專利名稱：：Hcv基因分型dna微陣列芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種DNA微陣列芯片，特別是涉及丙型肝炎病毒(HCV)基因分型DNA微陣列芯片。本發(fā)明采用固相載體基片，針對HCV不同基因型設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，制備成DNA微陣列芯片，用于快速準(zhǔn)確對血液樣品中丙型肝炎病毒進(jìn)行分型檢測。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康、流行范圍廣泛的傳染病，其病原體為丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)。目前，全球有超過1.7億人感染HCV，其中每年有超過IO萬例HCV患者發(fā)展為肝癌，進(jìn)而出現(xiàn)消化道出血及腹水。根據(jù)WHO2002年年報(bào)，在2001年，慢性肝病引起1,400萬例死亡，包括79.6萬例由肝硬化引起、61.6萬例由原發(fā)性肝癌引起。HCV是正性單鏈RNA黃病毒，包括9，400左右個(gè)核苷酸。HCV基因組具有一個(gè)單獨(dú)的開放閱讀框，基因結(jié)構(gòu)由5，-NCR-C-El-E2-NSl-NS2-NS3-NS4-NS5-N-CR-3，組成，編碼一具有3,010個(gè)氨基酸的多聚蛋白體，翻譯后被分為病毒復(fù)制和病毒粒形成所必須的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV具有高度的變異性(其變異率高達(dá)1.4-1.9X10力核苷酸/年)和本身具有負(fù)選擇作用的特征，高突變是由于復(fù)制酶無校正功能；易誤性RDRP(error-proneRDRP，EP-RDRP)的存在以及正選擇作用等原因。而其本身具有負(fù)選擇作用又表現(xiàn)為病毒基因組中各種基因結(jié)構(gòu)及功能不同，有些區(qū)域高度保守。根據(jù)全世界不同地區(qū)分離的HCV不同株的全部或部分基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析，目前HCV可以分成16型共六個(gè)型別，各型又分亞型，HCV亞型已經(jīng)超過50個(gè)，其中最常見的是la，lb，2a，2b,3a,6a,各型核酸序列之間相差31—34%，氨基酸序列相差大約30%，而亞型序列之間相差約20_23%。有幾種HCV病毒株主要從東南亞被分離出，被命名為HCV7，8，9，10，ll型，除了HCV10a型(目前被列入HCV3型)，由于其系統(tǒng)進(jìn)化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。研究表明，HCV不同型別之間對干擾素治療的敏感度不一，特別是l型較其它型別敏感度尤為差。不同型別HCV感染性肝炎，其急性、慢性的中度及重度、肝炎后肝硬化及原發(fā)性肝癌發(fā)生率都有不同，HCV基因型與丙型肝炎患者臨床病情及其嚴(yán)重程度密切相關(guān)。目前對HCV基因分型方法主要有限制性長度多態(tài)性(RFLP)，型特異性引物PCR，型特異性探針核酸雜交分析，RDB，直接測序等方法，但是這些方法大多存在操作繁瑣，檢測時(shí)間長，通量低，還存在靈敏度低，特異性不高等缺點(diǎn)。本發(fā)明采用基因芯片技術(shù)，由于該4技術(shù)可以將極其大量的HCV分型探針同時(shí)固定于支持物上，制備成HCV基因分型DNA微陣列芯片，所以本芯片可以一次性對多個(gè)樣本中的HCV進(jìn)行準(zhǔn)確分型，從而解決了傳統(tǒng)方法的不足。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，制造具有高通量、高準(zhǔn)確性的DNA微陣列芯片，可以一次性對多個(gè)樣本中HCV進(jìn)行準(zhǔn)確分型檢測。因此，本發(fā)明的目的是制備一種丙型肝炎病毒(HCV)基因分型畫A微陣列芯片，以滿足大量血液樣品進(jìn)行HCV快速準(zhǔn)確分型的需要。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案采用固相載體基片，針對HCV不同基因型設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸探針，制備成DNA微陣列芯片，再配以RT-PCR系統(tǒng)，使得每張芯片可以一次性同時(shí)檢測多個(gè)樣本的HCV基因型。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，針對HCV不同型別的基因序列，設(shè)計(jì)一套特異性寡核苷酸探針(見表l)，采用自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)器人，將探針印制在一張玻片的特定區(qū)域，每張玻片印制10個(gè)微陣列矩陣，這樣就制成DNA微陣列芯片，一張芯片可以檢測8份樣本。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在上述的DNA微陣列芯片的基礎(chǔ)上再配以其它必要的組份，如PCR引物(見表2)，即組成完整的產(chǎn)品。在實(shí)際檢測時(shí)，取8份人基因組DNA溶液，采用CY3標(biāo)記引物和不對稱PCR方法，擴(kuò)增出可能存在的HCV基因組CY3標(biāo)記靶標(biāo)片段。