專利名稱：：α-低聚半乳糖的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以含有半乳糖的糖類為原料制造(x-低聚半乳糖的方法，更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及在不經(jīng)過對(duì)來源于屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)的微生物的a-半乳糖苷酶進(jìn)行酶提純的復(fù)雜工序的情況下而直接利用培養(yǎng)得到的微生物進(jìn)行ct-低聚半乳糖的制造的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著飲食生活、社會(huì)生活多樣化的發(fā)展，出于健康意識(shí)的提高，消費(fèi)者對(duì)食品、食品材料等的關(guān)心程度也有所提高。其中，發(fā)現(xiàn)蜜二糖、棉子糖、車前糖、水蘇糖、毛蕊花糖等在末端具有(x-半乳糖鍵的低聚糖即(x-低聚半乳糖具有改善腸內(nèi)菌群等功能，因此作為食品、藥品、香料等或者其原料而倍受關(guān)注。最近，有報(bào)告指出一些a-低聚半乳糖不僅具有免疫賦活作用、對(duì)特應(yīng)性皮膚炎有用，而且具有抑癌效果和自然殺傷細(xì)胞活化作用，因此這些(x-低聚半乳糖被看作是非常有用的低聚糖。這些a-低聚半乳糖廣泛地分布在自然界中，例如分布在豆類、油菜籽、芝麻、棉籽等植物的種子；黃瓜、甜瓜等葫盧科植物；以及甘蔗、蜂蜜、巻心菜、馬鈴薯、葡萄、麥類、玉米等中，現(xiàn)在市售的a-低聚半乳糖大多是從上述植物中提取的。例如，棉子糖是作為制造甜菜糖時(shí)的副產(chǎn)物回收的，而甜菜中的棉子糖含量不過是0.1%左右，生產(chǎn)量與主生產(chǎn)物砂糖的生產(chǎn)量有關(guān)，所以棉子糖的增產(chǎn)有限。另外，棉子糖以外的a-低聚半乳糖在自然界的植物中存在比率也較低，大豆的成熟種子中所含有的約515%左右的碳水化合物之中，水蘇糖約為4%;黑芝麻中存在有車前糖，但其含量非常低，約為0.23%。蜜二糖也是同樣，在大豆低聚糖中僅存在極少量。因此，為了穩(wěn)定地以低成本向市場(chǎng)供給具有這樣的有用特性的(x-低聚半乳糖，不僅需要來自天然的提取品，還需要來自低成本原料的合成品。作為迄今報(bào)道的a-低聚半乳糖的合成方法，可以舉出例如使用(3-果糖苷酶、酸、離子交換樹脂等對(duì)棉子糖進(jìn)行水解而得到蜜二糖的方法(例如專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)1);通過使來源于朱紅密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)的a-半乳糖苷酶作用于棉子糖來合成水蘇糖、毛蕊花糖、筋骨草糖等(x-低聚半乳糖的方法(例如參見非專利文獻(xiàn)2);禾擁來源于朱紅密孔菌或吉利蒙假絲酵母(Candidaguimermondii)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的a-半乳糖苷酶的糖轉(zhuǎn)移作用，將蔗糖用作半乳糖受體，將蜜二糖或棉子糖用作半乳糖供體，得到棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖等cx-低聚半乳糖的方法(例如參見專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4)。另外，作為利用(x-半乳糖苷酶的糖轉(zhuǎn)移作用的其他方法，例如已報(bào)道了利用對(duì)硝基苯基-(x-D-吡喃半乳糖苷作為半乳糖供體的方法(例如，參見非專利文獻(xiàn)5);利用肌醇半乳糖苷作為半乳糖供體的方法(例如，參見專利文獻(xiàn)4);利用UDP-半乳糖作為半乳糖供體的方法(例如，參見專利文獻(xiàn)5);利用半乳二糖作為半乳糖供體的方法(例如，參見專利文獻(xiàn)6)等。這種水解(x-低聚半乳糖本身的方法、利用(x-半乳糖苷酶的糖轉(zhuǎn)移作用的方法中，反應(yīng)容易進(jìn)行，能夠期待高的(x-低聚半乳糖產(chǎn)率。但是，這些方法需要使用(x-低聚半乳糖本身或高價(jià)的衍生物原料，所以在考慮到工業(yè)生產(chǎn)的情況下，難以穩(wěn)定地以低成本制造并供給百的物。另一方面，利用脫水縮合反應(yīng)的情況下，雖然反應(yīng)是熱力學(xué)上不利的反應(yīng)，但由于能夠利用成本低于糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)的底物，所以在工業(yè)上是有利的，例如已報(bào)道了使用來源于葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea)的a-半乳糖苷酶制造ct-低聚半乳糖的方法(例如，非專利文獻(xiàn)6)。但是，為了有效進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，優(yōu)選在高溫進(jìn)行反應(yīng)，所以要求酶具有耐熱性，但是來源于葡酒色被孢霉的a-半乳糖苷酶沒有耐熱性，在高溫反應(yīng)中，預(yù)見到酶的失活需要在反應(yīng)體系中添加大量的酶，因此需要大量培養(yǎng)微生物以得到大量的酶。另外，為了抑制酶活性的降低而在低溫進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，脫水縮合反應(yīng)不易進(jìn)行，所以從反應(yīng)時(shí)間方面出發(fā)，為了提高反應(yīng)速度，仍需要添加大量的酶，進(jìn)而需要用于大量培養(yǎng)微生物的大型設(shè)備。作為具有耐熱性的cx-半乳糖苷酶，例如已知嗜熱脂肪地芽孢桿菌具有耐熱性，但至今對(duì)于來源于屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌屬的微生物的a-半乳糖苷酶的幾篇報(bào)道全部是關(guān)于ct-低聚半乳糖的半乳糖鍵分解的(例如，專利文獻(xiàn)7)，迄今尚沒有關(guān)于蜜二糖、棉子糖、車前糖等a-低聚半乳糖的制造的報(bào)道。另外，迄今報(bào)道的(x-低聚半乳糖的制造方法是利用"提純酶"的例子，需要對(duì)酶進(jìn)行提純的工序，其不僅工序復(fù)雜，而且需要生成酶的設(shè)備。為了解決工序復(fù)雜這一問題而利用未提純的酶時(shí)，由于微生物內(nèi)的雜酶的影響，會(huì)在生成物中生成目的a-低聚半乳糖以外的雜質(zhì)低聚糖，并且難以從最終產(chǎn)品中分離出雜質(zhì)低聚糖，不僅如此，還產(chǎn)生了雜酶造成原料浪費(fèi)的問題。因此，現(xiàn)有技術(shù)中，不經(jīng)過酶的提純或者從回收后的生成物中僅提取出目的物的復(fù)雜處理工序，就不可能選擇性地僅合成a-低聚半乳糖。專利文獻(xiàn)l:日本特開平6-228180專利文獻(xiàn)2:CS239597專利文獻(xiàn)3:日本特許第2688854號(hào)專利文獻(xiàn)4:日本特開平10-84973專利文獻(xiàn)5:日本特開2001-321179專利文獻(xiàn)6:日本特公平8-24592專利文獻(xiàn)7:日本特開平5-23175非專利文獻(xiàn)1:Oligosaccharidystr.120，Praha1962非專利文獻(xiàn)2:Bull.Fac.Agr,,sagaUniv.，69，55-61(1990)非專利文獻(xiàn)3:Agric.Biol.Chem.，52(9)，2305-2311，1988非專利文獻(xiàn)4:Biosci.Biotech.Biochem.，59(4),619-623,1995非專利文獻(xiàn)5:Phytochemistry,18,35-38，1979非專利文獻(xiàn)6:Carbohydr.Res.，185,139-146，1989
