專利名稱：利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的合成方法，該方法利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系 統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
目前，已廣泛利用基因重組技術(shù)并使用酵母活細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng) (以下簡稱細(xì)胞系統(tǒng))作為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。但是，活細(xì)胞由于其功能保 留而表現(xiàn)出外源蛋白質(zhì)消失的傾向，并且由于活細(xì)胞中細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的表達(dá) 阻止了細(xì)胞生長而存在許多不能被容易表達(dá)的蛋白質(zhì)。而體外表達(dá)系統(tǒng)相對而 言沒有上述細(xì)胞系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成上的限制，并能在不傷害生物體的情況下合成 蛋白質(zhì)。另外由于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)不伴有培養(yǎng)等操作，因而與細(xì)胞系統(tǒng)相比，可 在短時間內(nèi)合成蛋白質(zhì)。此外，由于體外表達(dá)系統(tǒng)還用來大規(guī)模生產(chǎn)由不被生 物體利用的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，因而有望成為有前途的表達(dá)方法。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可使高表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊、二硫鍵 的搭配及寡聚物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天 然蛋白。在桿狀病毒極晚期基因表達(dá)過程中，有種高效表達(dá)的蛋白，是多角體 蛋白多角體蛋白是形成包含體的主要成分，感染后期在細(xì)胞中的積累可高達(dá) 30% 50%。多角體基因已被定位和克隆這個基因的啟動子具有較強(qiáng)的啟動能 力，使外源基因能高水平表達(dá)。目前，利用桿狀病毒多角體蛋白基因啟動子進(jìn) 行體外蛋白表達(dá)的方法還未有報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系 統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的一種利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，是在家
蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-polyhedrin-Redl重組質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑， 25-29"C水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。
所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括以下步驟取蠶蛹，接種桿狀病 毒，待蠶蛹發(fā)病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于1.5 ml EP管中，-8CTC、 20°C 反復(fù)凍融3次，4 °C， 18000 rpm離心15-30 min，取上清，重復(fù)兩次后， 35000 rpm超速離心30-60 min，吸取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul 管子分裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法還可以是包括以下步驟接種桿狀病 毒于家蠶細(xì)胞，待細(xì)胞發(fā)病后，-8(TC、 2(TC反復(fù)凍融3次，4 °C， 18000 rpm 離心15-30 min，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，取上清至新的 1.5 ml EP管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
所述pUC19-polyhedrin-Redl重組質(zhì)粒的制備方法包括
(1) 以家蠶桿狀病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增polyhedrin啟動子序 列，PCR所用的兩種引物為
L一h 5，-gcgaatccctagtaaaataatttgcaaaattt-3，， 含EcoRI位點.， L一2: 5，-atggatccatcgacaactacgcggccgcatga-3，含BamHI位點；
(2) 以質(zhì)粒pDsRed1-1為模板，PCR擴(kuò)增Redl報告基因序列，PCR所用 的兩種引物為
L-3.. 5'-atggatccatggacaacaccgaggacgtcatc-3'， 含B柳HI位點'， L-4: 5'-atgcatgcctactgggagccggagtggcgggc-3'， 含PaeI位點；
(3) 將polyhedrin啟動子序列片段和質(zhì)粒pUC19進(jìn)行EcoRI、 BamHI雙 酶切，37'C反應(yīng)2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 E.coli DH5a，得到pUC19-polyhedrin質(zhì)粒；
(4) 分別對Redl序列和質(zhì)粒pUC19-polyhedrin進(jìn)行BamHI、 Pael雙酶 切，37'C反應(yīng)2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 E.coli DH5a，得到pUC19-polyhedrin-Redl重組質(zhì)粒。
所述的蛋白酶抑制劑為PMSF蛋白酶抑制劑。200810120473.X
說明書第3/7頁
