專利名稱：使用質譜法的生物分子檢測和定量的制作方法
技術領域：
背景技術：
在多重分析中檢測并定量核酸的當前方法具有局限性，尤其是那些采用熒光染料 進行檢測的分析。例如，懷特(White)論述了使用TaqMAN⑧分析方法進行多重分析的 問題(生物技術的趨勢(7Ve"A z'"歷o&c/mo/ogv) (1996) 14(12); 478-483)。在各種問 題中，熒光染料僅提供有限多重分析選擇，并且試圖克服這些限制(例如通過使用引 物延伸和基于連接的SNP分析，之后對芯片陣列實施通用PCR和雜交)的當前可用 的方法通常極為費時(例如l-2天)。
由于檢測通道數增加，使用質譜法可提供解決方案來改良多重分析，但先前所揭 示基于質譜的方法的實際應用仍可進一步改良。例如，羅斯(Ross)闡述使用肽核酸(PNA) 探針與PCR擴增DNA高特異性雜交，并且隨后通過質譜法來檢測(分析化學 (^ a/.Cfem) (1997) 69:4197)。同樣，哈弗(Haff)闡述引物延伸方法和通過質譜法檢測 引物延伸產物(核酸研究(Nucleic Acids Res.) (1997) 25:3749)。朱林可(Jurinke)等人闡 述其它基于質譜法的方法(生化工程/生物技術進展(J^歷oc/2em五"g歷ofec/mo/) (2002) 77:57-74)。

發(fā)明內容
本發(fā)明部分提供鑒定和定量目標生物分子(例如核酸)并檢測目標生物分子序列 (例如核酸序列或核苷酸序列)的方法。本發(fā)明方法可有利地用于同時檢測單一樣品 或多個樣品中的多種目標核酸，同時可避免實施PCR后酶促過程?？僧a生眾多種獨特 的質量可區(qū)分產物(MDP)，此使得可同時檢測多種目標核酸。如本文中進一步所述， 通過標準擴增方法擴增一或多種目標核酸，其中所述擴增方法解離并降解檢測探針， 此產生可通過質譜法檢測到的特異性質量可區(qū)分產物。檢測多種MDP使得可鑒定和/ 或定量多種目標核酸。
每一種質量可區(qū)分產物(MDP)都具有獨特物理特征，此使得在與相同分析中所用 其它質量可區(qū)分產物相比時可特異性地將其區(qū)分出來。質量可區(qū)分產物可根據此差異 來分離和鑒定。例如，MDP可因其獨特的預定質量而彼此不同，并且可通過質譜法來 檢測。因此，質譜分析通過質量可區(qū)分產物間接揭示目標核酸的存在。
本發(fā)明由此部分提供在擴增反應中檢測并視情況定量目標核酸序列的方法，所述方法包含提供一組寡核苷酸引物，其中第一引物含有與目標核酸序列一條鏈中的一 個區(qū)域互補的序列，并且第二引物含有與目標核酸序列第二鏈中的一個區(qū)域互補的序 列；提供至少一種檢測用寡核苷酸，其含有與目標核酸中的一個區(qū)域互補的序列，其 中所述檢測用寡核苷酸在結合有第一步驟中的寡核苷酸引物的目標核酸序列內發(fā)生復 性，由此產生復性雙螺旋，且此外其中所選擇每種寡核苷酸引物都與其互補模板發(fā)生 復性，所述模板位于與所述相同核酸鏈發(fā)生復性的任一檢測用寡核苷酸上游；在以下 擴增循環(huán)步驟容許的條件下采用具有5'-3'核酸酶活性的酶作為模板依賴性聚合試劑來擴增目標核酸序列(i)使寡核苷酸引物和檢測用寡核苷酸與目標序列內所含模板核 酸序列發(fā)生復性，和(ii)延伸引物寡核苷酸，其中所述核酸擴增酶合成引物延伸產物，而且核酸擴增酶的5'至3'核酸酶活性同時自包含檢測用寡核苷酸和其互補模板核酸序 列的復性雙螺旋釋放MDP，由此產生一或多種MDP;并且通過質譜法檢測所述一或 多種MDP，由此確定樣品中是否存在目標序列。通常，擴增反應是聚合酶鏈式反應。 擴增反應也可為鑒定多種目標的多重反應。在相關實施例中，可在單一多重反應中檢 測多于2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 150、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、卯0、 1000 (和各數字之間的所有 數字)種或更多目標核酸。在另一實施例中，在多重反應中使用不止一種檢測用寡核 苷酸來檢測不止一種目標核酸。在某些實施例中，通過在目標擴增條件下組合目標核酸與一對試劑可同時確定多 種多態(tài)性(例如單核苷酸多態(tài)性(SNP))或基因。每一對試劑都包括結合目標核酸的寡 核苷酸引物和可經修飾或未經修飾的檢測用寡核苷酸。在SNP基因分型情況下，檢測 用寡核苷酸與SNP位點結合，并且所述寡核苷酸在其隨后的釋放后具有可檢測到的檢 測性質。在優(yōu)選實施例中，檢測性質可通過質譜法來檢測。在基因表達分析中，檢測 用寡核苷酸結合基因特異性序列，并且所述寡核苷酸在其隨后的釋放后具有可檢測到 的檢測性質。序列擴增條件可采用具有5'-3'核酸酶活性的聚合酶、dNTP和輔助試劑 以容許有效序列擴增。輔助試劑的實例包括(但不限于)甜菜堿、用于富CG區(qū)域的 DMSO、洗滌劑、和焦磷酸酶。實施序列擴增，藉此對結合目標核酸的檢測用寡核苷 酸實施解離和/或降解、釋放，并隨后通過質譜法來檢測。通過使各SNP或基因與特 定MDP相連，可確定存于樣品中的SNP或基因。在另一相關實施例中，提供在樣品中檢測目標核酸序列的聚合酶鏈式反應(PCR) 擴增方法，其包含以下步驟向含有樣品的PCR反應物中提供一組寡核苷酸引物，其 中第一 PCR引物含有與目標核酸序列一條鏈中的一個區(qū)域互補的序列，并且第二 PCR 引物含有與目標核酸序列第二鏈中的一個區(qū)域互補的序列；提供至少一種含有與目標 核酸中一個區(qū)域互補的序列的檢測用寡核苷酸，其中所述檢測用寡核苷酸在結合有第 一步驟中PCR引物的目標核酸序列內發(fā)生復性，由此產生復性雙螺旋，此外其中所選 擇每一 PCR引物都可與其互補模板發(fā)生復性，所述模板位于與相同核酸鏈發(fā)生復性的 任一檢測用寡核苷酸上游；在以下PCR循環(huán)步驟容許的條件下采用具有5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶作為模板依賴性聚合試劑來擴增目標核酸序列(i)使引物和檢測用 寡核苷酸與目標序列內所含模板核酸序列發(fā)生復性，和(ii)延伸引物，其中所述核酸 聚合酶合成引物延伸產物，而且所述核酸聚合酶的5'-3'核酸酶活性同時自包含檢測用 寡核苷酸和其互補模板核酸序列的復性雙螺旋釋放MDP，由此產生一或多種MDP; 并且通過質譜法檢測所述一或多種MDP，由此確定樣品中是否存在目標序列。在另一 實施例中，容許PCR循環(huán)的條件可視情況包括各鏈的變性。本發(fā)明也部分提供檢測目標核酸的方法，其包含以下步驟使寡核苷酸引物與目 標核酸發(fā)生復性，使檢測用寡核苷酸與相同目標核酸發(fā)生復性；引入酶以沿檢測用寡 核苷酸方向延伸寡核苷酸引物，其中所述酶解離并由此釋放至少一部分檢測用寡核苷 酸，由此產生一或多種MDP;并通過質譜法來檢測所述一或多種MDP。在一相關實 施例中，可部分解離一部分檢測用寡核苷酸并由此使其脫離目標核酸。因此，在此實 施例中，MDP可包括脫離目標核酸的部分解離檢測用寡核苷酸，并且隨后通過質譜法 對其實施檢測。在另一實施例中，引入結合第一寡核苷酸合成產物的第二寡核苷酸， 隨后可藉此進行指數擴增。在一相關實施例中，初始目標核酸是單鏈核酸分子，例如 cDNA。本發(fā)明也部分提供在樣品中檢測目標核酸序列的并非基于擴增的方法，其包含以下步驟使包含目標核酸的樣品與以下物質接觸(i)寡核苷酸引物，其包含3'末端和5，末端，并且含有與目標核酸中一個區(qū)域互補的序列，和(ii)檢測用寡核苷酸，其包含 3'末端和5'末端，并且含有與目標核酸序列中第二區(qū)域互補的序列，由此在雜交條件 下產生(iii)雙螺旋混合物，其中所述雙螺旋所包含目標核酸與寡核苷酸引物和檢測用 寡核苷酸發(fā)生復性，從而使得寡核苷酸引物的3'末端位于檢測用寡核苷酸5'末端的上 游-，在足以解離并釋放復性檢測用寡核苷酸或其至少一個片段的條件下使第一步驟中 的樣品暴露于解離劑中，由此產生一或多種MDP;并通過質譜法來檢測所述一或多種 MDP，由此檢測樣品中是否存在目標核酸序列。本發(fā)明另外部分提供檢測目標核酸的方法，其包含以下步驟使檢測用寡核苷酸 與目標核酸發(fā)生復性；引入解離劑以解離至少部分檢測用寡核苷酸；和通過質譜法檢 測部分解離檢測用寡核苷酸或其片段。在某些實施例中，反應條件容許延伸寡核苷酸引物，其置換并降解檢測用寡核苷 酸，由此產生寡核苷酸片段和/或其附屬的任何檢測性質。在某些實施例中，在實施檢 測方法之前通過擴增反應擴增目標核酸。在另一實施例中，檢測前的所有步驟都是在 單一密閉反應容器中同時實施。在另一實施例中，重復實施所述方法的擴增或延伸步 驟直至檢測到信號。在一相關實施例中，確定擴增步驟數。在某些實施例中，以相對于寡核苷酸引物較高的濃度引入檢測用寡核苷酸。同樣， 在某些情況下，檢測用寡核苷酸可能不能通過酶來延伸。在另一實施例中，使用不止 一種檢測用寡核苷酸來檢測單一目標核酸，或不止一種檢測用寡核苷酸在結合有寡核 苷酸引物的目標核酸序列內發(fā)生復性。在某些實施例中，解離劑是酶。在某些實施例中，酶具有5'-3'核酸酶活性。在其它實施例中，酶具有能擴增目標核酸的聚合酶活性。在某些實施例中，酶是DNA聚 合酶，并且在其它實施例中，酶是RNA依賴性DNA聚合酶、DNA依賴性RNA聚合 酶、RNA依賴性RNA聚合酶或DNA依賴性DNA聚合酶。實例性DNA聚合酶包括 Taq聚合酶和大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I。在另一實施例中，酶具有熱穩(wěn)定性。本發(fā)明部分提供得自檢測用寡核苷酸置換和/或降解的MDP的產生。在一實施例 中，通過質譜法檢測到不止一種來自相同檢測用寡核苷酸的質量可區(qū)分產物(MDP)， 其產生對應于目標核酸的質量特異性檢測譜特征。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸 包含與目標核酸不互補的核苷酸序列。非互補區(qū)域可位于檢測用寡核苷酸的5，末端、 位于檢測用寡核苷酸中部，在此情況下檢測用寡核苷酸仍能與目標核酸發(fā)生復性；或 其位于檢測用寡核苷酸的3'末端。在其它實施例中，MDP能在釋放后結合固體載體。 例如，MDP可直接結合MALDI-TOF質譜法分析的基質。在另一實施例中，在釋放一 或多種MDP后通過(例如)使用通用引物系統(tǒng)對其進行擴增。在某些實施例中，將檢測用寡核苷酸納入采用通用引物的核酸檢測方法中以擴增 得自酶促修飾的序列特異性引物或寡核苷酸，其中擴增過程產生可通過質譜法檢測的 質量可區(qū)分產物。更具體來說，本發(fā)明一實施例包括提供多種目標核酸序列，其各 自自3，至5，包含第一、第二和第三目標域，第一目標域包含檢測位置，第二目標域是 至少一個核苷酸；使目標核酸序列接觸每一目標序列的探針組，每一組包含第一探 針(其自5'至3'包含含有第一通用引導序列的第一域、包含檢測用寡核苷酸結合域的 第二域、和包含與目標序列第一目標域基本互補的序列的第三域、和在3，端四個末端 堿基內的詢問位置)，第二探針(其包含第一域，其包含與目標序列第三目標域基本 互補的序列以形成一組第一雜交復合物、和包含第二通用引導序列的第二域)；在一 定條件下使第一雜交復合物至少接觸與第一通用引導序列雜交的第一通用引物、延伸 酶和dNTP，其中如果詢問位置的堿基與檢測位置的堿基互補，則第一探針通過第二 目標域發(fā)生延伸以形成第二雜交復合物；使第二雜交復合物與連接酶接觸以將延伸第 一探針連接至第二探針從而形成擴增模板。所述實施例另外包括引入檢測用寡核苷酸， 其中特定檢測用寡核苷酸與序列特異性擴增模板發(fā)生復性；引入酶來擴增擴增模板； 和檢測一或多種得自擴增反應的MDP，其中確定是否存在目標核酸序列。在另一實施 例中，本發(fā)明方法是結合以下專利中所揭示的方法來使用美國專利第6,797,470號、 美國專利第6,890,741號、美國專利第6,812,005號、美國專利第6,890,741號、美國專 利申請公開案第20020006617號、美國專利申請公開案第20030036064號、美國專利 申請公開案第20030104434號、美國專利申請公開案第20030211489號、美國專利申 請公開案第20030108900號、美國專利申請公開案第20030170684號、美國專利申請 公開案第20040121364號、美國專利申請公開案第20040224352號、美國專利申請公 開案第20040224352號，上述所有專利都是以引用方式并入本文中。在某些實施例中，檢測用寡核苷酸未經修飾，在此情況下通過質譜法檢測包含寡核苷酸片段的未經修飾MDP。在其它實施例中，檢測用寡核苷酸包含一或多個核苷修 飾。核苷修飾包括對核苷酸、磷酸酯主鏈或糖部分的修飾。核苷修飾可發(fā)生在檢測用 寡核苷酸的非互補區(qū)域中、檢測用寡核苷酸的5'末端、檢測用寡核苷酸的3'末端、或檢測用寡核苷酸的中部，此可確保檢測用寡核苷酸與目標核酸的目標特異性雜交。在 另一實施例中，核苷修飾選自由同位素富集、同位素貧化和鹵素修飾組成的群組。在 另一實施例中，通過引入氘或其它適宜同位素來達成同位素編碼。在某些實施例中，檢測用寡核苷酸包含一或多種解離識別位點。在另一實施例中， 檢測用寡核苷酸包含一或多種不可降解核苷酸。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸包 含一或多種解離識別位點和一或多種不可降解核苷酸。在優(yōu)選實施例中，檢測用寡核苷酸包含一或多個鎖核酸(LNA)，其用作不可降解 核苷酸且由此可控制解離點。LNA可與其互補體極穩(wěn)定地結合并且具有相對于新生脫 氧核苷酸顯著降低的解離率?？赏ㄟ^置放兩種或更多種彼此相鄰的LNA來進一步增強 此效應。此外，LNA可提高納入其的寡核苷酸的解鏈溫度。由此控制質量降解產物的 解離位點以便可預測產物大小和進行適當鑒定。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸包含一或多種肽核酸(PNA)。在某些實施例中，檢測用寡核苷酸包含一或多種檢測部分。在一實施例中，檢測 部分可為以下物質中的任何一或多種復合體、糖、肽、蛋白質、抗體、化合物(例 如生物素)、質量標簽(例如金屬離子或化學基團)、熒光標簽、電荷標簽(例如聚 胺或帶電染料)和疏水標簽。在一相關實施例中，檢測部分是通過質譜法檢測的質量 可區(qū)分產物(MDP)或MDP的一部分。,在一具體實施例中，檢測部分是通過質譜法檢測 的熒光標簽或標記。在某些實施例中，檢測部分位于檢測用寡核苷酸的5'末端，檢測 部分與檢測用寡核苷酸的非互補區(qū)域相連，或檢測部分位于非互補序列的5'末端。在 另一實施例中，將檢測部分納入或連接至內部核苷酸或檢測用寡核苷酸3'末端的核苷 酸中。在另一實施例中，單獨或組合使用一或多種檢測部分。在某些實施例中，檢測部分是合成聚合物或生物聚合物或其某些組合，而在其它 實施例中，檢測部分是可通過質譜法檢測的任何化合物。在具體實施例中，檢測部分 是包含單體單元的生物聚合物，其中各單體單元單獨或獨立地選自任何一或多種氨基酸、核酸、和糖類。