專利名稱：交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法及用于擴(kuò)增靶核酸序列的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)核酸序列新的擴(kuò)增技術(shù)，更具體地說(shuō)，涉及利用交叉引物恒 溫?cái)U(kuò)增耙核酸序列的方法。本發(fā)明還涉及了在擴(kuò)增反應(yīng)中標(biāo)記擴(kuò)增靶核酸序 列的方法及耙核酸序列的快速檢測(cè)方法。
本發(fā)明還涉及了在快速核酸診斷方面的試劑盒及其在細(xì)菌和病毒等病原 微生物的核酸檢測(cè)方面的應(yīng)用，以及在人類遺傳性疾病相關(guān)的基因診斷應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近30年來(lái)，全球流行病趨勢(shì)表明，難培養(yǎng)和不能培養(yǎng)的病原微生物己經(jīng) 成為傳染性和感染性疾病的主要根源。 一些常規(guī)的病原菌檢測(cè)方法(例如， 大量增殖菌數(shù)、菌落純化分離、外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化鑒定以及血清學(xué)鑒 定等)由于其耗時(shí)費(fèi)力、步驟繁瑣等不足之處，已經(jīng)越來(lái)越跟不上人類對(duì)致 病微生物快速、簡(jiǎn)易、高特異性的鑒定要求。因此，在分子生物學(xué)水平上來(lái) 研究這些病原菌的核酸結(jié)構(gòu)和分子特征，將對(duì)那些難以人工培養(yǎng)和不能人工 培養(yǎng)的病原微生物進(jìn)行正確地鑒定起到重要作用，可以大大提高對(duì)病原菌的 檢測(cè)和研究能力。目前，高度敏感、高度特異的核酸擴(kuò)增技術(shù)可以直接檢測(cè) 臨床標(biāo)本，在較短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果，在感染性疾病的診斷中應(yīng)用越來(lái)越廣泛， 并有逐步替代傳統(tǒng)的細(xì)菌或病毒培養(yǎng)的趨勢(shì)。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是目前最成熟的核酸擴(kuò)增技術(shù)，自它問(wèn)世以來(lái)， 該技術(shù)就得到了極為廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。目前，體外核酸擴(kuò)增技術(shù)可分為兩 大類， 一類如聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligase chain reaction丄CR)禾口轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(transcription based amplification system, TAS)等，這類技術(shù)的共同特點(diǎn)是均要進(jìn)行幾個(gè)保溫點(diǎn)的循環(huán)。第二 類是恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，如鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification, SDA)，核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, 腦BA), 轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增技術(shù) (Transcription Mediated Amplification, TMA)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(Rolling Circle Amplification, RCA)，連環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP),解 鏈酶擴(kuò)增技術(shù)(Helicase D印endent Amplification, HDA)等。這類技術(shù)的 共同特點(diǎn)是擴(kuò)增反應(yīng)均在一個(gè)特定溫度下進(jìn)行，從而大大降低了對(duì)儀器的要 求。
由于目前各種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)大多需要與電^C、熒光、質(zhì)譜法或直接 測(cè)序等方法結(jié)合來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。這些方法大多操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴，而且都是 以大型的儀器設(shè)備和熟練的專業(yè)技能為前提的檢測(cè)技術(shù)，因此并不適合于在 基層醫(yī)院進(jìn)行廣泛的應(yīng)用和推廣。本發(fā)明是結(jié)合了先進(jìn)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù) 和核酸試紙條快速檢測(cè)技術(shù)而發(fā)明的一種操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、價(jià)格低廉的檢 測(cè)技術(shù)?？梢詮V泛地應(yīng)用于所有與病原體檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域。下面就現(xiàn)有的主 要的幾種擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行概述。
1、 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction ， PCR)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是應(yīng)用一對(duì)寡核苷酸引物結(jié)合到正負(fù)鏈上的靶序列兩 側(cè)，從而酶促合成多個(gè)拷貝的靶序列DNA片段。PCR的每一循環(huán)都包括DNA 變性，引物復(fù)性和由咖A聚合酶催化的延伸反應(yīng)。每次循環(huán)新合成的DNA片 段又可成為下次循環(huán)的模板，這就導(dǎo)致耙序列DNA的指數(shù)擴(kuò)增。目前，PCR 技術(shù)被廣泛的應(yīng)用到生物技術(shù)的各個(gè)方面。例如，對(duì)遺傳疾病或腫瘤癌癥的 診斷及預(yù)后的評(píng)估；對(duì)細(xì)菌、病毒及霉菌感染的診斷；用于親子關(guān)系的鑒定 等。
2、 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligase chain reaction, LCR)
連接酶反應(yīng)是基于Taq連接酶的連接能力的特異性，為了檢出靶基因序 列中的點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)的。連接酶反應(yīng)識(shí)別點(diǎn)突變的特異性高于PCR,若耙序 列有點(diǎn)突變，則引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近的核苷酸空間結(jié)構(gòu)發(fā) 生變化，則連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。目前該方法主要用 于點(diǎn)突變的研究與檢測(cè)，如單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷, 微生物的種型鑒定和癌基因的點(diǎn)突變研究等。