本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明所述的方法不受細(xì)胞的限制，可在短時間 內(nèi)合成蛋白質(zhì)，且有利于蛋白的分離純化。傳統(tǒng)的蛋白表達(dá)方法有兩個途徑， 一是原核表達(dá)，它具有許多的優(yōu)點，如表達(dá)周期短，成本低，但有些基因在原 核系統(tǒng)中的持續(xù)表達(dá)可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，目的蛋白常以包涵體形 式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難，且不利于蛋白形成正確的構(gòu)象；二是真核表達(dá)， 它能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，且能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，但它受細(xì)胞培養(yǎng)的限制。本 發(fā)明所述的方法不受細(xì)胞的限制，可在短時間內(nèi)(3—6小時內(nèi))合成蛋白質(zhì)， 以溶解狀態(tài)存在，這有利于蛋白的分離純化，同時它屬于真核表達(dá)體系，有利 于蛋白形成正確的構(gòu)象。


圖1、本發(fā)明的實施例的重組質(zhì)粒pUC19-polyhedrin-Redl; 圖2、本發(fā)明的實施例的蛋白表達(dá)電泳圖2: M，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1， 0小時取樣；2， 3小時取樣；3， 6小時取 樣；4， 12小時取樣。
具體實施例方式
一、家蠶桿狀病毒提取液的準(zhǔn)備
1、 用家蠶蠶蛹制備桿狀病毒提取液
取蠶蛹若干，接種桿狀病毒(BmNPV，購自上海生化研究所)，待蠶蛹發(fā) 病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于1.5 ml EP管中，-80°C、 20。C反復(fù)凍融3 次，4 。C， 18000 rpm離心20 min，取上清，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離 心30 min，吸取上清至新的1.5 ml EP管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即為桿狀病毒提取液，即用或存放于液氮中。
2、 用家蠶Bm5細(xì)胞制備桿狀病毒提取液
接種桿狀病毒(BmNPV，購自上海生化研究所)于家蠶Bm5細(xì)胞，待細(xì)胞 發(fā)病后，-80°C、 2(TC反復(fù)凍融3次，4 °C， 18000 rpm離心20 min，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離心30 min，取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul 管子分裝，每管50 ul，即為桿狀病毒提取液，即用或存放于液氮中。 二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
1. 引物設(shè)計
polyhedrin啟動子的引物
5， -gcgaatccctagtaaaataatttgcaaaattt-3， (EcoRI位點) L2: 5， -atggatccatcgacaactacgcggccgcatga-3， (BamHI位點) 紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein, Red)報告基因的引物
5' -atggatccatggacaacaccgaggacgtcatc-3' ; (BamHI位點) L_4: 5, -atgcatgcctactgggagccggagtggcgggc-3, 0 (Pael位點)
2. polyhedrin啟動子序列的擴(kuò)增
以家蠶桿狀病毒基因組DNA (NC-001875)為模板，以L-1、 L一2為引物， PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性5min， 94。C變性30s， 68'C復(fù)性延伸lmin， 30個循 環(huán)，68。C延伸5min。
在一個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
10xPCR Buffer 10^1
25,1 MgC12 8|xl
2.5 mmol dNTPs 8pl L-l
L-2 l^il
模板 l|il
K0D-Plus DNA聚合酶 (T0Y0B0公司，日本)lpl 加無菌雙蒸水至10(^1
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié) 束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時切膠回收目的片段，獲得polyhedrin啟動子。 3.Redl報告基因序列的擴(kuò)增
以質(zhì)粒pDsRedl-l (clontech公司)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94'C預(yù)變性 5min， 94。C變性30s， 68。C復(fù)性延伸lmin， 30個循環(huán)，68。C延伸5min。在一個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
10xPCR Buffer lO(il
25動1 MgC12 8)il
2.5 mmol dNTPs 8^1
L-3 lpl
L-4 1^1
模板 1^1
KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)lpl
加無菌雙蒸水至100]il
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié) 束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時切膠回收目的片段。 4. pUC19-polyhedrin載體的構(gòu)建
分別對polyhedrin啟動子序列片段和質(zhì)粒pUC19 (promega公司)進(jìn)行 fc^ I、 5aMH雙酶切，37'C反應(yīng)2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接。 在一個無菌的0. 2ml離心管中，混合下列成分
polyhedrin啟動子序列片段 2^1
質(zhì)粒pUC19 0.5jal
2xRapid Ligation buffer 5jil
T4 ■ ligase (購自promage公司) 1^1
加無菌雙蒸水至10pl，混勻。25'C反應(yīng)lh后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 E.coli DH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測序，序列 完全正確。