取DNA微陣列芯片一張，在8個(gè)雜交區(qū)分別加入8種PCR產(chǎn)物2ul和雜交液8ul，同時(shí)在陽性和陰性對照區(qū)加入?yún)⒄债a(chǎn)物溶液，將芯片放在自動(dòng)雜交洗滌儀的雜交槽內(nèi)，雜交溫度5(TC,雜交時(shí)間40分鐘，自動(dòng)洗滌吹干。取出玻片，放入GeriePix4100A掃描儀進(jìn)行掃描，使用分析軟件對掃描圖像信號進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換處理，并分析產(chǎn)生樣本HCV型別結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，DNA微陣列芯片的片基載體可以是玻片、尼龍膜或其它可以附著探針的載體。表l寡核苷酸探針序列以及所檢測的型別<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1HCV基因分型DNA微陣列芯片1芯片整體外觀(示意圖)2雜交區(qū)以及探針微陣列(示意圖)圖2HCV微陣列探針排列示意圖其中HP為陽性對照探針；HN為陰性對照探針圖31型HCV病毒樣本檢測結(jié)果掃描圖(示意圖)圖42型HCV病毒樣本檢測結(jié)果掃描圖(示意圖)圖53型HCV病毒樣本檢測結(jié)果掃描圖(示意圖)圖66型HCV病毒樣本檢測結(jié)果掃描圖(示意圖)具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1:HCV基因分型DNA微陣列芯片PCR引物和探針的設(shè)計(jì)在HCV基因組中5'UTR區(qū)設(shè)計(jì)RT及PCR引物，采用不對稱RT-PCR體系，擴(kuò)增分型所需要的目標(biāo)片段；在目標(biāo)片段范圍內(nèi)，設(shè)計(jì)1型探針3條，2型探針4條，3型探針3條，6型探針三條和通用探針1條。實(shí)施例2:HCV基因分型DNA微陣列芯片的制備采用基因芯片自動(dòng)點(diǎn)樣儀，將14條分型探針和2條對照探針點(diǎn)制到玻片的特定區(qū)域，制成DNA微陣列。(1)點(diǎn)樣探針溶液將探針稀釋到5XSSC、0.05。/。SDS溶液中，終濃度為30nM;(2)點(diǎn)樣矩陣將探針點(diǎn)制在玻片上，每個(gè)探針橫向重復(fù)2點(diǎn)點(diǎn)制在雜交區(qū)內(nèi)，每行8點(diǎn)，共4行，32個(gè)點(diǎn)(參見附圖l);雜交區(qū)分成10個(gè)區(qū)，可以同時(shí)檢測8份樣本(9，IO雜交區(qū)為對照區(qū))。實(shí)施例3:使用本發(fā)明產(chǎn)品檢測8份臨床樣本取8份臨床樣本和陰、陽性對照各一份，提取RNA，按照RT-PCR試劑操作說明，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得DNA雜交模板。采用本發(fā)明的HCV基因分型DNA微陣列芯片，對以上樣本進(jìn)行一次性檢測。取一張微陣列芯片，分別取10管PCR產(chǎn)物各2ul加到芯片的10孔，再在各孔加入雜交液(5xSSC)8ul，芯片放到自動(dòng)雜交洗滌儀的槽內(nèi)，設(shè)定雜交溫度5(TC，雜交時(shí)間40分鐘。雜交后自動(dòng)洗滌和風(fēng)干。采用GenePix4100A掃描儀，掃描雜交信號，得到雜交結(jié)果掃描圖，并將圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)。采用分析軟件，將以上數(shù)據(jù)自動(dòng)分析轉(zhuǎn)換成為各個(gè)樣本的基因型別，同時(shí)，將8份樣本DNA測序，作為檢測結(jié)果對照。結(jié)果表明，8份樣本檢測結(jié)果與樣本測序結(jié)果完全相符(見表3)。實(shí)施例說明了本發(fā)明產(chǎn)品在檢測通量方面的優(yōu)勢(一次檢測8個(gè)樣本)和檢測準(zhǔn)確性方面的可靠性(檢測結(jié)果與樣本測序結(jié)果完全相符)。表3本次檢測結(jié)果與樣本測序結(jié)果的比較樣本編號測序結(jié)果本次試驗(yàn)結(jié)果是否相符011型1型是022型2型是031型1型是043型3型是053型3型是066型6型是071型l型是086型6型是8序列表<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司<120>HCV基因分型DNA微陣列芯片<140><141><160>17<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>1atgcctggagatttggg<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>2gcgagactgctagccg<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>3cgagaccgctagccgag<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>4gtagcgttgggttgcgaa<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>5tcctttcttggataaaccca<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>6ccgggaagactgggtcct10<210>7<211>19<212>DNA<23>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>7cccactctatgcccggcca<