專利名稱：纈草環(huán)烯醚萜生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纈草環(huán)烯醚蔽的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
纈草為敗醬科纈草屬(Valeriana L.)多年生草本植物。在我國資源稍多 的主要有4種纈草(Valeriana officinalis L.)、寬葉纈草(Valeriana officinalis var. latifolia Miq.)、 黑水纈草 (Valeriana araurensis Smir. ex Kom)禾口蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones), 自東而西主要分布于 中南、西南、西北、東北山區(qū)及丘陵地帶。纈草根莖中主要含環(huán)烯醚萜類、倍 半萜類、生物堿類、木脂素類、黃酮類等生物活性成分，具有顯著的平滑肌解 痙、增加冠脈流量、抗心律失常、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜安神等作用，是優(yōu)良的天然藥 物資源。我國目前所用纈草基本為野生狀態(tài)，人工種植才剛開始，野生纈草中 環(huán)烯醚萜含量要三年左右生的植株才能達到較高的水平，由于三年齡的纈草量 少，造成采收時一年、二年、三年生纈草一并采收，這樣致使野外資源越來越 少，資源短缺現(xiàn)象嚴重，且纈草環(huán)烯醚萜類化合物含量低不穩(wěn)定。從加工的角 度來看目前企業(yè)的纈草素提取物的成分復(fù)雜，產(chǎn)品純度不高，有的還存在重金 屬超標，這樣一來就降低了纈草提取物的穩(wěn)定性和藥用價值。比如中國專利 CN1396166 —種制備總纈草素的新方法，介紹了用石油醚提取總纈草素的方法， 得到的是總纈草素總浸膏。中國專利CN1337255 —種纈草提取物的制備方法， 采用乙醇滲漉后，將滲漉液濃縮干燥即為產(chǎn)品；中國專利CN1370586A北纈草有 機溶劑提取物的醫(yī)藥用途，介紹了甲醇提取物為產(chǎn)品；中國專利CN1475490A — 種纈草提取物及其制備方法和用途，介紹了用對纈草先用超臨界二氧化碳提取 揮發(fā)油，余渣用乙醇滲漉后濃縮干燥即為纈草素產(chǎn)品。以上幾種方法是將提取 溶劑濃縮干燥即可，因而所得的纈草素產(chǎn)品純度不高，并且總產(chǎn)出周期間長。 因此如何利用有限的資源快速生產(chǎn)出純度高性能穩(wěn)定的纈草素藥用產(chǎn)品，是目前亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)品純度高、性能穩(wěn)定、產(chǎn)出周期短的纈草環(huán) 烯醚萜生產(chǎn)方法。
本發(fā)明提供的纈草環(huán)烯醚萜生產(chǎn)方法包括以下步驟
(1) 纈草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及處理將纈草外植體接種在含相應(yīng)植物生長 調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，pH調(diào)至5 7，溫度25"士2'C，光照強度 1200 25001x，光照時間每天6 18小時，在固體培養(yǎng)基上每15 30天繼代一次， 選擇生長快、顏色淺、顆粒均勻的細胞作為繼代培養(yǎng)，選出環(huán)烯醚萜高的纈草 愈傷組織；
(2) 細胞懸浮培養(yǎng)將步驟(l)獲得纈草愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，在 三角瓶、種子罐中進行逐步擴大培養(yǎng)，將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的纈草細胞接種于生物 反應(yīng)器的液體培養(yǎng)基中進行規(guī)模化纈草細胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度 25°C±2°C， pH 5 7，光照強度1200 25001x，光照時間每天6 18小時，攪 拌轉(zhuǎn)速為50 150 r/min，培養(yǎng)時間8 25天，收獲纈草細胞；