3、 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(Rolling Circle Amplification, RCA) 滾環(huán)復(fù)制技術(shù)分為線性和指數(shù)擴(kuò)增兩種。線性滾環(huán)復(fù)制只適用于環(huán)狀核酸
的擴(kuò)增，其產(chǎn)物是具有大量與環(huán)狀DNA互補(bǔ)的重復(fù)序列的DNA單鏈。線性滾 環(huán)復(fù)制非常適合于固相形式的微陣列的特異信號(hào)的檢測(cè)。指數(shù)滾環(huán)復(fù)制時(shí)， 擴(kuò)增產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，因此能使得產(chǎn)物呈指 遞增。同時(shí)指數(shù)滾環(huán) 復(fù)制也可用于非環(huán)狀DNA的擴(kuò)增。滾環(huán)復(fù)制技術(shù)特異性很高，可用于突變與SNP的檢測(cè)，若與熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)，其應(yīng)用前景將是很廣的。
4、 轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增技術(shù)(Transcription Mediated Amplification, TMA)
轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增技術(shù)是一種在逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA多聚酶的共同作用下，在等 溫條件下來(lái)擴(kuò)增RNA或DNA的反應(yīng)系統(tǒng)。其擴(kuò)增原理為目標(biāo)序列在逆轉(zhuǎn)錄酶 作用下，以引物為引導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的 RNA降解以后，合成雙鏈的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下,轉(zhuǎn)錄出成千上萬(wàn)個(gè) 目標(biāo)RNA序列,這些RNA又可以作為模板進(jìn)行下一個(gè)循環(huán),整個(gè)反應(yīng)是一個(gè)自 催化過(guò)程。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，擴(kuò)增效率高，無(wú)需專門(mén) 的擴(kuò)增儀器，且因整個(gè)反應(yīng)在1個(gè)試管中進(jìn)行，也減少了污染。
5、 依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA)
依賴核酸序列的擴(kuò)增，又稱自主序列復(fù)制系統(tǒng)(self-sustained sequence r印lication， 3SR)，主要用于RNA的檢測(cè)。該反應(yīng)有賴于逆轉(zhuǎn)錄酶，T7 RNA 多聚酶和核酸酶H,以及兩條特殊的引物共同協(xié)作完成。引物I的3'末端與 靶序列互補(bǔ)，5'端含T7RNA多聚酶啟動(dòng)子，用于合成cDNA。引物II的序列 則與cDNA的5'未端互補(bǔ)。反應(yīng)時(shí)，引物I先與RNA模板結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶 的作用下催化合成cDNA，再由核酸酶H水解cDNA上的RNA,形成一條單鏈的 DNA;引物II與此cDNA的5'未端結(jié)合，并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第二條 DNA鏈。這樣形成的DNA雙鏈含有T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子。逆轉(zhuǎn)錄酶再以此 DNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣品RNA序列相同的新的RNA鏈。每條新的RNA又可 作為模板合成cDNA，如此反復(fù)進(jìn)行，將獲得更多的RNA和cDNA。
NASBA操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)，同時(shí)由于外來(lái)雙鏈DNA 無(wú)啟動(dòng)子序列，不能被擴(kuò)增，這大大提高了反應(yīng)的特異性。NASBA技術(shù)適于 檢測(cè)和定量分析特異性RNA，也可應(yīng)用于擴(kuò)增雙鏈DNA，因此在臨床上有比較 廣泛的應(yīng)用。
6、 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification, SDA)
鏈置換擴(kuò)增技術(shù)主要是依賴于限制性內(nèi)切酶和DNA聚合酶兩種酶的共同 協(xié)作來(lái)完成。其過(guò)程主要包括單鏈DNA模板的準(zhǔn)備、生成兩端帶酶切位點(diǎn)的 目的DNA片段、SDA循環(huán)三個(gè)階段。鏈置換擴(kuò)增的原理是先用含有限制性內(nèi) 切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物與單鏈靶分子結(jié)合，在無(wú)外切酶活力的DNA聚合酶的作 用下，形成具有半磷酸硫酸化位點(diǎn)的DNA雙鏈。接著用限制性內(nèi)切酶切割未 保護(hù)的引物鏈，而被修飾的靶片段則保持不動(dòng)。這時(shí)再由DNA聚合酶在切口處啟動(dòng)延伸并取代下游部分，又重新產(chǎn)生了一條新的可以被限制性內(nèi)切酶打
開(kāi)切口的DNA單鏈，而耙DNA分子仍保持不動(dòng)。這種打切口、聚合、取代的 步驟不斷循環(huán)反復(fù)，產(chǎn)生大量靶分子的互補(bǔ)鏈。鏈置換擴(kuò)增靈敏性高，可快 速擴(kuò)增獲得單鏈DNA分子，但由于其靶序列準(zhǔn)備的復(fù)雜性和其結(jié)果檢測(cè)手段 的局限，限制了它的應(yīng)用范圍。
7、 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)
DNA環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法主要由Bst大片段DNA聚合酶和兩對(duì)特殊的內(nèi) 引物(FIP由F1C和F2組成；BIP由BIC和B2組成)、 一對(duì)外引物(F3和B3) 組成。FIP引物的F2序列與靶DNA上互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)。 F3引物與模板上的F3C區(qū)域互補(bǔ)，引起合成與模板DNA互補(bǔ)的雙鏈，從而擠 掉FIP引起的DNA單鏈。與此同時(shí)，BIP引物與被擠掉的這條單鏈雜交結(jié)合， 形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，接著B(niǎo)3引物在BIP外側(cè)進(jìn)行堿基配對(duì)，在聚合酶的 作用下形成新的互補(bǔ)鏈。被置換的單鏈DNA兩端均存在互補(bǔ)序列，從而發(fā)生 自我堿基配對(duì)，形成類似啞鈴狀的DNA結(jié)構(gòu)。LAMP反應(yīng)以此DNA結(jié)構(gòu)為起始 結(jié)構(gòu)，進(jìn)行再循環(huán)和延伸，靶DNA序列大量交替重復(fù)產(chǎn)生，形成的擴(kuò)增產(chǎn)物 是有許多環(huán)的花椰菜形狀的莖一環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA。
