專利名稱：抑制人鐵調(diào)素的rna、重組體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生物醫(yī)藥及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利 用逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)人鐵調(diào)素 (HEPCIDIN)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾體系(Retro-FPN)，并將其運(yùn)用到 鐵代謝相關(guān)疾病的藥物開發(fā)制備當(dāng)中。
背景技術(shù)：
RNAi指的是當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA 時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。
RNA干擾過程主要有2個(gè)步驟(1)長(zhǎng)雙鏈RNA被細(xì)胞源性的雙鏈 RNA特異的核酸酶切成21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA (small interfering RNA， siRNA)。 (2)小干擾性RNA與細(xì)胞源性的某些 酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)，該復(fù)合體可識(shí)別與小干擾性RNA有同源序列的 mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。
1998年，安德魯'法厄(Andrew Z. Fire)等在秀麗隱桿線蟲(C.elegans) 中進(jìn)行反義RNA抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，作為對(duì)照加入的雙鏈RNA相比正鏈或 反鏈RNA顯示出了更強(qiáng)的抑制效果(Fire et al., 1998)。從與靶mRNA的 摩爾比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強(qiáng)于理論上1:1配對(duì)時(shí)的抑制 效果，因此推測(cè)在雙鏈RNA引導(dǎo)的抑制過程中存在某種擴(kuò)增效應(yīng)并且有 某種酶活性參與其中。隨后，又相繼發(fā)現(xiàn)具有RNase III活性的Dicer可將 長(zhǎng)的雙鏈RNA加工成稱之為siRNA (small interfering RNA)的21 23nt 及3'端突出的短的雙鏈RNA，siRNA與若干個(gè)蛋白組成稱之為RISC復(fù)合 物(RNA-induced silencing complex)的RNA蛋白復(fù)合物，并由該復(fù)合物 主導(dǎo)RNAi效應(yīng)。2001年，Tuschl等將短的siRNA導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中并由此解決了在哺乳細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入長(zhǎng)的雙鏈RNA時(shí)引發(fā)的干擾素效應(yīng)， 由此拓展了RNAi在基因治療上應(yīng)用前景。RNAi機(jī)制普遍存在于生物種 中，因此被認(rèn)為是進(jìn)化上相對(duì)保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。一種假說為，RNAi機(jī)制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機(jī)制而存在的。目前發(fā)現(xiàn)，
RNAi機(jī)制中的相關(guān)一些因子如內(nèi)源性
雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其范 圍已經(jīng)超越了 PTGS (posttranscriptional gene silencing),如RNAi機(jī)制同 樣參與了轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)調(diào)控過程中。2006年，安德魯.法厄與克 雷格.梅洛(Craig C.Mdlo)由于在RNAi機(jī)制研究中的貢獻(xiàn)獲得諾貝爾生 理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
