專利名稱：：一種對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑敏感的報(bào)告菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種通過分子生物學(xué)手段，利用代謝工程改造的細(xì)菌菌株，具體涉及一種對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌報(bào)告菌株、制備方法及其在檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來，工業(yè)迅猛發(fā)展，人們生活條件改善，對于環(huán)境問題也越來越關(guān)注。"環(huán)保、生態(tài)、綠色、健康"已成為21世紀(jì)人們生活的主題概念。氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑(redoxcyclingreagents)是一類較嚴(yán)重的工農(nóng)業(yè)污染物，該類物質(zhì)具有酶的特性，使細(xì)胞持續(xù)性產(chǎn)生超氧陰離子，同時(shí)造成細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量(NADH/NADPH)大量消耗，所產(chǎn)生的超氧自由基能夠引起機(jī)體氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激參與很多疾病如神經(jīng)退行性變、癌癥和衰老等的發(fā)生過程，還參與動(dòng)脈粥樣硬化和心臟病的進(jìn)展，也和血管生成以及心血管狀態(tài)的調(diào)節(jié)有關(guān)。環(huán)境中的這種物質(zhì)增多會(huì)惡化生態(tài)環(huán)境，污染水源食物，嚴(yán)重威脅著人們的健康。目前已經(jīng)發(fā)展了一些物理化學(xué)方法，利用質(zhì)譜儀、氣相色譜儀及其它現(xiàn)代化的儀器對氧還循環(huán)反應(yīng)劑進(jìn)行精確監(jiān)測，但是，這些物理化學(xué)方法需要昂貴的儀器和專門的實(shí)驗(yàn)室，更重要的是，這些技術(shù)雖說能夠精確定量污染物，但是不能提供這些污染物的生物有效度、細(xì)胞內(nèi)潛在的修飾/去毒作用以及體內(nèi)的協(xié)同/拮抗效應(yīng)等生物學(xué)關(guān)鍵信息。因此，有必要發(fā)展一種生物傳感器來對這些有毒物質(zhì)進(jìn)行檢測。在過去的十幾年里，利用生物檢測技術(shù)來檢測特殊污染物的研究引起了廣泛的關(guān)注，生物檢測技術(shù)的基本原理即是利用模式生物對特定化學(xué)物質(zhì)的分子反應(yīng)機(jī)理。對于生物檢測技術(shù)而言需要三種必需的元件l)針對特定或具有相似性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)的感應(yīng)器；2)由感應(yīng)器控制的啟動(dòng)子；3)受此啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因。在設(shè)計(jì)生物檢測技術(shù)時(shí)，由于細(xì)菌具有在環(huán)境中大量存在、生長快速、低成本及易維護(hù)等優(yōu)點(diǎn)而受到研究人員普遍親睞。使用生長曲線法、終點(diǎn)法、MIC法來檢測菌株對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性均有一定的局限性，不能很好地反應(yīng)細(xì)菌對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間長，多次重復(fù)試驗(yàn)耗時(shí)耗力，不利于快速檢測。平板計(jì)活菌法檢測細(xì)菌對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，則不能連續(xù)監(jiān)測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑作用下的細(xì)菌生長狀態(tài)，且該方法測定周期較長，主觀誤差大，準(zhǔn)確度不高，故也不能很好檢測出細(xì)菌對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性。所以需要進(jìn)一步的改建菌株以快速而敏感地檢測出細(xì)菌對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性。對于氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的研究主要基于大腸桿菌中SoxR和OxyR兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的研究?，F(xiàn)在已經(jīng)比較清楚大腸桿菌針對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑反應(yīng)的分子機(jī)理，兩種氧還反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，SoxR和OxyR,主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)胞對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的反應(yīng)。SoxR包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域N端的螺旋一轉(zhuǎn)折一螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。SoxRC端的四個(gè)半胱氨酸殘基(Cys)作為氧還活性簇(2Fe-2S)的配體。純化的SoxR是一同源二聚體，每一單體包含一個(gè)氧還活性簇(2Fe-2S)。在普通培養(yǎng)條件下，SoxR(2Fe-2S)簇處于還原狀態(tài)，無任何轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)，SoxR立即被氧化，并刺激其唯一目標(biāo)其因SoxS的表達(dá)。其產(chǎn)物SoxS是ara-c相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活子，誘導(dǎo)36種基因，包括含有Mn的過氧化物歧化酶，檢酸內(nèi)切酶IV,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，延胡索酸酶C,烏頭酸酶A和NADPH-鐵氧還蛋白氧化還原酶基因的表達(dá)。當(dāng)大腸桿菌接觸氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)，還原狀態(tài)的SoxR(2Fe-2S)續(xù)立即被氧化。還原態(tài)(2Fe-2S)簇的氧化即顯示出SoxR轉(zhuǎn)錄活性，刺激目標(biāo)基因SoxS表達(dá)的能力可增高達(dá)100。由SoxR對SoxS直接而強(qiáng)有力的誘導(dǎo)控制可以推測SoxR及其目標(biāo)SoxS啟動(dòng)子可以用作檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的絕佳的生物檢測系統(tǒng)。SoxR和SoxS墓因頭對頭分布于大腸桿菌染色上(如圖1)，它們的翻譯起始位置相隔僅85bp。SoxS啟動(dòng)子包含典型-35(TTTACC)和-10(TATACT)元件。SoxS啟動(dòng)子-35及-10元件間相隔19bp，對由氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑生成的過氧化物，SoxR活化后刺激SoxS基因的表達(dá)。為了檢測SoxR的活化，將把一報(bào)告基因與SoxS啟動(dòng)子相融合。通常使用的報(bào)告基因包括LacZ和LuxABCD基因。大腸桿菌LacZ基因編碼催化-半乳糖苷及其類似物水解的p-半乳糖苷酶。此酶轉(zhuǎn)換率高且活性強(qiáng)。但是，為了檢測卩-半乳糖苷酶的活性必須在檢測系統(tǒng)中加入酶底物。源于Vibriofisher的LuxABCD基因編碼的細(xì)菌熒光素酶催化還原態(tài)黃素單核苷酸(FMN)和長鏈醛有氧氧化成氧化態(tài)FMN和相應(yīng)的羧酸，后者在490nm左右有發(fā)射光譜。如果使用完整的LuxABCD基因，不需加入外源底物用于生成檢測信號(hào)，但是生物發(fā)光技術(shù)不完全等同于原位檢測。此外，大腸桿菌中表達(dá)的細(xì)菌性熒光素酶即使在不存在任何氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)，其酶活性也會(huì)產(chǎn)生顯著的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。