專利名稱：：具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半壽期的因子ix類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及凝血因子IX(FIX)類似物及衍生物，與天然的因子IX相比，它們?cè)谘髦械难h(huán)時(shí)間延長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
：因子IXa(FIXa)是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，在止血過程中發(fā)揮重要作用，它是凝血因子X酶復(fù)合物的組成部分，產(chǎn)生大部分的因子Xa,因子Xa在凝血過程中參與凝血酶的形成(見綜述(Hoffman和Monroe，III2001))。先天性因子IXa缺乏導(dǎo)致X-連鎖出血性疾病-血友病B,男性發(fā)病率約為I:IOO，OOO。目前，血友病B的治療主要是使用重組或血漿凝血因子IX的替代療法。然而，目前的觀點(diǎn)正由傳統(tǒng)的按需治療轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)防性治療。當(dāng)前的預(yù)防性治療需要每周多次給藥，但要達(dá)到最佳的血漿濃度和藥效，最好每天注射一次。但考慮到每天給藥的實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)限制，目前尚不能用于患者的治療。因而，顯然需要一種長(zhǎng)效的重組因子IX藥物。WO2006005058涉及因子IX的一部分與一種或多種分子量為5-150kDa的水溶性聚合物的結(jié)合體。WO2006018204涉及修飾的維生素K依賴性多肽，包括修飾的激活肽。WO2004101740涉及嵌合蛋白，至少包括一種凝血因子和部分免疫球蛋白恒定區(qū)。WO2005001025涉及嵌合單體-二聚體雜交蛋白，其中該蛋白的第一條多肽鏈包括部分免疫球蛋白恒定區(qū)和生物活性分子，第二條多肽鏈包括不含生物活性分子的部分免疫球蛋白恒定區(qū)。US2006040856涉及因子IX和聚乙二醇的結(jié)合，聚乙二醇通過完整的糖基連接起來(lái)并連接到多肽和修飾基上。SE9501285A公開了使用一種混合物在體外合成具有適當(dāng)折疊和二硫化物交聯(lián)的生物活性蛋白的方法，該混合物包括蛋白二硫化物氧化還原酶(如蛋白二硫化物異構(gòu)酶(PDI))，谷氧還蛋白和氧化還原體系。參考文獻(xiàn)主要是關(guān)于參與分子內(nèi)二疏鍵形成的半胱氨酸殘基。4WO2006/134173涉及至少包含一個(gè)非天然半胱氨酸殘基的重組工程化蛋白的選擇性還原和衍生方法，重組蛋白包括因子IX多肽在內(nèi)。本發(fā)明的目的是提供修飾的FIX類似物或衍生物，與天然FIX相比，它們?cè)谘髦械难h(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，但仍能維持足夠的生物活性參與凝血。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及循環(huán)半壽期延長(zhǎng)的FIX類似物，其中在下列位點(diǎn)的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合(conjugate)化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加，所述位點(diǎn)為第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415位。在優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點(diǎn)的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加，所述位點(diǎn)為第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80或84位。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點(diǎn)的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加，所述位點(diǎn)為第87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141或142位。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點(diǎn)的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加，所述位點(diǎn)為第185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、5257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415位。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)IX類似物在位點(diǎn)146-180的天然^tJ^酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加?？梢岳斫猓捎谖稽c(diǎn)146-180相當(dāng)于FIX的活性肽，該活性肽在FIX激活時(shí)被釋放(remove),那么，對(duì)于這樣一種FIX類似物，其中在選自位點(diǎn)146-180的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被半胱氨酸殘基取代，所述半胱氨酸殘基結(jié)合了使FIX多肽的分子量增加的化學(xué)基團(tuán)，在類似物激活后，所述化學(xué)基團(tuán)將不存在于類似物中。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點(diǎn)的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加，所述位點(diǎn)選自第155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177位。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點(diǎn)的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加，所述位點(diǎn)選自第160、161、162、163、164、165和166位。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)IX類似物的氨基酸殘基E162被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。另一方面，本發(fā)明涉及循環(huán)半壽期延長(zhǎng)的FIX類似物，其C-末端T415后至少附加一個(gè)半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，與非天然半胱氨酸殘基結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)是聚乙二醇(PEG)。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案中，聚乙二醇的平均分子量是500-100,000,例如1000-75,000或2,000-60,000。優(yōu)選的FIX類似物，其循環(huán)半壽期至少是野生型FIX半壽期的1.5倍。在進(jìn)行凝血實(shí)-險(xiǎn)時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選的FIX類似物，其生物活性至少6是野生型FIX的20%。另一方面，本發(fā)明涉及FIX類似物的制備方法，包括以下步驟a)選擇性還原工程化(engineered)FIX多肽，該多肽在下列位點(diǎn)至少包含一個(gè)非天然半胱氨酸，所迷位點(diǎn)選自第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415位，所述非天然半胱氨酸殘基通過二硫鍵與低分子量的硫醇(thiol)(RS-CYS)結(jié)合，方法是使結(jié)合低分子量硫醇的FIX和含有氧化還原緩沖體系的混合物反應(yīng)；b)同時(shí)或其后，將至少一個(gè)選擇性還原的半胱氨酸(HS-Cys)部分與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，制備方法包含氧化還原緩沖體系(redoxbuffer),氧化還原緩沖體系包括含有還原型和氧化型谷胱甘肽的混合物。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，氧化還原緩沖體系還包括谷氧還蛋白。另一方面，本發(fā)明涉及FIX類似物的制備方法，包括以下步驟a)選擇性還原工程化FIX多肽，該多肽在下列位點(diǎn)至少包含一個(gè)非天然半胱氨酸，所述位點(diǎn)選自第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415位，所述非天然半胱氨酸殘基通過二硫鍵與低分子量的硫醇(RS-CYS)結(jié)合，方法是使結(jié)合低分子量硫醇的FIX和含有三芳基膦-3,3，，3"-三磺酸化合物的混合物反應(yīng)；b)同時(shí)或其后，將至少一個(gè)選擇性還原的半胱氨酸(HS-Cys)部分與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合。7在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，化學(xué)基團(tuán)選自聚乙二醇(PEG),尤其是平均分子量為500-100,000的PEG,例如1000-75,000或2,000-60,000。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療血友病患者的藥物制劑，其中包含有效治療劑量的本發(fā)明的FIX類似物的和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及血友病患者的治療方法，其中包括給予患者有效治療劑量的本發(fā)明的FIX類似物及藥學(xué)上可接受的載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，治療方法包括每周至少一次治療。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，治療方法包括每周只進(jìn)行一次的治療。發(fā)明詳述FIX是維生素K依賴性凝血因子，結(jié)構(gòu)類似于因子vn、凝血素、因子X和蛋白C。其循環(huán)酶原的血漿半壽期約為18-30小時(shí)，由415個(gè)氨基酸組成，分為四個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域，包括N-末端富含Y-羧基谷氨酸(Gla)結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域和C-末端胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。