由外界導(dǎo)入的長(zhǎng)的雙鏈RNA首先被稱作Dicer并具有RNaseIII活性的 RNA酶切割成21 23堿基對(duì)的小的雙鏈RNA，這種RNA被稱作small interfering RNA(siRNA)，其特征是3'端相對(duì)于互補(bǔ)鏈突出兩個(gè)堿基。完成 上述過程后，siRNA上結(jié)合RNAi蛋白因子，并形成稱為RISC(RNA-induced silencing complex)的RNA-蛋白復(fù)合物。在RISC復(fù)合物中，siRNA 依賴于ATP/或ATP非依賴性的轉(zhuǎn)換為單鏈，進(jìn)而RISC被活化?；罨?RISC受己成單鏈的siRNA引導(dǎo)(guide strand),序列特異性地結(jié)合在標(biāo)耙 mRNA上并切斷標(biāo)靶mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。迄今為止已 鑒定出包括Dicer在內(nèi)的若干個(gè)與RNAi有關(guān)的蛋白因子。在果蠅 (Drosophila melanogaster) RISC中，已知存在著稱為Argonaute2(AG02) 的因子，AG02蛋白的表達(dá)受到抑制時(shí)，RNAi效應(yīng)缺失，也就是說AG02 是果蠅RNAi機(jī)制的必須因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切 割酶活性(slicer activity), RNAi機(jī)制正是由Argonaute家族蛋白的RNA 切割酶活性主導(dǎo)。另外，幾個(gè)RNA解旋酶(RNA helicase)也被鑒定為參與 RNAi機(jī)制的因子。在秀麗隱桿線蟲(C. elegans)的RNAi中必須的因子 有EGOl ，這是一種RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase),植物中也存 在該蛋白同系物。RNAi中RdRP是將標(biāo)靶mRNA作為模板，以導(dǎo)入的 dsRNA(或siRNA)作為引物合成RNA，在細(xì)胞內(nèi)針對(duì)于標(biāo)靶mRNA合成 新siRNA的酶。這一反應(yīng)在一些生物的RNAi中為必須，但RdRP活性在 人和果蠅的RNAi中是非必須的，這說明在不同物種之間RNAi機(jī)制的基 本框架雖然相同，但存在著微妙差異。
RNAi在基因沉默方面的具有高效性和簡(jiǎn)單性，所以是基因功能研究 的重要工具。大多數(shù)藥物屬于靶標(biāo)基因(或疾病基因)的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，這功能丟失(LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得(GOF) 方法更具優(yōu)勢(shì)。因此,RNAi在今天的制藥產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標(biāo)確認(rèn)的一個(gè)重 要工具。同時(shí)，那些在耙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以 被進(jìn)一步開發(fā)成為RNAi藥物。
在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)方面，RNAi技術(shù)已獲得了廣泛的應(yīng)用。生物 技術(shù)公司或制藥公司通常利用建立好的RNAi文庫(kù)來引入細(xì)胞，然后通過 觀察細(xì)胞的表型變化來發(fā)現(xiàn)具有功能的基因。如可通過RNAi文庫(kù)介導(dǎo)的 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)來發(fā)現(xiàn)能抑制腫瘤的基因。 一旦所發(fā)現(xiàn)的基
因?qū)儆诳捎盟幍陌袠?biāo)(如表達(dá)的蛋白在細(xì)胞膜上或被分泌出細(xì)胞外)， 就可以針對(duì)此靶標(biāo)進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)還可用 RNAi技術(shù)在細(xì)胞水平或動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步確認(rèn)。
在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被用于臨床測(cè)試用于 幾種疾病治療，如老年視黃斑退化。
然而要將RNA干擾技術(shù)運(yùn)用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表 達(dá)持續(xù)以及表達(dá)效率等重要問題。
shRNA即短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA)。在RNAi感染過程中，產(chǎn) 生dsRNA的一個(gè)有效方法就是在體內(nèi)表達(dá)一個(gè)短發(fā)夾RNA，這種shRNA 包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列(其中一個(gè)與目的基因互補(bǔ))，中間由一個(gè)loop 序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA可以被加工成siRNA，從而降 解目的基因抑制其表達(dá)。