本發(fā)明所述報(bào)告菌株可以克服這些不足，形成比較穩(wěn)定的基因突變株ExoliWMC-002報(bào)告菌株，為生物檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑奠定基礎(chǔ)。經(jīng)檢索本研究構(gòu)建的基因置換報(bào)告菌株在國內(nèi)外均無文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是通過基因敲除、基因置換技術(shù)構(gòu)建了一種穩(wěn)定的大腸桿菌報(bào)告菌株作為檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的反應(yīng)宿主，來快速靈敏檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑，以解決生長曲線法、終點(diǎn)法、MIC法檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑耗時(shí)耗力、主觀誤差大、準(zhǔn)確度不高等缺陷。本發(fā)明所述大腸桿菌報(bào)告菌株，名稱為E.coliWMC-002,已于2008年4月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址是北京巿朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，編號(hào)CGMCCNo.2464。該大腸桿菌報(bào)告菌株和野生型大腸桿菌E.coliMC4100相比，缺失五個(gè)基因，分別是sodA(序列如SEQIDNO.1所示)、sodB(序列如SEQIDNO.2所示)、katG(序列如SEQIDN0.3所示)、ahpCF(序列如SEQIDNO.4所示)、frdABCD(序列如SEQIDNO.5所示)，這些基因中sodA、sodB是編碼過氧化物岐化酶的基因、katG、ahpCF編碼過氧化氫酶、frdABCD編碼延胡索酸還原酶，產(chǎn)生內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫，這些基因的刪除可以增加菌株對氧化還原劑檢測的靈敏度和降低檢測的本底值。在此基礎(chǔ)上，通過交叉PCR反應(yīng)，形成含有報(bào)告基因GFPmut2(序列如SEQIDNO.6所示)與待置換目的基因SoxS(序列如SEQIDNO.7所示)兩側(cè)DNA片段N和C端相融合的一段1.7kb左右的DNA片段，如圖2所示；克隆到pKOV條件復(fù)制質(zhì)粒，構(gòu)建pKOV-GFPmut2重組載體，如圖3所示；將該重組載體轉(zhuǎn)化入敲除了五個(gè)基因的E.coliMC4100中，通過溫度及蔗糖的選擇，發(fā)生兩次同源重組，最后將基因SoxS置換，得到對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌報(bào)告菌株E.coliWMC-002。本發(fā)明的E.coliWMC-002報(bào)告菌株的構(gòu)建方法是利用條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV作為工具，利用同源重組原理，敲除sodA、sodB、katG、ahpCF、frdABCD五個(gè)基因，再通過基因置換技術(shù)將基因組上的SoxS編碼基因置換成為GFPmut2報(bào)告基因。其置換方法為利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)將大腸桿菌基因組中待置換目的基因SoxS兩側(cè)DNA片段N和C進(jìn)行擴(kuò)增，按照經(jīng)驗(yàn)，需要較大的DNA片段N和C(每段DNA長度為500bp)才能利用宿主重組酶系統(tǒng)成功進(jìn)行重組；再對報(bào)告基因GFPmut2報(bào)告基因進(jìn)行擴(kuò)增。對于DNA片段N,引物SoxS-No被設(shè)計(jì)成含有Notl內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物SoxS-Ni5'端含有與引物GFP-N互補(bǔ)的堿基序列；DNA片段C的引物SoxS-Co被設(shè)計(jì)成含有Sail內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物SoxS-Ci5'端含有與引物GFP-C互補(bǔ)的堿基序列。從上述PCR反應(yīng)中合成的DNA產(chǎn)物通過交叉PCR連接形成含有報(bào)告基因GFPmut2與待置換目的基因SoxS兩側(cè)DNA片段N和C端相融合的一段DNA片段，如圖2所示。GFPmut2基因融合的DNA片段被克隆進(jìn)pKOV質(zhì)粒的Notl、Sail內(nèi)雙酶切位點(diǎn)。克隆的質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入已敲除5個(gè)相關(guān)基因的大腸桿菌株E.coliMC4100。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含氯霉素/LB平板并置42t:孵育。平板上存活的菌落指示重組pKOV質(zhì)粒已成功整合進(jìn)入基因組DNA,因?yàn)橛坞x質(zhì)粒不會(huì)在非允許溫度下復(fù)制增殖。存活的菌落將會(huì)立即被置于含5。/。(W/V)蔗糖的平板上置3(TC培養(yǎng)以選擇發(fā)生第二次重組事件的大腸桿菌克隆。對蔗糖抵抗且對氯霉素敏感的細(xì)菌克隆被挑選用作進(jìn)一步分析。如果插入及整合事件全發(fā)生在目的基因SoxS的同一側(cè)的話，將會(huì)產(chǎn)生象親代一樣的大腸菌株。另一方面，如果插入與整合發(fā)生在目的基因SoxS的不同側(cè)的話(如圖6)，就會(huì)發(fā)生GFPmut2置換SoxS基因。因此，陽性克隆通過針對目的基因SoxS兩側(cè)序列的引物的PCR方法加以確證。此基因置換方法實(shí)現(xiàn)在不導(dǎo)入基因組中任何抗生素抗性DNA標(biāo)志的情況下實(shí)現(xiàn)精確基因置換。為了克服(3-半乳糖苷酶和生物發(fā)光的局限性，選用編碼水母AequoreaVicroria綠色熒光蛋白(GFP)的GFP基因用作報(bào)告基因。發(fā)光型細(xì)菌生物傳感器因?yàn)槟芸焖贆z測到毒物而受到歡迎。因此，在菌株基因組中引入報(bào)告基因來快速靈敏檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑是本專利的特色。GFP作為備受青睞的標(biāo)記分子，在短短幾年時(shí)間內(nèi)就得到了廣泛的應(yīng)用,其原因在于它具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)易于檢測。GFP熒光反應(yīng)不需要外加底物和輔助因子，只需紫外光或藍(lán)光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到,且靈敏度高,對于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識(shí)別；(2)熒光穩(wěn)定。GFP對光漂白有較強(qiáng)的耐受性，能耐受長時(shí)間的光照；GFP在pH712范圍內(nèi)也能正常發(fā)光；對高溫(7(TC)、堿性、除港劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)都有較強(qiáng)抗性；(3)無毒害。從目前的研究結(jié)果來看，GFP對生活的細(xì)胞基本無毒害，對目的基因的功能也沒有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代；(4)通用性。表現(xiàn)在GFP的表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動(dòng)物中都獲得了成功的表達(dá)；其次是GFP沒有細(xì)胞種類和位置上的限制，在各個(gè)部位都可以表達(dá)發(fā)出熒光；(5)易于構(gòu)建載體。由于GFP分子量較小，僅為2730kD,編碼GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。(6)可進(jìn)行活細(xì)胞定時(shí)定位觀察。對活細(xì)胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真實(shí)的狀態(tài)。穩(wěn)定的GFP蛋白較之細(xì)菌性熒光素酶(~0.1)有更高的量子產(chǎn)量(0.88)。而且，只需大約105106個(gè)GFP分子即可檢測出熒光信號(hào)。在此，使用一種由GFPmut2基因編碼的GFP蛋白，它比野生型GFP蛋白亮100多倍。