氨基酸和核酸是優(yōu)選單體單元。由于可單獨并獨立地選擇各單體 單元，因此生物聚合物檢測部分可為多核酸、肽、肽核酸、寡核苷酸等等。在某些實施例中，檢測部分是合成聚合物，例如聚乙二醇、聚乙烯苯酚、聚丙二 醇、聚甲基丙烯酸甲酯、和其衍生物。合成聚合物通?？珊羞x自主要由以下組成的 群組的單體單元乙二醇、乙烯苯酚、丙二醇、甲基丙烯酸甲酯、和其衍生物。更通 常地，檢測部分可為含有聚乙二醇單元的聚合物。本發(fā)明部分提供檢測用寡核苷酸，其用作與特定目標核酸序列結合的探針。在一 實施例中，檢測用寡核苷酸選擇性地結合基因特異性序列，其藉此使得可實施基因表 達分析。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸選擇性地結合等位基因特異性序列。在一相關實施例中，檢測用寡核苷酸的等位基因特異性核苷酸堿基包含檢測部分或核苷修 飾。在優(yōu)選實施例中，檢測用寡核苷酸的等位基因特異性核苷酸堿基位于檢測用寡核 苷酸中部或靠近檢測用寡核苷酸的5'末端。本發(fā)明也部分提供根據表觀遺傳差異(例如甲基化、乙?；推渌切蛄懈淖冃?修飾)檢測目標核酸的方法。在一實施例中，檢測用寡核苷酸根據目標核酸的甲基化 狀態(tài)選擇性地結合甲基化特異性序列。在一相關實施例中，檢測用寡核苷酸在亞硫酸 氫鹽處理之前或之后根據目標核酸的甲基化狀態(tài)選擇性地結合甲基化特異性序列。在 另一實施例中，通過用能結合甲基化DNA的多肽涂布容器來針對甲基化DNA選擇性 富集目標核酸(在擴增之前或擴增之后)；使所述多肽接觸包含甲基化和/或未甲基化 DNA的樣品；并檢測所述多肽與甲基化DNA的結合。檢測甲基化DNA的方法闡述 于PCT專利公開案第WO06056478A1號中，其是以引用方式并入本文中。本發(fā)明部分提供檢測目標核酸的方法。 一般來說，所述方法包括獲得多種檢測用 寡核苷酸，每種檢測用寡核苷酸都針對所給分析加以特定設計(例如等位基因特異性、 基因特異性、序列特異性、甲基化特異性等)，如上所述。優(yōu)選地，在所述多種檢測 用寡核苷酸中，每種都能產生一或多種與是否存在目標核酸相關的獨特質量可區(qū)分產 物。"獨特質量可區(qū)分產物"意指多種檢測用寡核苷酸中每種都可產生與所述復數種檢 測用寡核苷酸中所有其它核苷酸不同的質量可區(qū)分產物。多種一般應理解為包括兩種 或更多種檢測用寡核苷酸。隨后，在適合容許生成可通過質譜法分析的MDP的條件 下使目標分子接觸多種檢測用寡核苷酸。通常，質量指示特定目標核酸。以此方式， 可根據MDP的獨特組合來鑒定目標分子。實例1提供使用序列特異性分析來檢測恒 河猴(Rhesus) D基因外顯子10的實例。在另一實例中，針對目標核酸每一具體SNP 來設計分析，其中所分析的檢測用寡核苷酸根據所存在SNP種類產生獨特MDP。如 果欲在特定位置檢測兩種SNP，則使用兩種具有獨特MDP的等位基因特異性檢測用 寡核苷酸。對于基因表達分析，可使用基因特異性檢測用寡核苷酸和競爭劑。例如， 可參見美國專利申請案第20040081993號(康托爾(Cantor)等人)，其是以引用方式并 入本文中。在某些實施例中，寡核苷酸引物選擇性地結合等位基因特異性序列。在某些實施 例中，寡核苷酸引物的3'末端位于檢測用寡核苷酸5'末端上游至少一個堿基處。本發(fā)明部分提供通過質譜法檢測MDP的方法。在一實施例中，通過質譜儀來實 施檢測，質譜儀可為以下中的一種MALDI-TOF MS、串聯式MS、 ESI-TOF、 ESI-離子阱、LC-MS、 GC-MS、離子遷移MS、激光解吸電離質譜法(LDI-MS)和四極MS。 現有的或可研發(fā)的其它質譜法器件和方法在本發(fā)明范圍內。本發(fā)明也部分提供檢測并定量生物分子(例如目標核酸)的方法，其中通過檢測 質量可區(qū)分產物(MDP)來監(jiān)測PCR產物的生成。在一實施例中，檢測是以實時方式來 實施。在某些實施例中，實時檢測是用電噴霧質譜儀或LC-MS來實施。在另一實施例 中，在質譜法相關介質上使一或多種MDP定點在對應于擴增過程期間特定時刻的特定位置上。質譜法相關介質的一實例是適用于MALDI-TOF MS的基質。在另一實施 例中，引入競爭模板核酸，其中所述模板核酸用作內部對照。在另一實施例中，確定 擴增循環(huán)數以獲得定量結果?？赏ㄟ^循環(huán)閾值(Ct)或業(yè)內已知的任何其它方法來定量 存于反應混合物中的起始目標核酸量。本文也提供檢測目標核酸序列的方法，其包含通過質譜法分析含有質量可區(qū)分產 物的核酸樣品，其中所述質量可區(qū)分產物得自(a)使寡核苷酸引物與目標核酸發(fā)生復 性；(b)使檢測用寡核苷酸與相同目標核酸發(fā)生復性；和(c)使目標核酸接觸沿檢測用寡核苷酸方向延伸寡核苷酸引物的酶，其中所述檢測用寡核苷酸或其部分與目標核酸序列互補，并且所述酶解離并由此釋放至少一部分檢測用寡核苷酸，由此產生一或多種質量可區(qū)分產物；藉此通過以質譜鑒定質量可區(qū)分產物來檢測目標核酸序列。在 某些實施例中，引入結合第一寡核苷酸合成產物的第二寡核苷酸，隨后可藉此實施指 數擴增。本文也提供檢測目標核酸序列的方法，其包含通過質譜法分析含有質量可區(qū)分產 物的核酸樣品，其中所述質量可區(qū)分產物得自(a)在可檢測探針特異性結合目標生物 分子的條件下使目標生物分子接觸含有用作模板核酸的寡核苷酸的可檢測探針；(b) 使寡核苷酸引物與所述模板核酸發(fā)生復性；(c)使檢測用寡核苷酸與相同模板核酸發(fā) 生復性；和(d)使模板核酸接觸沿檢測用寡核苷酸方向延伸寡核苷酸引物的酶，其中 所述檢測用寡核苷酸或其部分與目標核酸序列互補，并且所述酶解離并由此釋放至少 一部分檢測用寡核苷酸，由此產生一或多種質量可區(qū)分產物；藉此通過以質譜鑒定質 量可區(qū)分產物來檢測目標核酸序列。在某些實施例中，引入結合第一寡核苷酸合成產 物的第二寡核苷酸，隨后可藉此進行指數擴增。


圖l是繪示使用質譜法檢測目標核酸的示意圖。反應組份包括目標核酸、正向和 反向PCR引物、檢測用寡核苷酸、擴增酶、和諸如緩沖液等擴增試劑以及核苷酸。在 步驟A中，進行引物延伸。在延伸期間，置換并降解檢測用寡核苷酸(步驟B)。在 每一擴增循環(huán)期間，通過酶的5'核酸酶活性(步驟C)來生成質量可區(qū)分產物(MDP)(在圖中也稱作降解產物)。在擴增后，可視情況調整MDP并隨后通過質譜法對其 實施檢測。反應副產物尤其可包括PCR產物、殘余引物、未降解寡核苷酸引物和MDP(步驟D)。步驟E展示實例性波譜圖，其中y軸是任意強度(a丄)并且x軸是質量(m) 比z (電荷)。MDP的存在證實了目標核酸的存在。圖2是繪示使用質譜法檢測目標核酸的示意圖，其中檢測用寡核苷酸包含5'非互 補區(qū)域。在步驟B中，酶釋放檢測用寡核苷酸的5'非互補區(qū)域，并在步驟C中對其實 施檢測。圖9提供實驗性波譜圖，其中生成并檢測5，非互補MDP。在圖底部術語"鑒 定目標NS"是指"鑒定目標核苷酸序列"。圖3是繪示使用質譜法檢測目標核酸的示意圖，其中檢測用寡核苷酸包含3'非互 補區(qū)域。在步驟B中，酶釋放檢測用寡核苷酸的3'非互補區(qū)域，并在步驟C中對其實 施檢測。在圖底部術語"鑒定目標NS"是指"鑒定目標核苷酸序列"。在一實施例中，本 發(fā)明可部分包括經解離和檢測的3'非互補區(qū)域。在另一相關實施例中，3'非互補區(qū)域 上游的雜交寡核苷酸是不可解離或不可降解的，由此產生獨特定義的解離產物。圖4是繪示檢測多種目標核酸的多重分析的示意圖。針對四種目標(l-4)中的每一 目標設計分析，其中各目標具有獨特檢測用寡核苷酸，其具有特定長度(L1-L4)的5， 非互補區(qū)域。在擴增后(步驟A)，如果存在目標則生成5'非互補區(qū)域MDP。在此具 體實例中，存在目標1和4，因此生成Ll和L4 MDP并通過質譜法對其實施檢測(如 步驟B的波譜圖中所示)。圖5是繪示本發(fā)明實時實施例的示意圖。方案與圖1中所示類似，然而在每一循 環(huán)后或在給定時間點(例如在每5次循環(huán)后)實施質譜法分析。如果存在目標核酸， 則降解產物(即MDP)信號強度隨每一循環(huán)而增強，同時引物和未降解檢測用寡核苷 酸信號強度由于消耗和降解而減弱。圖6是示意圖繪示分析的變化形式，其中采用通用引物來檢測目標生物分子。在 此具體圖中，展示基因分型分析，其中每一單一核苷酸多態(tài)性(SNP)具有獨特引物組。 例如，使用具有序列區(qū)域5和6 (S5和S6)的等位基因特異性引物來分析SNP3，所 述序列區(qū)域分別對應于C等位基因和G等位基因。也引入名為CS3或通用引物3的 下游引物。在步驟A中，引物與目標雜交，并且如果存在等位基因則發(fā)生等位基因特 異性引物延伸。在延伸后，形成連接產物。引入與連接產物中分析特異性序列區(qū)域互 補的名為cS5和cS6或互補引物5和6的檢測用寡核苷酸用于SNP3分析。在使用通 用引物擴增連接產物后，置換并降解檢測用寡核苷酸(cS5和cS6)以產生MDP，并 通過質譜法對其實施檢測。實例性質譜圖揭示存在具有SNP1的等位基因A，具有SNP2 的等位基因T，和具有SNP3的等位基因C和G (雜合)。圖7是繪示可用于非核酸檢測(例如蛋白質檢測)的本發(fā)明實施例的示意圖。每 一適體含有目標結合域(A1-A3)，在隨后的擴增期間可結合有獨特互補檢測用寡核苷酸 (CS)的獨特序列(S)、和通用引物結合位點。在步驟A中，目標蛋白質結合固定抗體。 在步驟B中，通過洗滌移除未結合試劑，并添加適體庫?；パa適體結合目標蛋白質， 并洗滌除去非互補適體。添加通用引物和序列特異性檢測用寡核苷酸(步驟C)。在 擴增后，置換并降解檢測用寡核苷酸以產生MDP，并通過質譜法對其實施檢測(步驟 D) 。 MDP1和MDP3的存在分別指示存在蛋白質1和蛋白質3。圖8是展示在PCR擴增期間自外顯子IO特異性檢測用寡核苷酸生成的MDP(質 量介于1900與3000 Da范圍內)的質譜圖。在2123.6 Da、 2437.0 Da禾卩2726.2 Da處 的質量信號代表含有以下標簽的5' MDP:在第一個雜交T核苷酸處解離的polyA標 簽(6腺嘌呤)(AAAAAAT)、在前兩個雜交核苷酸后解離的polyA標簽(AAAAAATA)、 和在前三個雜交核苷酸后解離的polyA標簽(AAAAAATAC)。 Y軸是信號強度并且X軸是質荷比。圖9是展示在PCR擴增期間自外顯子5特異性檢測用寡核苷酸生成的MDP (質 量介于2500與7000 Da范圍內)的質譜圖。在5765和6335.9 Da處的質量信號代表 剩余未使用PCR引物。在2741.6 Da和3032.6 Da處的質量信號代表含有以下標簽的5' MDP:在第一個雜交T核苷酸處解離的polyA標簽(8腺嘌呤)(AAAAAAAAT)和 在前兩個雜交核苷酸后解離的polyA標簽(AAAAAATC)。 Y軸是信號強度并且X軸是 質荷比。
具體實施方式
本發(fā)明提供多種優(yōu)于當前核酸檢測和定量方法的優(yōu)勢，例如多重分析能力增強、 分析簡易性、循環(huán)時間較短和無PCR后處理。當前方法經常需要多步驟反應，包括固 相純化、轉移和洗滌步驟、和PCR后酶促反應，所有這些步驟都會增加總分析時間和 成本，由此限制方法適用性。例如，基于TaqMan的QPCR方法受限于其對染料的使 用，而本發(fā)明僅受限于針對每種分析所設計的獨特檢測性質數。此使得可明確檢測有 限質量范圍內的MDP。所述分析也較簡單。在一實施例中，僅有一種在密閉管中實施的擴增或延伸步驟， 因此未轉移產物或未對其實施擴增后酶促反應。同樣，擴增步驟容許快速循環(huán)(即分 析在平臺期結束)，因此速度和運轉時間僅受限于循環(huán)速率-并且可使用快速循環(huán)。 最后，不實施擴增后處理。例如，不需要將任何產物固定在固體載體上或使其結合在 捕獲探針上并用酶進一步處理。本發(fā)明提供同時鑒定并定量大量來自一或多種樣品的序列以供眾多種應用的優(yōu) 勢，所述應用包括(但不限于)診斷學、法醫(yī)學和諸如種體(例如航空旅客)身份驗 證等安全應用。在某些應用中，本發(fā)明提供分析一或多種樣品中是否存在多種與具體 疾病相關的多態(tài)性的優(yōu)勢，用以分析一或多種與具體疾病相關的基因的表達，或用以 在可在數小時內而非數天內完成的簡單快速多重分析中鑒定一或多種樣品的來源。本發(fā)明方法可用于實施多重分析來檢測/分析生物分子目標，包括(但不限于)核 酸檢測，例如序列識別、SNP檢測、轉錄分析或mRNA測定、等位基因測定、突變測 定和甲基化分析。在另一實施例中，本發(fā)明方法可與基于鄰位連接或免疫分析的方法 組合用于檢測和定量非核酸生物分子，例如蛋白質或肽。例如，在一實施例中，本發(fā) 明檢測用寡核苷酸與在初期鄰位連接反應或免疫分析期間形成的連接復合物發(fā)生復 性，隨后將其用作模板用于核酸擴增反應。在連接復合物擴增后，產生質量可區(qū)分產物并如本文所述對其實施檢測，由此容許增強多重分析能力。鄰位連接和免疫分析另 外闡述于以下文獻中美國專利第5,665,539號；美國專利第6,511,809號；美國專利 第6,878,515號；美國專利申請案第20050233351號；美國專利申請案第20020064779 號；以及羅杰布倫特(Roger Brent)和他的同僚，分子科學研究所(Molecular SciencesInstitute)(伯克利(Berkeley)， CA)，自然方法(7V^M"/w血)，2005年l月;2(1):31-7,所有這些文獻都是以引用方式并入本文中。使用產生質譜法可檢測質量可區(qū)分產物的基于擴增的方法的優(yōu)勢在于能同時檢 測多種目標核酸。當前方法因通過基于熒光生色團的現有方法產生的重疊波譜較寬而 受限。因此，熒光多重分析的上限最可能為約十種不同標記?；谫|譜法的當前方法 可用于最多約50重的多重反應。使用本文所揭示的基于質譜法的方法，可對大于約五 十種或數百種、并且可能甚至數千種不同目標實施多重分析。由于此高水平多重分析 能力，不僅可同時使用多種分析，而且可用多種不同檢測性質來標記任何單獨檢測用 寡核苷酸。最后，所述分析可廣泛用于任何需要快速運轉和多重分析能力的領域中(例如公 共安全)。所述分析快速穩(wěn)定，并且檢測平臺較小，并且具有較高準確性和易使用性， 此使得本發(fā)明方法稱為眾多應用中的理想方法，所述應用包括檢測臨床樣品內的傳染 原、法醫(yī)學、診斷學、研究(例如檢測無性系內的基因(cDNA)插入物)、安全和野外 應用。 A定乂本文所用術語"樣品"包括試樣或培養(yǎng)物(例如微生物培養(yǎng)物)，其包括核酸。術 語"樣品"也意欲包括生物和環(huán)境樣品二者。樣品可包括合成來源的試樣。生物樣品包 括全血、血清、血漿、臍帶血、絨毛膜絨毛、羊水、腦脊液、脊髓液、灌洗液(例如 支氣管肺泡、胃、腹膜、導管、耳、關節(jié)鏡)、活組織檢査樣品、尿、糞便、痰、唾 液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、膽汁、淚液、汗液、母乳、乳液、胚胎細胞 和胎兒細胞。在優(yōu)選實施例中，生物樣品為血液，并且更優(yōu)選為血漿。