人Hepc基因定位于19ql311,編碼84個(gè)氨基酸的前體肽,含有3個(gè)外顯子, 長(zhǎng)約215Kb,成熟Hepc分子內(nèi)有8個(gè)半胱氨酸殘基,形成4個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，對(duì) 于維持分子的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)三種成熟Hepc肽,分別為 Hepc25、 Hepc22和Hepc20, Hepc25存在于人血液和尿中，尿中HepcK和 Hepc20肽較Hepc25N端少3個(gè)或5個(gè)氨基酸殘基,可能是Hepc25的降解產(chǎn)物。 人體存在著嚴(yán)格的鐵代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，確保體內(nèi)鐵始終處于正常水平。在 人體，小腸是鐵吸收的唯一部位，肝臟和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system, RE)是鐵儲(chǔ)存的主要部位，而骨髓是利用鐵的主要部位。機(jī)體鐵 穩(wěn)態(tài)(ironhomeostasis)關(guān)鍵依賴于小腸鐵吸收和機(jī)體鐵需要之間的平衡。 機(jī)體缺鐵時(shí)，小腸鐵吸收增加，反則反之。最近研究顯示，鐵調(diào)素(Hepcidin)是一種控制小腸鐵吸收及調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì)。它能在肝臟、小腸， 網(wǎng)織紅細(xì)胞和RE系統(tǒng)之間傳遞有關(guān)鐵調(diào)節(jié)的信號(hào)，控制和調(diào)節(jié)這些組織 鐵吸收(攝取)或釋放蛋白的表達(dá)。當(dāng)任何原因引起循環(huán)鐵增加時(shí)，肝細(xì)胞 攝鐵也增加。這會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞增加合成和分泌鐵調(diào)素進(jìn)入血液，鐵調(diào)素經(jīng) 血流運(yùn)輸?shù)绞改c隱窩細(xì)胞，促成隱窩細(xì)胞攝鐵量增加，隱窩細(xì)胞內(nèi)鐵 池增大進(jìn)而抑制腸吸收上皮細(xì)胞四種鐵吸收蛋白表達(dá)下降鐵吸收量因此下 降。當(dāng)循環(huán)鐵較低時(shí)，經(jīng)肝細(xì)胞鐵攝取將會(huì)減少，肝臟合成分泌的鐵調(diào)素 將會(huì)減少。這將引起隱窩細(xì)胞鐵池變小，腸吸收上皮相關(guān)蛋白表達(dá)增加， 腸鐵吸收量增加，使鐵水平回復(fù)到正常。同時(shí)肝臟分泌的鐵調(diào)素也可經(jīng)血
流到達(dá)RE系統(tǒng)和骨髓，調(diào)節(jié)這些組織鐵代謝作相應(yīng)變化。鐵調(diào)素是一個(gè)
富含半胱氨酸的抗菌多肽。2001年P(guān)ark等人首次從人尿中分離到這一多
肽，并將其命名為鐵調(diào)素。人鐵調(diào)素包含有20、 22和25個(gè)氨基酸多肽等
三種組成形式。25個(gè)氨基酸多肽是鐵調(diào)素的主要存在形式。鐵調(diào)素基因位
于人的第19號(hào)染色體上，由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成，轉(zhuǎn)錄后的
mRNA長(zhǎng)約為0.4kb。 Northern Bolt的分析結(jié)果顯示，鐵調(diào)素的基因在肝臟
特異表達(dá)，心臟、脊髓、肺表達(dá)很少，前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、
腎臟和膀胱幾乎沒有表達(dá)。
鐵調(diào)素及其在鐵調(diào)節(jié)中作用的認(rèn)識(shí)是進(jìn)入21世紀(jì)后鐵代謝領(lǐng)域中最重
要的突破性進(jìn)展。無論對(duì)臨床診斷還是治療各類貧血及高鐵負(fù)荷相關(guān)疾病， 其意義均是巨大的。大量研究包括我們的結(jié)果己經(jīng)證實(shí)，在外周組織參與 鐵代謝如小腸鐵吸收以及肝臟、網(wǎng)織紅細(xì)胞和RE系統(tǒng)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白,如載 鐵蛋白(Tf, Transferrin)及其受體(TfR, Transferrin Receptor)、細(xì)胞色素b (Dcytb, Duodenal Cytochrome b)、 二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DMT1， Divalent Metal Transporter 1 )、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (FP1, Ferr叩ortin 1 )、銅藍(lán)蛋白(CP, Ceruloplasmin)和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白(HP, Hephaestin)在腦內(nèi)均有表達(dá)。 我們最近的研究發(fā)現(xiàn)并在國(guó)際上首先報(bào)導(dǎo)了腦有能力表達(dá)鐵調(diào)素。我們的 實(shí)驗(yàn)也己初步顯示腦室內(nèi)注射鐵調(diào)素可降低腦內(nèi)鐵水平，說明鐵調(diào)素能調(diào) 節(jié)腦鐵代謝，參與腦鐵平衡的維持。