發(fā)明內(nèi)容基于這種情況，本發(fā)明的目的在于提供一種制造(x-低聚半乳糖的方法，其中無需昂貴的原料，利用屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的且產(chǎn)生具有耐熱性(X-半乳糖苷酶的微生物作為催化劑，并且使用微生物本身作為催化劑，就能以無需復(fù)雜的酶提純的制造方法制造a-低聚半乳糖。另外，本發(fā)明的目的還在于提供一種a-低聚半乳糖制造方法，盡管該方法利用微生物本身作為催化劑，也能夠選擇性地合成(x-低聚半乳糖。為了解決這些課題，本發(fā)明的發(fā)明人反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種a-低聚半乳糖制造方法，其中，使用能夠選擇性合成(x-低聚半乳糖的耐熱性(x-半乳糖苷酶，不經(jīng)過酶的提純工序，利用微生物本身作為催化劑，就抑制了目的a-低聚半乳糖以外的雜質(zhì)低聚糖的生成，基于上述發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。艮P，本發(fā)明是下述(1)(11)所示的a-低聚半乳糖的制造方法。(1)一種(X-低聚半乳糖的制造方法，其是以含有半乳糖的糖類為原料制造(x-低聚半乳糖的方法，其特征在于，該制造方法利用屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的微生物作為催化劑。(2)如(1)所述的(x-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述制造方法以蔗糖和半乳糖為原料。(3)如(1)或(2)所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述a-低聚半乳糖含有棉子糖和/或車前糖。(4)如(1)(3)中任一項(xiàng)所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，用作催化劑的微生物是通過將培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)液pH降低到6.5以下而得到的。(5)如(2)(4)中任一項(xiàng)所述的ct-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的三糖以上的ot-低聚半乳糖含有率為35%以上。(6)如(2)(5)中任一項(xiàng)所述的(x-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的三糖以上的(x-低聚半乳糖含有率為80%以上。(7)如(1)所述的(x-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述制造方法以半乳糖和葡萄糖為原料。(8)如(1)或(7)所述的(X-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述(X-低聚半乳糖是蜜二糖。(9)如(7)或(8)所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率為50%以上。(10)如(7)(9)中任一項(xiàng)所述的(x-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率為70%以上。(11)如(1)(10)中任一項(xiàng)所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，微生物催化劑來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937)、AKC-002株(受理編號(hào)FERMABP-10938)、AKC-010(受理編號(hào)FERMABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株；和以AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937)、AKC-002株(受理編號(hào)FERMABP-10938)、AKC-010(受理編號(hào)FERMABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株為母株的變異株。通過采用本發(fā)明，能夠以低成本的底物為原料，制造不含a-低聚半乳糖以外的雜質(zhì)低聚糖的(x-低聚半乳糖，并且不經(jīng)過酶提純這一復(fù)雜的工序。另外，在日本，本發(fā)明使用的來源于微生物嗜熱脂肪地芽孢桿菌的a-半乳糖苷酶作為食品添加物的安全性已經(jīng)得到確認(rèn)，是允許使用的，所以從技術(shù)、安全這兩方面出發(fā)，也能在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中利用本發(fā)明。圖1給出了對(duì)使用嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-001株的糖合成反應(yīng)(實(shí)施例l)的反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)時(shí)保留時(shí)間為020分鐘的結(jié)果。圖2給出了對(duì)使用嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-010株的糖合成反應(yīng)(實(shí)施例13)的反應(yīng)液進(jìn)行離子色譜分析時(shí)保留時(shí)間為020分鐘的結(jié)果。圖3給出了對(duì)使用嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-010株的糖合成反應(yīng)(實(shí)施例13)的反應(yīng)液進(jìn)行HPLC(Sugar柱)分析時(shí)保留時(shí)間為045分鐘的結(jié)果。圖4給出了對(duì)使用嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)DSM13147株的糖合成反應(yīng)(比較例l)的反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)時(shí)保留時(shí)間為020分鐘的結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明。本發(fā)明涉及(x-低聚半乳糖的制造方法，其中包括使屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的微生物作為催化劑作用于含有半乳糖的糖類的步驟。作為本發(fā)明中的含有半乳糖的糖類，可以舉出由半乳糖和半乳糖以外的糖類組成的混合物，作為半乳糖以外的糖類，可以含有選自例如葡萄糖、果糖等單糖；蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、蜜二糖、乳糖、海藻糖、纖維素二糖、黑曲霉二糖等二糖；棉子糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、潘糖、異潘糖、蔗果三糖、車前糖、乳果糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖(工》口一7)等三糖；或分子量為三糖以上的低聚糖的至少一種物質(zhì)，作為單糖，優(yōu)選葡萄糖，作為二糖，優(yōu)選蔗糖。