(3) 環(huán)烯醚萜提取分離將步驟(2)收獲的纈草細胞過濾后干燥粉碎得到 纈草細胞干粉，將此干粉放入浸提罐中并加入乙醇溶劑，用乙醇溶劑超聲波輔 助提取，將提取液過濾、除去濾渣，濾液減壓濃縮為環(huán)烯醚萜浸膏，將所述浸 膏用醇水溶液溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂初步分離，再經(jīng)反相U柱精細分離，濃縮 干燥后得到纈草環(huán)烯醚萜產(chǎn)品。
由于本發(fā)明生產(chǎn)方法通過對纈草細胞大規(guī)模培養(yǎng)，將所獲得的培養(yǎng)細胞提 取分離生產(chǎn)環(huán)烯醚萜和其他活性物質(zhì)，則可使在野外三年才能收獲的纈草植株 改為10-25天就可收獲一次纈草細胞，而且原料的有效成分穩(wěn)定，提取的產(chǎn)品 中纈草環(huán)烯醚萜類化合物純度高，使得環(huán)烯醚萜提取分離工藝過程便于控制， 生產(chǎn)過程易操作，提取分離的生產(chǎn)成本下降。解決了纈草環(huán)烯醚萜生產(chǎn)的原料 問題，提高了產(chǎn)品純度和質(zhì)量，所用溶劑可回收，相對生產(chǎn)成本低。 具體實施方案
實施例一、這是一個用寬葉纈草(Valeriana officinalis L. var. latifolia
Miq)根作為外植體，培養(yǎng)纈草環(huán)烯醚萜細胞，生產(chǎn)環(huán)烯醚萜產(chǎn)品的實例，其生 產(chǎn)方法按如下步驟進行-
(1) 纈草愈傷組織誘導(dǎo)配制固體培養(yǎng)基組成為MS+2， 4-D 2.5 mg/L + KT 1.8 mg/L +6-BA 3.0 mg/L+ NAA 1.0 mg/L，用酸或堿將該固體培養(yǎng)基的pH值 調(diào)至5.8，選擇寬葉纈草根為外植體，接種于上述配置好的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度25'C士rC，光照強度1200 lx,光照時間每天18小時，在固體培養(yǎng) 基上每30天繼代一次，選擇生長快、顏色淺顆粒均勻細胞作為繼代培養(yǎng)，選出 環(huán)烯醚萜高的纈草愈傷組織。
(2) 細胞懸浮培養(yǎng)配制的液體培養(yǎng)基組成為MS+2， 4-D 2. 5 mg/L + KT 1. 8 mg/L +6-BA 3.0 mg/L+ NAA 1.0 mg/L+蔗糖40 g/L +乙烯利5 mg/L，將該液體 培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8，將步驟(1)中得到的愈傷組織細胞轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng) 基中，在不同容量的三角瓶、種子罐中進行逐步擴大培養(yǎng)，將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的 纈草細胞接種于生物反應(yīng)器的液體培養(yǎng)基中進行規(guī)?；i草細胞懸浮培養(yǎng)，每 次接種量為3%。培養(yǎng)條件溫度25°C±2°C， pH為5.8，光照強度1200 lx， 光照時間每天18小時，轉(zhuǎn)速為50 150 r/min，培養(yǎng)時間15天，收獲的纈草 細胞，細胞增殖倍數(shù)為4.8倍。
(3) 環(huán)烯醚萜提取分離將收獲的纈草細胞離心過濾，低溫真空干燥后粉 碎得到纈草細胞干粉；用超聲波輔乙醇溶劑提取，提取條件是乙醇溶劑的體積 濃度為40%，乙醇溶劑與所述纈草細胞干粉的重量比為20 : 1，超聲波300 W， 溫度30'C，提取時間60min，重復(fù)提取1 3次，將所得提取液合并過濾；將 提取后的濾液在40 60 。C減壓濃縮為至浸膏狀，用水溶解浸膏后，上大孔樹
脂柱分離，洗脫溶劑為40%乙醇，分離液濃縮回收乙醇，用v鴨v7K :v甲酸 =18 : 82 : 0. 05的溶劑溶解后作為流動相上u柱分離，收集不同時間段的分離
液，真空濃縮干燥后即為環(huán)烯醚萜產(chǎn)品，純度可達95%以上。
實施例2、這是一個用蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones)葉作為外植 體，培養(yǎng)纈草環(huán)烯醚萜細胞，生產(chǎn)環(huán)烯醚萜產(chǎn)品的實例，其生產(chǎn)方法按如下步 驟進行
(1)纈草愈傷組織誘導(dǎo)配制固體培養(yǎng)基組成為MS+2，4-D 4 mg/L + KT