很多鐵代謝相關(guān)疾病是由于體內(nèi)hepcidin的調(diào)節(jié)失調(diào)所導(dǎo)致，還有一些 因?yàn)殍F吸收障礙而導(dǎo)致的鐵缺乏癥都可以通過抑制hepcidin的表達(dá)來達(dá)到一定的預(yù)防以及治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供一種能夠有效抑制
體內(nèi)人鐵調(diào)素表達(dá)、從而調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵水平的RNA。
本發(fā)明的另一 目的在于提供編碼含有上述RNA的DNA。 本發(fā)明的再一目的在于提供具有優(yōu)良的耙向性、安全性以及持續(xù)表達(dá)
上述RNA、進(jìn)而抑制人鐵調(diào)素(HEPCIDIN)表達(dá)的重組體。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述RNA、 DNA以及重組體在制備藥物
方面的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
本發(fā)明公開了一種抑制人鐵調(diào)素(HEPCIDIN)表達(dá)的RNA，所述RNA 含有以下序列
Seq ID No. 1: 5，- CAGAACAUAGGUCUUGGAA -3'
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述RNA為含有以下雙鏈結(jié)構(gòu)的 siRNA:
5，畫CAGAACAUAGGUCUUGGAA-3' 3,- GUCUUGUAUCCAGAACCUU畫5' 優(yōu)選地，所述siRNA具有以下結(jié)構(gòu) 5，畫CAGAACAUAGGUCUUGGAA□ □ -3, 3'-圖GUCUUGUAUCCAGAACCUU -5，
其中口口為3'端的兩個(gè)突出堿基，可以為AA或UU，或本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的其他形式。
或者，在本發(fā)明另外的實(shí)施方式中，所述RNA為同時(shí)含有Seq ID No. 1 以及SeqIDNo.l的反向重復(fù)序列的短發(fā)夾RNA (shRNA)。
所述shRNA優(yōu)選含有以下序列
Seq ID No.2:
本發(fā)明還公開了編碼所述RNA的DNA。
優(yōu)選的，所述DNA含有序列表中Seq ID No.3和/或Seq ID No.4所示的序列。
本發(fā)明還公開了一種抑制人鐵調(diào)素表達(dá)的重組體，所述重組體含有上
述的DNA以及基因轉(zhuǎn)移載體。
所述基因轉(zhuǎn)移載體優(yōu)選為病毒性載體，更優(yōu)選為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述RNA、上述DNA以及上述重組體在制備用 于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應(yīng)用。
所述鐵代謝紊亂疾病是指血清鐵水平低而導(dǎo)致的鐵代謝紊亂疾病，或 者是指人鐵調(diào)素過量表達(dá)而導(dǎo)致的鐵代謝紊亂疾病。
由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備了以下有益效果
本發(fā)明的RNA，特別是siRNA及shRNA，以及編碼shRNA的DNA 以及重組體能夠有效抑制體內(nèi)人鐵調(diào)素表達(dá)、促進(jìn)鐵的吸收與代謝，并提 升體內(nèi)的血清鐵水平，從而達(dá)到治療鐵代謝相關(guān)疾病的目的。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的shRNA經(jīng)過體內(nèi)以及體外實(shí)驗(yàn)證明，能有效的抑制 HEPCIDIN表達(dá)，有效的調(diào)節(jié)血清鐵的水平。


圖l是Retrovirus逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的多克隆位點(diǎn)圖； 圖2是Retro-HEPCIDINi系統(tǒng)感染體細(xì)胞后，HEPCIDINmRNA的表 達(dá)情況圖3是retro-hepcidini處理細(xì)胞后的同位素鐵Fe55攝取結(jié)果圖，可見 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒能有效的提升鐵的攝取。
圖4是利用Retrovims-HEPCIDINi系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，提升SD大鼠 的血清鐵水平結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用鐵代謝相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，有針對(duì)性的調(diào)節(jié)HEPCIDIN 的表達(dá)，設(shè)計(jì)特定的小干擾性RNA以及編碼shRNA的DNA，從而提升 體內(nèi)的血清鐵水平。本發(fā)明的小干擾性RNA以及DNA所編碼的shRNA， 能特異性的識(shí)別序列CAGAACATAGGTCTTGGAA,該序列位于 HEPCIDIN (NM—014585.3 )第2379-2397石咸基處。