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>8ccgcgagatcactagccg<210>9<211>19<212>DNA<2]3>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>9aatcgctggggtgaccggg<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列11<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>10ccgctcaatgcccggaaa<210>11<211>19<212>DNA<23>人:i:序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>11accgggtcctttccattgg<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>12atcaacccgctcaat<210>13<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>13gatcaacccgctcaat<210>14<211>18<212>DNA<2i3>人n序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作芯片雜交反應(yīng)探針。<400>14tactgcctgatagggtgc<210>15<211>23<212>DNA<2n>人r.序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR引物。<400>15tcatggtgcacg沐tacgagac<210>16<211>23<212>DNA<213>人「序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR引物。<400>16ctagccatggcgttagtatgagt<210>17<211>23<212>DNA<2i3>人—:序列13<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR引物。<400>17actcgcaagcaccctatcaggca權(quán)利要求1、一種DNA微陣列芯片，采用DNA微陣列芯片技術(shù)，對HCV進(jìn)行基因分型檢測，其特征在于將一組HCV不同基因型特異性寡核苷酸探針，點(diǎn)制在載體上，制成DNA微陣列芯片，再配以RT-PCR引物以及其它組分，組成完整的試劑盒。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA微陣列芯片，其特征還在于其中擴(kuò)增HCV基因的特異性RT-PCR引物的序列分別是RT引物5，-TCATGGTGCACGGTCTACGAGAC-3'上游引物5，-CTAGCCATGGCGTTAGTATGAGT-3，下游引物5'-ACTCGCAAGCACCCTATCAGGCA-3，。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA微陣列芯片，其特征還在于其中采用14條分型探針，點(diǎn)制在載體上，制成DNA微陣列，用于與樣本擴(kuò)增模板雜交反應(yīng)，14條寡核苷酸探針的序列分別是HI5，-ATGCCTGGAGATTTGGG-3，H25，-GCGAGACTGCTAGCCG-3，H35，-CGAGACCGCTAGCCGAG-3'H45,-GTAGCGTTGGGTTGCGAA-3'H55，-TCCTTTCTTGGATAAACCCA-3，H65，-CCGGGAAGACTGGGTCCT-3，H75，-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3'H85，-CCGCGAGATCACTAGCCG-3'H95,-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3,mo5，-CCGCTCAATGCCCGGAAA-3，Hll5，-ACCGGGTCCTTTCCATTGG-3，H125，'-ATCAACCCGCTCAAT-3'H135，'-GATCAACCCGCTCAAT-3'H145，'-TACTGCCTGATAGGGTGC-3，。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA微陣列芯片，其特征還在于其中寡核苷酸探針點(diǎn)樣的載體可以是玻片、尼龍膜或者其它可以固著探針的載體。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA微陣列芯片，其特征是還在于主要應(yīng)用于對血液樣品中的丙型肝炎病毒進(jìn)行分型檢測。全文摘要本發(fā)明涉及一種DNA微陣列芯片，特別是涉及丙型肝炎病毒(HCV)基因分型DNA微陣列芯片。本發(fā)明采用固相載體基片，針對HCV不同基因型設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，制備成DNA微陣列芯片，再配以PCR引物以及其它組分，可以快速準(zhǔn)確對血液樣品中丙型肝炎病毒進(jìn)行分型。文檔編號C12Q1/70GK101660002SQ200810198010公開日2010年3月3日申請日期2008年8月27日優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日發(fā)明者何蘊(yùn)韶,帆張,彭春梅,明李,胡守旺申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司