3.0mg/L +6-BA 5 mg/L+ NAA 3.0 mg/L，用酸或堿將該固體培養(yǎng)基的pH值調(diào)至 7，選擇蜘蛛香葉為外植體，接種于配置好的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 25°C±2°C，光照強度2500 lx，光照每天6小時，在固體培養(yǎng)基上每15天繼 代一次，選擇生長快、顏色淺顆粒均勻細胞作為繼代培養(yǎng)，選出環(huán)烯醚萜高的 纈草愈傷組織。
(2) 細胞懸浮培養(yǎng)配制的液體培養(yǎng)基組成為MS+2， 4-D 4 mg/L + KT 3. Omg/L +6-BA 5 mg/L+ NAA 3. 0 mg/L+蔗糖60 g/L +乙烯利6 mg/L， pH調(diào)至7，將上 述愈傷組織細胞轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，在不同容量的三角瓶、種子罐中進行逐 步擴大培養(yǎng)，將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的纈草細胞接種于生物反應(yīng)器的液體培養(yǎng)基中進 行規(guī)?；i草細胞懸浮培養(yǎng)，每次接種量為7%。培養(yǎng)條件溫度25。C士2。C， pH值為7，光照強度25001x，光照每天6小時，轉(zhuǎn)速為50 150 r/min，培養(yǎng) 時間8天，收獲的纈草細胞，細胞增殖倍數(shù)為2.5倍。
(3) 環(huán)烯醚萜提取分離將收獲的纈草細胞離心過濾，低溫真空干燥后粉 碎；用超聲波輔乙醇溶劑提取，提取條件是乙醇的濃度為50%，液料比8 : 1， 超聲波200 W，溫度20 。C，提取時間300 min，重復(fù)提取l 3次，將所得提 取液合并過濾；將提取后的濾液在20 50 。C減壓濃縮為至浸膏狀，用20%乙 醇溶解浸膏后，上大孔樹脂柱分離，洗脫溶劑為40%乙醇，分離液真空濃縮回
收乙醇，用v甲醇v 7K : v甲酸=io : 90 : o. 3的溶劑溶解后作為流動相上c18 柱分離，收集不同時間段的分離液，真空濃縮干燥后即為環(huán)烯醚萜產(chǎn)品，純度
可達80%以上。
實施例3、選擇纈草(Valeriana officinalis L.)根為外植體培養(yǎng)纈草環(huán) 烯醚萜細胞，生產(chǎn)環(huán)烯醚萜產(chǎn)品的實例，其生產(chǎn)方法按如下步驟進行
(1) 纈草愈傷組織誘導(dǎo)配制固體培養(yǎng)基組成為MS+2，4-D 2.5 mg/L + KT 1.5 mg/L +6-BA3. 5 mg/L+ NAA 0.2 mg/L，用酸或堿將pH調(diào)至6，選擇纈草根 為外植體，接種于該培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25'C土2-C，光照強度1500 lx， 光照每天10小時，在固體培養(yǎng)基上每25天繼代一次，選擇生長快、顏色淺顆 粒均勻細胞作為繼代培養(yǎng)，選出環(huán)烯醚萜高的纈草愈傷組織。
(2) 細胞懸浮培養(yǎng)配制的液體培養(yǎng)基組成為MS+2， 4-D 2. 5 mg/L + KT 1. 5
mg/L +6-BA3. 5 mg/L+ NAA 0. 2 mg/L+蔗糖35g/L +乙烯禾廿3. 5 mg/L， pH調(diào)至6， 將上述愈傷組織細胞轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，在不同容量的三角瓶、種子罐中進 行逐步擴大培養(yǎng)，將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的纈草細胞接種于生物反應(yīng)器的液體培養(yǎng)基 中進行規(guī)?；i草細胞懸浮培養(yǎng)，每次接種量為10%。培養(yǎng)條件溫度 25。C士2。C， pH值為6，光照強度1500 1x，光照每天10小時，轉(zhuǎn)速為50 150 r/min，培養(yǎng)時間15天，收獲的纈草細胞，細胞增殖倍數(shù)為4. 5倍。
(3)環(huán)烯醚萜提取分離將收獲的纈草細胞離心過濾，低溫真空干燥后粉 碎；用超聲波輔乙醇溶劑提取，提取條件是乙醇的濃度為50%，液料比30:1， 超聲波250 W,溫度40°C，提取時間5 min，重復(fù)提取3次，將所得提取液合 并過濾；將提取后的濾液在40 50。C減壓濃縮為至浸膏狀，用40%乙醇溶解浸 膏后，上大孔樹脂柱分離，洗脫溶劑為60%乙醇，分離液濃縮回收乙醇，用
