專利名稱：具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的蜂花粉肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物制藥技術(shù)或功能性食品加工 技術(shù)，特別是制備具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性蜂花粉肽的方法。
背景技術(shù)：
目前，我國高血壓患病率已上升到11.88%，患病人數(shù)估計己近l億，每年 死于心血管疾病的人數(shù)達200萬。因此，高血壓病已成為一個十分嚴重的社會 公共衛(wèi)生問題。我國臨床常用的抗高血壓藥主要包括利尿藥、腎上腺素受體阻 斷藥等。雖然這些藥具有很好的降壓效果，但都具有一定的副作用或不良反應。 由于來源于食品中的降血壓肽具有降血壓效果明顯且對正常血壓無影響、無副 作用等優(yōu)點，己成為目前研究的熱點。
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑是降血壓藥物中發(fā)展最快的一種，ACE 在血壓調(diào)節(jié)中扮演重要的角色。降壓肽通過抑制血管緊張素I向血管緊張素II 轉(zhuǎn)換以及阻止ACE降解緩激肽而起降血壓的作用。目前已有多種化學合成肽類 藥物，抑制ACE活性。這類合成降血壓藥物作用時間不長，停藥后易引起"停 藥綜合癥"會使血壓反彈，而且，這類藥物經(jīng)腎臟排出易造成腎功能的損傷。 引發(fā)蛋白尿和白細胞減少等，嚴重威脅患者的生命安全。
來源于食物蛋白質(zhì)的降壓肽具有食用安全性高、無副作用，可以克服藥物 治療中出現(xiàn)的種種副作用，特別是其對高血壓患者具有降血壓作用，而對血壓 正常的人無降壓作用等優(yōu)點，近來受到廣泛重視。這些肽是經(jīng)酶在溫和條件下 水解獲得，安全性高，同時它還有免疫調(diào)節(jié)等其他作用。因此，開發(fā)天然降血
壓肽產(chǎn)品將成為非藥物治療中的重要組成部分。
目前已有研究發(fā)現(xiàn)膠原蛋白、酪蛋白等經(jīng)胰蛋白酶水解后的產(chǎn)物具有ACE 抑制活性，并通過高壓液相色譜分離、分析了部分有抑制活性的組分。這些研 究主要采用單一的胰蛋白酶，選擇的原料多為動物蛋白質(zhì)，且分離方法成本太 高，或者肽中灰分含量較高而影響其活性等，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。
蜂花粉是蜜蜂采集植物的精細胞加上自身腺體分泌物、唾液和蜂蜜混合而 形成，是我國一種低附加值的蛋白資源，至今沒有有效的開發(fā)利用。由于蜂花 粉較高的蛋白含量和較低的脂肪含量，因此，蜂花粉是用于酶解的很好的蛋白 資源，而且蜂花粉富含具有與降血壓肽結(jié)構(gòu)有關(guān)的支鏈氨基酸和芳香族氨基酸， 是酶解分離降血壓肽的好原料。利用蛋白酶水解蜂花粉蛋白生產(chǎn)具有血管緊張 素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的肽國內(nèi)外目前還未見報道。
發(fā)明目的
針對現(xiàn)有方法的不足，本發(fā)明利用來源廣泛的可再生資源蜂花粉為原料，
分離提取蜂花粉中的蛋白質(zhì)，利用多種蛋白酶，如木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、
酸性蛋白酶、堿性蛋白酶等，單獨或不同組合水解蜂花粉蛋白，水解產(chǎn)物經(jīng)進 一步分離純化，獲得具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的蜂花粉肽。
技術(shù)方案
本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)
將濃度為3~15%的蜂花粉蛋白溶液，用蛋白酶水解，水解的工藝條件為 反應溫度30 6(TC、加酶量0.5~5%、 pH值4 12、反應時間60~240分鐘，攪袢 酶解。酶解后經(jīng)2000Da 5000Da的超濾膜超濾，濾液經(jīng)離子交換樹脂脫鹽，分
離產(chǎn)物再經(jīng)過SephadexG-15 SephadexG-25凝膠層析分離獲得具有血管緊張素 轉(zhuǎn)移酶抑制活性的蜂花粉肽，經(jīng)冷凍干燥即成干粉，可制成各種制劑。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點是
1. 提供了一種制備具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的蜂花粉肽的新方法。 本發(fā)明制品具有生物學功能，對血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)具有極強的抑制活 性。同其他生物活性肽一樣，具有直接、快速、主動、完整吸收的特點。特別 是對高血壓等心血管疾病有療效。本發(fā)明的制成品可作為保健食品、食品、食 品添加劑、藥物增效劑、藥品配方等，是一種適宜于工業(yè)化生產(chǎn)的方法。