本文所用術語"血 液"涵蓋全血或血液中的任一部分，例如通常所定義的血清和血漿。血漿是指對經抗凝 劑處理的血液實施離心獲得的全血部分。血清是指在血液樣品凝固后剩余的水樣流體 部分。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料，例如地表物質、土壤、水和工業(yè)樣品，以及自食品和 牛奶加工儀器、裝置、設備、器皿、可棄式和不可棄式物件獲得的樣品。不應將這些 實例視為限制適用于本發(fā)明的樣品類型。本文所用術語"目標"或"目標核酸"欲意指任何欲檢測或測量其存在或欲研究其功 能、相互作用或特性的分子。因此，目標主要包括存在可檢測探針(例如檢測用寡核 苷酸)或分析或可由所屬領域技術人員制造的任何分子。例如，目標可為生物分子， 例如核酸分子、多肽、脂質、或碳水化合物，其能結合或接觸可檢測探針(例如抗體)， 其中可檢測探針也包含能通過本發(fā)明方法加以檢測的核酸分子。本文所用"可檢測探 針"是指能與所關注目標生物分子發(fā)生雜交或復性并且使得可特異性檢測本文所述目 標生物分子的任何分子或試劑。在本發(fā)明一方面中，目標是核酸，并且可檢測探針是 檢測用寡核苷酸。在整個本發(fā)明中術語"核酸"與"核酸分子"可互換使用。所述術語是 指寡核苷酸、寡聚核苷酸、聚核苷酸、脫氧核糖核苷酸(DNA)、基因組DNA、線粒體 DNA(mtDNA)、互補DNA (cDNA)、細菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、 RNA、信使RNA(mRNA)、轉移RNA (tRNA)、核糖體RNA (rRNA)、 siRNA、催化RNA、無性系、 質粒、M13、 Pl、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、擴增核酸、 擴增子、PCR產物和其它類型的擴增核酸、RNA/DNA雜合體和聚酰胺核酸(PNA)，所有這些物質都可呈單螺旋或雙螺旋形式，并且除非另外加以限制，否則其涵蓋可以 與天然存在核苷酸類似的方式發(fā)揮作用的天然核苷酸已知類似物和其組合和/或混合 物。因此，術語"核苷酸"是指天然存在和經修飾/非天然存在核苷酸二者，其包括三、 二和單磷酸核苷以及存于多核酸或寡核苷酸內的單磷酸酯單體。核苷酸也可為核糖核苷酸；2'-脫氧核苷酸；2', 3'-脫氧核苷酸以及眾多種業(yè)內熟知的其它核苷酸模擬物。 模擬物包括鏈終止核苷酸，例如3'-0-甲基鹵代堿基或糖取代物；替代性糖結構，包括 非糖物質、烷基環(huán)結構；替代堿基，包括肌苷；經脫氮(deaza)修飾的核苷酸；經x和 V/連接體修飾的核苷酸；經質量標記修飾的核苷酸；磷酸二酯修飾或替換，包括硫代 磷酸酯、甲基膦酸酯、硼垸磷酸酯、酰胺、酯、醚；和基本或完全的核苷酸間替代， 包括解離連接，例如光可解離硝基苯基部分。可以定量或定性方式測量目標是否存在。目標可呈多種形式，包括(例如)簡單 或復雜混合物，或呈基本純化形式。例如，目標可為含有其它組份的樣品的一部分， 或可為樣品的唯一或主要組份。因此，目標可為完整細胞或組織的一種組份、細胞或 組織提取物、其分級分離的裂解物、或基本純化的分子。目標也可具有已知或未知序 列或結構。本文所用術語"氨基酸"是指天然存在的氨基酸以及可通過業(yè)內熟知方法合成或獲 得的任何經修飾氨基酸。術語"擴增反應"是指任何增加核酸中目標序列的拷貝的體外方式。"擴增"是指使溶液經受足以容許進行擴增的條件的步驟。擴增反應的組份可包括 (但不限于)例如引物、聚核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP和諸如此類。術語"擴 增"通常是指目標核酸的"指數式"增加。然而，本文所用"擴增"也可指核酸中所選目標 序列數量的線性增加，但與一次性單一引物延伸步驟不同。"聚合酶鏈式反應"或"PCR"是指可以幾何級數擴增目標雙鏈DNA中特定區(qū)段或 子序列的方法。PCR為所屬領域技術人員所熟知；例如，參見美國專利第4,683,195 號和第4,683,202號；以及PCR方案方法與應用指南(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications),英尼斯(Innis)等人編輯，19卯。本文所用"寡核苷酸"是指通過磷酸二酯鍵或其類似物連接的天然或經修飾核苷單 體的線性寡聚體。寡核苷酸包括能特異性結合目標核酸的脫氧核糖核苷、核糖核苷、 其環(huán)口異構形式、肽核酸(PNA)、和諸如此類。通常通過磷酸二酯鍵或其類似物來連 接各單體以形成大小在數種單體單元(例如3-4種)至數十種單體單元(例如40-60 種)范圍內的寡核苷酸。每當通過字母序列(例如"ATGCCTG")來表示寡核苷酸時， 應理解從左至右核苷酸呈5'-3'順序，并且除非另外說明，否則"A"表示脫氧腺苷，"C" 表示脫氧胞苷，"G"表示脫氧鳥苷，"T"表示脫氧胸苷，并且"U"表示核糖核苷(尿苷)。通常寡核苷酸包含四種天然脫氧核苷酸；然而，其也可包含核糖核苷或非天然核苷酸 類似物。倘若酶活性需要特定寡核苷酸或聚核苷酸底物，例如單鏈DNA、 RNA/DNA 雙螺旋或諸如此類，則所屬領域技術人員熟知寡核苷酸或聚核苷酸底物適宜組成的選 擇。本文所用"寡核苷酸引物"(或簡寫成"引物")是指可與目標核酸模板上的序列雜 交并且有助于檢測檢測用寡核苷酸的聚核苷酸序列。在本發(fā)明的擴增實施例中，使用 寡核苷酸引物作為核酸合成中的起始點。在非擴增實施例中，寡核苷酸引物可用于產 生能被解離劑解離的結構。引物可具有各種長度并且長度經常小于50個核苷酸，例如 長度為12-25個核苷酸?？筛鶕鶎兕I域技術人員己知的原理來設計PCR中所用引物 的長度和序列。本文所用術語"檢測用寡核苷酸"是指能與所關注目標核酸發(fā)生雜交或復性并且使 得可特異性檢測所述目標核酸的聚核苷酸序列。"錯配核苷酸"或"錯配"是指在所述位置處與目標序列不互補的核苷酸。檢測用寡 核苷酸可具有至少一處錯配，但也可具有2、 3、 4、 5、 6或7種或更多錯配核苷酸。本文所用術語"多態(tài)性"是指等位基因變體。多態(tài)性可包括單核苷酸多態(tài)性(SNP) 以及簡單序列長度多態(tài)性。多態(tài)性可能是由于在一種等位基因處相對于另一種等位基 因有一或多個核苷酸發(fā)生取代所致，或可能是由于插入或缺失、重復、反轉和業(yè)內已 知的其它改變所致。本文所用術語"質量可區(qū)分產物"可與"解離產物"、"降解產物"或"探針片段"互換 使用。此外可使用縮寫"MDP"。術語"質量可區(qū)分產物"是指通過本文方法解離并釋放 所述檢測用寡核苷酸而獲得的一或多種降解產物。質量可區(qū)分產物(MDP)可包括(但 不限于)未經修飾檢測用寡核苷酸片段、經修飾檢測用寡核苷酸片段(例如同位素富 集或貧化寡核苷酸片段)、包含檢測部分的寡核苷酸片段、自檢測用寡核苷酸釋放的 檢測部分、和與目標核酸不互補的檢測用寡核苷酸片段。質量可區(qū)分產物也可包括在 檢測用寡核苷酸部分降解后與目標核酸脫離的部分解離檢測用寡核苷酸片段。本文所用術語"質量特異性檢測譜特征"是指以下情形檢測到不止一種質量可區(qū) 分產物，由此獲得每種目標核酸具有不止一個質量峰的波譜圖。在檢測用寡核苷酸解 離后，可生成多種可通過質譜法檢測的MDP。每一檢測分析可具有其自身質量特異性 檢測譜特征，其包含多種對應于相同目標核酸的具有不同質量的解離產物。本文所用術語"經修飾"是指已經改變而包括檢測性質的檢測用寡核苷酸。本文所用術語"檢測性質"是指已經引入以產生分離特征的修飾，所述分離特征可 根據(例如)質量差異或大小差異通過質譜法或任何其它基于大小的分離方法(例如 凝膠電泳(在包括丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠、紙等在內的各種載體上進行)、色譜或過 濾)來檢測。分離特征使得可自較大MDP組檢測特定MDP或MDP亞組。檢測性質 包括(但不限于)檢測部分和核苷修飾。本文所用術語"檢測部分"是指可用于提供可檢測(優(yōu)選地可定量)效應并且可連接或納入核酸(例如檢測用寡核苷酸)中的任何原子或分子。在一優(yōu)選實施例中，檢 測部分是特征在于具有獨特質量的部分，所述特征使得可在基于質量的分離(例如通 過質譜法、凝膠電泳、色譜或過濾來分離)中進行特異性鑒定。檢測部分包括(但不 限于)核苷酸、復合體、糖、肽、蛋白質和抗體、化合物、金屬化合物、吸電子物質、 諸如生物素等結合部分、質量標簽、熒光標簽、電荷標簽、揮發(fā)性標簽和疏水標簽。 可結合本發(fā)明使用的檢測部分的其它實例闡述于美國專利公開案第20030194717號 (申請案第10/221,666號)中，其是以引用方式并入本文中。本文所用術語"復合體"在目標檢測分析中自復合體模板合成的分子，其用以間接 指示所分析樣品中特定目標分子的存在。復合體包括一或多種亞單元。復合體聚合的 特別優(yōu)選亞單元是核苷堿基亞單元。復合體更詳細地闡述于美國專利申請案第 20050287533號(序列號10/874898)中，其是全文以引用方式并入本文中。本文所用術語"核苷修飾，，是指檢測用寡核苷酸在分子水平上(例如堿基部分、糖 部分或磷酸酯主鏈)的改變。核苷修飾包括(但不限于)引入解離封阻劑或解離誘導 劑、引入小溝結合劑、同位素富集、同位素貧化、引入氘、和鹵素修飾。核苷修飾也 可包括增加雜交嚴謹度或提高檢測用寡核苷酸解鏈溫度的部分。例如，核苷酸分子可 用連接2'與4'碳的外部橋接來修飾，從而獲得可抵抗核酸酶解離的鎖核酸(LNA)核苷 酸。在提及一種分子與另一種分子(例如目標聚核苷酸的探針)的結合時，術語"特 異性的"或"特異性"是指兩種分子之間的識別、接觸、和穩(wěn)定復合物的形成，以及所述 分子與其它分子之間顯著較弱的識別、接觸或復合物的形成。本文所用術語"復性"是 指在兩種分子之間形成穩(wěn)定復合物。如果探針中至少一種區(qū)域與核酸序列互補體中至少一種區(qū)域共有基本序列一致 性，則探針"能與所述核酸序列發(fā)生雜交"。"基本序列一致性"是至少約80%、優(yōu)選地 至少約85%、更優(yōu)選地至少約90%、 95%或99%、并且最優(yōu)選100%的序列一致性。 出于確定DNA序列和RNA序列的序列一致性的目的，經常將U和T視為相同核苷 酸。例如，包含序列ATCAGC的探針能與包含序列GCUGAU的目標RNA序列發(fā)生 雜交。本文所用術語"解離劑"是指能解離檢測用寡核苷酸以產生質量可區(qū)分產物的任何 手段，包括(但不限于)酶。在不發(fā)生擴增的方法中，解離劑可僅用于解離、降解或 釋放檢測用寡核苷酸或其片段。解離劑可為酶。解離劑可為天然的、合成的、未經修 飾的或經修飾的。在發(fā)生擴增的方法中，解離劑優(yōu)選地為具有合成(或聚合)活性和核酸酶活性的 酶。此類酶經常為核酸擴增酶。核酸擴增酶的實例是核酸聚合酶，例如棲熱水生菌 (Thermus aquaticus) (Taq) DNA聚合酶(TaqMAN⑧)或大腸桿菌DNA聚合酶I。酶可為 未經修飾或經修飾的天然存在的酶。術語"聚合酶"是指通過使用DNA或RNA作為模板將核苷酸單元添加至核苷酸鏈中來催化聚核苷酸合成的酶。所述術語是指完整酶或催化結構域。 漢■本發(fā)明部分涉及采用欲通過質譜法檢測的雜交探針的定量擴增方法和包含具有 合成和核酸酶活性的單一酶的反應。相反，其它文獻中所述某些定量擴增應用需要(a) 含有可通過除質譜法以外的方法檢測的可檢測標記(例如熒光標簽)的雜交探針(例 如參見美國專利第5,210,015號)、或(b)用于在并非基于擴增的方法中解離解離結構 的多種解離劑(例如參見美國專利第5,719,028號)。在本文所述實施例中，擴增反應 中包括檢測用寡核苷酸以及擴增模板的引物。此外，通過質譜法檢測檢測用寡核苷酸 或其片段使得可提高多重分析水平。在某些實施例中，檢測用寡核苷酸經修飾，并且 在其它實施例中檢測用寡核苷酸未經修飾。下文中更詳細地闡述擴增條件、酶特性、 檢測用寡核苷酸特性、檢測用寡核苷酸結合特性和質量可區(qū)分產物檢測方法。 C. f潛殺#在一實施例中，本文所述方法采用經修改定量擴增方法，此使得可以多重分析方 式進行準確靈敏的核酸分析。如頒予馬利斯(Mullis)和馬利斯等人的美國專利第 4,683,195號和第4,683,202號中所述，聚合酶鏈式反應(PCR)闡述在基因組DNA混合 物中不實施克隆或純化即可提高具有目標序列的區(qū)段濃度的方法?？墒褂肞CR來將目 標濃度直接增加至易于檢測的水平。此擴增目標序列的方法涉及將摩爾過量的兩種與 雙鏈目標序列中各自鏈互補的寡核苷酸引物引入含有期望目標序列的DNA混合物中。 使混合物變性然后使其發(fā)生雜交。在雜交后，用聚合酶使引物延伸以形成互補鏈。可 將變性、雜交、和聚合酶延伸步驟重復實施所需要次數以獲得相對高濃度的具有期望 目標序列的區(qū)段。本發(fā)明方法容許在單一密閉反應容器中同時實施擴增反應，其中可重復實施擴增 步驟直至檢測到信號。此合成的副產物是來自檢測用寡核苷酸的寡核苷酸片段，其為 單-、二-和較大核苷酸片段的混合物。檢測用寡核苷酸可經修飾以包括可通過質譜法 檢測的檢測性質，或寡核苷酸片段可經修飾以產生具有給定分子質量或大小的質量可 區(qū)分產物。變性、檢測用寡核苷酸與引物復性、以及引物延伸和檢測用寡核苷酸解離 的重復循環(huán)導致引物所界定的目標區(qū)域的指數式積累以及質量可區(qū)分產物的指數式生 成。運行足夠循環(huán)以獲得可檢測種類的MDP。尤其與當前可用分析相比，本發(fā)明可提供多種優(yōu)勢，包括能更容易地設計并實施 多重分析。在多重分析中，可同時檢測若干目標核酸。在多重模式中，使用數組特別 設計的檢測用寡核苷酸從而使得所得質量可區(qū)分產物具有彼此相異的獨特質量?？墒?用多重實驗在同一分析中檢測2種或更多種目標核酸、IO種或更多種目標核酸、100 種或更多種目標核酸、或1,000種或更多種目標核酸。在多重分析中所用檢測用寡核 苷酸數量等于或大于欲檢測目標核酸數。例如，當使用多重實驗來檢測io種目標核酸 時，使用10種或更多種檢測用寡核苷酸以產生10種或更多種具有獨特質量的質量可 區(qū)分產物。單一分析中所檢測分析物數量僅受限于單一分析中可檢測的質量可區(qū)分產物數量。如本文所述，質譜法可分辨質量中的較小差異，從而使得可在單一分析中使用大量檢測用寡核苷酸。A歹/激錄絲可使用適宜方法來制備寡核苷酸引物和探針，例如所屬領域技術人員熟知的使用 磷酸三酯和磷酸二酯的方法。在某些實施例中，檢測用寡核苷酸中包括一或多種檢測 部分。也可在堿基部分、糖部分、或磷酸酯主鏈處用(例如)小溝結合劑或嵌入劑修 飾寡核苷酸。根據已知算法來設計擴增反應引物。將引物設計為可與目標核酸兩側的序列發(fā)生 雜交。通常，市售或常規(guī)軟件可使用各種算法來設計引物從而使得復性溫度接近解鏈 溫度。擴增引物的長度通常為至少12個堿基、更通常為約15、 18或20個堿基。通常 將引物設計為參與一個特定反應的所有引物的解鏈溫度彼此相差在5'C內，并且最優(yōu) 選地相差在2"C內。