìn)而生 成子代的重組腺病毒載體。本發(fā)明還提供通過該方法產(chǎn)生的子代的重組腺病毒 載體。其中，所述復(fù)制活性細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。所述的子代的重組腺病毒載體優(yōu) 選是被包裝的載體。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)
復(fù)制重組腫瘤靶向表達(dá)系統(tǒng)具有原創(chuàng)性和新穎性，其主要優(yōu)點(diǎn)如下
1. 可制備出純化病毒，而復(fù)制重組僅發(fā)生在腫瘤細(xì)胞內(nèi)；
2. 它應(yīng)用了強(qiáng)啟動子，可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)獲得外源基因的相對高表達(dá)；
3. 它突破了只能針對某種特定腫瘤的限制，針對多數(shù)腫瘤獲得靶向表達(dá)；
4. 同時(shí)應(yīng)用了復(fù)制基因和治療基因，在腫瘤靶向性復(fù)制溶瘤的基礎(chǔ)上表達(dá)治療 基因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，達(dá)到治療惡性腫瘤的目的。
5. 治療基因mda-7的過表達(dá)，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞血 管形成和腫瘤細(xì)胞的遷移擴(kuò)散，還能激活免疫反應(yīng)，從而通過多種途徑阻滯腫 瘤細(xì)胞的生長。


圖l構(gòu)建的重組腺病毒基因圖譜
圖2重組腺病毒載體在腫瘤細(xì)胞特異性復(fù)制原理
圖3重組腺病毒載體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性比表達(dá)報(bào)告基因
圖4 Ela增強(qiáng)帶有治療基因mda7的重組腺病毒載體對腫瘤細(xì)胞的殺傷
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例-一 用于同源重組的第一代腺病毒的構(gòu)建
以下描述了MOOl， M002, M003重組腺病毒的構(gòu)建。除非另外說明，本發(fā)明 所采用的技術(shù)，均是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，如分子克隆技術(shù)，微生物學(xué)技術(shù)，細(xì)胞 生物學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)在文獻(xiàn)中均有充分解釋。
1. M001病毒的構(gòu)建
以 pGEM. Intron 為模板，PCR得到 Intron 片段(引物為 5， CTAGCAGCTGAGCTAGGACTCT3' ， 5' GGGAAGCTTGAATTCTTTGCCAA3， )， Sail 和HindI工I雙酶切后，回收大片段；用Sail和HindIII切割質(zhì)粒pShuttle. CMV， 回收大片段，與Intron片段相連接構(gòu)成質(zhì)粒pSh. CMV. Intron。將此質(zhì)粒與 PAdeasyl共同電轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌斑，酶切鑒定獲得質(zhì)粒 pAd. CMV. Intron，將此質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，將細(xì)胞表面鋪0. 75%的瓊脂， 內(nèi)含l XDMEM， 7%胎牛血清，置于37。C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約9天后培養(yǎng) 皿瓊脂層下細(xì)胞出現(xiàn)噬斑，挑取噬斑，進(jìn)行擴(kuò)增，提取重組腺病毒DNA，進(jìn)行 DNA酶切分析，確定正確的重組腺病毒毒株。
2. M002病毒的構(gòu)建
用HindlII和Xbal切割質(zhì)粒pEGFP-Nl，回收含有EGFP基因的片段.用Sail 和HindIII雙酶切Intron的PCR片段，回收大片段.質(zhì)粒pIRES-Ela-blunt Af III酶切后，Klenow大片斷補(bǔ)平，再用Nhel酶切，回收含有Ela基因的片段. 將質(zhì)粒pShuttle用Munl酶切后補(bǔ)平，再用Sail切割，回收大片段，分別將 Intron片段和EGFP基因及Ela基因與該片斷連接，構(gòu)成質(zhì)粒 shuttle. Intron. EGFP/Ela.將此質(zhì)粒與PAdeasyl共同電轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì) 胞，挑取菌斑，酶切鑒定獲得質(zhì)粒pAd. Intron. EGFP/Ela，將此質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn) 染293細(xì)胞，將細(xì)胞表面鋪0. 75%的瓊脂，內(nèi)含1 XDMEM， 7%胎牛血清，置于 37 °C 5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約9天后培養(yǎng)皿瓊脂層下細(xì)胞出現(xiàn)噬斑，挑取噬 斑，進(jìn)行擴(kuò)增，提取重組腺病毒DNA，進(jìn)行DNA酶切分析，確定正確的重組腺病
毒毒株o3.M003病毒的構(gòu)建
M003病毒的構(gòu)建方法是用質(zhì)粒pORFmda7中的mda7基因片段代替M002病毒 構(gòu)建中的EGFP基因片段，形成質(zhì)粒pshuttle.Intron.mda7/Ela.將此質(zhì)粒與 PAdeasyl共同電轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌斑，酶切鑒定獲得質(zhì)粒 pAd. Intron. EGFP/Ela，將此質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，將細(xì)胞表面鋪0. 75% 的瓊脂，內(nèi)含l XDMEM， 7%胎牛血清，置于37 °C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約9 天后培養(yǎng)皿瓊脂層下細(xì)胞出現(xiàn)噬斑，挑取噬斑，進(jìn)行擴(kuò)增，提取重組腺病毒DNA， 進(jìn)行DNA酶切分析，確定正確的重組腺病毒毒株。