2. 工藝科學合理、簡單易行。本發(fā)明工藝包括3個主要步驟，即蜂花粉 分離蛋白的提取一蛋白質(zhì)的酶解一層析分離，方法簡單、有效。
3. 原料來源廣泛。本發(fā)明所選擇的蜂花粉原料來源廣泛，資源豐富，使本 發(fā)明具有較強的實用性。
實施例1
將分離得到的蜂花粉蛋白配置成濃度為5%蜂花粉蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值為 9.0，加入堿性蛋白酶(終濃度為5%)。 37'C水解180分鐘后，水解產(chǎn)物經(jīng)3000Da 的超濾膜超濾，Sephadex G-15凝膠層析分離后得到十個組分。測定各組分在 0.5mg/mL時對ACE的抑制率，結(jié)果列于表l。得到的組分中，除組分1的抑制 率為零外，其余各組分對ACE均具有抑制作用，其中組分6~8的抑制作用較強。
不同組分(0. 5mg/mL)抑制率
組分l0.00%
組分218.64%
組分324.04%
組分477.26%
組分564.81%
將上述獲得的各活性組分冷凍干燥，得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性 蜂花粉肽，各活性組分可單獨或不同比例混合制成降血壓制品。
100.00% 73.57%
100.00% 28.84% 19.19%
實施例2
將分離得到的蜂花粉蛋白配置成濃度為5%蜂花粉蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值為 7.0,加入中性蛋白酶(終濃度為5%)。 37"C水解210分鐘后，水解產(chǎn)物經(jīng)3000Da 的超濾膜超濾，Sephadex G-15凝膠層析分離后得到十個組分，測定各組分對 ACE的抑制率，結(jié)果列于表1。得到的組分中，除組分1的抑制率為零外，其 余各組分對ACE均具有抑制作用，其中組分8的抑制作用最強。
不同組分(0.5mg/mL)_抑制率
1 0.00%
2 43.01%
3 43.01%
4 51.58%
5 29.62%
6 41.56%
7 66.42%
8 69.92%
9 48.80% 組分10 19.04%
組分10
分分分分分分分分分
經(jīng)經(jīng)經(jīng)自自經(jīng)自自自
6 7 8 9
分分分分
經(jīng)經(jīng)經(jīng)經(jīng)
權(quán)利要求
1.一種用蜂花粉分離蛋白制備具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的蜂花粉肽的方法，其特征在于將蛋白質(zhì)濃度為3～15％(W/W)的蜂花粉分離蛋白溶液，用蛋白酶水解，水解工藝條件為pH值4～12、反應溫度30～60℃、加酶量0.5～5％、反應時間60～240分鐘，攪拌酶解。酶解結(jié)束后經(jīng)2000Da～5000Da的超濾膜超濾，再經(jīng)離子交換樹脂脫鹽、凝膠層析，分離出具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的蜂花粉肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性蜂花粉肽的方 法，其特征在于所采用的蛋白酶包括瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、 堿性蛋白酶等。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性蜂花粉肽 的方法，其特征在于分離出的蜂花粉多肽經(jīng)冷凍干燥，進一步制成各種制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述蜂花粉可以是商用或非 商用蜂花粉的任意品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的蜂花粉肽及其制備方法，其采用蛋白酶水解濃度為3～15％(W/W)的蜂花粉分離蛋白溶液，水解工藝條件為pH值為4～12、反應溫度30～60℃、加酶量0.5～5％、反應時間60～240分鐘，攪拌酶解。酶解結(jié)束后溶液經(jīng)2000Da～5000Da的超濾膜超濾，然后采用離子交換樹脂脫鹽，再經(jīng)過凝膠層析分離、冷凍干燥得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性的蜂花粉肽。本發(fā)明提供了一種制備具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的蜂花粉肽的新方法，工藝科學合理，簡單易行，獲得的產(chǎn)品可加工成降血壓各種制劑，具有良好的開發(fā)前景。
文檔編號A23L1/29GK101353687SQ20081013481
公開日2009年1月28日 申請日期2008年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日
發(fā)明者孫麗萍, 響 徐 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所