另外應將引物設計為可避免在其自身上引導或相互引導。引物濃度通常足以結合所擴增數量的目標序列以提供對所擴增序列數量的準確評價。所屬領 域技術人員應了解，引物濃度可根據引物的結合親和性以及欲結合序列的數量而變化。典型引物濃度可在0.01 ^M至1.0 ^M范圍內。同樣，引物濃度可相對于檢測用寡核苷 酸濃度而改變，其中檢測用寡核苷酸濃度大于引物濃度。在另一實施例中，正向和反向引物濃度可相對于彼此而改變(有時稱作不對稱 PCR的條件)以藉此相對于模板DNA中的一條鏈優(yōu)先擴增另一條鏈。在優(yōu)選實施例 中，優(yōu)先擴增結合有檢測用寡核苷酸的鏈。在引物與目標序列模板雜交并用聚合酶使其延伸的條件下培養(yǎng)擴增反應。所述反 應條件可根據所關注目標核酸以及引物的組成而改變。所選擇擴增反應循環(huán)條件應使 得引物可與目標模板序列發(fā)生特異性雜交并進行延伸。與所分析樣品中可能存在的其 它核酸相比，與目標模板發(fā)生特異性雜交的引物可優(yōu)先擴增所述目標序列。 五.朦錄絲本發(fā)明納入解離劑的使用以降解并釋放可檢測質量可區(qū)分產物。可使用若干種業(yè) 內已知核酸酶來解離不同類型的核酸。例如，可使用可解離雙鏈DNA的核酸酶(例 如DNA酶I和外切核酸酶III)，或可解離單鏈DNA的核酸酶，例如核酸酶S1。核 酸酶包括僅用作核酸酶的酶以及含有核酸酶活性的多功能酶，例如DNA聚合酶，例 如具有5，核酸酶活性的Taq聚合酶。人們已知若干種得自不同細菌物種或經設計突變 的Taq聚合酶衍生物，其可解離特定結構的核酸雜合體(凱瑟(Kaiser)等人，生物化學 期刊(J. Biol. Chem.) 274:21387-21394 (1999);萊米車夫(Lyamichev)等人，美國國家科 學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 96:6143-6148 (1999);馬(Ma)等人，生物化學期刊， 275:24693-24700 (2000))。例如，已研發(fā)出CleavaseTM酶(三浪技術公司(Third Wave Technologies))，其僅在特定核酸結構中引發(fā)解離。在優(yōu)選實施例中，解離劑是具有 聚合酶和核酸酶活性的酶，其中目標核酸以指數方式擴增同時生成質量可區(qū)分產物。在某些實施例中，酶在與目標雜交的檢測用寡核苷酸區(qū)域的5'末端處將檢測用寡核苷酸解離為單個核苷酸。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸并非以逐核苷酸方式解 離。相反，通過引入可產生具有不止一個核苷酸的質量可區(qū)分產物的檢測部分或核苷 修飾來調節(jié)解離。在優(yōu)選實施例中，檢測用寡核苷酸的解離方式應使得其可產生可復 制并且可區(qū)分的MDP。 F.澄層織辦錄絲本發(fā)明檢測用寡核苷酸可具有任何適宜大小，并且通常在約6至約100個核苷酸 范圍內，更優(yōu)選為約6至約80個核苷酸并且甚至更通常地為約10至約40個核苷酸。 檢測用寡核苷酸的確切序列和長度部分取決于其所結合目標聚核苷酸的性質。在具體 實施例中，結合位置和長度可變以獲得適宜復性和解鏈特性。作出此類設計選擇的指 導可參見許多業(yè)內認可的參考文獻。通過檢測用寡核苷酸的雜交以及引物對目標序列 的擴增來擴增目標核酸可提供對樣品中目標核酸序列數量的定量確定。在優(yōu)選實施例 中，檢測用寡核苷酸是不可延伸的(例如通過引入3'雙脫氧核苷酸)，由此降低出現 擴增偽跡的可能性。檢測用寡核苷酸與目標核酸序列之間也可含有錯配，例如在目標核酸序列的不變 (非多態(tài))位置處。在某些實施例中，其它核苷酸(例如2、 3、 4、 5、 6、或7個或 更多個核苷酸)也可與目標核酸發(fā)生錯配。在某些實施例中，所述其它錯配在與目標 核酸序列雜交之前與上游檢測用寡核苷酸序列形成莖-環(huán)結構。錯配核苷酸可存于檢測 用寡核苷酸的5'末端、3'末端或內部。3'錯配的實例闡述于美國專利申請案第 20060024695號中，其是以引用方式并入本文中。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸 互補區(qū)域的5'末端可含有GC夾。檢測用寡核苷酸可經修飾或未經修飾。經修飾寡核苷酸可含有檢測部分或核苷修 飾。檢測部分和核苷修飾以及制備和使用其的方法的實例闡述于以下文獻中美國專 利第5,174,962號；美國專利第5,360,819號；美國專利第5,516,931號;美國專利第 6,268,129號；美國專利第6,635,452號；美國專利第6,322,980號；美國專利第6,514,700 號；美國專利第6,649,351號；和美國專利第6,613,509號；和美國專利申請案第US 20060172319號，所有上述文獻都是以引用方式并入本文中。術語"檢測部分"是指質量標記、標簽或信號。本發(fā)明各類檢測部分的實例包括一 組優(yōu)選地共有類似質譜解析特性并且具有類似或相同偶合化學性質的化合物以簡化多 個檢測部分變體的合成。本發(fā)明檢測部分可通過質譜法來檢測。質譜技術的代表類型 包括基質輔助激光解吸電離、直接激光解吸、電噴霧電離、二次中性粒子質譜、和二 次離子質譜法，其中優(yōu)選者為激光解吸電離。 一般可通過在信號處理和分析中使用對 數放大器和/或可變衰減來擴展質譜測量的動態(tài)范圍。在其它相關實施例中，可用任一類型的容許檢測用寡核苷酸的檢測、解離、或抗 解離的化學基團或部分來標記核苷酸，所述基團或部分包括(但不限于)放射性分子、 熒光分子、抗體、抗體片段、半抗原、碳水化合物、生物素、生物素衍生物、磷光部 分、發(fā)光部分、電化學發(fā)光部分、有色部分、和具有可檢測電子自旋共振、電容、介電常數或電導率的部分。可用一類或不止一類化學基團或部分來標記核苷酸。各核苷 酸可用相同化學基團或部分來標記。或者，各不同核苷酸可用不同化學基團或部分來標記。經標記核苷酸可為dNTP、 ddNTP、或dNTP與ddNTP 二者的混合物。未經標 記核苷酸可為dNTP、 ddNTP、或dNTP與ddNTP二者的混合物。可使用核苷酸的任一組合來納入核苷酸，包括(但不限于)未經標記脫氧核苷酸、 經標記脫氧核苷酸、未經標記雙脫氧核苷酸、經標記雙脫氧核苷酸、經標記與未經標 記脫氧核苷酸的混合物、經標記與未經標記雙脫氧核苷酸的混合物、經標記脫氧核苷 酸與經標記雙脫氧核苷酸的混合物、經標記脫氧核苷酸與未經標記雙脫氧核苷酸的混 合物、未經標記脫氧核苷酸與未經標記雙脫氧核苷酸的混合物、未經標記脫氧核苷酸 與經標記雙脫氧核苷酸的混合物、雙脫氧核苷酸類似物、脫氧核苷酸類似物、雙脫氧 核苷酸類似物與脫氧核苷酸類似物的混合物、磷酸化核苷類似物、2'-脫氧核苷酸-5'-三磷酸酯、和經修飾2，-脫氧核苷酸-5，-三磷酸酯。所有四種核苷酸都可用不同熒光基團來標記，此使得一個反應可在所有四種經標 記核苷酸的存在下進行?；蛘?，可在每個所關注基因座實施四個單獨"填補"反應；四 個反應中每個反應都含有一種不同的經標記核苷酸(例如ddATP*、 ddTTP*、 ddGTP*、 或ddCTP+，其中*指示經標記核苷酸)。每種核苷酸都可經不同化學基團或相同化學 基團標記。經標記核苷酸可為雙脫氧核苷酸或脫氧核苷酸。在另一實施例中，核苷酸可經熒光染料標記，包括(但不限于)熒光素、芘、7-甲氧基香豆素、瀑布藍(Cascade Blue).TM.、埃里克撒熒光素(Alexa FIur) 350、埃里克 撒熒光素430、埃里克撒熒光素488、埃里克撒熒光素532、埃里克撒熒光素546、埃 里克撒熒光素568、埃里克撒熒光素594、埃里克撒熒光素633、埃里克撒熒光素647、 埃里克撒熒光素660、埃里克撒熒光素680、 AMCA-X、 二烷基氨基香豆素、太平洋藍 (Pacific Blue)、莫利納藍(Marina Blue)、 BODIPY 493/503、 BODIPY Fl-X、 DTAF、俄 勒岡綠(Oregon Green) 500、丹酰(Dansyl)-X、 6-FAM、俄勒岡綠488、俄勒岡綠514、 羅丹明(Rhodamine)綠-X、羅德爾綠(Rhodol Green)、鈣黃綠素(Calcein)、曙紅(Eosin)、 溴乙啶、NBD、 TET、 2,,4，,5，,7，四溴磺基熒光素、BODIPY-R6G、 BODIPY國FI BR2、 BODIPY 530/550、 HEX、 BODIPY 558/568、 BODIPY-TMR-X. 、 PyMPO、 BODIPY 564/570、 TAMRA、 BODIPY 576/589、 Cy3、羅丹明紅-x、 BODIPY 581/591 、羧基X 羅丹明、德克薩斯紅(Texas Red)-X、 BODIPY-TR-X.、 Cy5、光譜藍(SpectrumAqua)、 光譜綠1號、光譜綠2號、光譜橙、光譜紅、或萘并熒光素。檢測部分可包括大量不同類型化合物，包括生物聚合物和合成聚合物。可以單獨 或聚合形式用作檢測部分的代表性生物單體單元包括肽核酸(PNA)氨基酸、非天然氨 基酸、核酸、糖類、碳水化合物、肽模擬物和核酸模擬物。優(yōu)選肽是天然存在的、穩(wěn) 定的并且相對較小的肽(例如神經肽物質P)。優(yōu)選氨基酸也包括具有簡單脂肪族側 鏈的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)、具有芳香族側鏈 的氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、和組氨酸)、具有含有氧和硫的側鏈的氨基酸(例如絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸)、具有含有羧基或酰胺基的側 鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)、和具有含有強堿性基 團的側鏈的氨基酸(例如賴氨酸和精氨酸)、以及脯氨酸。上述氨基酸的衍生物也可 視作單體單元。本文所用氨基酸衍生物是任何結構內含有經氨基取代羧酸的堿性氨基酸核心的化合物，其中代表性實例包括(但不限于)偶氮絲氨酸、氟丙氨酸、GABA、 鳥氨酸、正亮氨酸和環(huán)絲氨酸。也可使用衍生自上述氨基酸的肽作為單體單元。代表 性實例包括分子量大于約500道爾頓的天然存在的肽和合成肽二者，其中優(yōu)選者為約 500-5000道爾頓的肽。糖類的代表性實例包括核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳 糖和其它由具有2-7個碳的碳鏈組成的糖衍生物。代表性多糖包括上文所列通過糖苷 鍵連接的糖類單元的組合。 一般來說，任何一個檢測部分內聚合單元的序列并不重要； 總質量才是標記的關鍵性質。在本發(fā)明一實施例中，使肽檢測部分與核苷酸組合以產 生MDP庫。例如，使相同肽(例如物質P:具有以下序列的11氨基酸多肽ArgPro Lys Pro Gin Gin Phe Phe Gly Leu Met)與具有不同質量的核苷酸庫(例如所有可能的四 聚體)偶聯。本發(fā)明單體單元也可由核苷堿基化合物或核苷修飾組成。本文所用術語核苷堿基 是指結構內包括以下物質的任一部分嘌呤、啼啶、核酸、核苷、核苷酸或這些物質 中任一種的衍生物，例如經保護核苷堿基、嘌呤類似物、嘧啶類似物、亞葉酸類似物、 甲基膦酸酯衍生物、磷酸三酯衍生物、磷酸硼衍生物或硫代磷酸酯衍生物。本發(fā)明檢測部分也可包括任何有機或無機聚合物，其具有所限定質量值，在生物 分析期間保持水溶性并且可通過質譜法來檢測?？梢跃酆闲问接米髻|量單元的代表性 合成單體單元包括聚乙Z1醇、聚乙烯苯酚、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙二醇、聚吡咯、和其衍生物。所屬領域技術人員可容易地獲得眾多種聚合物。所述聚合物可由單一類 型的單體單元或單體單元的組合組成以產生混合聚合物。任何一個檢測部分內聚合單元的序列并不重要；總質量才是標記的關鍵性質。對于質量低于約500 Da的非揮發(fā)性檢測部分來說，通常需要顯著離子特征；代 表性實例包括季銨鹽的聚乙二醇寡聚體(例如R-(0-CHrCH2)n-N(CH3)3+.Cr)和羧酸 和鹽的聚乙二醇寡聚體(例如R-(0-CH2-CH2VC02—.Na+)。不揮發(fā)性檢測部分的實例通常包括分子量低于約500 Da的較小聚乙二醇寡聚體 和小肽(天然或經修飾)。在這些情況下，如同本文所考慮的所有情形一般，質量分 析不是通過電子連接來進行的。本發(fā)明檢測部分也可包括多種非揮發(fā)性和不揮發(fā)性非聚合有機化合物。非揮發(fā)性 有機化合物的代表性實例包括血紅素基團、染料、有機金屬化合物、類固醇、富勒烯 (fullerene)、類視色素、類胡蘿卜素和聚芳烴。優(yōu)選地在使用檢測用寡核苷酸上的多個檢測部分時避免信號重疊。除具有單電荷 的檢測部分呈現較大的主信號外，多電荷形式的檢測部分以及二聚形式的檢測部分也 可能呈現較大的主信號。單一檢測部分呈現的多個信號可能與第二檢測部分的主峰信號重疊或使其變模糊。因此在給定分析所用檢測部分的質量范圍中通常多電荷或二聚 體物質不會干擾所有檢測部分的檢測，例如在檢測部分的質量范圍中最小質量標記大 于最大檢測部分質量的一半。其它檢測部分包括業(yè)內熟知的堿基連接熒光素和猝滅劑。其可得自(例如)以下 公司生物技術公司(Life Technologies)(蓋瑟斯堡(Gaithersburg)， Md.)、西格瑪-吉 諾斯(Sigma-Genosys)(伍德蘭茲(The Woodlands), Tex.)、英杰公司(Invitrogen)(卡 爾斯巴德(Carlsbad)， Ca.)、或合成遺傳學公司(Synthetic Genetics)(圣地亞哥(San Diego)， Calif.)。在某些情況下，通過對寡核苷酸的合成后修飾將堿基連接熒光素納 入寡核苷酸中，所述寡核苷酸是用連接有堿基的反應性基團來合成。熒光素可連接至 糖或堿基的3' OH。堿基連接熒光素和/或猝滅劑可用于產生具有特定質量的獨特 MDP，然后可通過質譜法來檢測。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸包含不可解離(即不可降解或抗核酸酶)核苷 酸。如本文所述，本發(fā)明的酶可解離檢測用寡核苷酸中對核酸酶敏感的任何鍵。然而， 在目標結合部分(即檢測用寡核苷酸中與目標核酸雜交或互補的部分)中具有至少一 個抗核酸酶鍵的優(yōu)勢在于，檢測用寡核苷酸可在解離后產生單粒級種類的質量可區(qū)分 產物。特別優(yōu)選的不可解離(或抗解離)核苷酸是鎖核酸(LNA)。鎖核酸(也稱作不 可接近RNA)是經修飾RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分通常經連接2，與4'碳的 外部橋接修飾。在需要時可將LNA核苷酸與DNA或RNA堿基一起納入檢測用寡核 苷酸中。在一實施例中，將一或多種LNA納入檢測用寡核苷酸互補(或目標結合部分) 區(qū)域的5'末端中。