另外，本發(fā)明中的(x-低聚半乳糖是指分子內(nèi)具有cx-半乳糖基的低聚糖，例如可以舉出蜜二糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖、筋骨草糖、車前糖等，利用本發(fā)明的情況下，能夠特別地選擇性制造蜜二糖、棉子糖、車前糖。另外，原料利用半乳糖和蔗糖的情況下，能夠?qū)⑸晌锏途厶侵械娜且陨系?x-低聚半乳糖含有率提高到35%以上，在更優(yōu)選的條件下，能夠提高到80%以上。原料利用半乳糖和葡萄糖的情況下，能夠?qū)⑸傻途厶侵械拿鄱呛新侍岣叩?0%以上，在更優(yōu)選的條件下，能夠提高到70%以上，在進(jìn)一步優(yōu)選的條件下，能夠提高到90%以上。生成物低聚糖中的a-低聚半乳糖含有率低的情況下，由生成物提純(x-低聚半乳糖是非常困難的，不僅如此，作為底物的半乳糖或者其他單糖、二糖等無謂的浪費(fèi)也是重要的問題。本發(fā)明使用的半乳糖既可以利用半乳糖本身，也可以利用UDP-半乳糖、由其他具有半乳糖基的化合物等制造的半乳糖。另外，本發(fā)明中的雜質(zhì)低聚糖是指分子內(nèi)不具有a-半乳糖基的低聚糖，例如可以舉出麥芽糖、異麥芽糖、纖維素二糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、松三糖、潘糖、異潘糖、纖維三糖、龍膽三糖、蔗果三糖、吡喃葡糖基蔗糖、乳糖基蔗糖等。用于制造(X-低聚半乳糖的微生物催化劑可以利用通過通常進(jìn)行的培養(yǎng)方法得到的微生物本身，而無需從微生物提純a-低聚半乳糖的合成酶。另外，有時(shí)也可以利用微生物培養(yǎng)液、微生物培養(yǎng)上清液。另一方面，也可以根據(jù)需要在用水或緩沖液等對(duì)經(jīng)培養(yǎng)法得到的微生物進(jìn)行清洗后加以利用。例如，可以使用經(jīng)培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)液、或通過離心分離、緩沖液的清洗等而得到的微生物懸浮液、懸浮或溶解有微生物或微生物的處理物(例如微生物的破碎物等)的水溶液、通過包埋法、交聯(lián)法或者載體結(jié)合法而固定的微生物或微生物處理物。作為進(jìn)行固定化時(shí)的固定化載體的例子，可以舉出玻璃珠、硅膠、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、角叉菜膠、藻酸等，但并不限于這些。作為用于本發(fā)明的微生物，可以使用屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的任意的微生物，并且可以使用具有選擇性合成a-低聚半乳糖的活性的任意的微生物。優(yōu)選舉出來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937)、AKC-002株(受理編號(hào)FERMABP-10938)、AKC-010(受理編號(hào)FERMABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株；和以AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937)、AKC-002株(受理編號(hào)FERMABP-10938)、AKC-010(受理編號(hào)FERMABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株為母株得到的變異株的微生物。嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-001株和AKC-002株在2006年11月14日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566))，AKC-010株在2007年3月14日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)),其保藏編號(hào)如下。AKC-001株(FE畫P畫2應(yīng)9)AKC-002株(FERMP-21090)AKC-010株(FE腿P-21252)上述的AKC-001株(FERMP-21089)、AKC-002株(FERMP-210卯)以及AKC-010株(FERMP-21252)于2007年11月30日移交給國際保藏。國際保藏的受理編號(hào)如下。AKC-001株(FERMABP畫10937)AKC-002株(FERMABP-10938)AKC-010株(FE腹ABP-10939)AKC-001株、AKC-002株、AKC-010株分別是本發(fā)明人將DSM2358株、DSM6790株、DSM2313株重新保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心的菌株。另夕卜，上述記載的DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株可由菌株保藏機(jī)構(gòu)德國微生物菌種保藏中心(DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkulturen(DSMZ)，http:〃www.dsmz.de/microorganisms/bacteria弁catalogue.php)獲f導(dǎo)。下面纟合出DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株的其他館藏編號(hào)。DSM2358株NCIB10280DSM2027株ATCC7954，NCIB8924DSM2313株NCIB10278DSM22株ATCC12980,CCM2062,CCUG26241，IAM11062,IFO12550，NBRC12550,NCIB8923,NCTC10339,VKMB-2231DSM6790株ATCC10149作為用于本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)方法，采用通常的通氣攪拌培養(yǎng)或者固體培養(yǎng)，并可以應(yīng)用通常進(jìn)行的微生物的培養(yǎng)方法。作為培養(yǎng)基，可以舉出合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基，其中含有使該微生物繁殖良好且順暢地生成微生物中的(X-低聚半乳糖合成酶所必須的碳源、氮源、無機(jī)鹽、必須的營養(yǎng)源等。例如，作為碳源，可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、水蘇糖、纖維素二糖、吡喃葡糖基蔗糖、有機(jī)酸、大豆粕、淀粉、橄欖油、大豆油等。作為氮源，例如可以舉出硫銨、硝銨、脲、氨基酸、胺類、氨、各種無機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽、其他含氮化合物、蛋白胨、胰化蛋白胨、聚胨、肉湯、酵母提取液、棉籽粕、玉米漿和大豆粕等。另外，作為無機(jī)鹽類，可以舉出磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鐵、碳酸鈣等。培養(yǎng)溫度優(yōu)選為258(TC，更優(yōu)選為4065'C，進(jìn)一步優(yōu)選為5060°C。培養(yǎng)溫度小于25。C或者高于8(TC的情況下，繁殖性差而不優(yōu)選。另夕卜，培養(yǎng)基的初期pH優(yōu)選為39，更優(yōu)選為4.57.5。另夕卜，培養(yǎng)中的pH可在較寬范圍進(jìn)行調(diào)整，可以在pH39進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH小于3或者大于9的情況下，繁殖性差而不優(yōu)選。