LAMP反應(yīng)特異性強(qiáng)、靈敏度高，利用LAMP方法檢測(cè)病原微生物，不僅 可以對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行定性，而且還可以通過(guò)利用焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生量與 DNA的生成量之間的線性關(guān)系，對(duì)反應(yīng)的DNA進(jìn)行定量。同時(shí)LAMP反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 裝置簡(jiǎn)單可在恒溫進(jìn)行，因此僅需要普通水浴鍋或者其他可以得到穩(wěn)定熱源 的設(shè)備就可以。但是此方法需要使用肉眼或比濁儀來(lái)^i測(cè)結(jié)果，而使用肉眼 觀察通常是不精確的，比濁儀則需要額外的投資。
8、 轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(transcription based amplification system, TAS)
轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)主要用于擴(kuò)增RNA，它由逆轉(zhuǎn)錄酶，T7 RNA多聚酶 和核酸酶H，以及兩條特殊的引物共同協(xié)作完成。引物I的3'末端與待擴(kuò)增 RNA互補(bǔ)，其5'端有T7 RNA多聚酶的啟動(dòng)子信息。逆轉(zhuǎn)錄酶以引物I為起 點(diǎn)合成cDNA;引物II與此cDNA的3'端互補(bǔ)合成cDNA第二鏈。T7 RNA多聚 酶又以此雙鏈DNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與待擴(kuò)增RNA—樣的RNA，可作為下輪反 應(yīng)的模板。轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)的擴(kuò)增效率高，特異性高但其循環(huán)過(guò)程復(fù)雜， 需重復(fù)加入逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA多聚酶，因此有待進(jìn)一步研究。
9、 解鏈酶擴(kuò)增技術(shù)(Helicase D印endent Amplification, HDA)
HAD是模擬自然的DNA復(fù)制的方法，即利用一種解鏈酶使得DNA變性。
9因此，整個(gè)HAD反映能夠在同一個(gè)溫度下進(jìn)行，從而起到優(yōu)化合成并且不需 要昂貴的耗電的熱循環(huán)器。
本發(fā)明人發(fā)明的交叉引物擴(kuò)增法是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特 點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6種(三對(duì))特異引物，引物尾端交叉互換 序列，利用鏈置換DNA聚合酶(如，但不限于，Bst DNA polymerase)在恒溫 條件即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的熱變'性、多次溫度循環(huán)等過(guò)程。
本發(fā)明的目的在于為人們提供一種操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉的恒溫核酸檢測(cè) 方法，從而使得有關(guān)的研究工作能在基層科研機(jī)構(gòu)及醫(yī)院的檢驗(yàn)順利幵展。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供一種交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其包括以下步
驟
1) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和一對(duì)剝離引物；
2) 在擴(kuò)增耙核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定末端，為 快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板；
3) 以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù)雜交、延 伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位點(diǎn)，使同一條模 板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。
另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其包括以 下步驟
1) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和一對(duì)剝離引物；
2) 在擴(kuò)增靶核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定末端，為 快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板；
3) 以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù)雜交、延 伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位點(diǎn)，使同一條模 板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；和
4) 設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，以擴(kuò)增階段產(chǎn)生的大量含有檢測(cè)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物 為模板，用檢測(cè)引物合成可被檢測(cè)的雙重標(biāo)記的DNA雙鏈分子。
另一方面，本發(fā)明提供一種靶核酸序列的快速檢測(cè)方法，其包括以下步
驟
1) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和一對(duì)剝離引物；
2) 在擴(kuò)增靶核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定末端，為快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板；