鎖核糖構象可增強堿基堆積和主鏈預組裝，并由此顯著提高納入LNA的檢測用 寡核苷酸的熱穩(wěn)定性(解鏈溫度)?？赏ㄟ^置放兩個或更多個彼此相鄰的LNA進一步 增強這種效應。參見下文實例3。核酸酶可解離鍵可包括(例如)磷酸二酯鍵，并且抗核酸酶鍵可包括(例如)硫 代磷酸酯、次膦酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、或除亞磷酸衍生物以外的連接體， 例如酰胺和硼酸酯連接或烷基甲硅烷基二酯和肽核酸。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸包含可由酶解離的基團或連接?？擅复俳怆x的 釋放基團包括磷酸二酯或酰胺連接以及限制性內切核酸酶識別位點。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸包含小溝結合劑(MGB)，其中MGB根據具體 分析位于檢測用寡核苷酸的5'末端、中部、或3'末端。小溝結合蛋白質和/或具有偶聯 小溝結合劑(MGB)基團的經修飾堿基DNA探針與單鏈DNA目標形成極穩(wěn)定雙螺旋， 從而使得較短探針可用于基于雜交的分析中(例如美國專利第5,801,155號)。因此， 在某些實施例中，在檢測用寡核苷酸中(例如在探針3'末端處)也包括小溝結合劑基 團。文獻中已闡述多種適宜小溝結合劑。例如，參見美國專利第5,801,155號；威瑪和 徳萬(Wemmer & Dervan)，結構生物學新見(Current Opinon in Structural Biology), 7:355-361-(1997);沃克(Walker)等人，生物聚合物(Bi叩olymers) 44:323-334 (1997);齊默和華納特(Zimmer & Wahnert)，生物物理學與分子生物學進展(Prog. Biophys. Molec. Bio.)， 47:31-112 (1986);以及雷迪(Reddy)等人，藥理與治療(Pharmacol. Therap.)， 84:1-111 (1999)。通過連接體將MGB (以及其它部分)連接至寡核苷酸的適宜方法闡 述于(例如)美國專利第5,512,677號；第5,419,966號；第5,696,251號；第5,585,481 號；第5,942,610號和第5,736,626號中，所有這些文獻都是以引用方式并入本文中。在另一實施例中，檢測用寡核苷酸包含同位素編碼核苷酸。在一實例中，等位基 因特異性檢測用寡核苷酸包含與SNP等位基因雜交的同位素編碼核苷酸。同位素編碼 檢測用寡核苷酸繼而產生同位素編碼質量可區(qū)分產物。在一實施例中，僅生成單一同 位素編碼核苷酸或包含同位素編碼核苷酸的短片段(例如2個、3個或4個堿基)并 通過通過質譜法來檢測。在僅檢測到單一核苷酸時，由于不存在磷酸酯主鏈并且鹽加 合物形成降至最低，因此可簡化純化。例如，參見美國專利第6,613,509號(以引用方 式并入本文中)，其闡述將同位素納入核酸中。在另一實施例中，可修飾檢測用寡核苷酸以提高其解鏈溫度(Tm)。在一實施例中， 引物解鏈溫度經常在58-6(TC左右，并且檢測用寡核苷酸Tm經常比引物Tm高l(TC。 兩種引物的Tm經常大致相等。 G.層微滯麟會錄絲在某些實施例中，在結構中一或多個核酸可脫離目標的條件下實施檢測用寡核苷 酸的降解。在一實施例中，檢測用寡核苷酸的完全或部分脫離使得可形成多種質量可 區(qū)分產物。在某些實施例中，通過提高溫度來引發(fā)所述脫離，從而使得一或多個寡核 苷酸可不再與目標鏈雜交。在其它實施例中，所述脫離的發(fā)生是由于寡核苷酸的解離 僅產生在反應條件下不能結合目標鏈的解離產物。在優(yōu)選實施例中，在所選擇條件中 不論是否解離，寡核苷酸皆可連接(即雜交)和脫離目標鏈。在特別優(yōu)選的實施例中， 所選擇條件應使得可被解離的檢測用寡核苷酸的拷貝數超過目標核酸鏈拷貝數的量足 以使得在部分解離檢測用寡核苷酸脫離時，目標鏈連接檢測用寡核苷酸完整拷貝的可 能性大于其連接檢測用寡核苷酸解離拷貝的可能性。 i/.凝 分產激漸誠質量可區(qū)分產物是通過具體物理屬性或檢測性質來區(qū)分，包括(但不限于)長度、 質量、電荷、或荷質比。在優(yōu)選實施例中，檢測性質是質量。在另一相關實施例中， MDP可通過與物理屬性相關的特征來區(qū)分，包括(但不限于)質量、在MALDI-TOF 質譜法中的飛行時間。在一相關實施例中，來自一或多種檢測用寡核苷酸的MDP是 自質譜基質中釋放并選擇性解吸，從而使得非選擇性引物和檢測用寡核苷酸(即不存 在目標核酸)不解吸。對于這些實施例，MDP應比存于反應混合物中的檢測用寡核苷 酸或其它非MDP更有效地自質譜基質解吸。優(yōu)選質譜基質包括2，5-二羥基苯甲酸、a-氰基-4-羥基肉桂酸、3-羥基吡啶甲酸(3-HPA)、檸檬酸二銨(DAC)和其組合。在另一實 施例中，質譜基質可設計為用于分析蛋白質。蛋白質分析的實例性基質包括(但不限 于)DHB和CHCA。所述方法可另外包括使一或多種檢測用寡核苷酸片段(即MDP)與未解離或部 分解離檢測用寡核苷酸分離的額外步驟。分離可使用捕獲配體(例如生物素或其它親 和性配體)和與捕獲配體具有特異性結合活性的捕獲劑(例如抗生物素蛋白、抗生蛋 白鏈菌素、抗體、受體、與MDP互補的捕獲探針、或其功能性片段)來完成。MDP 可含有對捕獲劑具有特異性結合活性的捕獲配體。例如，可使用業(yè)內熟知的方法使 MDP發(fā)生生物素化或與親和性配體連接。參見下文實例4。也可使用捕獲配體和捕獲 劑來增加MDP剩余部分的質量，從而使得可自質譜儀可檢測的MDP質量范圍中將其 排除。在一實施例中，捕獲探針可具有通用擴增解離產物的通用引物。也可使用分離步驟自MDP移除鹽、酶、或其它緩沖組份?？墒褂弥T如色譜、凝 膠電泳或沉淀等若干種業(yè)內熟知的方法來提純樣品。例如，可使用尺寸排阻色譜或親 和色譜自樣品移除鹽。分離方法的選擇可取決于樣品量。例如，在獲得少量樣品或使 用小型化裝置時，可使用微量親和色譜分離步驟。此外，是否需要分離步驟以及分離 方法的選擇可取決于所用檢測方法。例如，基質輔助激光解吸/電離和電噴霧電離的效 率可通過自樣品移除鹽來改良。例如，鹽可自基質輔助激光解吸/電離的激光中吸收能 量并導致電離效率降低。質譜法是檢測本發(fā)明質量可區(qū)分產物并且由此鑒定和/或定量目標核酸的優(yōu)選方 法。質量可區(qū)分產物可在質譜儀中發(fā)生電離并且根據其質荷比在空間或時間上發(fā)生分 離。然后質譜儀計算與各離子相關的質量。因此，在提及質譜法時，出于簡潔目的可 使用術語質量來描述質荷比。質譜法是分離并鑒定分子的靈敏準確技術。通常，質譜儀具有兩個主要組件產 生離子的離子源和測量離子質荷比的質量選擇性分析儀，質荷比是這些離子質量的量 度并且可換算為質量。業(yè)內己知若干種電離方法并將其闡述于本文中。質量可區(qū)分產 物可在自檢測用寡核苷酸解離之前、期間或之后荷電。因此，欲通過質譜法測量的質 量可區(qū)分產物并非總是需要電荷，因為其可通過質譜法程序獲得電荷。在質譜法分析 中，可使用諸如電荷和檢測部分等MDP的可選組份來使MDP的質量增加。如本文所述，不同質譜方法(例如四極質譜、離子阱質譜、飛行時間質譜、氣相 色譜質譜和串聯式質譜)可使用不同離子源與質量分析儀的組合，此使得可靈活設計 定制檢測方案。此外，可將質譜儀程序化以自離子源將所有離子依序或同時傳遞至質 譜儀中。此外，可將質譜儀程序化以選擇具有特定質量的離子并在封阻其它離子的同 時將其傳遞至質譜儀中。在質譜儀中精確控制離子移動的能力使得在檢測方案中存在更多選擇，此在分析 (例如)來自多重實驗的大量質量可區(qū)分產物時是有利的。例如，在具有大量MDP 的多重實驗中，有利地可自類似報道分子群組中選擇個別報道分子，然后單獨分析所 述報道分子?；诳刂瀑|譜儀所檢測質量范圍的另一優(yōu)勢包括自所分析探針中排除未 解離或部分解離的經標簽探針，此可降低分析中的背景噪聲。質譜儀可分辨質量差異較小的離子并以高準確度測量離子質量。因此，由于質譜儀可區(qū)分甚至密切相關的標簽的質量，所以具有類似質量的MDP可一起用于同一實 驗中。因為所得報道分子標簽彼此之間是可區(qū)分的，因此使用質譜法達成的高分辨率 和質量準確度容許使用眾多種經標簽探針。在設計多重實驗時能夠使用眾多種經標簽 探針是一種優(yōu)勢。使用質譜法來檢測質量可區(qū)分產物的另一優(yōu)勢基于此類質量分析的高靈敏度。質 譜儀通過采用離子源形成的大部分離子和將這些離子通過質量分析儀有效傳遞至檢測 器中來達成高靈敏度。由于此高度靈敏度，甚至有限量的樣品也可使用質譜法來測量。這在多重實驗中可能是有利的，其中每個MDP種類的量都可較小。質譜方法為業(yè)內所熟知(參見柏林蓋姆(Burlingame)等人，分析化學，70:647R-716R (1998);肯特(Kinter)和謝爾曼(Sherman)，使用質譜的蛋白質測序和鑒定(Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry), 韋禾U跨學禾斗公司 (Wiley-Interscience)，紐約(New York) (2000))。與質譜法相關的基本方法是生成得自 樣品的氣相離子，并測量其質量。可使用質譜儀中生成的電磁場來精確控制氣相離子的移動。離子在這些電磁場屮 的移動與離子的m/z成比例，并且此為測量m/z并由此測量樣品質量的基礎。離子在 這些電磁場中的移動使得離子可被圍控并集中于其中，因此質譜法具有高靈敏度。在 m/z測量期間，以高效率將離子傳遞至記錄這些離子到達的粒子檢測器中。通過圖上 的峰來表示每種m/z下的離子數量，其中x軸是m/z并且y軸是相對豐度。不同質譜 儀具有不同分辨率，也就是分辨質量密切相關的離子之間的峰的能力。分辨率定義為 R=m/Am，其中m是離子質量并且Am是質譜中兩峰之間的質量差異。例如，分辨率 為1000的質譜儀可分辨m/z為100.0的離子與m/z為100.1的離子。若千類質譜儀可購得或可以各種配置來制造。 一般來說，質譜儀具有以下主要組件樣品入口、離子源、質量分析儀、檢測器、真空系統(tǒng)、和儀器控制系統(tǒng)、以及數 據系統(tǒng)。 一般以樣品入口、離子源、與質量分析儀的差異來定義儀器和其能力的類型。 例如，入口可為毛細管柱液相色譜源或可為直接探頭或平臺，例如用于基質輔助激光 解吸中者。例如，常用離子源為電噴霧(包括納米噴霧和微噴霧)或基質輔助激光解 吸。實例性質量分析儀包括四極質量過濾器、離子阱質量分析儀和飛行時間式質量分 析儀。離子形成過程是質譜分析的起點?？墒褂萌舾煞N電離方法并且電離方法的選擇取決于欲分析的樣品。例如，在分析多肽時，需要諸如電噴霧電離(ESI)等相對溫和的電 離程序。對于ESI，在產生強電場的高電勢下使含有樣品的溶液流經細針，從而產生 可引導至質譜儀中的高度帶電微滴細霧。其它電離程序包括(例如)快原子轟擊(FAB)， 其使用高能中性原子束來撞擊固體樣品，從而引起解吸和電離。基質輔助激光解吸電 離(MALDI)是使用激光脈沖撞擊已在UV吸收化合物基質中結晶的樣品的方法。業(yè)內 已知其它電離程序包括(例如)等離子體和輝光放電、等離子體解吸電離、共振電離、 和二次電離。質量可區(qū)分產物可在自經標簽探針解離之前、期間或之后發(fā)生電離。電噴霧電離(ESI)具有可用于本文所述本發(fā)明中的若干特性。例如，ESI可用于諸 如多肽等難于電離或氣化的生物分子中。此外，ESI的效率可極高，從而提供高靈敏 度測量的基礎。此外，ESI自溶液產生帶電分子，這對于分析溶液中的質量可區(qū)分產 物來說是很方便的。相反，諸如MALDI等電離程序需要在電離之前使樣品結晶。由于ESI可直接自溶液產生帶電分子，因此其與來自液體色譜系統(tǒng)的樣品相容。 例如，質譜儀可具有諸如HPLC等液體色譜系統(tǒng)的入口以使流份自色譜管柱流至質譜 儀中。此液體色譜系統(tǒng)與質譜儀的聯機布置有時稱作LC-MS。例如，可使用LC-MS 系統(tǒng)在質譜分析之前分離未解離或部分解離MDP與解離MDP。此外，可使用色譜在 質譜分析之前自MDP樣品移除鹽或其它緩沖組份。例如，使用聯機或脫機反相HPLC 管柱實施的樣品除鹽可用于提高電離過程的效率并由此改良通過質譜法檢測的靈敏 性?？墒褂酶鞣N質量分析儀，其與不同離子源配對。如所屬領域技術人員已知以及本 文中所述，不同質量分析儀具有不同優(yōu)勢。質譜儀和檢測方法的選擇取決于具體分析， 例如在生成少量離子用于檢測時可使用靈敏度較高的質量分析儀。下文闡述若干類型 的質量分析儀和質譜方法。離子遷移質譜法(IM)是向質譜法(MS)添加新維度的氣相分離方法。IM基于氣相 離子的碰撞截面將其分離并且可與飛行時間(TOF)質譜法偶聯以產生可用于鑒定和表 征蛋白質和肽的強效工具。因此，在質量可區(qū)分產物是蛋白質或肽時，IM-MS尤其可 用于本發(fā)明中。IM-MS由弗畢克(Verbeck)等人更詳細地論述于生物分子技術期刊 ( 7owr"a/ o/\Sz'omo/ecw/ar 7"ec/zm々we力(第13巻，第2期，56-61)中。四極質譜法采用四極質量過濾器或分析儀。此類質量分析儀是由四根桿組成，其 布置為兩組，每組有兩個電連接桿。將rf與dc電壓的組合施用至每對桿上，此產生 可使離子振蕩運動的電場，其自質量過濾器的起始端移動至末端。這些電場導致在一 對桿中產生高通質量過濾器，并在另一對桿中產生低通過濾器。高通與低通過濾器之 間的重疊留下可通過所述兩個過濾器并橫跨四極桿長度的限定m/z。當所有其它m/z 都具有不穩(wěn)定軌跡并且不留于質量過濾器中時，選擇此m/z并且其在四極質量過濾器中保持穩(wěn)定。通過斜坡改變所施加電場使得所選擇遞增m/z通過質量過濾器并到達檢 測器而得到質譜。此外，四極桿也可設置為通過僅施加rf電場含有并傳遞所有m/z的 離子。此使得四極桿可在質譜儀內需要離子傳遞但不使用質量過濾器的區(qū)域中用作透 鏡或聚焦系統(tǒng)。此可用于下文進一步闡述的串聯式質譜法中?？蓪⑺臉O質量分析儀以及本文所述其它質量分析儀程序化以分析限定m/z或質量 范圍。質譜儀的這種特性可用于本文所述本發(fā)明中。由于可在分析前獲知所解離質量 可區(qū)分產物的質量范圍，因此可將質譜儀編程為傳遞具有預期正確質量范圍的離子， 同時排除具有較高或較低質量范圍的離子。選擇質量范圍的能力可在分析中減少背景噪聲并由此提高信號-噪聲比。此外，可使用限定質量范圍來排除對任何未解離檢測用 寡核苷酸的分析，其具有比質量可區(qū)分產物高的質量。因此，質譜儀可完成內在分離步驟以及質量可區(qū)分產物的檢測和鑒定。離子阱質譜法采用離子阱質量分析儀。在這些質量分析儀中，施加電場以使得首 先陷獲所有m/z的離子并使其在質量分析儀中振蕩。離子通過諸如八極透鏡系統(tǒng)等聚 焦器件自離子源進入離子阱中。在陷獲區(qū)域發(fā)生離子陷獲，之后通過電極將其激發(fā)并 噴射至檢測器中。通過連續(xù)施加電壓來完成質量分析，所述電壓以將m/z遞增的離子 自阱噴射至檢測器中的方式來增大振蕩幅度。與四極質譜法相反，除具有所選m/z的 離子外，所有離子都保持在質量分析儀電場中。