無論培養(yǎng)中的pH是多少，與普通的微生物的a-低聚半乳糖含有率(約30。/。以下灘比，屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的微生物表現(xiàn)出非常高的a-低聚半乳糖含有率(約35100%)，特別是制造三糖以上的cx-低聚半乳糖的情況下，為了得到更高的a-低聚半乳糖含有率，優(yōu)選使培養(yǎng)中的pH小于7，更優(yōu)選為6.5以下、進(jìn)一步優(yōu)選為6.0以下、特別優(yōu)選為5.5以下。作為降低培養(yǎng)中的pH的方法，可以舉出利用培養(yǎng)中從微生物生成的酸性物質(zhì)；添加鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、乙酸等酸性物質(zhì)的方法。從脫水縮合反應(yīng)的性質(zhì)方面出發(fā)，本發(fā)明中制造(x-低聚半乳糖時(shí)，優(yōu)選原料濃度高，但半乳糖濃度過高時(shí)，半乳糖的分子內(nèi)縮合會(huì)抑制半乳糖與半乳糖以外的糖類之間的脫水縮合反應(yīng)，所以不優(yōu)選。半乳糖濃度優(yōu)選設(shè)定在2%(w/v)45%(w/v)，更優(yōu)選設(shè)定在5%(w/v)35°/。(w/v)。利用葡萄糖作為底物的情況下，葡萄糖濃度優(yōu)選設(shè)定在30%(w/v)90%(w/v)。另外，利用蔗糖作為底物的情況下，蔗糖濃度優(yōu)選設(shè)定在30%(w/v)80°/。(w/v)，更優(yōu)選設(shè)定在45%(w/v)70%(w/v)。反應(yīng)溫度優(yōu)選為2090°C，更優(yōu)選為4080°C,進(jìn)一步優(yōu)選為5070°C。反應(yīng)溫度小于2(TC的情況下，反應(yīng)速度極低，反應(yīng)溫度大于9(TC的溫度區(qū)域，酶活性的失活變快，需要大量的微生物催化劑，所以不優(yōu)選。反應(yīng)pH可在較寬范圍進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)選pH310，更優(yōu)選pH4.58.5，進(jìn)一步優(yōu)選pH5.06.0。反應(yīng)pH小于3或者大于10的情況下，催化劑的失活明顯變快，所以不優(yōu)選。反應(yīng)時(shí)間會(huì)因微生物催化劑的用量而有所不同，考慮到工業(yè)利用的情況下，通常優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為20分鐘200小時(shí)，更優(yōu)選為6小時(shí)80小時(shí)。但是，本發(fā)明并不限于上述的反應(yīng)條件和反應(yīng)形態(tài)，可以適當(dāng)進(jìn)行選擇。通過下述的方法對(duì)本發(fā)明中得到的a-低聚半乳糖進(jìn)行測(cè)定。[生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率的測(cè)定方法]反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液稀釋25倍，在99"C保持10分鐘，由此停止反應(yīng)。反應(yīng)停止后，通過離心分離除去微生物，用高速液相色譜法(HPLC)對(duì)所得到的反應(yīng)溶液進(jìn)行分析。HPLC分析(Hypercarb柱)使用Hypercarb柱(THERMOELECTRON社制造)，在柱溫度6(TC、流量0.5ml/min的條件下使用RI檢測(cè)器實(shí)施分析。洗脫液使用由蒸餾水/乙腈/甲酸=950/50/5的組成構(gòu)成的混合液。生成物低聚糖中的三糖以上的ct-低聚半乳糖含有率(。/。)是根據(jù)在HPLC分析譜圖中檢測(cè)到的各個(gè)峰的面積比通過(三糖以上的a-低聚半乳糖的峰面積)/(生成物低聚糖的峰面積)x100計(jì)算出的。[生成物低聚糖中的蜜二糖含有率的測(cè)定方法]以葡萄糖和半乳糖為原料的(x-低聚半乳糖合成反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液稀釋25倍，在99t:保持10分鐘，由此停止反應(yīng)。反應(yīng)停止后，進(jìn)一步將糖合成液稀釋20倍，通過離子色譜分析，計(jì)算出蜜二糖累積濃度％(w/v)。另外，將反應(yīng)停止后的糖合成液稀釋2倍，進(jìn)行HPLC分析(Sugar柱)，計(jì)算出全部二糖的累積濃度。離子色譜分析中，使用CarbpacPA1柱(DIONEX社制造)，在柱溫度35°C、流量lmL/min的條件下進(jìn)行分析。檢測(cè)器使用脈沖安培檢測(cè)器。洗脫液使用水、100mM氫氧化鈉水溶液、500mM乙酸鈉水溶液，在水、lOOmM氫氧化鈉水溶液、500mM乙酸鈉水溶液在0-20分鐘、20-40分鐘、40-45分鐘的各階段的比例為49/50/1、30/50/20、0/100/0的梯度條件下進(jìn)行分析。HPLC分析(Sugar柱)中，將ShodexSugarSCLG保護(hù)柱(昭和電工社制造)、ShodexSugarSC1011柱(昭和電工社制造)、ShodexSugarSP0810柱(昭和電工社制造)連起來使用，在柱溫度80°C、流量0.6mL/min的條件下用RI檢測(cè)器進(jìn)行分析。洗脫液使用蒸餾水。生成物低聚糖中的蜜二糖含有率(％)通過蜜二糖累積濃度/全部二糖的累積濃度x100來計(jì)算。[a-半乳糖苷酶活性的測(cè)定方法]對(duì)于測(cè)定a-半乳糖苷酶活性的方法，例如在含有2.67mM對(duì)硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷的450pL乙酸鈉緩沖液(lOOmM，pH5.0)中混合經(jīng)適當(dāng)調(diào)整的150pL酶液，在4(TC進(jìn)行10分鐘左右的反應(yīng)后，將反應(yīng)液添加到lmL碳酸鈉水溶液(lM)中，使酶失活，停止反應(yīng)。測(cè)定所得到的溶液在波長420nm的吸收(所得到的溶液的著色度)，使用以各濃度的對(duì)硝基苯酚制作的校準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度。另外，評(píng)價(jià)酶活性時(shí)，以在上述條件下，1分鐘游離出liamol對(duì)硝基苯酚的酶量為1U。另外，評(píng)價(jià)ot-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性時(shí)，可以通過在各溫度條件下曝露一定時(shí)間后測(cè)定oi-半乳糖苷酶活性來進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過本發(fā)明的方法制造的a-低聚半乳糖可根據(jù)需要利用一般采用的方法來進(jìn)行提純、分離等處理。即，例如可通過離心分離、利用MF(微濾)膜或UF(超濾)膜等的膜處理、壓濾機(jī)等除去微生物催化劑；通過陽離子交換色譜法、陰離子交換色譜法等色譜處理或透析等脫鹽處理來除去由緩沖液、培養(yǎng)基等帶入的鹽類等；以及通過陽離子交換色譜法、陰離子交換色譜法、高速液相色譜法、活性炭色譜法等色譜處理或利用溶解度差等的結(jié)晶化處理、其他常規(guī)方法進(jìn)行a-低聚半乳糖的分離、提純。色譜處理可以單獨(dú)使用這些方法，也可以組合使用這些方法，并可以適當(dāng)利用移動(dòng)床方式、模擬移動(dòng)床方式、多成分分離模擬移動(dòng)床方式、多成分分離循環(huán)方式等。