從pGFPmut2質(zhì)粒(購自Clonetech)DNA中獲得含GFPmut2基因的DNA片段，利用交叉PCR技術(shù)通過三步PCR進(jìn)行基因融合，將目的基因SoxS兩端序列與GFPmut2基因融合，利用pKOV質(zhì)粒特性，進(jìn)行了基因置換，形成SoxS啟動(dòng)子直接啟動(dòng)GFPmut2基因表達(dá)的模式。在此構(gòu)建中，SoxR基因編碼產(chǎn)生的SoxR蛋白結(jié)合于SoxS啟動(dòng)子序列。當(dāng)存在氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下由氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑產(chǎn)生的過氧化物活化SoxR并刺激SoxS::GFPmut2融合基因的表達(dá),產(chǎn)生GFPmut2蛋白，如圖4所示。本發(fā)明提供一種對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌報(bào)告菌株，由野生型大腸桿菌E.coliMC4100缺失sodA、sodB、katG、ahpCF、frdABCD五個(gè)基因，再利用基因置換技術(shù)，將SoxS編碼基因替換為GFPmut2報(bào)告基因，命名為E.coliWMC-002,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)CGMCCNo.2464。本發(fā)明還提供所述大腸桿菌報(bào)告菌株的構(gòu)建方法，包含以下步驟(1)利用條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV作為工具，通過同源重組的方法順序敲除野生型大腸桿菌E.coliMC4100基因組中frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA五個(gè)基因；(2)利用交叉PCR反應(yīng)構(gòu)建含有報(bào)告基因GFPmut2與待置換目的基因SoxS的兩端同源臂的融合PCR片斷；(3)將步驟2所得片段克隆到pKOV條件復(fù)制質(zhì)粒，構(gòu)建pKOV-GFPmut2重組載體；(4)所述重組載體pKOV-GFPmut2轉(zhuǎn)化入步驟(1)中所得菌株基因組中，通過兩次同源重組，將步驟(1)中所得菌株基因組SoxS編碼基因置換成為GFPmut2報(bào)告基因。本發(fā)明還提供所述大腸桿菌報(bào)告菌株在檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明所述大腸桿菌報(bào)告菌株對于典型氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑VitK3(VitaminK3，維生素K3)、PMS(Phe腿inemethosulfate，吩嗪硫酸甲酯)和PQ(Parquat，百草枯)的敏感性明顯高于野生菌E.coliMC4100。同時(shí)能夠解決生長曲線法、終點(diǎn)法、MIC法檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑耗時(shí)耗力、主觀誤差大、準(zhǔn)確度不高等缺陷。也可以克服帶有報(bào)告載體的報(bào)告菌株由于單個(gè)細(xì)菌中質(zhì)粒的高拷貝數(shù)且數(shù)量不均一，在細(xì)菌基礎(chǔ)代謝沒有誘導(dǎo)物的情況下報(bào)告信號(hào)的本底很高，降低了對污染物檢測的敏感性的缺點(diǎn)；質(zhì)粒的遺傳具有相對的獨(dú)立性，引入微生物細(xì)胞的質(zhì)粒，經(jīng)過幾代的培養(yǎng)，很可能丟失，導(dǎo)致工程菌失效；進(jìn)入環(huán)境的質(zhì)粒也可能污染其他的菌種，造成潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)性；另外利用質(zhì)粒作為載體的報(bào)告系統(tǒng)檢測污染物也存在精確定量相對困難、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，而構(gòu)建的基因突變株E.coliWMC-002報(bào)告菌株可以克服這些不足。利用本發(fā)明提供的E.coliWMC-002菌株作為檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的反應(yīng)宿主菌，其對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性明顯增加且生物信號(hào)能夠快速客觀地檢測。利用本發(fā)明所述菌株作為宿主菌可以在環(huán)境污染物一氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的檢測中得到應(yīng)用。圖1E.coli染色體中soxSandsoxR基因分布圖；圖2利用交叉PCR技術(shù)進(jìn)行基因融合示意圖；圖3重組載體pKOV-GFPmut2的構(gòu)建流程圖；圖4SoxS::GFPmut2基因融合示意圖5基因替換載體導(dǎo)入宿主于30'C孵育PCR電泳1:DL2000DNAMarker;5:空白對照；2、3、4、6、7:基因替換載體導(dǎo)入宿主于30。C孵育PCR產(chǎn)物；圖6SoxS與GFPmut2基因置換構(gòu)建報(bào)告基因示意圖7基因替換載體與宿主在42。C氯霉素孵育發(fā)生同源重組PCR電泳1:DL2000DNAMarker;3:空白對照；7:基因替換載體導(dǎo)入宿主于30。C孵育PCR產(chǎn)物；2、4、5、6、8:基因替換載體與宿主在42。C氯霉素孵育中發(fā)生同源重組PCR產(chǎn)物。圖8SoxS與GFPmut2基因發(fā)生基因替換PCR電泳鑒定1:DL2000DNAMarker;2:基因替換載體導(dǎo)入宿主于30。C孵育PCR產(chǎn)物；3、4、6、7:SoxS與GFPmut2基因發(fā)生基因替換PCR產(chǎn)物；5、8-13:宿主未發(fā)生基因替換的PCR產(chǎn)物(陰性對照)；14:空白對照。圖9基因置換報(bào)告菌株在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果圖；左基因置換報(bào)告菌株在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；右普通大腸桿菌在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(陰性對照)；圖IO報(bào)告菌株生長曲線圖11不同濃度PQ作用于報(bào)告菌株熒光顯微鏡觀察結(jié)果(10xioo倍)圖；A:10|iM;B:1jiM;C:0,1jiM;D:Blank圖12不同濃度PMS作用于報(bào)告菌株熒光顯微鏡觀察結(jié)果(10xl00倍)A:IO一；B:1pM;C:0.1pM;D:Blank圖13不同濃度VitK3作用于報(bào)告菌株熒光顯微鏡觀察結(jié)果(10xIOO倍)圖。A:lOOjiM;B:IOjiM;C:1|iM;D:Blank具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌的構(gòu)建具體方法如下實(shí)施例1.目的基因的融合(一)、引物信息及合成根據(jù)哈佛大學(xué)網(wǎng)站提供基因敲除的引物序列和GenBank公布的SoxS及GFPmut2基因序列，設(shè)計(jì)soxS基因N末端和C末端的內(nèi)側(cè)引物(P2:soxS-Ni和P3:soxS-Ci)和外側(cè)引物(Pl:soxS-No和P4:soxS-Co),使P2與P5，P3與P6之間存在互補(bǔ)序列，基因敲除兩個(gè)外側(cè)引物不變，P5與P6為一對擴(kuò)增GFPmut2基因引物。具體信息見表-1,引物由大連寶生物公司合成。用無菌去離子水將引物溶解，配成濃度為10^mol/L。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(二)、交叉PCR進(jìn)行基因融合利用交叉PCR技術(shù)通過三步PCR進(jìn)行基因融合，將目的基因SoxS兩端序列與GFPmut2基因融合，形成SoxS啟動(dòng)子直接啟動(dòng)GFPmut2基因表達(dá)的模式。實(shí)施例2.擴(kuò)增兩個(gè)同源臂及GFPmut2基因1.兩個(gè)同源臂的擴(kuò)增用接種針挑取LB平板E.coliMC4100—單個(gè)菌落少許，混于含15|iL無菌水的200(iLPCR反應(yīng)管中，沸水煮10min,12000rpm離心35min把凝結(jié)在蓋子上的水滴離到管底。取表2中所配體系5pL加入該管中，混勾。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>PCR反應(yīng)條件如下94°C1min;88°C4min;94°C10sec，66°C3min,25個(gè)循環(huán)；72°C10min，4。C保存。