重組病毒的基因結(jié)構(gòu)圖見圖1。
實(shí)施例二第二代腺病毒的生成
將MOOl病毒和M002病毒(或M003病毒)以3:7的比例感染腫瘤細(xì)胞，約24 小時(shí)后，可形成具有完整外源基因表達(dá)框的子代腺病毒，從而表達(dá)外源基因。
實(shí)施例三子代病毒在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制與表達(dá) 將M001病毒和M002病毒以3:7的比例和感染系數(shù)100感染Hela細(xì)胞(人 宮頸癌細(xì)胞)，A549細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)，PLC/PRF/5細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)，H印3B細(xì)胞 (人肝癌細(xì)胞)，LTEP-a-2細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)，H印al-6細(xì)胞(小鼠肝癌細(xì)胞).Tc-l 細(xì)胞(小鼠肺癌細(xì)胞).MRC-5細(xì)胞(人胚肺細(xì)胞)，TE353.sk細(xì)胞(人正常皮膚細(xì) 胞)，RF/6A (猴正常眼細(xì)胞).以上細(xì)胞分別培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)條件是DMEM培 養(yǎng)基，10%胎牛血清，37 。C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72小時(shí)后，用高內(nèi)涵藥物分析 系統(tǒng)檢測EGFP的表達(dá)量，結(jié)果見圖3，從圖中可看出EGFP在人的腫瘤細(xì)胞中有 很高的表達(dá)，而在正常細(xì)胞中幾乎沒有表達(dá)。
實(shí)施例四Mda7對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷
將M001病毒和M002病毒或M003病毒以3:7的比例和感染系數(shù)100感 染，A549細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)，BEL7404細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)，H印3B細(xì)胞(人肝癌細(xì) 胞)，NCI-H460細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)，huh7細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞).MRC-5細(xì)胞(人胚肺細(xì)胞)，.以上細(xì)胞分別培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)條件是DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，37 °C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72小時(shí)后用cck8試劑檢測細(xì)胞活力，結(jié)果見圖4，從 圖中可見mda7基因的表達(dá)可有效的殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞沒有影響。
權(quán)利要求
1.一種至少缺少E1和/或者E3基因的重組腺病毒載體，其含有強(qiáng)啟動子CMV序列；內(nèi)含子Intron序列，連接于所述CMV啟動子序列的后面。
2. —種至少缺少E1和/或者E3基因的重組腺病毒載體，其含有內(nèi)含子Intron 序列；外源DNA序列，連接于所述內(nèi)含子Intron序列的后面。
3. —種獲得子代的重組腺病毒載體的方法，包括在適合的環(huán)境條件下，將 至少兩個(gè)以上第一和二項(xiàng)所述的親本重組腺病毒載體導(dǎo)入一個(gè)復(fù)制活性 細(xì)胞中，這樣兩個(gè)載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)制活性細(xì)胞中可以發(fā)生同源重組，進(jìn)而 生成子代的重組腺病毒載體。
4. 通過該方法產(chǎn)生的子代的重組腺病毒載體。其中，所述復(fù)制活性細(xì)胞是腫 瘤細(xì)胞。所述的子代的重組腺病毒載體優(yōu)選是被包裝的載體。
5. 權(quán)利要求二種所述外源基因是mda7基因。
6. 權(quán)利要求一和權(quán)利要求二所說的重組腺病毒載體，制備用于治療惡性腫瘤 的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了一套高效低毒的基因轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)的構(gòu)建過程及應(yīng)用構(gòu)建了具有強(qiáng)啟動子和內(nèi)含子的重組腺病毒載體和含有同樣內(nèi)含子及mda7/IL-24基因、腺病毒復(fù)制基因E1a的腺病毒載體，使其能夠靶向我們選定的目的細(xì)胞，尤其是復(fù)制活性細(xì)胞；本發(fā)明的重組腺病毒載體在宿主細(xì)胞中經(jīng)復(fù)制重組，產(chǎn)生子代腺病毒，具有外源基因的表達(dá)框，表達(dá)外源基因，達(dá)到在宿主細(xì)胞中特異性表達(dá)的目的。本發(fā)明的重組腺病毒可作為基因治療的有效工具，達(dá)到基因治療，特別是各種癌癥的基因治療的目的。
文檔編號C12N7/01GK101684477SQ20081020051
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者旻 梁, 琴 陸 申請人:上海三維生物技術(shù)有限公司