要將RNA干擾技術(shù)運(yùn)用于臨床治療，就需要解決RNA干擾片段表達(dá) 持續(xù)以及表達(dá)效率等重要問題。我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶RNA干擾片段的DNA模板，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成shRNA，完美的解決了 RNA干擾基 因治療的靶向性、安全性以及表達(dá)持續(xù)性的問題。
在本發(fā)明中，我們采用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 具有廣泛的宿主細(xì)胞以及高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和持續(xù)且可控制的基因表達(dá)等特 點(diǎn)，是一種非常適合用于生物藥品開發(fā)的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移載體。通常而言，
基因轉(zhuǎn)移載體可分兩大類病毒性載體和非病毒性載體。非病毒性載體的
方法包括裸DNA注射、基因槍法、多聚賴氨酸或陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹DNA 法等。 一般非病毒性載體毒性成分少，且較安全。但它們存在共同的弱點(diǎn) 效率低且攜帶基因表達(dá)時(shí)間短。所以目前研究仍是一些病毒性載體，如逆 轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)用最早，研究 也相當(dāng)成熟，目前仍被廣泛應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒的許多特點(diǎn)使其成為基因轉(zhuǎn) 移載體的上佳選擇。最重要的一點(diǎn)是它可以有效的整合入靶細(xì)胞基因組并 穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶的外源基因。病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，其基因 組不會(huì)發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基因也不會(huì)改變。而另幾種整合載體 ——例如腺相關(guān)病毒，以同源重組的方式整合，整合過程中病毒基因組發(fā) 生重排，可能會(huì)影響到外源基因的結(jié)構(gòu)與功能。因此,如果能實(shí)現(xiàn)有效的基 因轉(zhuǎn)移，基因治療在對(duì)付遺傳性疾病、減緩腫瘤發(fā)展、戰(zhàn)勝病毒性感染和 終止神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等方面都會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明通過合成干擾片段，將片段連接至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體當(dāng)中。轉(zhuǎn)染 重組體入Phoenix細(xì)胞，獲取病毒上清，體外以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明能夠有效 抑制HEPCIDIN。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，構(gòu)建了人鐵調(diào)素(HEPCIDIN)的逆轉(zhuǎn) 錄病毒干擾體系(Retro-HEPCIDINi)，并取得了良好的抑制效果。 下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例l
根據(jù)人鐵調(diào)素(HEPCIDIN)序列(NM_021175.2 )，設(shè)計(jì)模板鏈與 編碼鏈。分別于5，端加上BglII與XhoI酶切位點(diǎn)，送Invitrogen公司合成 序列。經(jīng)過篩選，獲得干擾效果最為顯著的本發(fā)明的HEPCIDIN干擾片斷 序列如下 .模板鏈(SeqlDNo.3): 5-GATCCCCCAGAACATAGGTCTTGGAATTCAAG TTCCAAGACCTATGTTCTG AGTCTG TTTTTTA-3,
編碼鏈(SeqlDNo.4): 5，-AGCTTAAAAACAGAACATAGGTCTTGGAATCTCTTGA TTCCAAGACCTATGTTCTG GGGG-3 ，
實(shí)施例2
Retro-HEPCIDINi系統(tǒng)構(gòu)建
一、將合成的HEPCIDIN干擾片段(Seq ID No.3及Seq ID No.4)進(jìn) 行退火。具體步驟如下 1.建立退火系統(tǒng)
5ul10x退火buffer
2nmole模板鏈Seq ID No.3
2nmole編碼鏈Seq ID No.4 用三蒸水補(bǔ)足至50ul。