3) 以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù)雜交、延 伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位點(diǎn)，使同一條模 板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；
4) 設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，以擴(kuò)增階段產(chǎn)生的大量含有檢測(cè)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物 為模板，用檢測(cè)引物合成可被檢測(cè)的雙重標(biāo)記的DNA雙鏈分子；和
5) 用核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明提供快速核酸檢測(cè)靶核酸序列的試劑盒。 另一方面，本發(fā)明提供上述試劑盒在細(xì)菌和病毒等病原微生物的核酸檢 測(cè)和在人類遺傳性疾病相關(guān)的基因診斷中的用途。


圖1A說(shuō)明了引物設(shè)計(jì)過(guò)程，交叉擴(kuò)增引物、剝離引物和檢測(cè)引物的位置;
圖1B說(shuō)明了引物設(shè)計(jì)過(guò)程，交叉擴(kuò)增引物、剝離引物和檢測(cè)引物的序列 安排；
圖1C說(shuō)明了引物設(shè)計(jì)過(guò)程，交叉擴(kuò)增引物、剝離引物和檢測(cè)引物的序列 設(shè)計(jì)；
圖2，圖2A及圖2B圖2a說(shuō)明了，交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法原理， 包括起動(dòng)階段，擴(kuò)增階段，其中
圖2為交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增法原理圖解一，屬起動(dòng)階段，表述了交叉引物 雜交位點(diǎn)及固定末端的產(chǎn)生；
圖2a為圖2的圖例；
圖2A為交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增法原理圖解二A，屬擴(kuò)增階段，表述了線性結(jié) 構(gòu)，多個(gè)引物雜交位點(diǎn)的產(chǎn)生；
圖2B為交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增法原理圖解二B，屬擴(kuò)增階段，表述了二級(jí)結(jié) 構(gòu)，自我雜交折疊及延伸；
圖3為交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增法原理圖解三。說(shuō)明了可檢測(cè)產(chǎn)物的產(chǎn)生原理。 屬檢測(cè)引物階段，表述了雙重標(biāo)記產(chǎn)物用于檢測(cè)；
圖4為交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)原理圖解，說(shuō)明了用核酸檢測(cè)試紙條檢 測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的原理，雙重標(biāo)記的擴(kuò)增終產(chǎn)物的試紙條檢測(cè)；
圖5顯示了不同反應(yīng)時(shí)間的電泳結(jié)果；
圖6顯示了不同反應(yīng)溫度下的電泳結(jié)果；圖7顯示了不同交叉擴(kuò)增引物濃度的電泳結(jié)果； 圖8顯示了不同Mg2+濃度下的電泳結(jié)果； 圖9顯示了試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果；
具體實(shí)施例方式
因此，本發(fā)明提供一種交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其包括以下步
驟-
1) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和一對(duì)剝離引物；
2) 在擴(kuò)增耙核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定末端，為 快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板；
3) 以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù)雜交、延 伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位點(diǎn)，使同一條模 板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。
更具體地，本發(fā)明提供一種利用交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其包 括以下步驟
1) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和一對(duì)剝離引物，其包括
a) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物，交叉擴(kuò)增引物F和交叉擴(kuò)增引物R，交叉擴(kuò) 增引物F和交叉擴(kuò)增引物R主要由雜交序列、連接區(qū)域和互換序列三部分組 成；
b) 設(shè)計(jì)一對(duì)剝離引物，剝離引物F和剝離引物R，剝離引物F為正向外 引物，與靶基因的反義鏈完全互補(bǔ)，剝離引物R為反向外引物，與耙基因的 正義鏈完全互補(bǔ)；
2) 在擴(kuò)增靶核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定末端，為 快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板，其包括
a) 使正向擴(kuò)增引物F與核酸靶分子雜交，其中所述正向引物F的5，末 端帶有反向引物R的雜交識(shí)別序列；
b) 用具備剝離功能的DNA聚合酶延伸正向擴(kuò)增引物F，合成雙鏈核酸；
c) 使正向剝離引物F與核酸耙分子雜交；
d) 用具備剝離功能的DNA聚合酶延伸剝離引物F，剝離正向擴(kuò)增引物F 的延伸鏈，由此產(chǎn)生固定的正向鏈5'末端；
e) 用被剝離的擴(kuò)增引物延伸鏈作為模板，與反向擴(kuò)增引物R雜交，其中 所述反向引物R的5'末端帶有正向引物F的雜交識(shí)別序列；f) 用具備剝離功能的DNA聚合酶延伸反向擴(kuò)增引物R，合成雙鏈核酸；
g) 使反向剝離引物R與核酸靶分子雜交；
h) 用具備剝離功能的DNA聚合酶延伸剝離引物R，剝離反向擴(kuò)增引物R 的延伸鏈，由此產(chǎn)生固定的反向鏈5'末端，此時(shí)產(chǎn)生的反向擴(kuò)增引物R延 伸鏈兩端已經(jīng)固定，并在3'和5'末端分別引入擴(kuò)增引物F和R的雜交序列， 用作快速擴(kuò)增的模板(如圖2，圖2a所示)；
3)以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù)雜交、延 伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位點(diǎn)，使同一條模 板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，位于后方的引物延伸依次剝離前方引物的 延伸鏈，而被剝離的延伸鏈又可作為模板參與下一輪的擴(kuò)增，從而大大地提 高了擴(kuò)增速度。