v甲醇v * : v =20 : 80 : o. 06的溶劑溶解后作為流動相上u柱分離，收
集不同時間段的分離液，真空濃縮干燥后即為環(huán)烯醚萜產(chǎn)品，純度可達95%以上。
實施例4、選擇黑水纈草(Valeriana amurensis Smir. ex Kom)莖為外植 體培養(yǎng)纈草環(huán)烯醚萜細胞，生產(chǎn)環(huán)烯醚萜產(chǎn)品的實例，其生產(chǎn)方法按如下步驟 進行
(1) 纈草愈傷組織誘導(dǎo)配制固體培養(yǎng)基組成為MS+2，4-D 0.5 mg/L + KT 0. lmg/L +6-BA1. 0 mg/L+ NAA 0. 2 mg/L，用酸或堿將pH值調(diào)至5. 2，選擇黑 水纈草莖為外植體，接種于該培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C±2°C，光照 強度1800 1x，光照9h/d，在固體培養(yǎng)基上每22天繼代一次，選擇生長快、顏 色淺顆粒均勻細胞作為繼代培養(yǎng)，選出環(huán)烯醚萜高的纈草愈傷組織。
(2) 細胞懸浮培養(yǎng)配制的液體培養(yǎng)基組成為MS+2，4-D 0.5 mg/L + KT 0. lmg/L +6-BA1.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L +乙烯利0. 5mg/L， pH調(diào) 至5.2，將上述愈傷組織細胞轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，在不同容量的三角瓶、種 子罐中進行逐步擴大培養(yǎng)，將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的纈草細胞接種于生物反應(yīng)器的液 體培養(yǎng)基中進行規(guī)?；i草細胞懸浮培養(yǎng)，每次接種量為5%。培養(yǎng)條件溫度 25。C士2。C， pH為5. 2，光照強度1800 lx，光照9 h/d，轉(zhuǎn)速為50 150 r/min，
培養(yǎng)時間25d，收獲的纈草細胞，細胞增殖倍數(shù)為2.2倍。
(3)環(huán)烯醚萜提取分離將收獲的纈草細胞離心過濾，低溫真空干燥后粉 碎；用超聲波輔乙醇溶劑提取，提取條件是乙醇的濃度為95%，液料比25:1， 超聲波500 W，溫度50 'C，提取時間5min，重復(fù)提取2次，將所得提取液合 并過濾；將提取后的濾液在20 4(TC減壓濃縮為至浸膏狀，用50%乙醇水溶解 浸膏后，上大孔樹脂柱分離，洗脫溶劑為75%乙醇，分離液濃縮回收乙醇，用
v甲醇: v申酸=20 : 80 : o. 15的溶劑溶解后作為流動相上U柱分離，收
集不同時間段的分離液，真空濃縮干燥后即為環(huán)烯醚萜產(chǎn)品，純度可達85%以上。
權(quán)利要求
1、一種纈草環(huán)烯醚萜生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)纈草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及處理將纈草外植體接種在含相應(yīng)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，pH調(diào)至5～7，溫度25℃±2℃，光照強度1200～25001x，光照時間每天6～18小時，在固體培養(yǎng)基上每15～30天繼代一次，選擇生長快、顏色淺、顆粒均勻的細胞作為繼代培養(yǎng)，選出環(huán)烯醚萜高的纈草愈傷組織；(2)細胞懸浮培養(yǎng)將步驟(1)獲得纈草愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，在三角瓶、種子罐中進行逐步擴大培養(yǎng)，將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的纈草細胞接種于生物反應(yīng)器的液體培養(yǎng)基中進行規(guī)模化纈草細胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度25℃±2℃，pH5～7，光照強度1200～25001x，光照時間每天6～18小時，攪拌轉(zhuǎn)速為50～150r/min，培養(yǎng)時間8～25天，收獲纈草細胞；(3)環(huán)烯醚萜提取分離將步驟(2)收獲的纈草細胞過濾后干燥粉碎得到纈草細胞干粉，將此干粉放入浸提罐中并加入乙醇溶劑，用超聲波輔助提取，將提取液過濾、除去濾渣，濾液減壓濃縮為環(huán)烯醚萜浸膏，將所述浸膏用醇水溶液溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂初步分離，再經(jīng)反相C18柱精細分離，濃縮干燥后得到纈草環(huán)烯醚萜產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述纈草外植體為纈草或?qū)捜~ 纈草或黑水纈草或蜘蛛香的根或莖或葉。