FIX的激活是通過Arg145-Ala146和Arg18Q-Val181位氨基酸的限制性酶切，釋放含有35個(gè)氨基酸殘基的片段，所謂的激活肽(Schmidt和Bajaj2003)。激活肽高度糖基化，包括兩個(gè)N-連接多糖和高達(dá)四個(gè)的O-連接多糖。共價(jià)修飾，例如聚乙二醇化或脂連接(lipidattachment),已經(jīng)成功地用于幾個(gè)蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的制藥學(xué)中，改進(jìn)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。通過天然或工程化半胱氨酸殘基進(jìn)行的結(jié)合，提供了位點(diǎn)特異性的修飾方法，主要是由于蛋白表面缺乏這種半胱氨酸殘基和硫醇進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)具有高度選擇性。然而，實(shí)際上，這種方法通常是復(fù)雜的，原因是加入的半胱氨酸殘基與低分子量(LMW)硫醇組成的混合二硫化物如半胱氨酸和谷胱甘肽會(huì)抑制隨后的修飾反應(yīng)。因此，就需要一種方法，其中半胱氨酸殘基和低分子量硫醇組成的混合二硫化物能夠在保護(hù)天然二硫鍵的情況下被化學(xué)還原。已經(jīng)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離、表達(dá)出人因子IX基因(K.Kumchi和E.W.Davie.編碼人因子IX的cDNA的分離與特征描述。PNAS.79(21I):6461-6464,1982;K.H.Choo,K.G.Gould,D.J.Rees,和G.G.8Brownlee;人抗血友病因子IX基因的分子克隆，Nature299(5879):178-180,1982;R.J.Kaufman,L.C.Wasley,B.C.Furie,B.Furie和C.B.Shoemaker;中國(guó)大鼠卵巢細(xì)胞中合成的重組"羧基因子IX的表達(dá)、純化和特征描述.J.Biol.Chem.261(21):9622-9628,1986.),并從cDNA中推導(dǎo)出氨基酸序列。目前FIX用于血友病B的治療通常包括每周兩次注射，例如在拔牙或手術(shù)前^L輔助注射。FIX在血循環(huán)中以無(wú)活性酶原形式存在，只有出血時(shí)才轉(zhuǎn)變成有活性的FIXa。因此，F(xiàn)IX預(yù)防性治療的方法是例如每周注射一次，增加患者血液中FIX的循環(huán)時(shí)間。這樣，患者體內(nèi)就總會(huì)有一定水平的FIX酶原，在任何時(shí)候都可以一皮激活，保證正常的凝血過程。本發(fā)明的FIX類似物，其修飾方法是用半胱氨酸殘基取代FIX中的一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸殘基。識(shí)別FIX中適于加入半胱氨酸殘基的位點(diǎn)要修飾的氨基酸殘基位點(diǎn)優(yōu)選來(lái)自相對(duì)側(cè)鏈表面可接觸性大于50%的氨基酸殘基庫(kù)。重鏈和EGF2結(jié)構(gòu)域的表面可接觸性從發(fā)表的晶體學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中計(jì)算而來(lái)(1PFX,Hopfner等，1999),而EGF1結(jié)構(gòu)域表面可接觸性的計(jì)算是基于豬FIXa晶體結(jié)構(gòu)的同源模型(1PFX,Bmndstetter等，1995)。另外，激活肽中的氨基酸殘基(155-177位殘基)，尚無(wú)其結(jié)構(gòu)信息的，也被認(rèn)為是重要的。最近的出版物指出，激活肽這部分片段可以被刪除，而不影響FIX的生活活性(Begbie等，2005)。表1中列出了人類FIX中所有相關(guān)的氨基酸殘基位點(diǎn)。表l.位點(diǎn)特異性修飾的FIX相關(guān)位點(diǎn)。'ASA1，(以A"表示)是所有氨基酸殘基的可接觸位點(diǎn)，'ASA2，(以人2表示)是側(cè)鏈的可接觸位點(diǎn)，'Rel.ASA，是側(cè)鏈的部分可接觸位點(diǎn)。序列按照糜蛋白酶進(jìn)行編號(hào)，與豬FIXa晶體結(jié)構(gòu)的編號(hào)(lPFX.pdb)相同。標(biāo)記有星號(hào)(*)或負(fù)號(hào)(-)側(cè)鏈，被認(rèn)為在與FVIIa/TF復(fù)合物(Chen,C.W.等，ThrombHaemost.2002;88:74-82.)或FVIIIa(Autin,L.等,J.Thromb.Haem.2005,3:2044-56)的連接中有重要作用。9FIXEO1殘基號(hào)殘基ASAlASA2RelASA標(biāo)記44GLN98.989.620.6545TYR127.61102.770.56承46VAL92.0379.540.7347ASP120.51105.860.9150GLN94.2981.750.5652GLU137.29121.940.85承53SER110.671.750.8954ASN78.8162.970.54承57LEU94.4685.040.5759GLY64.1647.950.89承61SER57.2947.740.58*66ILE128.4117.580.7767ASN116.6299.470.8668SER65.5263.950.8470GLU104.0898.670.7172TRP143.49135.570.6374PRO109.6291.250.73承80LYS191.42178.010.9984LEU103.2998.380.65FIXEGF2殘基號(hào)殘基ASAlASA2RelASA標(biāo)記87THR83.5776.410.6689ASN122.2699.360.890ILE8479.820.5391LYS128.196.730.5894ARG151.51138.140.69100LYS118.47114.680.6710101ASN78.9263.60.56102SER8353.180.63103ALA88.6647.670.7104ASP88.4674.730.62105ASN108.1999.740.86106LYS131.06126.340.68108VAL75.4969.940.59113GLU101.3787.960.58116ARG136.07129.020.64119GLU137.93126.990.82120ASN113.5886.880.72121GLN84.29830.57123SER52.4152.410.57125GLU76.1976.190.55129PRO127.1591.630.8138SER99.8772.520.79140THR78.2262.840.6141SER124.1790.361.02142LYS243.38231.320.95FIX重鏈殘基號(hào)殘基ASAlASA2RelAS185GLU104.18102.680.73186ASP93.0281.460.74188LYS124.37123.070.67189PRO62.1858.270.51201LYS174.2136.050.73202VAL73.9768.060.63203ASP103.2396.570.79224GLU110.0699.470.71225THR136.54115.791.0211228LYS158.34146.180.82239GLU111.987.550.58240GLU105.3695.430.66241THR93.6282.060.72243HIS160.28127.850.82247LYS147.15133.670.73249ASN62.462.40.54252ARG120.71108.770.57257HIS134.8798.770.65260ASN71.463.120.56261ALA62.4544.520.68262ALA94.5349.720.76263ILE141.89110.30.74265LYS100.0299.840.54277GLU104.36104.360.73280VAL102.3798.010.82292ASP72.6259.010.52293LYS115.6115.560.67294GLU107.3101.010.68301LYS146.99124.630.65314PHE120.75120.080.72316LYS165.63138.790.76318ARG170.14155.690.8321LEU98.8295.810.61327ARG120.09116.480.55332ASP79.5160.870.55333ARG148.18139.330.67338ARG188.9160.870.76341LYS220.48183.470.99342PHE118.351060.59343THR92.3277.520.6812346ASN61.2559.080.51354HIS106.42105.150.63355GLU100.5789.470.69372GLU93.7975.650.53374GLU140.35102.570.72391MET108.83100.480.67392LYS160.88145.950.81楊A(yù)SN104.2798.780.79410GLU117.1997.590.68413LYS153.75134.030.75415THR201.09182.540.95承承nx激活肽殘基號(hào)155156157158159160161162163164165166167168169170171殘基TyrValAsnSerThrGluAlaGluThrlieLeuAspAsnlieThrGinSer13172Thr173Gin174Ser175Phe176Asn177Asp本發(fā)明的FIX類似物較野生型FIX的循環(huán)半壽期長(zhǎng)。循環(huán)半壽期可用技術(shù)人員采用已知的方法測(cè)量，如McCarthy等，ThrombHaemost.2002May;87(5):824-30中講述的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用同樣的實(shí)驗(yàn)或模型測(cè)量時(shí)，本發(fā)明FIX類似物的循環(huán)半壽期至少是野生型FIX的1.5倍，例如至少1.64咅、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.4倍。此外，本發(fā)明的FIX類似物保持了足夠的體內(nèi)凝血生物活性。生物活性可用技術(shù)人員已知的方法測(cè)量，如McCarthy等，ThrombHaemost.2002May;87(5):824-30中講述的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用同樣的實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)，本發(fā)明FIX類似物的凝血活性至少是野生型FIX的15%,例如至少20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%。突變，表達(dá)和純化FIX類似物可用重組核普酸技術(shù)制備。通常，克隆的人核苷酸序列經(jīng)過修飾，編碼所需的FIX類似物，然后與表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選高等真核細(xì)胞，尤其是培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，作為宿主細(xì)胞。氨基酸序列的改變方法有很多種。核苷酸序列修飾可采用位點(diǎn)特異性突變方法。