5. pUC19-polyhedrin-Redl重組質(zhì)粒的制備
分別對Redl序列和質(zhì)粒pUC19-polyhedrin進(jìn)行^3/zm、尸ael雙酶切，37°C 反應(yīng)2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接。
在一個無菌的0. 2ml離心管中，混合下列成分 Redl序列片段 2pl質(zhì)粒pUC19-polyhedrin
2xR叩id Ligation buffer
T4 DNA ligase (購自promage公司)
0. 5^1 1^1
加無菌雙蒸水至lO(il，混勻。25°0反應(yīng)lh后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài) 細(xì)胞E. coli DH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒pUC19-polyhedrin-Redl (圖 1)，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測序，序列完全正確。
三、 反應(yīng)體系
在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-polyhedrin-Redl重組質(zhì)粒或含有外 源基因的pUC19-polyhedrin-Redl重組質(zhì)粒、PMSF蛋白酶抑制劑，25-29。C水 浴，分0, 3h， 6h， 12h， 18h， 24h取樣。結(jié)果見圖2，在3小時后蛋白的表達(dá) 量就可達(dá)到所需的量，6小時表達(dá)量最大，隨后，蛋白表達(dá)量將會降低。
四、 電泳檢測表達(dá)產(chǎn)物
電泳結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察，在588nm激發(fā)波長下觀察綠色熒光蛋 白Redl的表達(dá)，或用考染法觀測蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明(圖2)，約在6小時 蛋白表達(dá)量較大。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從 本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范 圍。<formula>formula see original document page 10</formula>
權(quán)利要求
1、一種利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，其特征在于在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-polyhedrin-Red1重組質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括取蠶蛹，接種桿狀 病毒，待蠶蛹發(fā)病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于1.5mlEP管中，-80°C、 20°C 反復(fù)凍融3次，4°C， 18000rpm離心15-30min，取上清，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，吸取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul管子分 裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括接種桿狀病毒于家 蠶細(xì)胞，待細(xì)胞發(fā)病后，-8(TC、20。C反復(fù)凍融3次，4°C， 18000 rpm離心15-30 min，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，取上清至新的1.5 ml EP 管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述pUC19-polyhedrin-Redl重組質(zhì)粒的制備方法包括(1) 以家蠶桿狀病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增polyhedrin啟動子序 列，PCR所用的兩種引物為1: 5，-gcgaatccctagtaaEia1:aa1:ttgcaaaa1:1:t-3，， 含EcoRI位點5 2: 5，-atggatccatcgacaactacgcggccgcatga-3，含BamHI位點；(2) 以質(zhì)粒pDsRedl-l為模板，PCR擴(kuò)增Redl報告基因序列，PCR所用的 兩種引物為L-3: 5'-atggatccatggacaacaccgaggacgtcatc-3'， 含BamHI位點； 4: 5'-atgcatgcctactgggagccggagtggcgggc-3'， 含PaeI位點；(3) 將polyhedrin啟動子序列片段和質(zhì)粒pUC19進(jìn)行EcoRI、 BamHI雙酶 切，37。C反應(yīng)2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 E. coli DH5a,得到pUC19-polyhedrin質(zhì)粒；(4) 分別對Redl序列和質(zhì)粒pUC19-polyhedrin進(jìn)行BamHI、Pael雙酶切， 37T:反應(yīng)2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5a，得到pUC19-polyhedrin-Redl重組質(zhì)粒。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述的蛋白酶抑制劑為PMSF蛋白酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，是在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-polyhedrin-Red1重組質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明所述的方法不受細(xì)胞的限制，可在短時間內(nèi)合成蛋白質(zhì)，且有利于蛋白的分離純化。
文檔編號C12N15/866GK101423845SQ20081012047
公開日2009年5月6日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者呂正兵, 夏佳音, 張耀洲, 清 盛, 聶作明, 健 陳, 琴 陳 申請人:浙江理工大學(xué)