離子阱的一個優(yōu)勢在于，其具有極高 靈敏度，但應謹慎限制同時陷獲的離子數?？赏ㄟ^改變將離子注入阱中的時間來達成 對離子數的控制。離子阱的質量分辨率與四極質量過濾器類似，但離子阱具有較低m/z 限制。飛行時間質譜法采用飛行時間式質量分析儀。對于此m/z分析方法，首先通過在 電場中加速給予離子以固定量的動能(通過高電壓生成)。在加速后，離子進入無場 區(qū)域或"漂移"區(qū)域，其中其以與其m/z成反比的速率移動。因此，具有低m/z的離子 比具有高m/z的離子移動更快。測量離子移動穿過無場區(qū)域所需時間并使用其來計算 離子的m/z。在此類質量分析中一個考慮因素在于，所研究離子組是同時引入分析儀中。例如， 此類質量分析非常適合用于電離技術，例如以明確限定的短脈沖產生離子的MALDI。 另一考慮因素是控制動能量各異的離子產生的速度分布。使用較長飛行管、離子反射 器、或較高加速電壓可有助于將速度分布效應降至最低。飛行時間式質量分析儀具有 高靈敏度和比四極質量分析儀或離子阱質量分析儀寬的m/z范圍。由于不需要質量分 析儀掃描，因此使用此類質量分析儀也可快速獲得數據。氣相色譜質譜法為實時檢測目標提供良好解決方案。系統(tǒng)中的氣相色譜(GC)部分 將化學混合物分離為分析物脈沖(例如MDP)，并且質譜儀(MS)對所述分析物實施鑒 定和定量。串聯式質譜法可采用上述質量分析儀的組合。串聯式質譜儀可使用第一質量分析 儀根據離子的m/z對其進行分離以分離出所關注離子以供進一步分析。然后將分離出 的所關注離子分裂為片段離子(稱為碰撞活化解離或碰撞誘導解離)，并通過第二質 量分析儀分析片段離子。這些類型的串聯式質譜儀系統(tǒng)稱作空間串聯系統(tǒng)，因為兩個 質量分析儀通常通過碰撞室在空間上分離。串聯式質譜儀系統(tǒng)也包括時間串聯系統(tǒng)， 其中使用一個質量分析儀，但依序使用所述質量分析儀來分離離子，誘導碎裂，之后 實施質量分析。在空間范疇內串聯的質譜儀具有不止一個質量分析儀。例如，串聯四極質譜儀系 統(tǒng)可具有第一四極質量過濾器，之后是碰撞室，之后是第二四極質量過濾器，并且之后是檢測器。另一種布置是在第一質量分析儀中使用四極質量過濾器并且在第二質量 分析儀中使用飛行時間式質量分析儀，并以碰撞室分離兩個質量分析儀。業(yè)內己知其 它串聯系統(tǒng)，包括反射-飛行時間、串聯扇區(qū)和扇區(qū)-四極質譜法。在時間范疇內串聯的質譜儀具有一個質量分析儀，其在不同時間發(fā)揮不同功能。 例如，可使用離子阱質譜儀來陷獲所有m/z的離子。施用一系列rf掃描功能，其可自 阱噴射除所關注m/z離子外的所有m/z的離子。在分離所關注m/z后，施加rf脈沖以 造成離子與阱中氣體分子的碰撞，從而誘導離子碎裂。然后通過質量分析儀測量碎裂 離子的m/z值。離子回旋共振儀器(也稱作傅里葉(Fourier)變換質譜儀)是時間串聯 系統(tǒng)的實例?？赏ㄟ^控制在實驗各階段所選擇的離子來實施若干類型的串聯式質譜實驗。不同 類型的實驗采用不同操作模式，有時稱作質量分析儀的"掃描"。在稱作質譜掃描的第 一實例中，第一質量分析儀和碰撞室將用于質量分析的所有離子都傳遞至第二質量分 析儀中。在稱作產物離子掃描的第二實例中，在第一質量分析儀中根據質量選擇所關 注離子并隨后在碰撞室中使其碎裂。然后通過掃描第二質量分析儀對所形成離子實施 質量分析。在稱作前體離子掃描的第三實例中，掃描第一質量分析儀以將經質量分析 的離子依序傳遞至碰撞室中進行碎裂。第二質量分析儀根據質量選擇所關注產物離子 以供傳遞至檢測器中。因此，檢測器信號是可碎裂為共有產物離子的所有前體離子的 結果。其它實驗模式包括中性脫失掃描，其中在質量掃描中對恒定質量差異加以考慮。 當在如同多重實驗的單一實驗中測量眾多種報道分子標簽時，可有利地使用這些不同 串聯式質譜法掃描程序。在典型應用中，反應期間生成的質量可區(qū)分產物的數量是根據循環(huán)閾值(Ct)數值 來確定的，其代表生成可檢測量核酸所需要的循環(huán)數。Ct的測定為業(yè)內所熟知。簡單 來說，在PCR期間，隨著所形成擴增子的數量增加，信號強度增加至可測量水平并在 后續(xù)循環(huán)中當反應進入非對數期時到達平臺期。通過在反應對數期期間相對于循環(huán)數 繪制信號強度，可推斷出獲得可測量信號的特定循環(huán)，并且在開始PCR之前使用其來 計算目標數量。測定Ct的實例性方法闡述于海德(Heid)等人，基因組方法(Ge"ome AfeAoc/力，6:986-94， 1996中，參照水解探針部分。在定量中，可選擇使用對照，其提供與存在或引入的目標數量有關的信號。容許 將相對質量信號轉換為絕對數量的對照是通過在質量可區(qū)分產物檢測之前將已知數量 的質量標簽或質量標記添加至各樣品中來達成。例如，參見丁(Ding)和康托爾，美國 國家科學院學報，2003年3月18日；100(6):3059-64，其闡述實施定量基因表達分析 的方法，其中對照核苷酸含有人工單一核苷酸多態(tài)性以使其有別于所關注基因?？墒?用不干擾MDP檢測的任何質量標簽來標準化質量信號。所述標準品優(yōu)選地具有與樣 品中任一分子標簽不同的分離特性，并且可具有相同或不同質量譜特征。 /.教^激*試^/盒在另一方面中，本發(fā)明包括實施本發(fā)明方法的試劑盒，例如包含引物(例如通用 引物)和檢測用寡核苷酸以檢測或測量一或多種目標核酸的試劑盒。所述試劑盒另外 包含酶和適宜緩沖劑以實施擴增反應，實施擴增反應解離并釋放檢測用寡核苷酸或其 片段以供檢測。在某些實施例中，試劑盒可包括一或多種可產生一或多種質量可區(qū)分產物的檢測用寡核苷酸、和一或多種與質譜法相關的試劑，后者可為(例如) 一或多 種質量標準品(例如用作內部標準)、基質輔助激光解吸電離(MALDI)質譜的基質(例 如3-羥基吡啶甲酸)、核酸結合樹脂(例如C"樹脂)、和/或調節(jié)核酸的溶液(例如鹽溶液)。實例下文所提供實例闡釋而非限制本發(fā)明。澄粼朋D著歷游/A^子/0實施檢測分析以檢測恒河猴D基因的外顯子10區(qū)域。根據具體說明部分實施PCR 引物和檢測用寡核苷酸的設計。在具體分析中，檢測用寡核苷酸攜載由6個腺嘌呤組 成的非互補5，突出端。由于樣品中存在目標序列(RhD的外顯子lO)，因此PCR引 物和檢測用寡核苷酸可與目標雜交。在擴增期間，檢測用寡核苷酸通過自PCR引物上 游延伸的DNA聚合酶的5'核酸酶活性發(fā)生降解。在降解期間，釋放并通過質譜分析 明確鑒定包括5，polyA標簽的質量可區(qū)分產物(MDP)(參見圖8)。這些質量信號的檢 測證實了目標核酸的存在。引物和檢測用寡核苷酸序列使用以下引物來擴增恒河猴D(RhD)基因外顯子10內的部分序列 正向PCR引物5' CCTCTCACTGTTGCCTGCATT 3 ， 反向PCR引物5' AGTGCCTGCGCGAACATT 3'以下檢測用寡核苷酸與目標雜交并降解而產生通過質譜法檢測的MDP:檢測用寡核苷酸5' AAAAAAATTGCTGTCTGATCTTTATCCTCCGTTCCCT 3' PCR混合物以終濃度900 nM的PCR引物和200 nM的檢測用寡核苷酸來使用PCR引物。PCR混合物也含有20 ng的基因組DNA (RhD+單個基因)、25 pi 2x PCR預混 合物(Mastermix)(包括緩沖劑和AmpliTaq Gold酶的ABI TaqMan⑧PCR預混合物) 和水，終體積為50 |il。在96孔ABGene微量滴定板中實施反應。循環(huán)條件在95。C下將PCR混合物活化10分鐘，然后對其實施40次在95'C下保持15秒 并在60'C下保持1分鐘的循環(huán)。 質譜分析的樣品制備將10 pl PCR產物轉移至新96孔微量滴定板中并將20 ^含有15 mg載銨離子交 換樹脂(清潔樹脂(CleanResin)， SEQUENOM )的水添加至PCR產物中。將反應混 合物培養(yǎng)15分鐘并緩慢旋轉。使用針形工具器件(毫微分散器(Nanodispenser)， SEQUENOM )將15 nl分析 物轉移至小型化芯片陣列(SpectroCHIP⑧，SEQUENOM⑧)上。質譜分析使用臺式線性MALDI-TOF質譜儀(集成分析儀(Compact Analyzer)， SEQUENOM )來實施數據釆集和分析。在每個波譜中積累至少20次激光照射。通 過外顯子IO特異性檢測用寡核苷酸的質量可區(qū)分產物(MDP)來鑒定目標核酸(在此處 為RhD基因的外顯子10)的存在。MALDI-TOF MS波譜例示RhD基因外顯子10的 檢測(參見圖8)。當在擴增期間存在目標序列(RhD基因的外顯子lO)時以及當在 擴增期間檢測用寡核苷酸可與目標核酸雜交時，僅生成三種MDP。 頻2:湖幕麟舒J縱,/實施檢測分析以檢測恒河猴D基因的外顯子5區(qū)域。根據具體說明部分實施PCR 引物和檢測用寡核苷酸的設計。在具體分析中，檢測用寡核苷酸攜載由8個腺嘌呤組 成的非互補5，突出端。由于樣品中存在目標序列(RhD的外顯子5)，因此PCR引物 和檢測用寡核苷酸可與目標雜交。在擴增期間，檢測用寡核苷酸通過自PCR引物上游 延伸的DNA聚合酶的5'核酸酶活性發(fā)生降解。在降解期間，釋放并通過質譜分析明 確鑒定包括5，polyA標簽的質量可區(qū)分產物(MDP)(參見圖9)。這些質量信號的檢測 證實了目標核酸的存在。引物和檢測用寡核苷酸序列使用以下引物來擴增恒河猴D(RhD)基因外顯子5內的部分序列 正向PCR引物5' CGCCCTCTTCTTGTGGATG 3' 反向PCR引物5 ， GAACACGGCATTCTTCCTTTC 3'以下檢測用寡核苷酸與目標雜交并發(fā)生降解而產生通過質譜法檢測的MDP:檢測用寡核苷酸5， AAAAAAAATCTGGCCAAGTTTCAACTCTGCTCGCT 3, PCR混合物以終濃度900 nM的PCR引物和200 nM的檢測用寡核苷酸來使用PCR引物。 PCR混合物也含有20 ng的基因組DNA (RhD+單個基因)、25 |al 2x PCR預混合物(包括緩沖劑和AmpliTaq Gold酶的ABI TaqMan PCR預混合物)和水，終體積為50 pl。在96孔ABGene微量滴定板中實施反應。 循環(huán)條件在95。C下將PCR混合物活化10分鐘，然后對其實施40次在95'C下保持15秒 并在60'C下保持1分鐘的循環(huán)。 質譜分析的樣品制備將10 pi PCR產物轉移至新96孔微量滴定板中并將20 pi含有15 mg載銨離子交 換樹脂(清潔樹脂，SEQUENOM公司⑧)的水添加至PCR產物中。將反應混合物培 養(yǎng)15分鐘并緩慢旋轉。使用針形工具器件(毫微分散器，SEQUENOM公司⑧)將15nl分析物轉移至小 型化芯片陣列(SpectroCHIPTM， SEQUENOM公司⑧)上。質譜分析使用臺式線性MALDI-TOF質譜儀(集成分析儀，SEQUENOM公司⑧)來實施 數據采集和分析。在每個波譜中積累至少20次激光照射。通過外顯子5特異性檢測用 寡核苷酸的質量可區(qū)分產物(MDP)來鑒定目標核酸(在此處為RhD基因的外顯子5) 的存在。MALDI-TOF MS波譜例示RhD基因外顯子5的檢測(參見圖9)。當在擴 增期間存在目標序列(RhD基因的外顯子5)時以及當在擴增期間檢測用寡核苷酸可 與目標核酸雜交時，僅生成三種MDP。70邀,I診存丄A^浙3'巡辦身腐^/游經錄像澄粼賴篡樣芽麼據定絲激游y實施檢測分析以檢測對Y染色體的十個特定區(qū)域。使用業(yè)內熟知方法將PCR引 物和檢測用寡核苷酸設計為符合本發(fā)明所述標準。例如，將檢測用寡核苷酸設計為具 有比PCR引物高約l(TC的解鏈溫度。此外，將polyA/G尾添加至長度和序列可變的 檢測用寡核苷酸的5'末端以在MALDI-TOF MS上間隔并分辨在2000-6000 Da范圍內的解離產物。在此特定多重分析中，檢測用寡核苷酸攜載由多個腺嘌呤和/或鳥嘌呤組成的非互 補5'突出端。在存在Y染色體的樣品中(例如雄性樣品)，PCR引物和檢測用寡核苷 酸與目標雜交。在擴增期間，檢測用寡核苷酸通過自PCR引物上游延伸的DNA聚合 酶的5'核酸酶活性發(fā)生降解。在降解期間，十次分析中成功九次，并且釋放包括 5'-polyA或polyA/G標簽的質量可區(qū)分產物(MDP)并通過MALDI-TOF質譜分析明確 鑒定。這些質量信號的檢測證實了目標核酸的存在。在不存在Y染色體模板的樣品中(例如雌性樣品或陰性對照(NTC辨品)，PCR 引物和檢測用寡核苷酸不與目標雜交，并且未檢測到5'-polyA或polyA/G標簽。引物和檢測用寡核苷酸序列下文所提供的檢測用寡核苷酸與目標雜交并降解而產生通過質譜法檢測的MDP。所述各序列可含有代表鎖核酸(LNA)的"+"或分別代表引入磷酸酯基團和倒轉脫氧胸腺嘧啶的"/3Phos/"和"/InvdT/"。鎖核酸(LNA)與其互補體極穩(wěn)定地結合并且具有相對于新生脫氧核苷酸高度降低的解離率。此可用于控制解離點，并由此產生均一解離產物。可通過置放兩個彼此相鄰的LNA來進一步增強此效應。引入一或多個磷酸酯基團或倒轉脫氧胸腺嘧啶可用于封阻檢測用寡核苷酸互補部分的3'末端，此可在循環(huán)期間阻止檢測用寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸。所述不期望延伸可具有若干種可能的負面效應，包括在5'尾解離發(fā)生后對目標的競爭性結合和諸如dNTP等PCR反應組份耗盡。使用以下引物來擴增BPY2基因內的部分序列(BPY2-2分析) 正向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGATATTCTAGACTCTTCCAAGCC- 3' 反向PCR引物5'-ACGTTGGATGAAAAAGAGGAGTGTCACTCTAC-3' 檢測用寡核苷酸(在不同分析中單獨測試多種檢測用寡核苷酸)5 ， - AAAAAAAAAAAAAT+T+TGC AAAGCCCAGCACTGA-3'其中+代表鎖核酸(LNA)或5'陽AAAAAAAAAAAAAT+T+TGC AAAGCCCAGCACTGA/3Phos/-3'或使用以下引物來擴增CDY1基因內的第二部分序列(CDY1-1分析) 正向PCR引物5 ，陽ACGTTGGATGATGTTAGCCAGGATTGTCTCG- 3' 反向PCR引物5'-ACGTTGGATGACACCTGTAATCCCAGCATTTT-3，檢測用寡核苷酸5 ， - AAA AA AA A AG+C+TGAGGTGCTTGGATC ACGA-3'或5 ，-AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA/3Phos/-3'或5 ， -AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATC ACGA/3 lnvdT/-3'使用以下引物來擴增CDY1基因內的部分序列(CDYl-2分析)正向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGCAATCCCGTGTCTTTCCT- 3'反向PCR引物5，-ACGTTGGATGGAACCAAATACTGTGTATTCCC-3'檢測用寡核苷酸5 ， -AAAAAAAAA+T+GGCTTCCC AGGAGTTTGAGG-3'或5 ，-AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG/3Phos/陽3'或5 ，-AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG/31nvdT/-3 ， 使用以下引物來擴增Y染色體CYORF14區(qū)域內的部分序列(CYORF14-3分析): 正向PCR引物5 ， -ACGTTGGATGTTTACATCAACAAACAAGGG - 3' 反向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGCTACTGGGTCTAGCCTTATAAT-3 ，檢測用寡核苷酸5 ，-AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTCATTTGCT隱3'或5 ，誦AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTC ATTTGCT/3Phos/-3'或使用以下引物來擴增PRY基因內的部分序列(PRY-2分析)正向PCR引物5 ， -ACGTTGGATGTCACTGGGATCAGGACAGAC國3'反向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGAGAGGAAACTGCTTCCCAAAC-3'檢測用寡核苷酸