位點(diǎn)特異性突變技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的，例如，在Zoller和Smith(DNA3:479-488,1984)或"重疊延伸剪接技術(shù)"，Horton等，Gene77,1989,pp.61-68中都有描述。因此，利用FIX的核苷酸序列和氨基酸序列可以進(jìn)行改變。同樣，利用特異性引物，采用多聚酶鏈反應(yīng)制備DNA的程序也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參考PCRProtocols,1990,AcademicPress,SanDiego,California,USA)。編碼本發(fā)明的FIX類似物的核酸構(gòu)建體可源自基因組或cDNA，例如，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，構(gòu)建基因組或cDNA文庫(kù)，用合成的寡核苷酸探針采用雜交方法篩選編碼FIX全長(zhǎng)或部分片段的DNA序列(參考Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd.Ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989)。編碼FIX多肽類似物的核酸體也可用已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如，Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetters22(1981),1859—1869中講述的亞磷酰胺(phosphoamidite)法，或Matthes等，EMBOJournal3(1984),801-805中講述的方法。按照亞磷酰胺法，寡核普酸可以在例如DNA自動(dòng)合成儀中合成，純化，退火，連接，并克隆到適當(dāng)?shù)妮d體上。編碼人FIX多肽的DNA序列也可以用特異性引物采用多聚酶鏈反應(yīng)合成，例如US4,683,202,Saiki等，Science239(1988),487—491或Sambrook等(同上)中講述的方法。此外，核酸構(gòu)建體也可以是混合的合成和基因組核苷酸片段、混合的合成和cDNA核苷酸片段或混合的基因組和cDNA核苷酸片段，方法是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，連接合成的、基因組或cDNA來(lái)源的核苷酸片段，這些核苷酸片段可以是FIX核苷酸序列全長(zhǎng)的各個(gè)不同部分。編碼FIX多肽的DNA序列通常浮皮插入到重組載體中，重組載體可以是任何載體，也可以是方便用于DNA重組程序的載體，載體的選自通常取決于誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞。因而，載體可以是具有自我復(fù)制功能的，即獨(dú)立于染色體之外的DNA,其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒。另外一種載體是導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中，隨著染色體復(fù)制而復(fù)制。載體優(yōu)選表達(dá)載體，其中編碼FIX類似物的DNA序列與載體中用于DNA轉(zhuǎn)錄的附加區(qū)段可操作連接。通常，表達(dá)載體來(lái)自質(zhì)粒或病毒DNA,或兩者均有。術(shù)語(yǔ)"可操作連接"指的是，排列核苷酸區(qū)段，使其功能達(dá)到共同目的，例如啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄合成編碼多肽的DNA序列。用于表達(dá)FIX類似物的表達(dá)載體，包括啟動(dòng)克隆基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA15序列，也可以是來(lái)自宿主細(xì)胞中編碼同源或異源性蛋白的基因。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中啟動(dòng)編碼FIX類似物DNA轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子(Subramam等，Mol.CellBiol.1(1981),854-864)、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動(dòng)子(Palmiter等，Science222(1983),809■814)、CMV啟動(dòng)子(Boshart等，Cell41:521-530,1985)或腺病毒2主要晚期啟動(dòng)子(Kaufman和Sharp,Mol.Cell.Biol,2:1304-1319,1982)。必要的話，編碼FIX類似物的DNA序列可以可操作地連接到合適的終止子上，如人生長(zhǎng)激素終止子(Palmiter等，Science222,1983,pp.809-814)或TPI1終止子(Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1,1982,pp.419_434)或ADH3終止子(McKnight等，TheEMBOJ.4,1985,pp.2093-2099)。表達(dá)載體也可以含有RNA剪接位點(diǎn)，位于啟動(dòng)子下游，F(xiàn)IX序列插入位點(diǎn)的上游。優(yōu)選的RNA剪接位點(diǎn)源自腺病毒和/或免疫球蛋白基因。表達(dá)載體也含有多聚腺苷酸信號(hào)，位于插入位點(diǎn)的下游。優(yōu)選的多聚腺苷酸信號(hào)包括SV40(Kaufman和Sha卬，ibid.)的早期或晚期多聚腺苷酸信號(hào)，腺病毒5Elb區(qū)的多聚腺苷酸信號(hào)，人生長(zhǎng)激素基因終止子(DeNoto等，Nucl.AcidsRes.9:3719-3730,1981)或人FIX基因的多聚腺苷酸信號(hào)。表達(dá)載體也可能含有病毒的非編碼先導(dǎo)序列，位于啟動(dòng)子和RNA剪接位點(diǎn)之間，例如腺病毒2的三聯(lián)先導(dǎo)序列；也可能含有增強(qiáng)子，例如SV40增強(qiáng)子。為了能使本發(fā)明的FIX類似物進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，分泌信號(hào)序列(也可稱為先導(dǎo)序列，信號(hào)肽序列或前序列)也應(yīng)存在于重組載體中。分泌信號(hào)序列按正確的讀碼框架連接到編碼FIX類似物的DNA序列上。分泌信號(hào)序列通常位于編碼多肽的DNA序列的5'端。分泌信號(hào)序列通常和編碼的蛋白有關(guān)，或者來(lái)自編碼另一種分泌蛋白的基因。連接編碼FIX類似物的DNA序列、啟動(dòng)子和終止子、分泌信號(hào)序列，并將其插入含有必要復(fù)制信息的適當(dāng)載體中的程序，是本領(lǐng)域的^支術(shù)人員所熟^口的(參見例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor，NewYork,1989)。如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.159(1982),601—621;Southern和16Berg,J.Mol.Appl.Genet1(1982),327-341;Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(1982),422—426;Wigler等，Cell14(1978),725;Corsaro和Pearson,SomaticCellGenetics7(1981),603,Graham和vanderEb，Virology52(1973),456;Neumann等，EMBOJ.1(1982),841誦845.克隆的DNA序列導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，Cell14:725-732,1978;Corsaro和Pearson,SomaticCellGenetics7:603-616,1981;Graham和VanderEb，Virology52d:456-467,1973)或電穿孔法(Neumann等，EMBOJ.1:841-845,1982)。為了識(shí)別并篩選表達(dá)外源性DNA的細(xì)胞，含有篩選表型(篩選標(biāo)志物)的基因通常和目的基因或cDNA—起導(dǎo)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的篩選標(biāo)志物包括抗藥性基因，如抗新霉素、勻霉素和甲氨蝶呤。篩選標(biāo)志物可以擴(kuò)增。優(yōu)選的可擴(kuò)增的篩選標(biāo)志物是二氬葉酸還原酶(DHFR)序列。Thilly對(duì)篩選標(biāo)志物進(jìn)行了綜述(MammalianCellTechnology,ButterworthPublishers,Stoneham,MA,引入本文作為參考)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易的挑選適當(dāng)?shù)暮Y選標(biāo)志物。篩選標(biāo)志物可以用獨(dú)立的質(zhì)粒與目的基因同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，也可以和目的基因使用相同的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)月包。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知這種結(jié)構(gòu)類型(例如Levinson和Simonsen,U.S.4,713,339)。在導(dǎo)入細(xì)胞的混合物中添加額外的DNA也是有利的，被稱為"載體DNA"。表達(dá)外源性DNA的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，開始表達(dá)目的基因。本文中的術(shù)語(yǔ)"適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基"是指含有營(yíng)養(yǎng)成分和其它細(xì)胞生長(zhǎng)、FIX類似物表達(dá)所需成分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基通常含有碳源、氮源、必須氨基酸、必須的糖、維生素、鹽、磷脂、蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)因子。然后用藥物篩選穩(wěn)定表達(dá)篩選標(biāo)志物的生長(zhǎng)細(xì)胞。對(duì)于轉(zhuǎn)染了可擴(kuò)增篩選標(biāo)志物的細(xì)胞，可以加大藥物濃度，以篩選拷貝數(shù)增加的克隆序列，從而增加表達(dá)量。篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆用于FIX類似物的表達(dá)。本發(fā)明中使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括COS-1細(xì)胞系(ATCCCRL1650),幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系(BHK)和293細(xì)胞系(ATCCCRL1573;Graham等，J.Gen.Virol.36:59-72,1977)。