利用這些分離、提純方法的情況下，不僅能將a-低聚半乳糖與其他雜質(zhì)低聚糖成分分離開，還能分離各種結(jié)合形態(tài)或者具有不同的分子量的2種以上的a-低聚半乳糖類。這些a-低聚半乳糖的提純、分離處理方法可以批量式進(jìn)行，也可利用柱等連續(xù)進(jìn)行。下面通過實(shí)施例具體進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限制。實(shí)施例實(shí)施例1將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ)，TryptoseBloodAgarBase)培養(yǎng)板(Difco)在55。C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL緩沖能低于培養(yǎng)基-B(pH7.2)(參見表3)的培養(yǎng)基-A(pH7.2)(參見表2)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)2天。開始該培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)液的pH從初期的7.2向酸性側(cè)移動(dòng)到4.9。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300|iL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度6(TC、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40(aL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99'C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，其結(jié)果見圖1。分離提取對(duì)應(yīng)圖1中的峰-1和峰-2的組分，用13C-NMR進(jìn)行解析，結(jié)果證明了峰-1對(duì)應(yīng)車前糖、峰-2對(duì)應(yīng)棉子糖?；厥站w時(shí)的pH為4.9，生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為100%。該結(jié)果見表l。實(shí)施例2將嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM2027株(保藏機(jī)構(gòu)DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55。C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL緩沖能低于培養(yǎng)基-B(參見表3)的培養(yǎng)基-A(pH7.2)(參見表2)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)2天。開始該培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)液的pH從初期的7.2向酸性側(cè)移動(dòng)到5.0。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始39小時(shí)后，回收40iiL反應(yīng)液，將其與960|aL蒸餾水充分混合，在99"C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率。回收菌體時(shí)的pH為5.0，生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為98。/。。該結(jié)果見表l。實(shí)施例3將嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM22株(保藏機(jī)構(gòu)DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difbo)在55。C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL緩沖能低于培養(yǎng)基-B(參見表3)的培養(yǎng)基-A(pH7.2)(參見表2)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)2天。開始該培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)液的pH從初期的7.2向酸性側(cè)移動(dòng)到5.0。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度6(TC、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始39小時(shí)后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99'C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率?；厥站w時(shí)的pH為5.0，生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為93。/。。該結(jié)果見表1。實(shí)施例4將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-002株(受理編號(hào)FERMABP-10938;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55°。培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL緩沖能低于培養(yǎng)基-B(參見表3)的培養(yǎng)基-A(pH7.2)(參見表2)中，在55。C以150rpm培養(yǎng)2天。開始該培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)液的pH從初期的7.2向酸性側(cè)移動(dòng)至U4.9。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始39小時(shí)后，回收40iiL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99。C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率?；厥站w時(shí)的pH為4.9，生成物低聚糖中的三糖以上的01-低聚半乳糖含有率為99%。該結(jié)果見表1。實(shí)施例5將嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM457株(保藏機(jī)構(gòu)DeutscheSammlimgVonMikroorganismenUndZellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55'C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL緩沖能低于培養(yǎng)基-B(參見表3)的培養(yǎng)基-A(pH7.2)(參見表2)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)2天。開始該培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)液的pH從初期的7.2向酸性側(cè)移動(dòng)到5.0。