取5產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的ddH20溶解洗脫備用。2.GFPmut2基因的擴(kuò)增用接種針挑取含有pGFPmut2質(zhì)粒(Clonetech)的單個(gè)菌落少許，混于含15|iL無菌水的200^LPCR反應(yīng)管中，沸水煮10min，12000rpm離心3~5min把凝結(jié)在蓋子上的水滴離到管底。取表3中所配體系5pL加入該管中，混勻。PCR反應(yīng)條件如下:94°Clmin;88。C4min;94°C25sec,55°C35sec，72。C40sec,25個(gè)循環(huán)；72°C10min，4"C保存。取5(iL產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的ddH20溶解洗脫備用。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.—側(cè)同源臂與GFPmut2基因融合按表4中所配體系反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件如下94°C1min;88°C4min;94°C25sec，55°C35sec，72°C40sec,25個(gè)循環(huán)；72°C10min，4。C保存。取5pL產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的ddH20溶解洗脫備用。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.兩側(cè)同源臂與GFPmut2基因融合按表5中所配體系反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件如下94°C1min;88°C4min;94°C10sec，66。C3min，25個(gè)循環(huán)；72°C10min,4。C保存。取5pL產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示，兩側(cè)同源臂與GFPmut2基因成功融合。表5ReagentsVolume((oL)dNTPMixture(2.5mM)尸戶6eWDNAPolymerase(5U/pL)na/ar叫(5U/|jL)N端同源臂與GF尸wW2基因融合的PCR反應(yīng)產(chǎn)物C端同源臂PCR反應(yīng)產(chǎn)物PI(soxS-No)P4(soxS"Co)10xbuffer(plusMg2+)ddH20_Total_實(shí)施例3、PCR產(chǎn)物加A反應(yīng)在上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中按每50iaL加入5U的比例加入ExTaq⑧聚合酶，72°C10min。(四)、PCR片斷純化回收加A反應(yīng)產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的ddH2O溶解洗脫備用。實(shí)施例4.目的片段與pMD19-Tsimple載體連接按TaKaRa公司的pMD19-TsimpleVector試劑盒說明書進(jìn)行T載體與目的基因的連接。連接反應(yīng)體系見表6，連接反應(yīng)于16t:過夜。20.090.030.50.50,40.4214.520表6ReagentsVolume((jL)pMD19-TsimpleVector1回收產(chǎn)物1ddH20LigationSolutionTotal10實(shí)施例5.轉(zhuǎn)化通過冷CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細(xì)胞中。實(shí)施例6.測序挑選一個(gè)經(jīng)外側(cè)引物P1、P4PCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定證實(shí)的單克隆送大連寶生物公司測序，測序結(jié)果與NCBI上提供的標(biāo)準(zhǔn)參考序列比對。實(shí)施例7.重組克隆pMD19T-GFPmut2的雙酶切和目的片段GFPmut2融合基因的回收1.堿裂解法小量質(zhì)粒DNA的制備(按《分子克隆》中的方法進(jìn)行)。2.pMD19T-GFPmut2質(zhì)粒的雙酶切和目的片段GFPmut2融合基因的回收提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切，其反應(yīng)體系見表7，37°C,酶切3h。表7ReagentsVolume(|jL)pMD19T-OF尸賺,210淑I(10U/(xL)15WI(腦VL)110xHBuffer20.1%BSA2ddH204Total20目的片段GFPmut2融合基因的切膠回收酶切反應(yīng)后產(chǎn)物行0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，在長波紫外燈下切割目的DNA片段，以TaKaRa公司膠回收試劑盒進(jìn)行回收。最后以Du-800核酸/蛋白分析儀對回收產(chǎn)物定量。實(shí)施例8.pKOV載體片段的制備(一)、堿裂解法中量制備pKOV載體因?yàn)橘|(zhì)粒pKOV是低拷貝的(5~10個(gè)/cell),為了得到足夠的量就選用質(zhì)粒中量提取法(按《分子克隆》中的方法進(jìn)行)。(二)、pKOV質(zhì)粒的雙酶切及其回收體系及酶切條件同pMD19T-GFPmut2質(zhì)粒，回收純化載體片段。實(shí)施例9.重組載體pKOV-GFPmut2的構(gòu)建及保存(一)、目的片斷與載體的連接反應(yīng)反應(yīng)體系見表8，連接反應(yīng)于16i:過夜。表8ReagentsVolume(pL)pKOV載體2OFPmw。片斷T4DNA連接酶210xbuffer2.5ddH2010.5Total20(二)、將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中(三)、陽性克隆的鑒定1.PCR鑒定用接種針挑取LBCM+平板單個(gè)菌落少許，混于取含14pL無菌水的200PCR反應(yīng)管中，沸水煮10min,12000rpm離心3~5min把蓋子上的水蒸氣離到管底。取表9中所配體系加入該管中，混勻。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>PCR反應(yīng)條件如下94°C1min;88°C4min;94°C10sec,66°C3min，25個(gè)循環(huán)；72。C10min,4。C保存。取5產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。電泳顯示PCR片斷長度在1.7kb左右的單克隆被挑選出，進(jìn)行下面的質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定。2.質(zhì)粒雙酶切鑒定1)上述克隆質(zhì)粒的中量提取(同上述)2)體系及酶切條件同pMD19T-GFPmut2質(zhì)粒。酶切反應(yīng)后產(chǎn)物行0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。酶切片斷在1.7kb左右證實(shí)重組載體構(gòu)建成功，菌種置含甘油15%的LBCM+中，-70°(3保存，備用。實(shí)施例10.SoxS與GFPmut2基因的置換(一)、五個(gè)基因缺失菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)將-70。C凍存的五個(gè)基因缺失菌株接種于約23mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C,200rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。(2)將振蕩培養(yǎng)過夜的細(xì)菌500(iL加入含有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，振蕩培養(yǎng)3h3.5h。(3)將菌液移入冰預(yù)冷的50mL聚丙烯管中，冰上放置10min。(4)4°C,4,000rpm離心10min，棄上清，收集菌體。(5)以10mL冰預(yù)冷的0.1MCaCl2重懸沉淀，置于冰上。(6)4°C，4,000rpm離心10min，棄上清。(7)用2mL冰預(yù)冷的0.1MCaCl2重懸沉淀，分裝(100i^L/每管)。直接用于轉(zhuǎn)化或加入15%甘油，放于-7(TC凍存。(二)、重組載體pK0V-GFPmut2轉(zhuǎn)化入五個(gè)基因缺失菌株感受態(tài)細(xì)胞1、DH5a中pKOV-GFPmut2重組載體的提取(試劑盒法TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0)2、重組載體pKOV-GFPmut2轉(zhuǎn)化(1)取100jiL感受態(tài)細(xì)菌，加入上述重組載體，輕輕搖勻，冰洛30min。(2)42°C熱休克90~120s，冰浴3~5min。