優(yōu)選的BHK細(xì)胞系是tk-17tsl3BHK細(xì)！包系(Waechter和Baserga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:1106-1110,1982，引入本文作為參考)和下文中提到的BHK570細(xì)胞系。BHK570細(xì)胞系已經(jīng)被列入ATCC庫(kù)中，12301ParklawnDr.,Rockville,Md.20852,在ATCC中的編號(hào)為CRL10314。tk-tsl3BHK細(xì)胞系在ATCC中的編號(hào)是CRL1632。此外，其它多種細(xì)胞系也可以用于本發(fā)明中，包括鼠HepI(大鼠肝細(xì)胞瘤；ATCCCRL1600),鼠HepII(大鼠肝細(xì)胞瘤；ATCCCRL1548),TCMK(ATCCCCL139),人肺癌細(xì)月包(ATCCHB8065),NCTC1469(ATCCCCL9.1),CHO(ATCCCCL61)和CHO-DUKX細(xì)胞系(Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220,1980)。本發(fā)明的FIX類似物存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中，可用本領(lǐng)域中已知的多種方法純化，但并不局限于這些方法，包括層析法(例如，離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和過濾層析法)，電泳法(例如等電聚焦(IEF)),溶解度分離法(例如，硫酸銨沉淀法)或萃取法(參見蛋白純化丄-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。優(yōu)選的是，將FIX類似物過抗FIX抗體柱的親和層析法。其它純化方法包括常規(guī)化學(xué)純化法，例如高效液相色譜法。其它純化法為本領(lǐng)域所知，可用于本文中新型FIX多肽的純化。要達(dá)到治療目的，F(xiàn)IX類似物的純化至少達(dá)到約90-95%的均一性(homogeneity),優(yōu)選的是至少約98%均一性。純化率可以用凝月交電泳和氨基末端氨基酸測(cè)序測(cè)定。選擇性還原考慮到上述半胱氨酸巰基基團(tuán)介導(dǎo)的化學(xué)結(jié)合的困難性(所述巰基基團(tuán)不參與重組技術(shù)制備的蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵形成)，本發(fā)明使用氧化還原混合緩沖體系(例如，硫醇-二硫化物聚合氧化還原催化劑)或三芳基膦選擇性還原低分子量硫醇和工程化蛋白組成的混合二硫鍵，該工程化蛋白至少包括一個(gè)非天然半胱氨酸，例如，含有工程化或天然半胱氨酸的凝血因子或絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族蛋白?；旌隙蚧锝?jīng)選擇性還原后，產(chǎn)生的游離半胱氨酸可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的蛋白質(zhì)巰基偶聯(lián)化學(xué)進(jìn)行結(jié)合修飾。工程化或天然半胱氨酸介導(dǎo)的化學(xué)結(jié)合可以耙向蛋白修飾，產(chǎn)生單一同源性產(chǎn)物。然而，如果半胱氨酸與低分子量硫醇結(jié)合后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵不穩(wěn)定，那么該措施就不可行。本發(fā)明可以選擇性去除低分子量硫醇部分，產(chǎn)生游離的半胱氨酸，用于隨后的化學(xué)修飾。因此，本發(fā)明涉及選擇性還原工程化FIX的方法，工程化FIX即至少包含一個(gè)非天然半胱氨酸的FIX,該FIX包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸部分(moiety)，通過二硫鍵與低分子量硫醇(RS-Cys)結(jié)合，該半胱氨酸部分不參與活性蛋白分子內(nèi)二硫鍵(Cys-S-S-Cys)的形成，此方法可以使結(jié)合低分子量硫醇的蛋白與包含氧化還原緩沖體系的混合物反應(yīng)。另外，本發(fā)明涉及選擇性還原工程化FIX的方法，工程化FIX即至少包含一個(gè)非天然半胱氨酸的FIX,該FIX包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸部分，通過二硫鍵與低分子量硫醇(RS-Cys)結(jié)合，該半胱氨酸部分不參與活性蛋白分子內(nèi)二硫鍵(Cys-S-S-Cys)的形成，此方法可以使結(jié)合低分子量硫醇的蛋白與包含三芳基膦還原劑的混合物反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)"選擇性還原"指的是，大部分通過二硫鍵與低分子量硫醇結(jié)合的半胱氨酸部分，如60%、80%、90%或更多，經(jīng)還原后釋放含有巰基的半胱氨酸部分，其易于和其它基團(tuán)結(jié)合，而大部分其它二硫鍵(主要是分子內(nèi)二硫鍵)，如60%、80%、90%或更多，受到保護(hù)，這樣，工程化蛋白就基本上保持其生物活性。(A)氧化還原緩沖體系如上所述，本發(fā)明提供了至少包括一個(gè)非天然半胱氨酸殘基的工程化蛋白(例如，凝血因子或絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族蛋白)的選擇性還原方法。涉及的蛋白包括一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸部分，其經(jīng)二硫鍵與低分子量硫醇(RS-Cys)結(jié)合，該半胱氨酸部分不參與活性蛋白分子內(nèi)二硫鍵(Cys-S-S-Cys)形成，此方法包括使結(jié)合低分子量硫醇的蛋白與包含氧化還原緩沖體系的混合物反應(yīng)。本文中術(shù)語(yǔ)"氧化還原緩沖體系"一詞的意思是，硫醇/二硫化物氧化還原對(duì)比例合適，足以還原以破壞蛋白-低分子量硫醇組成的混合19二硫化物(RS-Cys)，并足以氧化以保護(hù)蛋白中天然二硫鍵的完整性。優(yōu)選地，氧化還原緩沖體系包括低分子量硫醇/二硫化物氧化還原對(duì)。術(shù)語(yǔ)"低分子量"指的是，氧化還原對(duì)中硫醇形式的分子量最多為500g/mol。這些氧化還原對(duì)選自(i)還原型和氧化型谷胱甘肽，(ii)還原型和氧化型"谷氨酰半胱氨酸，(iii)還原型和氧化型半胱氨酰甘氨酸，(iv)還原型和氧化型半胱氨酸，(v)還原型和氧化型N-乙酰半胱氨酸，(vi)半胱胺，(vii)二氫硫辛酰胺/硫辛酰胺，優(yōu)選(i)還原型和氧化型谷胱甘肽。最佳的氧化還原條件可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的蛋白氧化還原滴定來(lái)確定，參見Gilbert(1995)。在實(shí)施方案中，氧化還原緩沖體系包含還原型和氧化型谷胱甘肽氧化還原對(duì)，還原型谷胱甘肽濃度為0-100mM,還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比率是2-200。在另一實(shí)施方案中，氧化還原緩沖體系包含還原型和氧化型谷胱甘肽氧化還原對(duì)，還原型谷胱甘肽濃度為0-100mM,如0.01-50mM,氧化型谷胱甘肽的濃度是0-5mM，如0.001-5mM。對(duì)于因子IX多肽，還原型谷胱甘肽的濃度優(yōu)選為0-5mM,如0.01-2mM,氧化型谷胱甘肽的濃度為0.001-2mM,如0.001-0.200mM。由于根據(jù)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，谷胱甘肽和其它低分子量硫醇通常是弱還原劑/氧化劑，混合物中最好含有硫醇/二硫化物氧化還原催化劑，與氧化還原緩沖體系一起作用，提高反應(yīng)速率?；旌衔锢锏牧虼?二硫化物氧化還原催化劑包括二巰基型和單巰基型谷氧還蛋白。谷氧還蛋白及其功能在Fernandes等(2004)中有講述。有用的谷氧還蛋白選自埃希氏菌屬的Grxl、Grx2或Grx3(Holmgren等，1995)，啤酒酵母的Grxlp、Grx2p、Grx3p、Grx4p和Grx5p(Luikenhuis等，1998;Rodriguez畫Manzaneque等，1999;Grant,2001),人類的Grxl和Grx2(Padilla等，1995;Lundberg等，2001)及其各種變異體。變異體包括，但不局限于這些，二巰基型谷氧還蛋白，其c-末端cxxc結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基被另一種氨基酸殘基通常是絲氨酸殘基取代(參見Yang等,1998)。氧化還原催化劑(尤其是谷氧還蛋白)優(yōu)選的使用濃度為0.001-2020jiM?；旌衔锢镒詈貌灰鞍踪|(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)。氧化還原緩沖體系也可包括其它一些成分，例如鹽，pH緩沖體系等，本發(fā)明的方法可以在任何溫度下實(shí)施，這些溫度適于所涉及的蛋白，例如，-5°C至50。C,例如0°C至37。C，.當(dāng)然，選用何種溫度取決于蛋白在該溫度下的穩(wěn)定性。(B)三芳基膦還原劑如上所述，本發(fā)明提供了至少包括一個(gè)非天然半胱氨酸殘基的工程化蛋白(例如凝血因子或絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族蛋白)的選擇性還原方法。涉及的蛋白包括一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸部分，其經(jīng)二硫鍵與低分子量硫醇(RS-Cys)結(jié)合，該半胱氨酸部分不參與活性蛋白分子內(nèi)二硫鍵(Cys-S-S-Cys)的形成，此方法包括使結(jié)合低分子量硫醇的蛋白與三芳基膦還原劑反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)"三芳基膦還原劑"指的是任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的三芳基膦。三芳基膦還原劑的芳基基團(tuán)優(yōu)選自苯基、萘基、1,2,3,4-四氫化萘基、蒽基、苯蒽基、芘基、苯芘基、芴基、占p屯基，尤其是苯基，在當(dāng)前挑選出的實(shí)施方案中，三個(gè)芳基基團(tuán)是相同的。在當(dāng)前最有意義的實(shí)施方案中，三芳基膦的三個(gè)芳基基團(tuán)都來(lái)自苯基。芳基基團(tuán)尤其是苯基中的取代基，通常選自磺酸、羧酸、d—6-烷基、d-6-烷氧基、C^-烷氧基-d-6-烷基、C3-6-亞烷基(alkylene)(含有兩個(gè)相鄰芳基碳原子的環(huán))或Cw-亞烷基氧基(含有兩個(gè)相鄰芳基碳原子的環(huán))或d_4-亞烷基-氧基-d—4-亞烷基(含有兩個(gè)相鄰芳基碳原子的環(huán))。在當(dāng)前最有意義的實(shí)施方案中，至少有一個(gè)芳基(如苯基)存在至少一個(gè)取代基，這些取代基選自磺酸和羧酸，尤其是磺酸；取代基最好位于磷原子鍵的間位。優(yōu)選地，三個(gè)芳基基團(tuán)都含磺酸取代基，而且至少有一個(gè)取代基位于磷原子鍵的對(duì)位，尤其是氧取代基。