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度6(TC、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始39小時(shí)后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99"C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的(x-低聚半乳糖含有率。回收菌體時(shí)的pH為5.0，生成物低聚糖中的三糖以上的01-低聚半乳糖含有率為94%。該結(jié)果見表1。實(shí)施例6將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-010株(受理編號(hào)FERMABP-10939;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55。C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL緩沖能低于培養(yǎng)基-B(pH7.2)(參見表3)的培養(yǎng)基-A(pH7.2)(參見表2)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)2天。開始該培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)液的pH從初期的7.2向酸性側(cè)移動(dòng)到5.0。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300jiL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960mL蒸餾水充分混合，在99"C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率?；厥站w時(shí)的pH為5.0，生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為100%。該結(jié)果見表l。將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55"培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL培養(yǎng)基-B(參見表3)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)1天。開始該培養(yǎng)1天后，培養(yǎng)液的pH為6.7，與培養(yǎng)初期的pH相比基本沒有變化。該培養(yǎng)1天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)),用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40(iL反應(yīng)液，將其與960|aL蒸餾水充分混合，在99"C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率?；厥站w時(shí)的pH為6.7，生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為49。/。。該結(jié)果見表1。實(shí)施例8將嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM2027株(保藏機(jī)構(gòu)DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55"C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL培養(yǎng)基-B(參見表3)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)1天。開始該培養(yǎng)1天后，培養(yǎng)液的pH為6.7，與培養(yǎng)初期的pH相比基本沒有變化。該培養(yǎng)1天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40iaL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99'C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的(x-低聚半乳糖含有率。回收菌體時(shí)的pH為6.7，生成物低聚糖中的三糖以上的oc-低聚半乳糖含有率為5P/。。該結(jié)果見表1。實(shí)施例9將嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM22株(保藏機(jī)構(gòu)DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55"C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL培養(yǎng)基-B(參見表3)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)1天。開始該培養(yǎng)1天后，培養(yǎng)液的pH為6.7，與培養(yǎng)初期的pH相比基本沒有變化。該培養(yǎng)1天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15rnL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40nL反應(yīng)液，將其與96(VL蒸餾水充分混合，在99。C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率?；厥站w時(shí)的pH為6.7，生成物低聚糖中的三糖以上的01-低聚半乳糖含有率為42%。該結(jié)果見表l。實(shí)施例10將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-002株(受理編號(hào)FERMABP-10938;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55°。培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL培養(yǎng)基-B(參見表3)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)1天。開始該培養(yǎng)1天后，培養(yǎng)液的pH為6.8，與培養(yǎng)初期的pH相比基本沒有變化。該培養(yǎng)1天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40|aL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率?；厥站w時(shí)的pH為6.8，生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為53。/。。該結(jié)果見表l。將嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM457株(保藏機(jī)構(gòu)DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL培養(yǎng)基-B(參見表3)中，在55。C以150rpm培養(yǎng)1天。開始該培養(yǎng)1天后，培養(yǎng)液的pH為6.6，與培養(yǎng)初期的pH相比基本沒有變化。