專利名稱：以細(xì)胞內(nèi)連接為基礎(chǔ)的定向基因重組技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是生物技術(shù)領(lǐng)域的一種定向基因重組技術(shù)。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)70年代PCR技術(shù)和限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以來，基因重組技術(shù)己經(jīng)建立了一套完善 的體系，其中主要主要包括目的基因的分離，目的基因和表達(dá)載體的切割，目的基因與表達(dá) 載體的定向連接，宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性克隆的篩選等。目的基因和載體的連接有正向和反 向兩種方式，只有正向連接的基因才能夠得到正確的表達(dá)，因此建立在雙酶切基礎(chǔ)上的定向 連接是傳統(tǒng)重組技術(shù)的核心。
目的基因和載體的切割和連接是其中操作作為最為繁瑣，工作周期最長(zhǎng)，并且失敗幾率 最高的步驟。目前國(guó)內(nèi)外很多生物技術(shù)公司陸續(xù)都開發(fā)出了用于簡(jiǎn)化操,作的試劑盒產(chǎn)品，比 如凝膠回收試劑盒，PCR片段回收試劑盒，酶切片段回收試劑盒，快速連接試劑盒等，但仍 然難以避免操作過程中基因片段的丟失。因此尋找更為簡(jiǎn)單的方法是必然的選擇。
目前人們對(duì)定向重組技術(shù)的改造主要是通過以下兩種方式實(shí)現(xiàn)的
1、 模擬自然條件下生物基因重組的原理。比如Clontech公司以同源重組為基礎(chǔ)的 In-fusion系統(tǒng)，Irwitrogen公司以位點(diǎn)特異性重組為基礎(chǔ)的Gateway系統(tǒng)等，F(xiàn)A斯圖爾特 等申請(qǐng)的專利技術(shù)一一應(yīng)用同源重組克隆和亞克隆的方法和組合物(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00812739.5)等。自然重組技術(shù)不需要用戶對(duì)目的基因進(jìn)行切割和連接，只要將載體、目的 基因和重組體系混合在一起處理適當(dāng)?shù)臅r(shí)間即可轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。自然重組技術(shù)需要載體末端 和目的基因末端之間存在20 40bp同源序歹ij，需要特殊的重組酶系，從而使基因重組的操作 成本提高了 50 100倍。而且同源重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，重組成功率一般不會(huì)太高，并不 適合在普通實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
2、 以體內(nèi)連接方式實(shí)現(xiàn)定向重組。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基礎(chǔ)上 建立的的USER Friendly系統(tǒng)等。常規(guī)的體內(nèi)連接方式一般需要目的基因和載體之間具有9 12bp的互補(bǔ)序列，上述方法就是通過不同的方式在載體和目的基因之間建立這樣一個(gè)互補(bǔ)序 列。前者需要合成特殊的引物，而且需要特定的工具酶，成本是傳統(tǒng)技術(shù)的10 20倍；常規(guī) 體內(nèi)連接技術(shù)中互補(bǔ)配對(duì)載體必須具備一段很長(zhǎng)的游離單鏈序列，在反復(fù)凍溶過程中很容易 出現(xiàn)堿基脫落，影響連接效率，不適合長(zhǎng)期儲(chǔ)備或者工業(yè)化生產(chǎn)。
上述技術(shù)分別從不同的角度改良了重組技術(shù)，但是受到技術(shù)本身的缺陷所導(dǎo)致的成本過 高或者連接效率過低等因素的影響，上述技術(shù)并不能替代既往傳統(tǒng)的重組技術(shù)進(jìn)行常規(guī)應(yīng)用。 本發(fā)明對(duì)體內(nèi)連接技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，但是在特定載體構(gòu)建過程中載體為原始載體或者平滑末 端載體，重組載體容易保存，可經(jīng)受反復(fù)凍溶，全過程在一個(gè)工作日內(nèi)即可完成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域一種新的定向基因重組操作技術(shù)，由重組載體，目的基因、定 向配對(duì)復(fù)合物和宿主細(xì)胞構(gòu)成；重組載體和目的基因兩端含有2 12bp的同源序列，利用T4 DNA聚合酶在特定底物缺失時(shí)產(chǎn)生的選擇性核酸外切酶活性消化目的基因和載體，產(chǎn)生互補(bǔ) 序列并互補(bǔ)配對(duì)。配對(duì)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，通過宿主細(xì)胞內(nèi)部的相關(guān)酶系進(jìn)行連接。該 技術(shù)對(duì)基因內(nèi)部序列沒有要求。
實(shí)施方式
1、 制備定向重組載體
1) 重組載體可以選用但不限于質(zhì)粒、噬菌體或者病毒載體
2) 在重組載體重組載體中引入兩個(gè)定向同源序列；定向同源序列由任意兩種或者三種堿 基構(gòu)成的堿基序列構(gòu)成，優(yōu)選但不限于由G、 C或者G、 C加上另外一種堿基構(gòu)成定向同源序 列，長(zhǎng)度2到12bp，優(yōu)選4到8bp;兩個(gè)定向同源序列之間含有限制性內(nèi)切酶酶切位；酶切 位點(diǎn)兩側(cè)序列不同而且不能互補(bǔ)，定向同源序列總長(zhǎng)度可選擇但不限于2 12bp。