目前認(rèn)為芳基基團(tuán)還原劑不存在位于磷原子鍵鄰位的取代基。術(shù)語(yǔ)"d-6-烷基"指的是含有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴殘21基。尤其是曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基等。同樣地，"d-4-烷基，，指的是含有1_4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴殘基。"d—6-亞烷基"、"C2-6-亞烷基"等分別為"d-6-烷基"、"C2-6-烷基"的二元基團(tuán)。適當(dāng)?shù)娜蓟⑦€原劑在還原性和空間位阻之間存在著較好的平衡。三芳基膦的化學(xué)性質(zhì)是，切開蛋白質(zhì)-低分子量硫醇組成的混合二硫化物(RS-Cys),而保護(hù)天然蛋白二硫鍵的完整性。有意義的化合物是三芳基膦三磺酸，例如三苯基膦-3,3，,3，，-三磺酸及其類似物。舉例說(shuō)明，三芳基膦還原劑選自三苯基膦-3,3，,3，，-三磺酸及其類似物，如下列9-11化合物中之一。三芳基膦還原劑優(yōu)選使用濃度為0.001-100mM,如0.01-50mM或0.1-25mM。在一項(xiàng)有意義的實(shí)施方案中，三芳基膦還原劑固定在載體上。這有利于還原劑與蛋白質(zhì)分離。通常，三芳基膦還原劑，如9-11化合物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法固定，如在其中一個(gè)芳基基團(tuán)中引入一個(gè)連接基。三芳基膦還原劑12就是還原劑1的一個(gè)連接變異體。反應(yīng)溫度通常是0-40。C,如室溫，反應(yīng)時(shí)間為5秒鐘-幾天，隨具體情況而定。反應(yīng)之后進(jìn)行高效液相色鐠分析，確定是否發(fā)生轉(zhuǎn)變。溶劑優(yōu)選水溶液，含有DMSO或DMF等助溶劑。溶劑也可含有鹽，如4丐鹽。R=H,Me，Et,Pr'2-Pr,Bu,Me。，EtO,PrO,2扁PrO,BuO.結(jié)合(conjligation)上述選擇性還原方法的一個(gè)重要目的就是釋放半胱氨酸基團(tuán)，用于化學(xué)基團(tuán)(如非多肽部分)的連接(結(jié)合)。因此，在一項(xiàng)重要的實(shí)施方案中，在選擇性還原的同時(shí)或隨后，將至少一個(gè)選擇性還原的半胱氨酸(HS-Cys)部分與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合。應(yīng)當(dāng)理解，至少一個(gè)選擇性還原的半胱氨酸殘基與化學(xué)基團(tuán)的結(jié)合可以與選擇性還原同時(shí)進(jìn)行，也可以隨后進(jìn)行，同時(shí)進(jìn)行就是在含有氧化還原緩沖體系的混合物中加入一種或多種參與結(jié)合反應(yīng)的試劑，隨后進(jìn)行就是在選擇性還原蛋白經(jīng)純化或分離后。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)基團(tuán)是延長(zhǎng)作用基(protractorgroup),即該基團(tuán)結(jié)合到蛋白質(zhì)(如因子IX多肽)上后，能夠相比較未修飾的蛋白或多肽而言延長(zhǎng)蛋白或多肽的循環(huán)半壽期。延長(zhǎng)作用的特定原理可能是，使多肽序列變大，隱蔽多肽酶或抗體識(shí)別的位點(diǎn)，或使多糖分子變大，將其隱蔽，不被肝細(xì)胞或巨嗜細(xì)胞表面的多糖特異性受體識(shí)別，防止或減少它們的清除。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，延長(zhǎng)作用基選自(a)有機(jī)帶電小分子(15-l，000Da),可包括一個(gè)或多個(gè)羧酸，磺酸胺，磷酸或其結(jié)合。(b)中性親水性小分子(15-1,000Da),如環(huán)狀糊精，或任選含有支鏈的聚乙烯鏈。(c)疏水性小分子，如脂肪酸或膽汁酸及其衍生物。(d)平均分子量為2,000-60,000Da的聚乙二醇。(e)定義明確的精密(precision)聚合物，如分子量精確為700-20，000Da的樹狀分子，更優(yōu)選的是分子量為700-10，000Da。(f)基本上無(wú)免疫原性多肽，如清蛋白或抗體或任選含有Fc片段的抗體的部分。(g)大分子有機(jī)聚合物，如右旋糖酐。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，延長(zhǎng)作用基選自樹狀分子或聚亞烷基氧化物(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG),含支鏈的PEGs,聚乙烯醇(PVA),聚羧酸脂，聚乙烯吡咯酮，聚乙烯-順丁烯二酸酐，聚苯乙烯-順丁烯二酸肝和右23旋糖酐，右旋糖酐包括羧甲基葡聚糖。在本發(fā)明的一項(xiàng)有意義的實(shí)施方案中，延長(zhǎng)作用基是PEG基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"支鏈聚合物"或"樹狀聚合物"、"樹狀分子"或"樹狀結(jié)構(gòu)"指的是有些含有支鏈的單體聚合而成的有機(jī)聚合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，延長(zhǎng)作用基選自由血清蛋白配體組成的基團(tuán)，這些配體包括結(jié)合到白蛋白上的化合物，如脂肪酸，C5-C24月旨肪酸，脂肪族二元酸(如C5-C24)。其它延長(zhǎng)作用基包括有機(jī)小分子或中性取代基，有機(jī)小分子含有在生理?xiàng)l件下電荷能發(fā)生改變的部分，例如羧酸或胺，中性取代基能防止多糖的特異性識(shí)別，如較小的烴基取代基(例如Cl-C5烷基)。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，延長(zhǎng)作用基是白蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，化學(xué)基團(tuán)是非多肽。在一項(xiàng)有意義的實(shí)施方案中，化學(xué)基團(tuán)是聚乙二醇(PEG),尤其是平均分子量為500-100,000的PEG，如1,000-75，000或2,000-60,000。結(jié)合反應(yīng)可以按照WO02/077218Al或WO01/58935A2中公開的方法進(jìn)行。PEG可以用作與蛋白結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"聚乙二醇"或"PEG"指的是，聚乙二醇化合物及其衍生物，含或不含偶合劑，偶合或激活一些基團(tuán)(如硫醇、三氟甲磺酸、三氟乙磺酸、氮丙環(huán)、環(huán)氧乙烷、硫代吡啶、乙烯砜，優(yōu)選馬來(lái)酰亞胺)?；衔锶珩R來(lái)酰亞胺基單甲氧PEG就是本發(fā)明中一種有活性的PEG化合物。PEG是合適的聚合物分子，因?yàn)榕c多糖如右旋糖肝相比，它所含的具有交叉反應(yīng)的基團(tuán)很少。尤其是，單功能的PEG,如單甲氧基聚乙二醇(mPEG)很有意義，因?yàn)樗慕Y(jié)合化學(xué)反應(yīng)相對(duì)簡(jiǎn)單(只有一個(gè)反應(yīng)基參與多肽表面基團(tuán)的結(jié)合反應(yīng))。因此，交叉反應(yīng)減少，目的多肽結(jié)合產(chǎn)物的同源性更大，聚合物分子與多肽的反應(yīng)也更容易控制。為了使聚合物分子結(jié)合到多肽上，活化型的聚合物分子含有羥基末端，即反應(yīng)活性基。有商業(yè)化的活化聚合物分子，如Shearwater公司，Huntsville,Ala.,USA或PolyMASCPharmaceuticalsplc,UK公司提供的活化聚合物分子?；蛘?，可以用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法激活聚24合物分子，如WO90/13540中公開的方法。本發(fā)明中使用的線型或支鏈活化聚合物分子在Shearwater公司1997和2000的目錄(具有生物功能的聚合物用作研究和藥物，聚乙二醇及其衍生物，僅作參考)中有講述。活化PEG聚合物包括下列線型PEGs:NHS-PEG(如SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA國(guó)PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC誦PEG、SG國(guó)PEG和SCM誦PEG)，和NOR-PEG)，BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO誦PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS曙PEG、IODO-PEG和MAL-PEG;和支鏈PEGs,如PEG2-NHS,以及U.S.Pat.No.5,932,462和U.S.Pat.No.5,643，575中公開的PEGs,這兩種出版物僅供參考。此外，下列出版物，僅供參考，也公開了有用的聚合物分子和/或PEG化的化學(xué)物U.S.Pat.No.5,824,778、U.S.PatNo.5,476,653、WO97/32607、EP229,108、EP402,378、U.S.Pat.No.4,902,502、U.S.Pat.No.5,281，698、U.S.Pat.No.5,122,614、U.S.Pat.No.5,219,564、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、W〇98/32466、WO95/06058、EP439508、W〇97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、U.S.Pat.No.5,736,625、WO98/05363、EP8099%、U.S.Pat.No.5,629,384、WO96/41813、WO96/07670、U.S.Pat.No.5,473,034、U.S.Pat.No.5,516，673、EP605963、U.S.Pat.No.5,382,657、EP510356、EP400472、EP183503和EP154316。多肽和活化聚合物分子可用傳統(tǒng)方法結(jié)合，如下面參考文獻(xiàn)中講(1991),"蛋白固定化，基礎(chǔ)和應(yīng)用，，，MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992)，"蛋白質(zhì)偶合(conjugation)和交聯(lián)化學(xué)，，，CRCPress,BocaRaton;G.T.Hermanson等，(1993),"固定化親和配體技術(shù)",AcademicPress,N.Y.。技術(shù)人員知道活化方法和/或結(jié)合化學(xué)反應(yīng)取決于多肽的附加基團(tuán)(如上所述)和聚合物的功能基團(tuán)(如，胺、羥基、羧基、乙醛基、巰基、琥珀酰亞胺、馬來(lái)酰亞胺、乙烯砜或鹵代乙酸)。聚乙二醇化可用于多肽表面附加基團(tuán)(即這些附加基團(tuán)暴露于多肽表面)的共價(jià)25修飾，或一個(gè)或多個(gè)特異的附加基團(tuán)，如N-末端氨基酸(U.S.Pat.No.5,985,265)的共價(jià)修飾。此外，結(jié)合可以一步完成，也可以分步完成(如WO99/55377中所述)。