2. 放入PCR儀，95°C 5分鐘，75°C 5分鐘，55°C 5分鐘，42°C 5分 鐘，37°C 15分鐘，之后逐步遞減溫度至室溫。
3. 制12% 1 x TAE聚丙烯酰胺膠，取10ul上述退火產(chǎn)物跑膠200V lh。銀染觀察退火條帶。置于-80。C保存退貨產(chǎn)物。
三、酶切(Xbal與Xhol)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(如圖1所示)，膠純化 回收后，用T4連接酶與退火產(chǎn)物室溫連接24小時(shí)，經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選之后，獲 得正確克隆。送Invitrogen公司測(cè)序鑒定，命名為Retro-HEPCIDINi系統(tǒng)。 具體操作步驟如下
1.構(gòu)建質(zhì)粒酶切體系
Bgin iou
Xhol 而 10 x Buffer 5ulBSA 0.5ul
Retro質(zhì)粒(pSUPER) 10ul
用水補(bǔ)足50ul， 37°C， 2h。
3. 利用試劑盒(invitrogen)膠純化上述酶切產(chǎn)物。
4. 構(gòu)建連接系統(tǒng)
10 x Buffer 2ul T4連接酶 lul Retro酶切產(chǎn)物 lul 退火產(chǎn)物 5ul 用水補(bǔ)足20ul，16°C， 16h。
4. 取5ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板后，氨芐青霉素篩選。
5. 挑取陽(yáng)性克隆，小量擴(kuò)增質(zhì)粒。
6. 用EcoRI與XhoI酶切鑒定質(zhì)粒，選擇陽(yáng)性結(jié)果質(zhì)粒，測(cè)序保存。 實(shí)施例3
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒Retro-HEPCIDINi的生產(chǎn)流程
1、 接種Phoenix細(xì)胞1.5乂107個(gè)細(xì)胞于9cm培養(yǎng)皿(Corning)中， 37°C， 5%002培養(yǎng)過夜；
2、 轉(zhuǎn)染前20分鐘換新鮮培養(yǎng)基；
3、 取20ul上述Retro-HEPCIDIM與DMEM培養(yǎng)基500ul混勻，標(biāo) 記為A管，另取20ul脂質(zhì)體與500ul DMEM培養(yǎng)基混勻，標(biāo)記為B管。 將A管與B管混勻，室溫放置30min，將混合物輕輕加入第1步中的9cm 培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；
5、 24小時(shí)后加7.5ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；
6、 收集細(xì)胞上清并用0.45um濾器過濾，細(xì)胞可以擴(kuò)大培養(yǎng)，持續(xù)收 取病毒上清。
7、 測(cè)定病毒上清滴度，用PH8.0Tris-HCl調(diào)整細(xì)胞滴度至1000VP/ml。
8、 包裝入2ml西林瓶中(每瓶含lml)，保存于-80'C。
9、 對(duì)病毒進(jìn)行熱源檢測(cè)、微生物檢測(cè)，確保無熱源，無細(xì)菌、真菌、 野生病毒污染。實(shí)施例4
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒Retro-HEPCIDINi體外實(shí)驗(yàn)
復(fù)蘇神經(jīng)元細(xì)胞株P(guān)12，接種于6孔板，每孔1乂106個(gè)。取 Retro-HEPCIDINi病毒液，按照每毫升培養(yǎng)基加lul病毒液(1000VP/ml) 的比例加入P12細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混勻，以充分感染細(xì)胞株，分別 處理0h、 6h、 12h、 24h、 48h，收集細(xì)胞，利用real-time PCR技術(shù)進(jìn)行定 量測(cè)定HEPCIDIN mRNA表達(dá)情況，以0h為對(duì)照組，可見HEPCIDIN的 表達(dá)在12h之后受到明顯的抑制。如圖2。
實(shí)施例5
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒Retro-HEPCIDINi體外鐵攝取實(shí)驗(yàn)
復(fù)蘇神經(jīng)元細(xì)胞株P(guān)12，接種于6孔板，每孔壓106個(gè)。將細(xì)胞分成 兩組， 一組加PBS， 一組加Retro-HEPCIDINi病毒液，按照每毫升培養(yǎng)基 加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混勻， 以充分感染細(xì)胞株。按照0h、 12h、 24h、 48h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行Fe55同位素 攝取實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在24小時(shí)后，鐵的攝取開始增強(qiáng)。如圖3.