在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，所使用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有如下含義 "交叉擴(kuò)增引物"是指用于交叉擴(kuò)增的主要引物，其中正向引物的5' 末端序列與反向引物的雜交序列相同，而反向引物的5'末端序列與正向引 物的雜交序列相同，因此在擴(kuò)增過(guò)程中這兩條引物互相引入對(duì)方的雜交序列， 增加引物的雜交位點(diǎn)，促進(jìn)擴(kuò)增反應(yīng)。
用于本發(fā)明的交叉擴(kuò)增引物為人工合成的單鏈寡核苷酸。 "剝離引物"是指位于交叉擴(kuò)增引物后方的短鏈引物，其作用是在鏈置 換DNA聚合酶的作用下，將擴(kuò)增引物的延伸鏈從模板上剝離。 用于本發(fā)明的剝離引物為人工合成的單鏈寡核苷酸。 "檢測(cè)引物"是指用生物素或半抗原標(biāo)記短鏈引物，其作用是使擴(kuò)增產(chǎn) 物帶有標(biāo)記，以用于檢測(cè)。
用于本發(fā)明的檢測(cè)引物為人工合成的單鏈寡核苷酸。 "半抗原"是指用于標(biāo)記檢測(cè)引物的化學(xué)物質(zhì)，它們與相應(yīng)的抗體特異 性地結(jié)合，用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。常見(jiàn)的半抗原如熒光染料等。此外，生物素 和親和素由于其高度特異的結(jié)合能力，也常用于此目的。 用于本發(fā)明的半抗原為熒光染料和/或生物素。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其 中，交叉擴(kuò)增引物F和交叉擴(kuò)增引物R主要由三部分組成
a) 雜交序列是與模板特異性雜交用于擴(kuò)增延伸的堿基序列；
b) 連接區(qū)域用于引物上兩個(gè)不同序列的連接，通常為一至三個(gè)單核苷c)互換序列，即交叉擴(kuò)增引物F的雜交序列用來(lái)作為交叉擴(kuò)增引物R的 5'末端序列，反之，交叉擴(kuò)增引物R的雜交序列用來(lái)作為交叉擴(kuò)增引物F 的5'末端序列；
剝離引物F和R主要是用于恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)起動(dòng)階段剝離交叉擴(kuò)增引物的 延長(zhǎng)鏈；
檢測(cè)引物F與檢測(cè)引物R分別用不同的半抗原標(biāo)記，用該對(duì)引物擴(kuò)增的 產(chǎn)物將帶有雙重抗原標(biāo)記，用于檢測(cè)。
引物的設(shè)計(jì)及各引物的位置如圖1A，圖1B和圖1C所示。
在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用交叉引物擴(kuò)增耙核酸序列的方 法，其中擴(kuò)增階段以線性結(jié)構(gòu)方式進(jìn)行擴(kuò)增引物每次延伸都會(huì)引入一個(gè)新的引 物雜交序列，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)隨著每輪擴(kuò)增而延長(zhǎng)；另一方面，由于短鏈產(chǎn)物的合 成速度較快，引物雜交的機(jī)會(huì)較多，最終產(chǎn)物大部分為短鏈產(chǎn)物。
因此，交叉引物擴(kuò)增法的產(chǎn)物是不同長(zhǎng)度擴(kuò)增物的混合物，其中長(zhǎng)鏈擴(kuò)增 物為進(jìn)一步擴(kuò)增提供多重引物雜交位點(diǎn)，提高擴(kuò)增速度；短鏈擴(kuò)增物是最終被 檢測(cè)的主要對(duì)象(參見(jiàn)附圖2 A)。
在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用交叉引物擴(kuò)增耙核酸序列的方 法，其中擴(kuò)增階段以二級(jí)結(jié)構(gòu)方式進(jìn)行，由于長(zhǎng)鏈擴(kuò)增物帶有多個(gè)重復(fù)互補(bǔ)的 序列，擴(kuò)增物將自我折疊形成各種復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中一些能夠自我延伸， 使產(chǎn)物更長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜；另一些二級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈部分可供引物雜交，合成新 的產(chǎn)物。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用交叉引物擴(kuò)增耙核酸序列的方 法，其中擴(kuò)增階段以線性結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)混合的方式進(jìn)行，線性結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié) 構(gòu)可互變，單鏈的線性結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分子還可通過(guò)雜交而相互交聯(lián)，形成巨 大的DNA雜交復(fù)合物。
因此交叉引物擴(kuò)增法的產(chǎn)物非常復(fù)雜，表現(xiàn)在凝膠電泳圖上，可見(jiàn)許多長(zhǎng) 短不一的條帶，特大的DNA雜交復(fù)合物可停留在點(diǎn)樣孔中而不泳動(dòng)(參見(jiàn)附圖 2B，以及圖5-8)。
另一方面，本發(fā)明提供利用檢測(cè)引物標(biāo)記耙核酸序列的方法，其包括 本發(fā)明的上述利用交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法的步驟1)-3)，和
4)設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，檢測(cè)引物F與檢測(cè)引物R，檢測(cè)引物R為反向內(nèi) 側(cè)引物，與靶基因的正義鏈完全互補(bǔ)；檢測(cè)引物F為正向內(nèi)側(cè)引物，與耙基 因的反義鏈完全互補(bǔ)；以擴(kuò)增階段產(chǎn)生的大量含有檢測(cè)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，檢測(cè)引物合成可被檢測(cè)的雙重標(biāo)記的DNA雙鏈分子。
此類雙重標(biāo)記的DNA雙鏈分子大多為較短的擴(kuò)增終產(chǎn)物，但較大的擴(kuò)增產(chǎn) 物以及特大的DNA雜交復(fù)合物均含有檢測(cè)引物的雜交位點(diǎn)，可通過(guò)與檢測(cè)引物 雜交而獲得雙重標(biāo)記，因而可被檢測(cè)(參見(jiàn)附圖3)。
另一方面，本發(fā)明提供利用核酸試紙條檢測(cè)靶核酸序列的方法，其包括 本發(fā)明的上述利用檢測(cè)引物標(biāo)記靶核酸序列的方法的步驟1)-4)，和
5)用核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
用本發(fā)明的利用檢測(cè)引物標(biāo)記的靶核酸序列的方法獲得的雙重標(biāo)記的靶 核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)常見(jiàn)的瓊脂糖凝膠電泳或核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢 測(cè)。核酸檢測(cè)試紙條的檢測(cè)原理參見(jiàn)附圖4。