該培養(yǎng)1天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15rnL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99t:對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率。回收菌體時(shí)的pH為6.6，生成物低聚糖中的三糖以上的01-低聚半乳糖含有率為50%。該結(jié)果見表1。實(shí)施例12將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-010株(受理編號(hào)FERMABP-10939;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55'C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL培養(yǎng)基-B(參見表3)中，在55。C以150rpm培養(yǎng)1天。開始該培養(yǎng)1天后，培養(yǎng)液的pH為6.7，與培養(yǎng)初期的pH相比基本沒有變化。該培養(yǎng)1天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300jaL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40|iL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99"C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率?；厥站w時(shí)的pH為6.7，生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為49M。該結(jié)果見表1。實(shí)施例13將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-010株(受理編號(hào)FERMABP-10939;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55。C培養(yǎng)24小時(shí)，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在500mL三角燒瓶中的100mL培養(yǎng)基-C(參見表7)中，在55'C以150rpm培養(yǎng)28小時(shí)。該培養(yǎng)28小時(shí)后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10，000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300iaL糖液(含80.0%葡萄糖、10%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始285小時(shí)后，回收40|aL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99'C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行離子色譜分析，其結(jié)果見圖2，HPLC分析(Sugar柱)的結(jié)果見圖3。蜜二糖糖累積濃度為1.6%(w/v)，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率為84.4%。實(shí)施例14將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-010株(受理編號(hào)FERMABP-10939;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55'C培養(yǎng)24小時(shí)，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在500mL三角燒瓶中的100mL培養(yǎng)基-C(參見表7)中，在55"以150rpm培養(yǎng)28小時(shí)。該培養(yǎng)28小時(shí)后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10,000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含50.0%葡萄糖、10%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始17.5小時(shí)后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960jiL蒸餾水充分混合，在99'C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行離子色譜分析，計(jì)算出生成物低聚糖中的蜜二糖含有率。蜜二糖糖累積濃度為0.93%(w/v)，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率為88.9%。實(shí)施例15將嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937;保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55。C培養(yǎng)24小時(shí)，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在500mL三角燒瓶中的100mL培養(yǎng)基-B(參見表2)中，在55'C以150rpm培養(yǎng)28小時(shí)。將上述得到的菌體懸浮在100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)中，分別在4。C和5(TC進(jìn)行2小時(shí)培養(yǎng)，進(jìn)行a-半乳糖苷酶活性測(cè)定?；钚詼y(cè)定中，在溶解有2.67mM對(duì)硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷的450pL乙酸鈉緩沖液(100mM，pH5)中混合150fiL在各溫度培養(yǎng)的菌液，在40。C反應(yīng)IO分鐘。反應(yīng)后，通過對(duì)游離的對(duì)硝基苯酚進(jìn)行定量來測(cè)定活性，計(jì)算出在4'C和5(TC培養(yǎng)的菌液的活性。以在4"C培養(yǎng)的菌體活性為100時(shí)，在5(TC培養(yǎng)的菌體的活性是高達(dá)80的值。比較例1將嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌DSM13147株(保藏機(jī)構(gòu)DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55'C培養(yǎng)l天，形成菌落。將l接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL表2所示的培養(yǎng)基-A(參見表2)中，在55'C以150rpm培養(yǎng)2天。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添力卩l(xiāng)mL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加30(VL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始39小時(shí)后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99。