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)基為MS加濃度 如下的物質(zhì)0.5 4. 0 mg/L的2，4-D、 0. 1 3, Omg/L的KT 、 1. 0 5. 0 mg/L 的6—BA、 0. 2 3. 0 mg/L的NAA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基為MS加濃度 如下的物質(zhì)0. 5 4. 0 mg/L的2， 4-D、 0. 1 3. Omg/L的KT 、 1. 0 5. 0 mg/L 的6-BA、 0. 2 3.0 mg/L的NAA、 20 60 g/L的蔗糖、0. 5 6mg/L的乙烯利。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中的纈草環(huán)烯 醚萜提取條件為乙醇溶劑的體積比濃度為20% 95%，該乙醇溶劑與所述纈草 細胞干粉的重量比為8 30 : 1，超聲波功率200 500 W，溫度20 60 。C，提 取時間5 300 min，重復(fù)提取1 3次，將所得提取液合并過濾。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述濾液減壓濃 縮為環(huán)烯醚萜浸膏的過程中減壓濃縮溫度為30 80 °C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中溶解浸膏用的醇 水溶液為0% 75%體積比濃度的乙醇，在所述初步分離中使用的洗脫溶劑為 20% 100%體積比濃度的乙醇，所述大孔樹脂柱為苯乙烯類樹脂或甲基丙烯酯類 樹脂。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述d8柱中所用填料為C18;流動相體積比v甲醇v水v甲酸為io 30 : 60 90 : o. 05 o. 3。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述"柱可為單柱或雙柱， 采用單柱分離的方式是在一個分離柱中完成分離過程；采用雙柱分離的方式是 將前一個柱作為粗分離柱，后一個柱作為精分離柱，通過六通進樣閥和制備泵完 成在線切換。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纈草環(huán)烯醚萜生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)纈草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及處理將纈草外植體接種在含相應(yīng)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每15～30天繼代一次，選出環(huán)烯醚萜高的纈草愈傷組織；(2)細胞懸浮培養(yǎng)將纈草愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行逐步擴大培養(yǎng)，將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的纈草細胞接種于生物反應(yīng)器的液體培養(yǎng)基中進行規(guī)?；i草細胞懸浮培養(yǎng)，收獲纈草細胞；(3)對收獲纈草細胞進行提取分離得到環(huán)烯醚萜，本發(fā)明解決了纈草環(huán)烯醚萜生產(chǎn)的原料匱乏的問題，并且產(chǎn)品純度高，工藝過程容易控制，成本相對較低。
文檔編號C12N5/04GK101392234SQ20081014351
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者慧 張, 彭映輝, 方勤敏, 李忠海, 衛(wèi) 王, 鐘海雁, 陳建華, 魯海波, 黎繼烈 申請人:中南林業(yè)科技大學(xué)