用于本發(fā)明的核酸擴(kuò)增物檢測(cè)試紙條的具體信息參見(jiàn)本發(fā)明人的另一項(xiàng) 發(fā)明專利申請(qǐng)CN1811447A(申請(qǐng)?zhí)?00610003429.1)。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，在交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增靶核酸序 列的方法中，所述DNA聚合酶選自Bst DNA聚合酶、KlenowDNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。
根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案，在交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增耙核酸序列的方法 中，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。
根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案，在交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增耙核酸序列的方法: 中，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，在用于擴(kuò)增靶核酸序列的試劑: 盒中，所述DNA聚合酶選自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，Vent DNA 聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。
根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案，在用于擴(kuò)增靶核酸序列的試劑盒中，所 述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。
根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案，在用于擴(kuò)增耙核酸序列的試劑盒中，所 述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增耙核酸序列的試劑盒在檢測(cè) 病原微生物、環(huán)境微生物或微生物分型中的用途。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增靶核酸序列的試劑盒在檢測(cè) 人類、動(dòng)物或植物傳染病病原體中的用途。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增耙核酸序列的試劑盒在檢測(cè) 食品或生物武器中傳染病病原體的用途。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增靶核酸序列的試劑盒在檢測(cè) 人類遺傳病或健康風(fēng)險(xiǎn)基因及其評(píng)估的用途。
15本發(fā)明的突出的有益效果是能利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(62。C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。 能夠快速有效的進(jìn)行核酸的快速擴(kuò)增。只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫裝置即可完成 所有的擴(kuò)增過(guò)程，極大的降低了對(duì)儀器的要求。同時(shí)本發(fā)明還可以結(jié)合我們 原有的核酸檢測(cè)試紙條發(fā)明專利，進(jìn)而開(kāi)發(fā)出一種新的快速核酸檢測(cè)的方法。 進(jìn)而使得整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程以及檢測(cè)過(guò)程快速簡(jiǎn)便，不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí) 間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳等過(guò)程。本發(fā)明以其特異、簡(jiǎn)單、快捷的特性可以 獲得很廣泛的應(yīng)用，如
1. 與直接相關(guān)的人類遺傳性疾病的分子診斷；
2. 病原體微生物的檢測(cè)；
3. 對(duì)腫瘤癌癥的診斷及預(yù)后的評(píng)估；
4. 某些微生物的分型。
以下實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)方法及其檢測(cè)效果。實(shí)施例僅用來(lái)舉 例，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的任何限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍在權(quán)利要求 書(shū)中說(shuō)明。 實(shí)施例
實(shí)施例1沙眼衣原體的檢測(cè)
自20世紀(jì)90年代以來(lái)，沙眼衣原體成為超過(guò)淋球菌成為泌尿生殖道感 染性疾病最常見(jiàn)的致病菌。隨著沙眼衣原體感染及其并發(fā)癥的發(fā)病率逐漸升 高，它已經(jīng)成為人類生殖健康越來(lái)越大的威脅。1995年世界衛(wèi)生組織估計(jì)全 球有9千萬(wàn)沙眼衣原體患者，僅次于HIV的感染。因此實(shí)現(xiàn)對(duì)沙眼衣原體的 快速診斷，有著重要的意義。應(yīng)用本專利就可對(duì)沙眼衣原體的病毒的DNA實(shí) 現(xiàn)快速檢測(cè)。其相關(guān)引物的具體設(shè)計(jì)如下我們?cè)谏逞垡略w的DNA序列上 選擇所要擴(kuò)增的基因片段，并且根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性的引物。反應(yīng)體系如下 剝離引物F和R 各0.05微摩爾每升
各0.4微摩爾每升
交叉擴(kuò)增引物F和R 檢測(cè)引物 F和R d證
Thermopol buffer (10X)
MgS04
甜菜堿
Bst DNA聚合酶
各0. 2微摩爾每升 0.4毫摩爾每升 2微升 8毫摩爾每升 l摩爾每升 8單位
反應(yīng)總體積共20微升<在上述反應(yīng)體系中，在其它條件設(shè)定不變的情況下，分別改變反應(yīng)時(shí)間、
反應(yīng)溫度、交叉擴(kuò)增引物F和R的濃度和鎂離子濃度，進(jìn)行一系列試驗(yàn)，試 驗(yàn)結(jié)果顯示于以下附圖中。