5 ，-AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT-3'
或
5 ，-AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT/3Phos/-3'
或
使用以下引物來擴增RBMY1A1基因內的部分序列(RBMY1A1-1分析) 正向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGGATGGGTTTTCTATGTGTGGG-3' 反向PCR弓I物5 ，- ACGTTGGATGTGAGTCTCTTAATAGCACTGAG-3'
檢測用寡核苷酸
5 ， - AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTC AGTGGGGA-3'
或
5 ，-AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTC AGTGGGGA/3Phos/-3'
或
5 ， - AAAAAAAA A A A+C+GGGAGGAGTC AGTGGGGA/3 lnvdTA3' 使用以下引物來擴增RBMY1A1基因內的第二部分序列(RBMYlAl-2分析) 正向PCR弓I物5，-ACGTTGGATGAGCTAATTACTCATTTCCCCAG-3' 反向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGAGACTCAACAGGACAAGAGAC-3 ，
檢測用寡核苷酸
或 或
5'國
使用以下引物來擴增RBMY2基因內的部分序列(RBMY2-1分析) 正向PCR引物5 '-ACGTTGGATGTGCAGAAAAGACCAAAGGAATC-3 ， 反向PCR引物5 ， - ACGTTGG ATGAT AGATGCC AC ATA ACTTGAGC-3'
檢測用寡核苷酸
5 ， - AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATC AGGGAGC ACCC-3'
或
5 ， -AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATC AGGGAGCACCC/3Phos/-3'
或
5 ， - AAA AAAAAAAA A+C+GAGGATC AGGGAGC ACCC/3 lnvdT/-3' 使用以下引物來擴增XKRY基因內的部分序列(XKRY-1分析) 正向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGAACGTTTTACCGAAGTGTTGT陽3 ， 反向PCR引物5 ， -ACGTTGGATGAAGCCAAAGGCTAATATGTAGG-3 ，檢測用寡核苷酸
5 ，陽AAAAAAAAAAAAT+G+ATGAACTACACGGCAATTATTGA-3 ，
或
'-3，
使用以下引物來擴增XKRY基因內的第二部分序列(XKRY-3分析) 正向PCR引物5 ， -ACGTTGGATGAGGCAAAATGTACTATGCCTAC-3 ， 反向PCR引物5 '-ACGTTGGATGTCCTGTAGTCTCAACTATTCAG-3'
檢測用寡核苷酸
5 ，-AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG陽3'
或
5 ，-AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG/3Phos/-3'
或
5 ，-AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG/31nvdT/-3'
PCR混合物
以終濃度900 nM的PCR引物和250 nM的檢測用寡核苷酸來使用PCR引物。 PCR混合物也含有25 ng的基因組DNA (雄性或雌性)、25 pl 2x PCR預混合物 (包括緩沖劑和AmpliTaq Gold酶的ABI TaqMan PCR預混合物)和水，終體積為50 pl。
在96孔ABGene微量滴定板中實施反應。 循環(huán)條件
在95"C下將PCR混合物活化10分鐘，然后對其實施55次在95'C下保持30秒、 在6(TC下保持30秒并在72"下保持1分鐘的循環(huán)。 質譜分析的樣品制備
將10 pi PCR產物轉移至新96孔微量滴定板中并將20 pl含有15 mg載銨離子交 換樹脂(清潔樹脂，SEQUENOM公司⑧)的水添加至PCR產物中。將反應混合物培 養(yǎng)15分鐘并緩慢旋轉。
使用針形工具器件(毫微分散器，SEQUENOM公司⑧)將15nl分析物轉移至小 型化芯片陣列(SpectroCHIPTM， SEQUENOM公司⑧)上。
質譜分析
使用臺式線性MALDI-TOF質譜儀(集成分析儀，SEQUENOM公司⑧)來實施 數據采集和分析。在每個波譜中積累至少20次激光照射。通過每個引物組的特異性檢 測用寡核苷酸的質量可區(qū)分產物(MDP)來成功鑒定目標核酸(此處是存于Y染色體上 的十個特定區(qū)域中的九個)的存在。MALDI-TOF MS波譜例示10重反應的90%檢測 率。當在擴增期間存在目標序列(Y染色體特定區(qū)域)時以及當在擴增期間檢測用寡核苷酸可與目標核酸雜交時，成功生成十種MDP。
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實施檢測分析以檢測對Y染色體的十個特定區(qū)域。分析包括額外提純步驟，其使 用生物素化檢測用寡核苷酸和涂布有抗生蛋白鏈菌素的磁珠來捕獲MDP。使用業(yè)內熟 知方法將PCR引物和檢測用寡核苷酸設計為符合本發(fā)明中所述標準。例如，將檢測用 寡核苷酸設計為解鏈溫度比PCR引物高約l(TC。
在此特定多重分析中，檢測用寡核苷酸攜載由多個腺嘌呤和/或鳥嘌呤組成的非互 補5'突出端。在存在Y染色體的樣品中(例如雄性樣品)，PCR引物和檢測用寡核苷 酸與目標雜交。在擴增期間，檢測用寡核苷酸通過自PCR引物上游延伸的DNA聚合 酶的5'核酸酶活性發(fā)生降解。在降解期間，釋放十種包括5'-polyA或polyA/G標簽的 質量可區(qū)分產物(MDP)中的九種并通過MALDI-TOF質譜分析明確鑒定。這些質量信 號的檢測證實在十次分析中有九次存在目標核酸。
在不存在Y染色體模板的樣品中(例如雌性樣品或陰性對照(NTC)樣品)，PCR 引物和檢測用寡核苷酸不與目標雜交，并且未檢測到5，-polyA或polyA/G標簽。己證 實，通過整個過程實施單一反應、并且隨后匯集反應物同樣可成功地在單一芯片元件 上檢測所有分析。
下文所提供的檢測用寡核苷酸與目標雜交并降解而產生通過質譜法檢測的MDP。 所述各序列可含有代表鎖核酸(LNA)的"+"或分別代表引入磷酸酯基團和倒轉脫氧胸 腺嘧啶的"/3Phos/"和"/InvdT/"。同樣，檢測用寡核苷酸也可含有代表生物素的"Biosg/"。 使用以下引物來擴增BPY2基因內的部分序列(BPY2-2分析) 正向PCR引物5 ， -ACGTTGGATGATATTCTAGACTCTTCCAAGCC- 3' 反向PCR引物5，-ACGTTGGATGAAAAAGAGGAGTGTCACTCTAC-3， 檢測用寡核苷酸(在不同分析中單獨測試多種檢測用寡核苷酸) 5'國5Biosg/AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA-3'
或
5 ，隱5Biosg/AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA/3Phos/隱3'
或
5 ，國5Biosg/AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA/31nvdT陽3' 使用以下引物來擴增CDY1基因內的第二部分序列(CDY1-1分析) 正向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGATGTTAGCCAGGATTGTCTCG- 3' 反向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGACACCTGTAATCCCAGCATTTT陽3'
檢測用寡核苷酸
5 ，陽5Biosg/AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA隱3'
或
5 ，-5Biosg/AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA/3Phos/-3'或
5，-5Biosg/AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA/31nvdT/-3' 使用以下引物來擴增CDY1基因內的部分序列(CDYl-2分析) 正向PCR弓I物5，-ACGTTGGATGCAATCCCGTGTCTTTCCT- 3' 反向PCR引物5，-ACGTTGGATGGAACCAAATACTGTGTATTCCC-3 ，
檢測用寡核苷酸
5'陽5Biosg/AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG陽3，
或
5 ，-5Biosg/AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG/3Phos/-3'
或
5，-5Biosg/AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG/31nvdT/-3' 使用以下引物來擴增Y染色體CYORF14區(qū)域內的部分序列(CYORF14-3分析): 正向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGTTTACATCAACAAACAAGGG - 3 ， 反向PCR引物5 '-ACGTTGGATGCTACTGGGTCTAGCCTTATAAT-3'
檢測用寡核苷酸
5 ，-5Biosg/AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTCATTTGCT-3'
或
5，-5Biosg/
或
5,-5Biosg/
使用以下引物來擴增PRY基因內的部分序列(PRY-2分析) 正向PCR引物5，-ACGTTGGATGTCACTGGGATCAGGACAGAC墨3' 反向PCR引物5，-ACGTTGGATGAGAGGAAACTGCTTCCCAAAC-3，
檢測用寡核苷酸
5 '-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT-3'
或
5 ，-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT/3Phos/-3'
或
使用以下引物來擴增RBMY1A1基因內的部分序列(RBMY1A1-1分析) 正向PCR引物5，-ACGTTGGATGGATGGGTTTTCTATGTGTGGG-3， 反向PCR引物5'- ACGTTGGATGTGAGTCTCTTAATAGCACTGAG-3'
檢測用寡核苷酸
5 ，-5Biosg/AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA-3'
或5 ，-5Biosg/AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA/3Phos/陽3'
或
5 ，-5Biosg/AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA/31nvdT/-3' 使用以下引物來擴增RBMY1A1基因內的第二部分序列(RBMY1A1-2分析) 正向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGAGCTAATTACTCATTTCCCCAG陽3' 反向PCR引物5 ，陽ACGTTGGATGAGACTCAACAGGACAAGAGAC-3 ，
檢測用寡核苷酸
5'-5Biosg
5'-5Biosg/ hos/-3'
5，隱5Biosg/ vdT/陽3'
使用以下引物來擴增RBMY2基因內的部分序列(RBMY2-1分析) 正向PCR弓I物5'-ACGTTGGATGTGCAGAAAAGACCAAAGGAATC-3， 反向PCR引物5'-ACGTTGGATGATAGATGCCACATAACTTGAGC-3 ，
檢測用寡核苷酸
5 ，-/5Biosg/AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC-3 ，
或
5 ，-/5Biosg/AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC/3Phos/-3'
或
5' -/5Biosg/AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC/31nvdT/-3' 使用以下引物來擴增XKRY基因內的部分序列(XKRY-1分析) 正向PCR引物5 '-ACGTTGGATGAACGTTTTACCGAAGTGTTGT扁3， 反向PCR引物5，-ACGTTGGATGAAGCCAAAGGCTAATATGTAGG-3'