(3)加800pLLB液體培養(yǎng)基，搖勻，37°C100rpm振蕩培養(yǎng)1h。(4)分別用LB液體培養(yǎng)基稀釋10倍、IOO倍，并各取O.lmL分別涂于LBCM+平板(5)待菌液完全吸收后，倒置培養(yǎng)皿，37'C過夜。(三)、同源重組前的鑒定1.30°CLBCM+平板生長出的單個(gè)菌落PCR鑒定用接種針挑取LBCM+平板單個(gè)菌落少許，混于含14pL無菌水的200pLPCR反應(yīng)管中，沸水煮10min，12000rpm離心35min把凝結(jié)蓋子上的水滴離到管底。取表10中所配體系加入該管中，混勻。表IOReagentsVolume(^L)dNTPMixture(2.5mM)2MgCl(25mM)1.5&2r函iara《(5U/(xL)0.1Pl(5bxS-No)0.4P4(5bxS-Co)0.42+10xbuffer(plusMg)2Total6,4PCR反應(yīng)條件如下94°Clmin;88°C4min;94°C10sec，66°C3min,25個(gè)循環(huán)；72°C10min，4'C保存。取5^L產(chǎn)物以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2.PCR產(chǎn)物為兩條帶，其亮度有明顯差異，如圖5所示(1200bp左右的較暗，1700bp左右的較亮)取35個(gè)克隆稀釋于42'C預(yù)熱1mLLB培養(yǎng)基中，按10倍、100倍稀釋，并各取0.1mL分別涂于42。C預(yù)熱的LBCM+的平板上。待菌液完全吸收后，倒置培養(yǎng)皿，42°C,24-36h培養(yǎng)。(四)、第一步同源重組(GFPmut2整合到大腸桿菌的基因組中)1.42°CLBCM+平板生長的單個(gè)菌落的PCR鑒定(方法同上)、2.PCR產(chǎn)物為兩條帶，其亮度相當(dāng)，約l200bp和l700bp左右的長度，如圖7，證明已經(jīng)發(fā)生了第一步同源重組，片斷及質(zhì)粒已經(jīng)整合到基因組上。選取上述菌落35個(gè)稀釋于30'C預(yù)熱lmLLB培養(yǎng)基中，倍比稀釋，并各取O.lmL分別涂于3(TC預(yù)熱的5。/。蔗糖LB平板上。待菌液完全吸收后，倒置培養(yǎng)皿，3(TC,24-36h培養(yǎng)。(五)、第二步同源重組(質(zhì)粒與基因組分離并丟失)用接種針挑取3(TC,5。/。蔗糖LB平板上生長的單個(gè)菌落，分別接種于LBCM+平板上和5。/。蔗糖LB平板上，3(TC,24-36h培養(yǎng)。(六)、基因置換陽性菌落的PCR篩選3(TCLBCM+平板不生長，LB5。/。蔗糖平板上生長的菌落作PCR鑒定(方法見上述)PCR產(chǎn)物約為1700bp的菌落初步證實(shí)為已經(jīng)發(fā)生基因置換的陽性菌落(如圖8)。分純菌落，PCR進(jìn)一步鑒定證實(shí)基因置換成功。(七)、熒光顯微鏡鑒定取PCR鑒定證實(shí)基因置換成功的單克隆，37°C1mLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6h，取培養(yǎng)液離心，PBS緩沖液洗滌3次，沉淀留下于熒光顯微鏡下觀察，GFPmut2的激發(fā)光波長為488nm,發(fā)射光波長為512nm，觀察結(jié)果如圖9。實(shí)施例ll.報(bào)告菌株生長曲線測定為了檢測基因置換報(bào)告菌株E.coliWMC-002對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，選擇具有代表性的氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑VitK3、PMS和PQ(均購自sigma公司)做氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑敏感性實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)施如下1.種子液制備取LB平板上的單個(gè)新鮮菌落，接種于2mlLB液體培養(yǎng)基，200rpm，37。C振蕩過夜，培養(yǎng)至飽和狀態(tài)。2.調(diào)整起始菌液的OD600值(1)吸取飽和菌液200)!l加入到含有LB液體培養(yǎng)基1,800W的比色皿中吹吸混勻，用空白LB液體培養(yǎng)基調(diào)零，測定OD600值，結(jié)果乘10即為飽和菌液的OD600值。(2)按照公式V4/OD600，計(jì)算出需加入到50mlLB液體培養(yǎng)基中的菌液量，使起始菌液OD600值約為0.02。(3)按照計(jì)算好的量吸取種子液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，同時(shí)分別吸取菌液2ml加入到比色皿中測定OD600值(作為0hOD600值)。(4)分裝將上述稀釋好的培養(yǎng)液，按照2ml/管加入到無菌試管中。3.標(biāo)記編號(hào)報(bào)告菌株、野生型菌株、親本菌株均按照2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h標(biāo)記；4.培養(yǎng)將上述試管在37。C下振蕩培養(yǎng)。然后分別按對應(yīng)時(shí)間將試管取出，立即放冰箱中貯存，待培養(yǎng)結(jié)東時(shí)一同測定OD值。5.生長量測定將未接種的LB培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計(jì)上調(diào)節(jié)零點(diǎn)，作為空白對照，并對不同時(shí)間培養(yǎng)液從Oh起依次進(jìn)行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，使其OD值在O.10~0.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實(shí)際的OD值。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置平行管，最后OD600值為所測值的平均值，每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。6.結(jié)果處理以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長曲線。通過測定報(bào)告菌株的生長曲線來評價(jià)其基因置換后的生長狀態(tài)，從生長曲線可以看出報(bào)告菌株與基因置換前的親本菌生長狀態(tài)沒有明顯差別，生長趨勢基本一致(如圖IO),說明基因置換不影響細(xì)菌的正常生長，有利于作為報(bào)告菌株對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的檢測。實(shí)施例12.報(bào)告菌株WMC-002對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性實(shí)驗(yàn)用固定時(shí)間點(diǎn)法檢測報(bào)告菌株WMC-002對VitK3、PMS和PQ的敏感性。1.種子液的準(zhǔn)備從LB平板上的挑取單個(gè)新鮮菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基，200rpm，37。C振蕩過夜，培養(yǎng)至飽和狀態(tài)。2.調(diào)整起始菌液的OD600值1)吸取飽和菌液200(xl加入到含有LB液體培養(yǎng)基180(HU的比色杯中吹吸混勻，用空白LB液體培養(yǎng)基調(diào)零，測定OD600值，結(jié)果乘10即為飽和菌液的OD600值。2)按照公式V=1/OD600，計(jì)算出需加入到50mlLB液體培養(yǎng)基中的菌液量，使起始菌液OD600值約為0.02。3.加入誘導(dǎo)劑(分別為VitK3、PMS和PQ)吸取適量種子液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，同時(shí)分別吸取菌液2ml加入到比色杯中測定OD600值(作為OhOD600值)，菌液分裝2ml每管加入到試管中，200rpm，37'C振蕩培養(yǎng)2h后，按照不同誘導(dǎo)濃度需求加入適量誘導(dǎo)劑，200rpm，37'C振蕩培養(yǎng)。4.報(bào)告菌株培養(yǎng)6小時(shí)后，取培養(yǎng)液離心，PBS緩沖液洗滌3次，加lmlPBS重懸沉淀，取5pl菌液制片，制片時(shí)加入抗熒光淬滅封片劑，于熒光顯微鏡下觀察。