應(yīng)當(dāng)理解，聚乙二醇化的目的是產(chǎn)生最佳的分子，包括PEG分子的數(shù)量、大小、形式(無(wú)論是線型還是支鏈型)以及多肽中PEG分子的結(jié)合位置?？紤]到所要到達(dá)的效果，要選擇分子量合適的聚合物。例如，如果結(jié)合反應(yīng)的主要目的是產(chǎn)生高分子和較大的結(jié)合物(如減少腎清除率)，那么就可以將一個(gè)或一些高分子聚合物結(jié)合起來(lái)，或者將大量的低分子聚合物結(jié)合到一起。在實(shí)施方案中，使用幾個(gè)低分子聚合物。這種情況也適用于大量的抗原決定簇需要隱蔽時(shí)。在這種情況下，要用到分子量約5,000Da的聚合物2-8個(gè)，如3-6個(gè)。在下面的例子中，要達(dá)到延長(zhǎng)多肽體內(nèi)半壽期的效果，使用大量低分子聚合物(如4-6個(gè)MW為5,000的聚合物)比使用少數(shù)幾個(gè)高分子聚合物((如1-3個(gè)MW為12,000-20,000的聚合物)更有利，即使這兩種情況產(chǎn)生的多肽總的分子量相同或相近。據(jù)人們所知，與單個(gè)高分子聚合物相比，大量低分子聚合物可以使多肽的直徑或表觀大小變大，至少當(dāng)聚合物相對(duì)均勻地分步于多肽表面時(shí)是這樣的。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明的大部分結(jié)合物的表觀大小(也叫"表觀分子量，，或"表觀質(zhì)量，，)至少為約50kDa,如約55kDa、60kDa、66kDa時(shí)，產(chǎn)生的結(jié)果更好。原因是，當(dāng)結(jié)合物的表觀大小足夠大時(shí)，就基本消除其腎清除率。在本文中，蛋白結(jié)合物或因子IX多肽的"表)(見大小"可用SDS-PAGE電泳測(cè)定。此外，據(jù)報(bào)道，聚合物結(jié)合過多會(huì)導(dǎo)致化學(xué)基團(tuán)(如非多肽)結(jié)合蛋白(如因子IX多肽)的活性丟失(如下所述)。解決此問題的方法是，去除位于功能位點(diǎn)的附加基團(tuán)或者在結(jié)合前可逆地封閉功能位點(diǎn)，使得結(jié)合時(shí)功能位點(diǎn)被封閉。特異地說(shuō)，就是用輔助分子如絲氨酸蛋白酶抑制劑封閉蛋白的功能位點(diǎn)后，再將蛋白和化學(xué)基團(tuán)(如非多肽)結(jié)合。優(yōu)選地，輔助分子能特異性識(shí)別蛋白的功能位點(diǎn)，例如受體或抑制劑的活性部位，從而保護(hù)催化三元體周圍的區(qū)域(位于催化三聯(lián)體原子IOA位的氨基酸殘基)。輔助分子也可以是抗體，尤其是識(shí)別蛋白(如因子IX多肽)的單26克隆抗體。尤其是，輔助分子為中和性單克隆抗體。優(yōu)選的是，蛋白在與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合前先與輔助分子結(jié)合。(使用和混合二硫化物還原反應(yīng)中相同的輔助分子(如抑制物)更有利)。這樣就能確保蛋白的功能位點(diǎn)受到屏蔽或保護(hù)，不能用于化學(xué)基團(tuán)(如非多肽)如聚合物的結(jié)合。與輔助分子結(jié)合后，化學(xué)基團(tuán)就可以和至少有一部分功能位點(diǎn)受到保護(hù)的蛋白結(jié)合。制劑和給藥方式本發(fā)明的其中一方面涉及藥物制劑，包括FIX類似物的干燥劑型，為何醫(yī)生或患者在使用之前要加溶劑和/或稀釋劑。"干燥劑型，，指的是流體藥物或制劑經(jīng)冷凍干燥(即凍干法，參見Williams和Polli(1984)J.ParenteralSci.Technol.38:48-59),噴霧干燥(參見Masters(1991)inSpray-DryingHandbook(5thed;LongmanScientificandTechnical,Essez,U.K.),pp.491-676;Broadhead等(1992)DrugDevel.Ind.Pharm.18:1169-1206;andMumenthaler等(1994)Pharm.Res.11:12-20),或空氣干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology25:459-470;和Roser(1991)Biopharm.4:47-53)。本發(fā)明的另一方面涉及藥物制劑，包括FIX類似物的水溶液和緩沖體系，其中，F(xiàn)IX類似物的濃度為0.01mg/ml或以上，其中該制劑的pH值為約2.0-10.0。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，緩沖體系選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、雙甘氨肽、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、二氫磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬氨酸或它們的混合物。每種特異的緩沖體系都可以組成本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，制劑包括配藥學(xué)上可接受的防腐劑。防腐劑選自苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)曱酚、對(duì)羥基苯曱酸曱酯、對(duì)羥基苯曱酸丙酯、2-苯氧乙醇、對(duì)羥基苯曱酸丁酯、2-苯乙醇、苯曱醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝醇、苯曱酸、咪脲、氯己定、脫氫醋酸鈉、氯化甲酚、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、氯化千乙銨、3口-氯化苯氧丙烷-1,2-二醇，及其混合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，防腐劑的濃度分別為O.lmg/ml-20mg/ml、0.1mg/ml-5mg/ml、5mg/ml-10mg/ml、10mg/ml-20mg/ml。每種特異的防腐劑都能組成本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案。藥物組合物里使用防腐劑是技術(shù)人員熟知的。為方便，可以參考Remington:77zeiScz'e/7ceaw<i尸n2c/7ceq/尸/zarmacy,19thedition,1995。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，制劑包括等張溶劑(isotonicagent)。等張溶劑選自鹽、糖或糖醇、氨基酸(L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛醇(如丙三醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(如PEG400)及其混合物。單糖、雙糖、或多糖、或水溶性葡聚糖，例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、戊醛糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖肝、支鏈淀粉、糊精、環(huán)式糊精、可溶淀粉、羥乙基淀粉、羧甲基纖維素等也可以使用。在實(shí)施方案中，添加的糖是蔗糖。糖醇是至少含有一個(gè)羥基的C4-C8烴，例如甘露醇、山梨醇、纖維醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在實(shí)施方案中，添加的糖醇是甘露醇。上面提到的糖或糖醇可以單獨(dú)或聯(lián)合使用。使用的量沒有明確限制，只要糖或糖醇溶于流體中，并且不會(huì)對(duì)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的穩(wěn)定效果起反作用。在實(shí)施方案中，糖或糖醇的濃度約為1mg/ml-150mg/ml。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，等張溶劑的濃度分別為1mg/ml-50mg/ml、1mg/ml-7mg/ml、8mg/ml-24mg/ml、25mg/ml-50mg/ml。每種特異的等張溶劑都能組成本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案。藥物組合物里使用等張溶劑是技術(shù)人員熟知的。為方便，可以參考Remington:7TzeS".ewce朋c/尸rac"ceq/"尸/^畫qy,19thedition,1995。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，制劑包括螯合劑。螯合劑選自乙二胺四乙酸鹽(EDTA)、檸檬酸、天冬氨酸及其混合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，螯合劑的濃度分別為0.1mg/ml-5mg/ml、0.1mg/ml-2mg/ml、2mg/ml-5mg/ml。每種特異的螯合劑都能組成本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案。藥物組合物里使用螯合劑是技術(shù)人員熟知的。為方1"更,可以參考Remington:ZTzeiSc/e"ce尸n2c"ce0/尸/zarm"cy,'19thedition,1995。28在本發(fā)明的實(shí)施方案中，制劑包括穩(wěn)定劑。藥物組合物里使用穩(wěn)定劑是技術(shù)人員熟知的。為方便，可以參考Remington:77^Sc/e"ce/V(2c"ce0/尸/zarmacy,19thedition,1995。本發(fā)明的藥物組合物里還包括一定量的氨基酸基Ominoacidbase),能夠減少藥物儲(chǔ)存時(shí)多肽聚集體的形成。"氨基酸基"指的是單個(gè)氨基酸或氨基酸的組合，這些氨基酸可以是游離基(base)形態(tài)，也可以是鹽形態(tài)。如果是氨基酸的組合，所有的氨基酸都可以是游離基形態(tài)或者鹽形態(tài)，或者一部分氨基酸是游離基形態(tài)，而其它氨基酸是鹽形態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的氨基酸是側(cè)鏈帶電荷的氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。一些特殊氨基酸(如甘氨酸、蛋氨酸、組氨酸、咪唑氨基酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸和它們的混合物)的立體異構(gòu)體(即左旋、物里，:口、要這些特殊氨i酸二游離基形態(tài)i鹽形態(tài)存在。在S施方案中，使用的是左旋立體異構(gòu)體。本發(fā)明也可以使用這些氨基酸的類似物。"氨基酸類似物"指的是天然氨基酸的衍生物，這些天然氨基酸能夠減少本發(fā)明的流體藥物組合物在儲(chǔ)存過程中多肽聚集體的形成。合適的精氨酸類似物包括胍氨酸，鳥氨酸，N-乙基左旋精氨酸，合適的蛋氨酸類似物包括乙硫氨酸，丁硫氨酸，合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基左旋半胱氨酸。和其它氨基酸一起，這些氨基酸類似物以游離基形態(tài)或鹽形態(tài)被添加到藥物組合物里。