檢測用寡核苷酸
5 ，陽/5Biosg/AAAAAAAAAAAAT+G+ATGAACTACACGGCAATTATTGA-3'<formula>formula see original document page 39</formula>
使用以下引物來擴增XKRY基因內的第二部分序列(XKRY-3分析) 正向PCR引物5 ， -ACGTTGGATGAGGCAAAATGTACTATGCCTAC-3 ，反向PCR引物5 ，-ACGTTGGATGTCCTGTAGTCTCAACTATTCAG-3 ，
檢測用寡核苷酸
5 ，-/5Biosg/AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG-3'
或
5 ，-/5Biosg/AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG/3Phos/-3'
或
5 ，-/5Biosg/AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG/31nvdT/-3'
PCR混合物
以終濃度900 nM的PCR引物和250 nM的檢測用寡核苷酸來使用PCR引物。 PCR混合物也含有25 ng的基因組DNA (雄性或雌性)、25 |il 2xPCR預混合物 (包括緩沖劑和AmpliTaq Gold酶的ABI TaqMan PCR預混合物)和水，終體積為50 pl。
在96孔ABGene微量滴定板中實施反應。 循環(huán)條件
在95'C下將PCR混合物活化10分鐘，然后對其實施55次在95'C下保持30秒、 在6(TC下保持30秒并在72。C下保持1分鐘的循環(huán)。
使用涂布有抗生蛋白鏈菌素的磁珠(英杰公司⑧)來制備質譜分析的樣品
磁珠制備
1. 混合磁珠與50 pi等分試樣-離心并移除上清液
2. 添加75pl洗滌緩沖液(已提供)-離心并移除上清液
磁珠結合
3. 向磁珠添加25 nl結合緩沖液(已提供)
4. 向含有磁珠的管中添加35 |al超純水
5. 向含有磁珠的管中添加15 pl PCR/核酸酶反應物
6. 在環(huán)境溫度下旋轉15分鐘 磁珠洗滌
7. 旋轉并移除上清液直至干燥
8. 用lx洗滌緩沖液(已提供)洗滌
9. 旋轉并移除上清液 自磁珠洗脫產物
10. 向磁珠添加25 pl 25% NH4OH (新制備)
11. 在60'C下培養(yǎng)10分鐘
12. 旋轉并將上清液移出至新管中(含有產物)
13. 在環(huán)境溫度下開蓋振蕩60分鐘
使用針形工具器件(毫微分散器，SEQUENOM公司⑧)將15nl分析物轉移至小 型化芯片陣列(SpectroCHIPTM， SEQUENOM公司⑧)上。質譜分析
使用臺式線性MALDI-TOF質譜儀(集成分析儀，SEQUENOM公司⑧)來實施 數據采集和分析。在每個波譜中積累至少20次激光照射。通過每個引物組的特異性檢 測用寡核苷酸的質量可區(qū)分產物(MDP)來鑒定目標核酸(此處是存于Y染色體上的十 個特定區(qū)域中的九個)的存在。MALDI-TOF MS波譜例示10重反應的90%檢測率。 當在擴增期間存在目標序列(Y染色體特定區(qū)域)時以及當在擴增期間檢測用寡核苷 酸可與目標核酸雜交時，僅生成九種MDP。實施單重擴增，之后匯集5)al的各反應物， 獲得類似結果。
氺 * *
每個專利、專利申請案、公開案和本文所引用文獻都是全文以引用方式并入本文 中。引用上述專利、專利申請案、公開案和文獻并不代表認可上述任一文獻都是相關 的先前技術，也不代表對這些出版物或文獻中的內容或日期的認可。
可在不背離本發(fā)明基本方面的情況下對上文加以修改。盡管已經參照一或多個具 體實施例十分詳細地闡述了本發(fā)明，但所屬領域技術人員應了解，可對本申請案中具 體揭示的實施例進行改變，而且這些修改和改良都在本發(fā)明范圍和精神內。
可在不存在本文未具體揭示的任何要素的情況下以適宜方式實踐本文說明性闡 述的本發(fā)明。因此，例如，在本文中每一情形中，詞語"包含"、"基本上由…組成"和"由...
組成"中的任一者都可用其它兩個詞語中的任一個來替代。所用詞語和表達是用作說明 性詞語而非限制性，并且使用所述詞語和表達并不排除所示和所述性質或其部分的任
何等效形式，并且可在本發(fā)明所主張范圍內作出各種修改。除非上下文中明確闡述一 種要素或不止一種要素，否則詞語"一"是指其所修飾的一種或多種要素(例如"一種引 物"可意指一或多種引物)。本文所用詞語"約"是指數值有時在基礎參數上下10%范圍 內(即加或減10%)，數值有時在基礎參數上下5%范圍內(即加或減5%)，數值有 時在基礎參數上下2.5%范圍內(即加或減2.5%)，或數值有時在基礎參數上下1%范 圍內(即加或減1%)，并且有時是指無變化的參數。例如，"約IOO個核苷酸"的長度 可包括介于90個核苷酸與110個核苷酸之間的各個長度。因此應了解，盡管已通過代 表性實施例和可選性質具體揭示本發(fā)明，但所屬領域技術人員仍可采用本文所揭示概 念的修改和變化形式，并且所述修改和變化形式視為在本發(fā)明范圍內。 本發(fā)明實施例闡述于上文權利要求中。
權利要求
1、一種檢測樣品中目標核酸序列的方法，其包含以下步驟(a)使包含目標核酸的樣品與以下物質接觸(i)寡核苷酸引物，其包含3’末端和5’末端并且含有與所述目標核酸中的一個區(qū)域互補的序列，和(ii)檢測用寡核苷酸，其包含3’末端和5’末端并且含有與所述目標核酸序列第二區(qū)域互補的序列，由此在雜交條件下形成(iii)雙螺旋混合物，其中所述雙螺旋包含與所述寡核苷酸引物和所述檢測用寡核苷酸發(fā)生復性的所述目標核酸，從而使得所述寡核苷酸引物的3’末端位于所述檢測用寡核苷酸5’末端的上游；(b)在足以解離并釋放所述復性檢測用寡核苷酸或其至少一個片段的條件下使步驟(a)的所述樣品暴露于解離劑中，由此產生一或多種質量可區(qū)分產物；和(c)通過質譜法檢測所述一或多種質量可區(qū)分產物，由此檢測在所述樣品中是否存在所述目標核酸序列。
2、 一種檢測樣品中目標核酸序列的擴增方法，其包含以下步驟(a) 向含有所述樣品的擴增反應物中提供一組寡核苷酸引物，其中第一引物含有 與所述目標核酸序列一條鏈中的一個區(qū)域互補的序列，并且第二引物含有與所述目標 核酸序列第二鏈中的一個區(qū)域互補的序列；(b) 提供至少一種檢測用寡核苷酸，其含有與所述目標核酸中的一個區(qū)域互補的 序列，其中所述檢測用寡核苷酸在結合有步驟(a)的所述寡核苷酸引物的所述目標核酸 序列內發(fā)生復性，由此產生復性雙螺旋，且此外其中所選擇每一寡核苷酸引物都與其 互補模板發(fā)生復性，所述模板位于與所述相同核酸鏈發(fā)生復性的任一檢測用寡核苷酸 上游；(c) 在以下擴增循環(huán)步驟容許的條件下采用具有5'-3'核酸酶活性的酶作為模板依 賴性聚合試劑來擴增所述目標核酸序列(i)使寡核苷酸引物和檢測用寡核苷酸與所述 目標序列內所含模板核酸序列發(fā)生復性，和(ii)延伸所述引物寡核苷酸，其中所述核 酸擴增酶合成引物延伸產物，而且所述核酸擴增酶的所述5'-3'核酸酶活性同時自所述 包含檢測用寡核苷酸和其互補模板核酸序列的復性雙螺旋釋放質量可區(qū)分產物，由此 產生一或多種質量可區(qū)分產物；和(d) 通過質譜法檢測所述一或多種質量可區(qū)分產物，由此確定在所述樣品中是否 存在所述目標序列。
3、 一種檢測目標核酸的方法，其包含以下步驟-(a) 使寡核苷酸引物與所述目標核酸發(fā)生復性，使檢測用寡核苷酸與所述相同目 標核酸發(fā)生復性；(b) 引入酶以沿所述檢測用寡核苷酸方向延伸所述寡核苷酸引物，其中所述酶解 離并由此釋放至少一部分所述檢測用寡核苷酸，由此產生一或多種質量可區(qū)分產物；和(C)通過質譜法檢測所述一或多種質量可區(qū)分產物。
4、 如權利要求1或3所述的方法，其中步驟a)和b)是在單一密閉反應容器中同 時實施。
5、 如權利要求2所述的方法，其中步驟a)、 b)和c)是在單一密閉反應容器中同時 實施。
6、 如權利要求2或3所述的方法，其中所述檢測用寡核苷酸不能通過酶來延伸。
7、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中在單一多重反應中檢測兩種或更多種 目標核酸。
8、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中在多重反應中使用不止一種檢測用寡 核苷酸來檢測不止一種目標核酸。
9、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述目標核酸包含核酸混合物。
10、 如權利要求9所述的方法，其中所述核酸混合物包含母源核酸和胎兒核酸， 此外其中所述核酸混合物得自懷孕雌性樣品。
11、 如權利要求3所述的方法，其中引入結合所述第一寡核苷酸的合成產物的第 二寡核苷酸，隨后可藉此進行指數擴增。
12、 如權利要求ll所述的方法，其中所述目標核酸初始時為單鏈核酸分子。
13、 如權利要求l所述的方法，其中所述解離劑具有5'-3'核酸酶活性。
14、 如權利要求3所述的方法，其中所述酶具有5'-3'核酸酶活性。
15、 如權利要求3所述的方法，其中所述酶具有能擴增目標核酸的聚合酶活性。
16、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中通過質譜法檢測到不止一種來自所 述相同檢測用寡核苷酸的質量可區(qū)分產物，且此外其中所述不止一種質量可區(qū)分產物 產生對應于目標核酸的質量特異性檢測譜特征。
17、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述檢測用寡核苷酸包含與所述目 標核酸不互補的核苷酸序列。
18、 如權利要求1、 2或3所述的方法，其中所述檢測用寡核苷酸包含一或多種 核苷修飾。
19、 如權利要求18所述的方法，其中所述核苷修飾是納入一或多個鎖核酸(LNA)。
20、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述檢測用寡核苷酸包含檢測部分。
21、 如權利要求20所述的方法，其中所述檢測部分選自由以下組成的群組糖、 蛋白質、抗體、化合物、質量標簽、熒光標簽、電荷標簽和疏水標簽。
22、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述一或多種質量可區(qū)分產物能在 釋放后結合固體載體。
23、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述一或多種質量可區(qū)分產物在其 釋放后進行擴增。
24、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述檢測用寡核苷酸根據所述目標核酸的甲基化狀態(tài)選擇性地結合甲基化特異性序列。
25、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述檢測是通過選自由以下組成的 群組的質譜儀來實施MALDI-TOFMS、串聯MS、 ESI-TOF、 ESI-離子阱、LC-MS、 GC-MS和LOI-MS。
26、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述檢測是以實時方式進行。
27、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中引入競爭模板核酸，且此外其中所 述競爭模板核酸用作內部對照。
28、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中測定所述樣品中所述目標核酸的量。
29、 如權利要求l、 2或3所述的方法，其中所述檢測用寡核苷酸包含小溝結合 部分。
30、 一種檢測目標生物分子的方法，其包含以下步驟(a) 將可檢測探針引入含有目標生物分子的樣品中，其中所述可檢測探針結合或 接觸目標生物分子，此外其中所述可檢測探針包含用作模板核酸的寡核苷酸；(b) 使寡核苷酸引物與所述模板核酸發(fā)生復性，使檢測用寡核苷酸與所述相同模 板核酸發(fā)生復性；(c) 引入酶以沿所述檢測用寡核苷酸的方向延伸所述寡核苷酸引物，其中所述酶 解離并由此釋放至少一部分所述檢測用寡核苷酸，由此產生一或多種質量可區(qū)分產物； 和(d) 通過質譜法檢測所述一或多種質量可區(qū)分產物。
31、 如權利要求30所述的方法，其中在步驟(a)中引入不止一種可檢測探針。
32、 如權利要求30所述的方法，其中所述可檢測探針特異性地結合所述目標生 物分子。
33、 如權利要求31所述的方法，其中所述不止一種可檢測探針包含寡核苷酸， 當所述可檢測探針接觸所述目標生物分子時所述寡核苷酸可發(fā)生連接以形成模板核 酸。
34、 一種檢測目標核酸序列的方法，其包含通過質譜法分析含有質量可區(qū)分產物 的核酸樣品，其中所述質量可區(qū)分產物得自(a)使寡核苷酸引物與目標核酸發(fā)生復性； (b)使檢測用寡核苷酸與所述相同目標核酸發(fā)生復性；和(c)使所述目標核酸接觸沿所述檢測用寡核苷酸方向延伸所述寡核苷酸引物的酶，其中所述檢測用寡核苷酸或其部分與所述目標核酸序列互補，并且 所述酶解離并由此釋放至少一部分所述檢測用寡核苷酸，由此產生一或多種質量可區(qū)分產物；由此通過以質譜法鑒定所述質量可區(qū)分產物來檢測所述目標核酸序列。
35、 一種檢測目標核酸序列的方法，其包含通過質譜法分析含有質量可區(qū)分產物 的核酸樣品，其中所述質量可區(qū)分產物得自(a)在含有用作模板核酸的寡核苷酸的可 檢測探針可特異性結合目標生物分子的條件下使所述目標生物分子接觸所述可檢測探針；(b)使寡核苷酸引物與所述模板核酸發(fā)生復性；(C)使檢測用寡核苷酸與所述相同模板核酸發(fā)生復性；和(d)使所述模板核酸接觸沿所述檢測用寡核苷酸方向延伸所述寡核苷酸引物的酶，其中所述檢測用寡核苷酸或其部分與所述目標核酸序列互補，并且 所述酶解離并由此釋放至少一部分所述檢測用寡核苷酸，由此產生一或多種質量可區(qū)分產物；由此通過以質譜法鑒定所述質量可區(qū)分產物來檢測所述目標核酸序列。
36、如權利要求34或35所述的方法，其中引入結合所述第一寡核苷酸的合成產 物的第二寡核苷酸，隨后可藉此進行指數擴增。
全文摘要
本發(fā)明部分涉及使用可通過質譜法檢測的檢測用寡核苷酸來檢測目標核酸的方法。這種方法使用核酸聚合酶的5’-3’核酸酶活性自雜交雙螺旋解離復性寡核苷酸探針并釋放質譜法檢測標記。這種方法易于納入PCR擴增分析中。這種方法也包括涉及目標核酸定量分析的實施例。
文檔編號C12P19/34GK101605909SQ200780050428
公開日2009年12月16日 申請日期2007年12月4日 優(yōu)先權日2006年12月5日
發(fā)明者迪爾克·約翰內斯·范登博姆 申請人:塞昆納姆股份有限公司