3) 對(duì)載體中引入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切處理
4) 對(duì)載體進(jìn)行或者不脫末端修飾處理，.修飾方式優(yōu)選但不限于末端脫磷酸化修飾。
2、 制備目的基因
1) 合成分別具有載體上下游定向同源序列同源部分的上下游擴(kuò)增引物。
2) 目的基因的擴(kuò)增，按照常規(guī)方法擴(kuò)增目的基因，優(yōu)選但不限于Pfu DNA聚合酶。
3) 目的基因鑒定，通過常規(guī)瓊脂糖電泳鑒定。
4) 目的基因提純，去除PCR體系中殘余的dNTP和引物。
3、 定向匹配
定向匹配體系由T4 DNA聚合酶，dNTP，和反應(yīng)緩沖液組成的定向匹配復(fù)合物。 方案一
1) 將由重組載體和目的基因按照數(shù)量比為6: 1 1: 6的比例混合，推薦但不限于按照l:
3的的比例混合。
2) 加入適當(dāng)?shù)腡4DNA聚合酶，同源序列中不含有相關(guān)堿基的一種或者兩種dNTP，以及反 應(yīng)緩沖液，按照工具盒操作說明進(jìn)行處理。
3) 目的基因和重組載體高溫變性一段時(shí)間，推薦但不限于按照T4DNA聚合酶滅活的方式 變性處理。
4) 目的基因和重組載體低溫復(fù)性一段時(shí)間，復(fù)性溫度10到40攝氏度，推薦但不限于室 溫，復(fù)興時(shí)間10分鐘到1小時(shí)，優(yōu)選但不限于優(yōu)選20到30分鐘。方案二
1) 將重組載體和目的基因分別加入適當(dāng)?shù)腡4DNA聚合酶，并分別加入同源序列中不含有 相關(guān)堿基的一種dNTP，在適當(dāng)?shù)臈l件下反應(yīng)一段時(shí)間。
2) 經(jīng)過上述步驟處理后的目的基因和重組載體按照數(shù)量比為6: 1 1: 6，推薦按照3: 1
的的比例混合。
3) 變性和復(fù)性方式同方案一
4、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
細(xì)胞轉(zhuǎn)化方式可以采用但不限于電轉(zhuǎn)化或者化學(xué)轉(zhuǎn)化方式。
電轉(zhuǎn)化方式如下前期常規(guī)電擊操作，電擊完成后迅速加入復(fù)蘇培養(yǎng)基，10 37攝氏度 復(fù)蘇10 12分鐘感受態(tài)細(xì)胞，優(yōu)選室溫復(fù)蘇45分鐘，常規(guī)方式篩選。
化學(xué)轉(zhuǎn)化方式重組載體與感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴5 60分鐘，優(yōu)選30分鐘，迅速加入 復(fù)蘇培養(yǎng)基10 37攝氏度復(fù)蘇10 12分鐘感受態(tài)細(xì)胞,優(yōu)選室溫復(fù)蘇45分鐘，常規(guī)方式克 隆化篩選。
本發(fā)明是在原有重組技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行的操作方法改進(jìn)，使用者一般無須改變?cè)械牟僮?習(xí)慣，容易適應(yīng)。操作歩驟簡(jiǎn)單，線性片段和定向重組酶系可商品化生產(chǎn)，用戶通過基因擴(kuò) 增后一般可直接進(jìn)行定向連接，無須其他操作。操作周期短，包含PCR過程在內(nèi)， 一般在一 個(gè)工作日內(nèi)可完成全部操作。
實(shí)施實(shí)例
下面我們將以幾丁質(zhì)酶基因作為目的基因，定向克隆進(jìn)入PUC18載體為例對(duì)技術(shù)進(jìn)行具 體說明，實(shí)例內(nèi)容并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明要求權(quán)利的限制。實(shí)驗(yàn)過程中選用的工具酶和試劑盒具 體操作步驟參見個(gè)公司相關(guān)說明。
已知一種幾丁質(zhì)酶的基因序列為ATGCGCAAATTTAATMA......AGCGCCGGCGTTCAATAA
1線性載體的制備
首先在pUC18質(zhì)粒DNA的用BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)之間引入下列序列 引入序列TGCGC^CGGG，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Hael11的酶切位點(diǎn) 引入后狀態(tài)GGATCC—TGCGC ggC<XGGG—AAGCTT 其中字體加粗部分為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。質(zhì)?？寺U(kuò)增后回收，利用HaeIII酶切線性化處理
處理后狀態(tài)5 ， -GGATCC—Tft7gC6g—J' f —OTCK^—AAGCTT-3， 下劃線部分為同源酶切位點(diǎn) 1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠回收試劑盒回收線性載體片段 CIAP磷酸酶37攝氏度10分鐘去磷酸化處理 2目的基因克隆
引物設(shè)計(jì)上游5， ATGCGCAAATTTAAT A-3，
下游5， - <XZmr TATTGAACGCCG G-3， *下劃線部分為同源選擇位點(diǎn) 基因擴(kuò)增選用Takara PyroBest DNA聚合酶按照試劑盒推薦方式擴(kuò)增. 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收試劑盒回收目的基因
3 定向匹配
取3微升線性載體片段(0.1微克/微升)，加入3微升PCR產(chǎn)物(0.3微克/微升)混合 均勻，加入由適量T4 DNA聚合酶、dTTP和反應(yīng)緩沖液構(gòu)成的處理體系，無菌去離子水補(bǔ)足到 20微升，37攝氏度保溫30分鐘.