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所使用的氨基酸或氨基酸類似物的濃度，足以防止或延遲蛋白的聚集。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，如果治療作用的多肽至少包括一個(gè)易于被氧化的蛋氨酸殘基，那么添加蛋氨酸(或其它含硫氨基酸或其類似物)就可以抑制蛋氨酸殘基氧化成蛋氨酸亞砜。"抑制，，指的是，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，使蛋氨酸氧化產(chǎn)物的積聚最少。抑制蛋氨酸氧化能更持久地保持多肽的分子形態(tài)。也可以使用蛋氨酸的立體異構(gòu)體(如左旋、右旋或外消旋異構(gòu)體)或它們的組合。使用的量應(yīng)當(dāng)足以抑制蛋氨酸殘基的氧化，使產(chǎn)生的蛋氨酸亞砜的量達(dá)到管理機(jī)構(gòu)的要求。一般來(lái)說(shuō)，這意味著藥物組合物里蛋氨酸亞砜的含量不超過約10%-30%。通常，添加的蛋氨酸和蛋氨酸殘基的比率約為1:1-1000:1，如10:1-29約100:1就能達(dá)到要求。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，制劑包括穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑選自高分子聚合物或低分子化合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯酮、羧基-氧化纖維素或它們的衍生物(如羥丙基纖維素、HPC-SL、HPC-L和羥丙基曱基纖維素)、環(huán)式糊精，含硫物質(zhì)如硫代甘油、巰基乙酸、甲基硫代乙醇和各種鹽(如氯化鈉)。每種特異的穩(wěn)定劑都能組成本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案。藥物組合物也包括穩(wěn)定劑，進(jìn)一步提高具有治療作用的活性多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明使用的穩(wěn)定劑包括蛋氨酸和EDTA，但不局限于這些，防止多肽的蛋氨酸殘基被氧化，也包括非離子型表面活性劑，防止在凍融或機(jī)械剪切過程中多肽發(fā)生聚集。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，制劑包括表面活性劑。表面活性劑可以是去垢劑、乙氧基蓖麻油、聚乙二醇甘油酯、乙?；视鸵货?、山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物(如泊洛沙姆，包括PluromcF68、泊洛沙姆188和407,TritonX-100)、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯的烷基和烷氧基衍生物(吐溫如吐溫-20,吐溫-40，吐溫-80和Brij-35)、甘油一酯或其乙氧基化書f生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、乙醇、甘油、植物凝血素和磷脂(如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂衍生物(如二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂(如棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和1-?；?磷脂酰乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸)和溶血磷脂、卵磷脂的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，如溶血卵磷脂，二棕櫚酰磷脂酰膽堿的十二酰和十四酰衍生物，和極性基團(tuán)的修飾，如膽堿，乙醇胺，磷脂酸，絲氨酸，蘇氨酸，甘油，肌醇，和帶正電荷的DODAC,DOTMA，DCP,BISHOP,溶血磷脂酰絲氨酸，溶血磷脂酰蘇氨酸，甘油磷脂(如腦磷脂)，甘油糖脂(如半乳糖吡喃糖苷)，神經(jīng)鞘糖脂(如神經(jīng)酰胺，神經(jīng)節(jié)苷脂)，十二烷基磷脂酰膽堿，雞蛋溶血卵磷脂，梭鏈孢酸衍生物(如?；嵌搴置顾徕c等)，長(zhǎng)鏈脂肪酸及其C6-C12鹽(如油酸和辛酸)，?；鈮A及其衍生物，賴氨酸、精氨酸或組氨酸的Na-酰基衍生物，或30賴氨酸、精氨酸的側(cè)鏈?；苌铮牡膇sr-?；苌铮陌ㄙ嚢彼?、精氨酸、組氨酸和中性或酸性氨基酸的任一組合，三肽的Na-?；苌?，三肽包括中性氨基酸和兩個(gè)帶電荷氨基酸的任一組合，DSS(琥珀辛酯鈉，CAS登錄號(hào)為[577-11-7];琥珀辛酯4丐，CAS登錄號(hào)為[128-49-4];琥珀辛酯鉀，CAS登錄號(hào)為[7491-09-0]),SDS(十二烷基磺酸鈉)，辛酸鈉，膽汁酸及其衍生物，膽汁酸及其鹽和甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合物，膽烷酸，膽酸鈉，脫氧膽酸鈉，牛黃膽酸鈉，甘膽酸鈉，N-十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-l-丙磺酸鹽，單價(jià)陰離子表面活性劑(烷基-烷基-磺酸鹽)，兩性離子表面活性劑(如N-烷基-N,N-二曱胺-l-丙磺酸鹽，3-膽氨-l-丙基二甲胺-l-丙磺酸鹽)，陽(yáng)離子表面活性劑(季銨)(如十六烷基-三甲基溴化銨，十六烷基吡啶氯化物)，非離子型表面活性劑(如十二烷基(3-D-喃葡萄糖)和聚氧乙烯聚氧丙烯乙二胺共聚物(如Tetronic，s),泊洛沙胺(poloxamines)是四功能化合物的嵌段共聚體，是由環(huán)氧丙烯和環(huán)氧乙烯連續(xù)連接到乙二胺上組成的，或者表面活性劑可選自咪唑啉的衍生物，或者它們的混合物。每種特異的表面活性劑都能組成本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案。藥物組合物里使用表面活性劑是技術(shù)人員熟知的。為方便，可以參考Remington:77zeS".ewceaw<i尸rac〃ceo/尸/z"，aqy,19edition,1995。其它成分也可以用于本發(fā)明的藥物制劑里，包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、抗氧化劑、疏松劑、增強(qiáng)劑、螯合劑、金屬離子、油質(zhì)物、蛋白質(zhì)(如人血清白蛋白、膠質(zhì)蛋白等)和兩性離子(如三甲銨乙內(nèi)酯、?；撬?、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。當(dāng)然，這些添加劑不能對(duì)本發(fā)明藥物制劑總的穩(wěn)定性起反作用。胃腸道外給藥方式包括皮下注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射或靜脈注射，可以使用鋼筆型注射器注射，也可以使用輸液器注射。另外一種胃腸道外給藥方式是，F(xiàn)IX化合物的溶液或懸液通過鼻腔或肺噴霧給藥。含有FIX化合物的藥物也適用于經(jīng)皮膚給藥，如無(wú)針注射或離子導(dǎo)入療法，或經(jīng)粘膜給藥，如經(jīng)口腔粘膜給藥。定義"因子IX，，或"FIX"在本文中指的是人血漿因子IX糖蛋白，它是內(nèi)原性凝血途徑的一員，是凝血過程必需的。應(yīng)當(dāng)理解，該定義包括天然和重組形式的人血漿因子IX糖蛋白。除非另有規(guī)定或說(shuō)明，這里所說(shuō)的因子IX是指任何在凝血過程中發(fā)揮正常作用的有功能的人因子IX蛋白分子，包括任何片段，類似物及其衍生物等。"天然FIX"指的是SEQIDNO:l中給出的人FIX分子全長(zhǎng)。根據(jù)SEQIDNO:l對(duì)氨基酸殘基位置進(jìn)行編號(hào)，氮末端的第一個(gè)氨基酸殘基編號(hào)為1,依次類推。術(shù)語(yǔ)"類似物"指的是含有SEQIDNO:l中氨基酸序列的因子FIX,其中母蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代，或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被去除，或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基插入母蛋白中，或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基加入母蛋白中。這個(gè)增加可能發(fā)生在母蛋白的N-末端、C-末端或兩者都有。這種定義下的"類似物"，其活化型仍具有FIX的活性。在實(shí)施方案中，變異體的氨基酸序列與SEQIDNO:1中氨基酸序列的同一性分別達(dá)到70%,80%,90%和95%。本文中提及的特異位置均指與SEQIDNO:l中相應(yīng)的位置。除非另有說(shuō)明，因子IX結(jié)構(gòu)域包括以下氨基酸殘基谷氨酸結(jié)構(gòu)域，包括從殘基Tyrl到殘基Lys43的區(qū)域；EGF1結(jié)構(gòu)域，包括從殘基Gln44到殘基Leu84的區(qū)域；EGF2結(jié)構(gòu)域，包括從殘基Asp85到殘基Argl45的區(qū)域；激活肽結(jié)構(gòu)域，包括從殘基Ala146到殘基Argl80的區(qū)域；蛋白酶結(jié)構(gòu)域，包括從殘基Val181到殘基Thr414的區(qū)域。輕鏈?zhǔn)侵赴ü劝彼峤Y(jié)構(gòu)域，EGF1和EGF2結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的區(qū)域，而重鏈?zhǔn)侵傅鞍酌附Y(jié)構(gòu)域。"FIX半壽期，，是指因子IX在血循環(huán)中的半壽期，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員采用已知的標(biāo)準(zhǔn)程序，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)，對(duì)人或動(dòng)物如老鼠進(jìn)行測(cè)量得到的。"FIX活性，，或"FIX的生物活性，，的定義為,在血液凝固中發(fā)揮作用的能力，包括在活化血小板表面與FVIIIa相互作用，激活FX成FXa，并促進(jìn)血凝塊形成。這種活性可以在體外通過凝血實(shí)驗(yàn)測(cè)定，如McCarthy等，ThrombHaemost.2002May;87(5):824畫30中講述的方法，也可以用其它本領(lǐng)域的4支術(shù)人員已知的方法測(cè)定。32"延長(zhǎng)型FIX"是指FIX化合物，與天然的人FIX相比，其給藥后在患者體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)。術(shù)語(yǔ)"插入型氨基酸殘基"包括兩種，一種是取代天然FIX分子中天然氨基酸殘基的插入型氨基酸殘基，該氨基酸殘基通常不會(huì)出現(xiàn)在該位點(diǎn)；另一種是在天然人FIX分子中新插入的氨基酸殘基。這個(gè)新插入的氨基酸殘基可以在兩個(gè)原氨基酸殘基中間，也可以在天然FIX分子的N-末端或C-末端。術(shù)語(yǔ)"聚乙二醇化FIX"指的是結(jié)合PEG分子的FIX。"半胱氨酸聚乙二醇化FIX"指的是含有與FIX分子中外源性半胱氨酸殘基巰基結(jié)合的PEG分子的FIX。本文用到的氨基酸取代的術(shù)語(yǔ)如下第一個(gè)字母代表出現(xiàn)在人FVIII中的天然氨基酸殘基。