附圖5顯示了在其他條件完全一致的情況下，不同反應(yīng)時(shí)間的電泳圖。 泳道2—9的反應(yīng)時(shí)間分別為66分鐘，68分鐘，70分鐘，72分鐘，74分鐘， 76分鐘，78分鐘和80分鐘。信號(hào)呈梯度增強(qiáng)。泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。 顯然最佳的反應(yīng)時(shí)間為80分鐘。附圖6顯示了在其他反應(yīng)條件完全一致的情 況下，不同反應(yīng)溫度結(jié)果的電泳圖。泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物，泳道2 — 7 的反應(yīng)溫度分別是56°C， 58°C， 60°C， 62°C， 64。C和66°C。當(dāng)溫度小于60 "C時(shí)，隨著溫度的升高，信號(hào)也隨著增強(qiáng)；當(dāng)溫度高于60'C時(shí)，隨著溫度的 升高，信號(hào)隨著減弱。從上述結(jié)果可知，最佳的反應(yīng)溫度為60'C。附圖7顯 示了在其他反應(yīng)條件完全一致的情況下，不同交叉擴(kuò)增引物F和R濃度的反 應(yīng)結(jié)果的電泳圖。泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物，泳道10為陰性對(duì)照，泳道2 一9的交叉擴(kuò)增引物F和R濃度分別0.8微摩爾每升，0.7微摩爾每升，0.6 微摩爾每升，0.5微摩爾每升，0.4微摩爾每升，0.3微摩爾每升，0.2微摩 爾每升，0. l微摩爾每升。交叉引物濃度在0.4微摩爾每升的時(shí)候信號(hào)最強(qiáng)， 而當(dāng)引物濃度高于0.4微摩爾每升時(shí)，隨著引物濃度的下降，信號(hào)也隨著增 強(qiáng)；而引物濃度低于0.4微摩爾每升時(shí)，隨著引物濃度的下降，信號(hào)也隨著 下降，因而最佳的擴(kuò)增引物濃度為0.4微摩爾每升。附圖8顯示了在其他反 應(yīng)條件完全一致的情況下，不同Mg2+濃度的反應(yīng)結(jié)果電泳圖。泳道1為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)物。泳道2—7的Mg2+濃度分別為10毫摩爾每升，9毫摩爾每 升，8毫摩爾每升，7毫摩爾每升，6毫摩爾每升，5毫摩爾每升。Mg2+濃度 在8毫摩爾每升時(shí)，反應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)。而當(dāng)Mg2+濃度高于8毫摩爾每升時(shí)，隨 著Mg2+濃度的下降，信號(hào)也隨著增強(qiáng)；而引物濃度低于8毫摩爾每升時(shí)，隨 著Mg2+濃度的下降，信號(hào)也隨著下降。顯然，最佳的Mg2+濃度為8毫摩爾每 升。圖9顯示了試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果。
權(quán)利要求
1、一種交叉引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其特征為包括以下步驟1)設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和一對(duì)剝離引物；2)在擴(kuò)增靶核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定末端，為快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板；3)以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù)雜交、延伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位點(diǎn)，使同一條模板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。
2、 一種檢測(cè)引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其特征為包括以下步驟1) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和一對(duì)剝離引物；2) 在擴(kuò)增靶核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定 末端，為快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板；3) 以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù) 雜交、延伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位 點(diǎn)，使同一條模板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；和4) 設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，以擴(kuò)增階段產(chǎn)生的大量含有檢測(cè)序列的擴(kuò) 增產(chǎn)物為模板，用檢測(cè)引物合成可被檢測(cè)的雙重標(biāo)記的DNA雙鏈分 子。
3、 一種靶核酸序列的快速檢測(cè)方法，其特征為包括以下步驟1) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和 一對(duì)剝離引物；2) 在擴(kuò)增靶核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定末端，為快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板；3) 以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù) 雜交、延伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位 點(diǎn)，使同一條模板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；4) 設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，以擴(kuò)增階段產(chǎn)生的大量含有檢測(cè)序列的擴(kuò) 增產(chǎn)物為模板，用檢測(cè)引物合成可被檢測(cè)的雙重標(biāo)記的DNA雙鏈分 子；和5) 用核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的任何一項(xiàng)方法，其特征為其中步驟1)-3) 分別包括以下步驟1) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物和一對(duì)剝離引物，其包括a) 設(shè)計(jì)一對(duì)交叉擴(kuò)增引物，交叉擴(kuò)增引物F和交叉擴(kuò)增引物R， 交叉擴(kuò)增引物F和交叉擴(kuò)增引物R主要由雜交序列、連接區(qū)域和互 換序列三部分組成；和b) 設(shè)計(jì)一對(duì)剝離引物，剝離引物F和剝離引物R，剝離引物F為正向外引物，與靶基因的反義鏈完全互補(bǔ)，剝離引物R為反向外引物， 與耙基因的正義鏈完全互補(bǔ)；2) 在擴(kuò)增耙核酸序列的兩端引入交叉引物雜交位點(diǎn)和產(chǎn)生固定末端， 為快速擴(kuò)增準(zhǔn)備模板，其包括-a) 使正向擴(kuò)增引物F與核酸耙分子雜交，其中所述正向引物F 的5'末端帶有反向引物R的雜交識(shí)別序列；b) 用具備剝離功能的DNA聚合酶延伸正向擴(kuò)增引物F，合成雙 鏈核酸；c) 使正向剝離引物F與核酸耙分子雜交；d) 用具備剝離功能的DNA聚合酶延伸剝離引物F，剝離正向擴(kuò) 增引物F的延伸鏈，由此產(chǎn)生固定的正向鏈5'末端；e) 使用被剝離的擴(kuò)增引物延伸鏈作為模板，與反向擴(kuò)增引物R 