4 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞
匹配產(chǎn)物與適量感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘，加入LB培養(yǎng)基，室溫復(fù)蘇45分鐘，涂 布篩選平板進(jìn)行克隆化篩選。
權(quán)利要求
1本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域一種新的定向基因重組操作技術(shù)，由重組載體，目的基因、定向配對(duì)復(fù)合物和宿主細(xì)胞構(gòu)成；重組載體和目的基因經(jīng)過定向配對(duì)復(fù)合物處理后按照堿基互補(bǔ)原則定向互補(bǔ)配對(duì)，配對(duì)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，連接反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求(1)中所描述的定向基因重組技術(shù)，其特征是定向重組載體來源于質(zhì) 粒，粘粒，噬菌體或者病毒；定向重組載體還有重組位點(diǎn)，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶切割后形成兩 個(gè)連接點(diǎn)序列，分別為連接序列A和連接序列B;連接序列是由A、 T、 C、 G中任意兩種或 者任意三種堿基構(gòu)成的2 12bp的堿基序列。
3.根據(jù)權(quán)力要求(1)中所描述的定向基因重組技術(shù)，其特征是定向目的基因?yàn)镻CR 產(chǎn)物或者酶切后加工的產(chǎn)物；目的基因兩側(cè)末端含有2 12bp的連接序列a和連接序列b， 分別與權(quán)力要求2所述載體連接序列與載體中連接序列A和連接序列B同源。
4.根據(jù)權(quán)力要求(1)中所描述的定向基因重組技術(shù)，其特征是:定向配對(duì)復(fù)合物由T4DNA 聚合酶，dNTP中的一種或者兩種，以及相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)力要求(1)中所描述的定向基因重組技術(shù)，其特征是宿主細(xì)胞來源于大腸桿 菌、酵母細(xì)胞、昆蟲、鼠和人；宿主細(xì)胞中含有DNA連接酶系。
6.根據(jù)權(quán)力要求(1)中所描述的定向基因重組技術(shù)，其特征是定向目的基因和定向重 組載體經(jīng)過定向配對(duì)復(fù)合物處理后，同源序列部分形成突出的單鏈結(jié)構(gòu)，并且同源序列之間 能夠按照堿基配對(duì)原則互補(bǔ)配對(duì)，既重組載體連接連接序列A和目的基因連接序列a配對(duì)； 重組載體連接序列B和目的基因連接序列b配對(duì)。
7.根據(jù)權(quán)力要求(1)中所描述的定向基因重組技術(shù)，其特征是定向目的基因和定向重 組載體按照權(quán)力要求5所所描述的方式互補(bǔ)配對(duì)后，可直接轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；目的基因和重組 載體的連接在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域一種新的基因重組技術(shù)。在目的基因兩側(cè)分別引入2～12個(gè)堿基的序列特征不同的配對(duì)序列，配對(duì)序列和載體兩個(gè)連接點(diǎn)末端的配對(duì)序列分別同源。利用T4DNA聚合酶在特定底物缺失時(shí)產(chǎn)生的選擇性核酸外切酶活性消化目的基因和載體，產(chǎn)生互補(bǔ)序列并互補(bǔ)配對(duì)。配對(duì)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，通過宿主細(xì)胞內(nèi)部的相關(guān)酶系進(jìn)行連接。該技術(shù)具有周期短，費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)單，成功率高，對(duì)目的基因內(nèi)部特征無要求等優(yōu)點(diǎn)，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)基因表達(dá)研究和大規(guī)模的基因表達(dá)操作。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101555475SQ200810103719
公開日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2008年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月10日
發(fā)明者張永鋼 申請(qǐng)人:張永鋼