實(shí)施例6
重組慢病毒Retro-HEPCIDINi體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
選擇3月齡SD大鼠雄雌各20只，按性別隨機(jī)分為兩組。 實(shí)驗(yàn)組注射retro-HEPCIDINi病毒液，每次劑量為500ul病毒液 (1000VP/ml)，每3天注射一次，3次為一療程；對(duì)照組注射PBS等滲 鹽水；
一療程結(jié)束后，分別于3、 6、 9、 12、 15、 18天采集血清按常規(guī)方法 利用血清生化儀測(cè)定血清鐵濃度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，從第6天開始，由于鐵的吸收增強(qiáng)以及釋 放受到抑制，病毒組血清鐵濃度開始上調(diào)。如圖4所示。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說 明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若 干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。能夠與HEPCIDIN的mRNA反向互補(bǔ)的所有其他19-27個(gè)堿基序列的小干擾性RNA、編碼 此類小干擾性RNA的相應(yīng)shRNA的DNA模板、以及含有這些DNA模板 的重組慢病毒也同樣可以實(shí)施到本發(fā)明中。序 歹lj 表 〈110>錢忠明，葛嘯虎，柯亞
〈120>抑制人鐵調(diào)素的RNA、重組體及應(yīng)用
〈130〉 081011
〈160〉 4
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 19
<212> 腿 〈213〉人工序列
〈400〉 1
cagaacauag gucuuggaa 19
〈210〉 2
<211〉 44
〈212〉 RNA <213>人工序列
<400> 2cagaacauag gucuuggaau ucaaguucca agaccuaugu ucug 44
<210〉 3
<211〉 64
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
〈400> 3
gatcccccag aacataggtc ttggaattca agttccaaga cctatgttct gagtctgttt 60 ttta 64
〈210〉 4
<211〉 60
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 4
agcttaaaaa cagaacatag gtcttggaat ctcttgattc caagacctat gttctggggg 60
權(quán)利要求
1、一種抑制人鐵調(diào)素(HEPCIDIN)表達(dá)的RNA，其特征在于所述RNA含有以下序列Seq ID No.15’-CAGAACAUAGGUCUUGGAA-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA，其特征在于所述RNA為含有以下 雙鏈結(jié)構(gòu)的siRNA:5，- CAGAACAUAGGUCUUGGAA -3'3 ，- GUCUUGUAUCCAGAACCUU -5'。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA，其特征在于所述RNA為同時(shí)含有 Seq IDNo,l及其反向重復(fù)序列的shRNA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNA，其特征在于，所述shRNA含有以下 序列Seq IDNo.2:
5、 編碼權(quán)利要求1 4任意一項(xiàng)所述RNA的DNA。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA，其特征在于所述DNA含有序列 表中Seq ID No.3禾口/或Seq ID No.4所示的序列。
7、 一種抑制人鐵調(diào)素表達(dá)的重組體，其特征在于所述重組體含有權(quán) 利要求5或6所述的DNA以及基因轉(zhuǎn)移載體。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組體，其特征在于所述基閔轉(zhuǎn)移載體為 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
9、 權(quán)利要求1 4任意一項(xiàng)所述的RNA在制備用于治療鐵代謝紊亂 疾病的藥物中的應(yīng)用。
10、 權(quán)利要求5或6項(xiàng)所述的DNA在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病 的藥物中的應(yīng)用。
11、 權(quán)利要求7或8所述的重組體在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制人鐵調(diào)素(Hepcidin)表達(dá)的小干擾性RNA。本發(fā)明進(jìn)一步公開了編碼所述小干擾性RNA的相應(yīng)shRNA的DNA以及能表達(dá)所述RNA的重組體。本發(fā)明的小干擾性RNA、DNA以及重組體能夠有效抑制體內(nèi)人鐵調(diào)素表達(dá)，調(diào)節(jié)體內(nèi)的血清鐵水平，從而達(dá)到治療鐵代謝相關(guān)疾病的目的。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101532013SQ200810141910
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日
發(fā)明者亞 柯, 葛嘯虎, 錢忠明 申請(qǐng)人:香港理工大學(xué)深圳研究院