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑中最為常見的為PQ、PMS、VitK3，本實(shí)驗(yàn)選擇這三種氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的不同濃度作用于報(bào)告菌株來評價(jià)其敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(如圖11、12、13):報(bào)告菌株對三種氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性不同，相同的濃度下誘導(dǎo)報(bào)告菌株發(fā)出的熒光強(qiáng)度不一，PMS的作用下熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，VitK3的作用下熒光強(qiáng)度最弱。這也與理論上PMS是強(qiáng)的氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑相符合。用這個(gè)報(bào)告菌株作為生物傳感器的宿主來檢測污染物氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑將會(huì)克服生長曲線法、終點(diǎn)法、MIC法檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑存在耗時(shí)費(fèi)力等缺陷性，為生物傳感器的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110〉溫州醫(yī)學(xué)院<120>—種對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑敏感的報(bào)告菌株及其制備方法<130〉081646-I-CP-NZJ<160>13<170>Patentlnversion3.5<210>1<211〉621<212>DNA<213>sodA<400〉1atgagctataccctgccatccctgccgtatgcttacgatgccctggaaccgcacttcgat60aagcagaccatggaaatccaccacaccaaacaccatcagacctacgtaaacaacgccaac120gcggcgctggaaagcctgccagaatttgccaacctgccggttgaagagctgatcaccaaa180ctggaccagctgccagcagacaagaaaaccgtactgcgcaacaacgctggcggtcacgct240aaccacagcctgttctggaaaggtctgaaaaaaggcaccaccctgcagggtgacctgaaa300gcggctatcgaacgtgacttcggctccgttgataacttcaaagcagaatttgaaaaagcg360gcagcttcccgctttggttccggctgggcatggctggtgctgaaaggcgataaactggcg420gtggtttctactgctaaccaggattctccgctgatgggtgaagctatttctggcgcttcc480ggcttcccgattatgggcctggatgtgtgggaacatgcttactacctgaaattccagaac540cgccgtccggactacattaaagagttctggaacgtggtgaactgggacgaagcagcggca600cgttttgcggcgaaaaaataa621<210>2<211>582<212>DNA<213>sodB<400〉2atgtcattcgaattacctgcactaccatatgctaaagatgctctggcaccgcacatttct60gcggaaaccatcgagtatcactacggcaagcaccatcagacttatgtcactaacctgaac120aacctgattaaaggtaccgcgtttgaaggtaaatcactggaagagattattcgcagctct180gaaggtggcgtattcaacaacgcagctcaggtctggaaccatactttctactggaactgc240ctggcaccgaacgccggtggcgaaccgactggaaaagtcgctgaagctatcgccgcatct300tttggcagctttgccgatttcaaagcgcagtttactgatgcagcgatcaaaaactttggt360tctggctggacctggctggtgaaaaacagcgatggcaaactggctatcgtttcaacctct420aacgcgggtactccgctgaccaccgatgcgactccgctgctgaccgttgatgtctgggaa480cacgcttattacatcgactatcgcaatgcacgtcctggctatctggagcacttctgggcg540ctggtgaactgggaattcgtagcgaaaaatctcgctgcataa582<210>3<211〉582<212>DNA<213>KatG<400>3atgtcattcgaattacctgcactaccatatgctaaagatgctctggcaccgcacatttctgcggaaaccatcgagtatcactacggcaagcaccatcagacttatgtcactaacctgaac120aacctgattaaaggtaccgcgtttgaaggtaaatcactggaagagattattcgcagctct180gaaggtggcgtattcaacaacgcagctcaggtctggaaccatactttctactggaactgc240ctggcaccgaacgccggtggcgaaccgactggaaaagtcgctgaagctatcgccgcatct300tttggcagctttgccgatttcaaagcgcagtttactgatgcagcgatcaaaaactttggt360tctggctggacctggctggtgaaaaacagcgatggcaaactggctatcgtttcaacctct420aacgcgggtactccgctgaccaccgatgcgactccgctgctgaccgttgatgtctgggaa48025cacgcttattacatcgactatcgcaatgcacgtcctggctatctggagcacttctgggcg540ctggtgaactgggaattcgtagcgaaaaatctcgctgcataa582<210〉4<211>2181<212〉DNA<213>ahpCF<400>4atgagcacgtcagacgatatccataacaccacagccactggcaaatgcccgttccatcag60ggcggtcacgaccagagtgcgggggcgggcacaaccactcgcgactggtggccaaatcaa120cttcgtgttgacctgttaaaccaacattctaatcgttctaacccactgggtgaggacttt180gactaccgcaaagaattcagc犯attagattectacggcctg犯aaaagatctga犯gcc240ctgttgacagaatctcaaccgtggtggccagccgactggggcagttacgccggtctgttt300attcgtatggcctggcacggcgcggggacttaccgttcaatcgatggacgcggtggcgcg360ggtcgtggtcagcaacgttttgcaccgctgaactcctggccggataacgtaagcctcgat420aaagcgcgtcgcctgttgtggccaatcaaacagaaatatggtcagaaaatctcctgggcc480gacctgtttatcctcgcgggtaacgtggcgctagaaaactccggcttccgtaccttcggt540tttggtgccggtcgtgaagacgtctgggaaccggatctggatgttaactggggtgatgaa600aaagcctggctgactcaccgtcatccggaagcgctggcgaaagcaccgctgggtgcaacc660gagatgggtctgatttacgttaacccggaaggcccggatcacagcggcgaaccgctttct720gcggcagcagctatccgcgcgaccttcggcaacatgggcatgaacgacgaagaaaccgtg780gcgctgattgcgggtggtcatacgctgggtaaaacccacggtgccggtccgacatcaaat840gtaggtcctgatccagaagctgcaccgattgaagaacaaggtttaggttgggcgagcact900tacggcagcggcgttggcgcagatgccattacctctggtctggaagtagtctggacccag960acgccgacccagtggagcaactatttcttcgagaacctgttcaagtatgagtgggtacag1020acccgcagcccggctggcgcaatccagttcgaagcggtagacgcaccggaaattatcccg1080gatccgtttgatccgtcgaagaaacgtaaaccgacaatgctggtgaccgacctgacgctg1140cgttttgatcctgagttcgagaagatctctcgtcgtttcctcaacgatccgcaggcgttc1200aacgaagcctttgcccgtgcctggttcaaactgacgcacagggatatggggccgaaatct1260cgctacatcgggccggaagtgccgaaagaagatctgatctggcaagatccgctgccgcag1320ccgatctacaacccgaccgagcaggacattatcgatctgaaattcgcgattgcggattct1380ggtctgtctgttagtgagctggtatcggtggcctgggcatctgcttctaccttccgtggt1440ggcgacaaacgcggtggtgccaacggtgcgcgtctggcattaatgccgcagcgcgactgg1500gatgtgaacgccgcagccgttcgtgctctgcctgttctggagaaaatccagaaagagtct1560ggtaaagcctcgctggcggatatcatagtgctggctggtgtggttggtgttgagaaagcc1620gcaagcgccgcaggtttgagcattcatgtaccgtttgcgccgggtcgcgttgatgcgcgt1680caggatcagactgacattgagatgtttgagctgctggagccaattgctgacggtttccgt1740aactatcgcgctcgtctggacgtttccaccaccgagtcactgctgatcgacaaagcacag1800caactgacgctgaccgcgccggaaatgactgcgctggtgggcggcatgcgtgtactgggt1860gccaacttcgatggcagcaaaaacggcgtcttcactgaccgcgttggcgtattgagcaat1920gacttcttcgtgaacttgctggatatgcgttacgagtggaaagcgaccgacgaatcgaaa1980gagctgttcgaaggccgtgaccgtgaaaccggcgaagtgaaatttacggccagccgtgcg2040gatctggtgtttggttctaactccgtcctgcgtgcggtggcggaagtttacgccagtagc2100gatgcccacgagaagtttgttaaagacttcgtggcggcatgggtgaaagtgatgaacctc2160gaccgtttcgacctgctgtaa2181<210>5<211〉3300<212>DNA<213>frdABCD<400〉5gtgcaaacctttcaagccgatcttgccattgtaggcgccggtggcgcgggattacgtgct60gcaattgctgccgcgcaggcaaatccgaatgcaaaaatcgcactaatctcaaaagtatac120ccgatgcgtagccataccgttgctgcagaagggggctccgccgctgtcgcgcaggatcat180gacagcttcgaatatcactttcacgatacagtagcgggtggcgactggttgtgtgagcag240gatgtcgtggattatttcgtccaccactgcccaaccgaaatgacccaactggaactgtgg300ggatgcccatggagccgtcgcccggatggtagcgtcaacgtacgtcgcttcggcggcatg360肌aatcgagcgcacctggttcgccgccgatwgaxxggcttccatatgctgcacacgctg420ttccagacctctctgcaattcccgcagatccagcgttttgacgaacatttcgtgctggat480attctggttgatgatggtcatgttcgcggcctggtagcaatgaacatgatggaaggcacg540ctggtgcagatccgtgctaacgcggtcgttatggctactggcggtgcgggtcgcgtttat600cgttacaacaccaacggcggcatcgttaccggtgacggtatgggtatggcgctaagccac660ggcgttccgctgcgtgacatggaattcgttcagtatcacccaaccggtctgccaggttcc720ggtatcctgatgaccgaaggttgccgcggtgaaggcggtattctggtcaacaaaaatggc780taccgttatctgcaagattacggcatgggcccggaaactccgctgggcgagccgaaaaac840aaatatatggaactgggtccacgcgacaaagtctctcaggccttctggcacgaatggcgt900aaaggcaacaccatctccacgccgcgtggcgatgtggtttatctcgacttgcgtcacctc960ggcgagaaaaaactgcatgaacgtctgccgttcatctgcgaactggcgaaagcgtacgtt1020ggcgtcgatccggttaaagaaccgattccggtacgtccgaccgcacactacaccatgggc1080ggtatcgaaaccgatcagaactgtgaaacccgcattaaaggtctgttcgccgtgggtgaa1140tgttcctctgttggtctgcacggtgcaaaccgtctgggttctaactccctggcggaactg1200gtggtcttcggccgtctggccggtgaacaagcgacagagcgtgcagcaactgccggtaat1260ggcaacgaagcggcaattgaagcgcaggcagctggcgttgaacaacgtctgaaagatctg1320gttaaccaggatggcggcgaaaactgggcgaagatccgcgacgaaatgggcctggctatg1380gaagaaggctgcggtatctaccgtacgccggaactgatgcagaaaaccatcgacaagctg1440gcagagctgcaggaacgcttcaagcgcgtgcgcatcaccgacacttccagcgtgttcaac1500accgacctgctctacaccattgaactgggccacggtctgaacgttgctgaatgtatggcg1560cactccgcaatggcacgtaaagagtcccgcggcgcgcaccagcgtctggacgaaggttgc1620accgagcgtgacgacgtcaacttcctcaaacacaccctcgccttccgcgatgctgatggc1680acgactcgcctggagtacagcgacgtgaagattactacgctgccgccagctaaacgcgtt1740tacggtggcgaagcggatgcagccgataaggcggaagcagccaataagaaggagaaggcg1訓(xùn)aatggctga3tggctgagatgaaaaacctgaaaattgaggtggtgcgctataacccggaa1860gtcgataccgcaccgcatagcgcattctatgaagtgccttatgacgcaactacctcatta1920ctggatgcgctgggctacatcaaagacaacctggcaccggacctgagctaccgctggtcc1980tgccgtatggcgatttgtggttcctgcggcatgatggttaacaacgtgccaaaactggca2040tgtaaaaccttcctgcgtgattacaccgacggtatgaaggttgaagcgttagctaacttc2100ccgattgaacgcgatctggtggtcgatatgacccacttcatcgaaagtctggaagcgatc2160aaaccgtacatcatcggcaactcccgcaccgcggatcagggtactaacatccagaccccg2220gcgcagatggcgaagtatcaccagttctccggttgcatcaactgtggtttgtgctacgcc2280gcgtgcccgcagtttggcctgaacccagagttcatcggtccggctgccattacgctggcg2340catcgttataacgaagatagccgcgaccacggtaagaaggagcgtatggcgcagttgaac2400agccagaacggcgtatggagctgtactttcgtgggctactgctccgaagtctgcccgaaa2460cacgtcgatccggctgcggccattcagcagggcaaagtagaaagttcgaaagactttctt2520atcgcgaccctgaaaccacgctaaatgacgactaaacgtaaaccgtatgtacggccaatg2580acgtccacctggtggaaaaaattgccgttttatcgcttttacatgctgcgcgaaggcacg2640gcggttccggctgtgtggttcagcattgaactgattttcgggctgtttgccctgaaaaat2700ggcccggaagcctgggcgggattcgtcgactttttacaaaacccggttatcgtgatcatt2760aacctgatcactctggcggcagctctgctgcacaccaaaacctggtttgaactggcaccg2820aaagcggccaatatcattgtaaaagacgaaaaaatgggaccagagccaattatcaaaagt2880ctctgggcggtaactgtggttgccaccatcgtaatcctgtttgttgccctgtactggtaa2940atgattaatccaaatccaaagcgttctgacgaaccggtattctggggcctcttcggggcc3000ggtggtatgtggagcgccatcattgcgccggtgatgatcctgctggtgggtattetgctg3060ccactggggttgtttccgggtgatgcgctgagctacgagcgcgttctggcgttcgcgcag3120agcttcattggtcgcgtattcctgttcctgatgatcgttctgccgctgtggtgtggttta3180caccgtatgcaccacgcgatgcacgatctgaaaatccacgtacctgcgggcaaatgggtt3240ttctacggtctggctgctatcctgacagttgtcacgctgattggtgtcgttacaatctaa3300<210>6<211〉717<212>DNA<213>gfpmut2<400>6atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggt60gatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacgga120aaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacactt180gtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcatatgaaacgg240catgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctttc300aaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgtt360aatcgtatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaa420ctcg堪tecaactataactcacacaatgtBtecatcacggcag3ca犯c3aaagaatgga480atcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcagac540cattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattac600ctgtcgacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtcctt660cttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcatggatgagctctacaaataa717<210>7<211>324<212>DNA<213>soxs<400〉7atgtcccatcagaaaattattcaggatcttatcgcatggattgacgagcatattgaccag60ccgctteacattgatgtagtcgcaaa肌犯tc嗎gctattcaaagtggtecttgcaacga120atgttccgcacggtgacgcatcagacgcttggcgattacattcgccaacgccgcctgtta180ctggccgccgttgagttgcgcaccaccgagcgtccgatttttgatatcgcaatggacctg240ggttatgtctcgcagcagaccttctcccgcgttttccgtcggcagtttgatcgcactccc300agcgattatcgccaccgcctgtaa324<210>8<211>35<212>DNA<213>pi<400>8aaggaaaaaagcggccgctcgcccgggttacgcaa35<210>9<211>59<212>DNA<213>P2<400>9acaactccagtgaaaagttcttctcctttactcataaatctgcctcttttcagtgttca59<210>10<211〉60<212>DNA<213>P3<400〉10tgggattacacatggcatggatgaactatacaaataattttattgcccgcgcgttaactc60<210>11<211>41<212>DNA<213>P4<400>11cgcacgcatgtcgaccgattttcatacgtcacggttgatag41<210>12<211>20<212〉DNA<213〉P5<400〉12atgagtaaaggagaagaact20<210>13<211>25<212>DNA<213>P6<400>13ttatttgtatagttcatccatgcca2權(quán)利要求1.一種對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌報(bào)告菌株，其特征在于，由野生型大腸桿菌E.coliMC4100敲除sodA、sodB、katG、ahpCF、frdABCD基因，再利用基因置換技術(shù)將SoxS編碼基因替換為GFP報(bào)告基因得到。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述大腸桿菌報(bào)告菌株，其特征在于，所述GFP報(bào)告基因?yàn)镚FPmut2報(bào)告基因。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述大腸桿菌報(bào)告菌株，其特征在于，所述大腸桿菌報(bào)告菌株命名為E.coliWMC-002，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)CGMCCNo.2464。4.一種權(quán)利要求1或2所述大腸桿菌報(bào)告菌株的制備方法，其特征在于，包含以下步驟(1)利用條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV作為工具，敲除野生型大腸桿菌E.coliMC4100基因組中frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA基因；(2)設(shè)計(jì)soxS基因N末端和C末端的內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物以及GFPmut2基因的引物，利用交叉PCR反應(yīng)構(gòu)建含有報(bào)告基因GFPmut2與待置換目的基因SoxS的兩端同源臂的融合PCR片斷；(3)將步驟(2)所得片段克隆到pKOV條件復(fù)制質(zhì)粒，構(gòu)建pKOV-GFPmut2重組載體；(4)將所述重組載體pKOV-GFPmut2轉(zhuǎn)化入步驟(1)所得的大腸桿菌菌株基因組中，通過兩次同源重組，將步驟(l)所得的大腸桿菌菌株基因組SoxS編碼基因置換成為GFPmut2報(bào)告基因。5.權(quán)利要求4所述大腸桿菌報(bào)告菌株的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中soxS基因N末端的外側(cè)引物序列如SEQIDN0:8所示，內(nèi)側(cè)引物序列如SEQIDN0:9所示;soxS基因C末端的內(nèi)側(cè)引物序列如SEQIDN0:10所示，外側(cè)引物序列如SEQIDN0:11所示，GFPmut2基因的N末端引物序列如SEQIDN0:12所示，C末端引物序列如SEQIDN0:13所示。6.權(quán)利要求1或2所述大腸桿菌報(bào)告菌株在檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種大腸桿菌報(bào)告菌株及其制備方法，具體涉及一種對氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的報(bào)告菌株及其制備方法。本發(fā)明所述大腸桿菌報(bào)告菌株由野生型大腸桿菌E.coliMC4100缺失sodA、sodB、katG、ahpCF、frdABCD五個(gè)基因，再利用基因置換技術(shù)將SoxS編碼基因替換為GFP報(bào)告基因得到。本發(fā)明所述大腸桿菌報(bào)告菌株名稱為E.coliWMC-002，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)，普通微生物中心，編號(hào)CGMCCNo.2464。本發(fā)明所述大腸桿菌報(bào)告菌株能夠解決用生長曲線法、終點(diǎn)法、MIC法檢測氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的局限性，同時(shí)可以克服帶有報(bào)告載體的報(bào)告菌株報(bào)告信號(hào)的本底很高、精確定量相對困難、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，可用于氧化還原循環(huán)反應(yīng)劑的生物檢測。文檔編號(hào)C12N15/09GK101386828SQ20081013318公開日2009年3月18日申請日期2008年7月9日優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日發(fā)明者呂建新,王茂峰,童貞珍申請人:溫州醫(yī)學(xué)院