C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，其結(jié)果見圖4。圖4中的峰-1和峰-2是a-低聚半乳糖的峰，峰-3、峰-4和峰-5是雜質(zhì)低聚糖的峰，根據(jù)各峰面積，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率，結(jié)果嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌DSM13147株的生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為27(%)。比較例2將嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌DSM13147株(保藏機(jī)構(gòu)DeutscheSammlungVonMikroorganismenUndZellkulturen)用TBAB(月夷蛋白月東血瓊脂基礎(chǔ))培養(yǎng)板(Difco)在55"C培養(yǎng)1天，形成菌落。將1接種環(huán)該培養(yǎng)物接種到分裝在150mL三角燒瓶中的30mL培養(yǎng)基-B(參見表2)中，在55°C以150rpm培養(yǎng)2天。該培養(yǎng)2天后，將10mL量的培養(yǎng)菌體回收到15mL管中。將回收有培養(yǎng)液的15mL管以10000rpm離心后，除去上清液。接著，添加lmL的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5)，再次懸浮后，將懸浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次對(duì)管進(jìn)行離心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5))，用渦流攪拌器使菌體充分懸浮，開始糖合成反應(yīng)。該糖合成反應(yīng)在反應(yīng)溫度60°C、轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下進(jìn)行。糖合成反應(yīng)開始47小時(shí)后，回收40pL反應(yīng)液，將其與960pL蒸餾水充分混合，在99。C對(duì)酶進(jìn)行10分鐘的熱失活。將該稀釋糖液的溫度降到常溫后，進(jìn)行HPLC分析(Hypercarb柱)，計(jì)算出生成物低聚糖中的三糖以上的(x-低聚半乳糖含有率，結(jié)果為21(%)。比較例3使用來源于生咖啡豆(Greencoffeebeans)的a-半乳糖苷酶(SIGMA-ALDRICH制造)，利用實(shí)施例13所述的方法進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。與實(shí)施例15同樣地設(shè)在4"C培養(yǎng)的(x-半乳糖苷酶的活性為100時(shí)，則在5(TC培養(yǎng)的(x-半乳糖苷酶的活性為50。培養(yǎng)基162<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>微量元素溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>培養(yǎng)基-C培養(yǎng)基組成<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>通過采用本發(fā)明，提供了一種制造不含ot-低聚半乳糖以外的雜質(zhì)低聚糖的a-低聚半乳糖的方法，其中無需復(fù)雜的酶提純工序，并且使用低成本的底物為原料。權(quán)利要求1、一種α-低聚半乳糖的制造方法，其是以含有半乳糖的糖類為原料制造α-低聚半乳糖的方法，其特征在于，該制造方法利用屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的微生物作為催化劑。2、如權(quán)利要求1所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述制造方法以蔗糖和半乳糖為原料。3、如權(quán)利要求1或2所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述cx-低聚半乳糖含有棉子糖和/或車前糖。4、如權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，用作催化劑的微生物是通過將培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)液pH降低到6.5以下而得到的。5、如權(quán)利要求24中任一項(xiàng)所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的三糖以上的a-低聚半乳糖含有率為35%以上。6、如權(quán)利要求25中任一項(xiàng)所述的(x-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的三糖以上的oi-低聚半乳糖含有率為80%以上。7、如權(quán)利要求1所述的(x-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述制造方法以半乳糖和葡萄糖為原料。8、如權(quán)利要求1或7所述的(x-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述ot-低聚半乳糖是蜜二糖。9、如權(quán)利要求7或8任一項(xiàng)所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率為50%以上。10、如權(quán)利要求79中任一項(xiàng)所述的(x-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率為70%以上。11、如權(quán)利要求110中任一項(xiàng)所述的a-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，微生物催化劑來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937)、AKC-002株(受理編號(hào)FERMABP-10938)、AKC-010(受理編號(hào)FERMABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株；和以AKC-001株(受理編號(hào)FERMABP-10937)、AKC-002株(受理編號(hào)FERMABP-10938)、AKC-010(受理編號(hào)FERMABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株為母株的變異株。全文摘要本發(fā)明的目的是提供一種簡便且低成本地制造不含α-低聚半乳糖以外的雜質(zhì)低聚糖的α-低聚半乳糖的方法。根據(jù)本發(fā)明，提供一種α-低聚半乳糖的制造方法，其是以含有半乳糖的糖類為原料制造α-低聚半乳糖的方法，其特征在于，該制造方法利用屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的微生物作為催化劑。文檔編號(hào)C12R1/01GK101568643SQ20078004822公開日2009年10月28日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日發(fā)明者小西一誠,山中沙也加申請(qǐng)人:旭化成化學(xué)株式會(huì)社