雜交，其中所述反向引物R的5'末端帶有正向引物F的雜交識(shí)別序 列；f) 用具備剝離功能的DNA聚合酶延伸反向擴(kuò)增引物R，合成雙 鏈核酸；g) 使反向剝離引物R與核酸耙分子雜交；h) 用具備剝離功能的DNA聚合酶延伸剝離引物R，剝離反向擴(kuò) 增引物R的延伸鏈，由此產(chǎn)生固定的反向鏈5'末端，此時(shí)產(chǎn)生的反 向擴(kuò)增引物R延伸鏈兩端已經(jīng)固定，并在3，和5'末端分別引入擴(kuò) 增引物F和R的雜交序列，用作快速擴(kuò)增的模板；和3) 以線性結(jié)構(gòu)和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)引物的反復(fù)雜交、 延伸和擴(kuò)增產(chǎn)物的自我雜交折疊及延伸，產(chǎn)生多個(gè)引物雜交位點(diǎn)，使 同一條模板上可有多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，位于后方的引物延伸依次 剝離前方引物的延伸鏈，而被剝離的延伸鏈又可作為模板參與下一輪 的擴(kuò)增，從而大大地提高了擴(kuò)增速度。
5、 一種檢測(cè)引物擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其特征為包括權(quán)利要求 4所述的步驟l)-3);和4)設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，檢測(cè)引物F與檢測(cè)引物R，檢測(cè)引物R為反 向內(nèi)側(cè)引物，與靶基因的正義鏈完全互補(bǔ)；檢測(cè)引物F為正向內(nèi)側(cè)引 物，與靶基因的反義鏈完全互補(bǔ)；以擴(kuò)增階段產(chǎn)生的大量含有檢測(cè)序 列的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用檢測(cè)引物合成可被檢測(cè)的雙重標(biāo)記的DNA雙 鏈分子。
6、 一種利用核酸試紙條檢測(cè)耙核酸序列的方法，其特征為包括 權(quán)利要求5所述的步驟1) -4);和5)用核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的任何一項(xiàng)的方法，其特征為其中擴(kuò)增階 段以線性結(jié)構(gòu)方式進(jìn)行，擴(kuò)增引物每次延伸都會(huì)引入一個(gè)新的引物雜 交序列，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)隨著每輪擴(kuò)增而延長(zhǎng)；另一方面，由于短鏈產(chǎn)物 的合成速度較快，引物雜交的機(jī)會(huì)較多，最終產(chǎn)物大部分為短鏈產(chǎn)物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的任何一項(xiàng)的方法，其特征為其中擴(kuò)增階 段以二級(jí)結(jié)構(gòu)方式進(jìn)行，由于長(zhǎng)鏈擴(kuò)增物帶有多個(gè)重復(fù)互補(bǔ)的序列， 擴(kuò)增物將自我折疊形成各種復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中一些能夠自我延 伸，使產(chǎn)物更長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜；另一些二級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈部分可供引物 雜交，合成新的產(chǎn)物。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的任何一項(xiàng)的方法，其特征為其中擴(kuò)增階 段以線性結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)混合的方式進(jìn)行，線性結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)可互 變，單鏈的線性結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分子還可通過(guò)雜交而相互交聯(lián)，形成 巨大的DNA雜交復(fù)合物。
10、 根據(jù)權(quán)利要求4-6所述的任何一項(xiàng)的方法，其特征為其中交叉擴(kuò) 增引物由三部分組成a) 雜交序列是與模板特異性雜交用于擴(kuò)增延伸的堿基序列；b) 連接區(qū)域用于引物上兩個(gè)不同序列的連接，通常為一至三個(gè) 單核苷酸；c) 互換序列，即交叉擴(kuò)增引物F的雜交序列用來(lái)作為交叉擴(kuò)增 引物R的5'末端序列，反之，交叉擴(kuò)增引物R的雜交序列用來(lái)作為 交叉擴(kuò)增引物F的5'末端序列。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征為其中檢測(cè)引物F和R分別用不同的半抗原標(biāo)記，該對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物將帶有雙重抗原標(biāo)記， 用于檢測(cè)。
12、 根據(jù)權(quán)利要求4-6所述的任何一項(xiàng)的方法，其特征為其中所述的 DNA聚合酶選自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Vent DNA聚 合酶或Phi29 DNA聚合酶。
13、 用于擴(kuò)增靶核酸序列的試劑盒，其特征為其中所述核酸為DNA或腿o
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征為其中所述DNA聚合酶 選自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。
15、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征為在檢測(cè)病原微生物、 環(huán)境微生物、微生物分型、檢測(cè)人類、動(dòng)物或植物傳染病病原體、檢 測(cè)食品或生物武器中傳染病病原體、檢測(cè)人類遺傳病或健康風(fēng)險(xiǎn)基因 及其評(píng)估的用途。
全文摘要
本發(fā)明是涉及對(duì)核酸序列新的擴(kuò)增技術(shù)，更具體地說(shuō)，涉及利用交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增靶核酸序列的方法。本發(fā)明還涉及了在擴(kuò)增反應(yīng)中標(biāo)記擴(kuò)增靶核酸序列的方法及靶核酸序列的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明還涉及了在快速核酸診斷方面的試劑盒及其在細(xì)菌和病毒等病原微生物的核酸檢測(cè)方面的應(yīng)用，以及在人類遺傳性疾病相關(guān)的基因診斷應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101638685SQ20081013458
公開(kāi)日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者尤其敏, 徐高連, 石翊軒, 林 胡 申請(qǐng)人:杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司