后面的數(shù)字代表氨基酸殘基在人FIX中的位置。第二個(gè)字母代表取代天然氨基酸殘基的不同氨基酸殘基。如E162C,指的是人FIX第162位的賴氨酸殘基被半胱氨酸殘基取代。在本文中，使用三個(gè)字母或一個(gè)字母的氨基酸殘基傳統(tǒng)筒稱形式，如表2所示。除非有特別說(shuō)明，本文所提到的氨基酸殘基都指左旋氨基酸殘基。此外，除非另有說(shuō)明多肽氨基酸殘基序列的左右兩端分別是指N-末端和C-末端。表2:氨基酸殘基的簡(jiǎn)稱:<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>術(shù)語(yǔ)"低分子量硫醇-結(jié)合(RS-Cys)形式"和類似的術(shù)語(yǔ)指的是所涉及的蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基的巰基與含巰基的化合物結(jié)合，其中該化合物的分子量小于500Da。這類化合物包括谷胱苷肽，"谷氨酰半胱氨酸，半胱氨酰甘氨酸，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，半胱胺等。術(shù)語(yǔ)"活化型"指的是能夠發(fā)揮所需作用的蛋白質(zhì)形態(tài)，例如催化劑(酶)，酶原，或輔助因子等。"活化型，，有時(shí)也被稱為"正確折疊形態(tài)"。蛋白質(zhì)通常是"工程化，，多肽，與天然蛋白相比至少包含一個(gè)非天然半胱氨酸殘基。這種"工程化"多肽優(yōu)先采用重組技術(shù)制備，這種技術(shù)是本領(lǐng)域的4支術(shù)人員所熟知的，參見WO02/077218Al和WO01/58935A2。本文引用的所有參考資料包括出版物，專利申請(qǐng)和專利的全部?jī)?nèi)容均通過引用結(jié)合到本文中，正如每一份參考資料均單獨(dú)并特別的通過引用結(jié)合并在本文中列出其全部?jī)?nèi)容。本文使用的所有標(biāo)題和副標(biāo)題都只為方便，無(wú)i侖如何都不應(yīng)纟皮理解為限制發(fā)明。本文提供的任何以及所有實(shí)例或者示例性語(yǔ)言(例如，"如")只是為了更好地闡述本發(fā)明，除非另有聲明，并不限制發(fā)明的范圍。本說(shuō)明書中的語(yǔ)言不應(yīng)理解為指明任何對(duì)本發(fā)明的實(shí)施非常必要的未聲明要素。本文引用并整合專利文獻(xiàn)只是為了方便，并不反映任何針對(duì)專利文獻(xiàn)合法性、專利性或執(zhí)行性的觀點(diǎn)。本發(fā)明包括附屬權(quán)利要求中所列主題的所有修改版和等價(jià)物，是法律所允許的。本發(fā)明的實(shí)施方案1.循環(huán)半壽期延長(zhǎng)的FIX類似物，其中在位點(diǎn)44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。2.實(shí)施方案1的FIX類似物，其中在位點(diǎn)44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80或84的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。3.實(shí)施方案1的FIX類似物，其中在位點(diǎn)87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141或142的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。4.實(shí)施方案1的FIX類似物，其中在位點(diǎn)185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。5.實(shí)施方案1的FIX類似物，其中在位點(diǎn)146-180的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。6.實(shí)施方案1的FIX類似物，其中在選自位點(diǎn)155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176或177的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)一皮結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。7.實(shí)施方案1的FIX類似物，其中在選自位點(diǎn)160、161、162、163、164、165和166的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。8.實(shí)施方案7的FIX類似物，其中E162位的氨基酸殘基被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增力口。9.循環(huán)半壽期延長(zhǎng)的FIX類似物，其中至少一個(gè)半胱氨酸殘基附加在C-末端T415上，該半胱氨酸殘基與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。10.上述任一實(shí)施方案的FIX類似物，其中化學(xué)基團(tuán)選自聚乙二醇(PEG)。11.實(shí)施方案10的FIX類似物，其中聚乙二醇的平均分子量為500-100,000,例如1000-75,000或2,000-60,000。12.上述任一實(shí)施方案的FIX類似物，其中類似物的循環(huán)半壽期至少為野生型FIX的1.5〃浩。13.上述任一實(shí)施方案的FIX類似物，用凝血實(shí)4全測(cè)定時(shí)，其中類似物的生物活性至少為野生型的20%。14.一種制備上述任一實(shí)施方案的FIX類似物的方法，包括a)選4奪性還原工程化FIX多肽，該多肽在選自44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、36341、372、374、391、392、406、410、413或415之一的位點(diǎn)至少包括一個(gè)非天然半胱氨酸殘基，其通過二硫鍵與低分子量硫醇(RS-CYS)結(jié)合，方法是使低分子量硫醇結(jié)合的FIX與包含氧化還原緩沖體系的混合物反應(yīng)；b)與之同時(shí)或隨后，將至少一個(gè)選擇性還原的半胱氨酸.(HS-Cys)部分與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合。15.實(shí)施方案14的方法，其中氧化還原緩沖體系包括含有還原型和氧化型谷胱甘肽和谷氧還蛋白的混合物。16.—種制備實(shí)施方案1-13中任一方案的FIX類似物的方法，包括a)選才奪性還原工程化FIX多肽，該多肽在選自44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415之一的位點(diǎn)至少包括一個(gè)非天然半胱氨酸殘基，其通過二硫鍵與低分子量硫醇(RS-CYS)結(jié)合，方法是使低分子量硫醇結(jié)合的FIX與包含三芳基膦3，3，,3"-三磺酸化合物的混合物反應(yīng)；b)與之同時(shí)或隨后，將至少一個(gè)選擇性還原的半胱氨酸(HS-Cys)部分與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合。17.實(shí)施方案14-16的方法，其中化學(xué)基團(tuán)選自聚乙二醇(PEG).18.實(shí)施方案17的方法，其中化學(xué)基團(tuán)是聚乙二醇，尤其是平均分子量為500-100,000,例如1000-75,000或2,000-60,000的PEG。19.用于血友病患者治療的藥物制劑，包含有效治療劑量的實(shí)施方案1-13的FIX類似物和藥學(xué)上可接受的載體。20.—種治療血友病患者的方法，包括給予患者有效治療劑量的實(shí)施方案1-13中任一方案的FIX類似物和藥學(xué)上可接受的載體。21.實(shí)施方案20的方法，其中治療包括每周至少一次的治療。22.實(shí)施方案21的方法，其中治療包括每周只進(jìn)行一次的治療。實(shí)施例下面實(shí)例中使用的氨基酸殘基取代的術(shù)語(yǔ)如下第一個(gè)字母代表37天然出現(xiàn)在SEQIDNO:l所列位置里氨基酸殘基。隨后的數(shù)字代表此氨基酸殘基在SEQIDNO:l中的位置。第二個(gè)字母代表取代天然氨基酸殘基的不同氨基酸殘基。例如因子IXE162C,指的是SEQIDNo:l中162位的谷氨酸殘基被半胱氨酸殘基取代原料-還原型和氧化型谷胱甘肽(分別是GSH和GSSG)購(gòu)自Sigma公司。PEG5k-馬來(lái)酰亞胺(2E2M0H01)，PEG20k-馬來(lái)酰亞胺(2E2M0P01),PEG40k-馬來(lái)酰亞胺(2D3Y0T01)購(gòu)自NektarTherapeutics(Huntsville,AL)公司。其它所有化學(xué)物都是分析等級(jí)或更好的。濃度測(cè)定-儲(chǔ)存液中GSSG的濃度根據(jù)248nm處的吸光度測(cè)定，消光系數(shù)為381M"cm"(Chau和Nelson,1991)。GSH的濃度用Ellman，s試劑(5,5，-二硫雙(2-硝基苯甲酸))測(cè)定，消光系數(shù)為14150M^cm-1,14150M^cm-1是2-硝基-5-硝基苯甲酸在412nm處的摩爾消光系數(shù)(Riddles等，1979)。谷氧還蛋白的克隆和表達(dá)_編碼埃希氏菌屬大腸桿菌谷氧還蛋白2序列(Grx2)的DNA用耐熱高保真PCR系統(tǒng)(羅氏診斷公司，Indianapolis,IN)，按照廠商的說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其引物對(duì)oHOJ98-f/oHOJ98含有側(cè)面WtM和A7zo1兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)(引物序列在表l中列出)。PCR反應(yīng)的基因組模板DNA按照標(biāo)準(zhǔn)程序從E.coli中提取而來(lái)(Grimberg等，1989)。純化的PCR產(chǎn)物用NdeI和XhoI酶切，然后與pET-24a(+)(Novagen)連接構(gòu)建pHOJ294。由于載體含有終止密碼子，基因擴(kuò)增的延長(zhǎng)反應(yīng)從3，載體端開始，編碼的C-末端含有LEHHHHHH親和標(biāo)簽。DNA測(cè)序識(shí)別正確的克隆。基因表達(dá)時(shí)，294質(zhì)粒被導(dǎo)入化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)(Stmtagene,LaJolla,CA)。培養(yǎng)過夜的新鮮轉(zhuǎn)化菌抹接種到500ml、含30(ig/ml卡那霉素的TB培養(yǎng)基(Sambrook等，1989)中,初始OD600為0.02。在三角瓶中，37。C,230rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD6003-4),溫度降低至25。C，0.1mM的異丙基-P-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。過夜培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，50ml細(xì)菌裂解液(50mM磷酸鉀，300mM氯化鈉，pH8.0)重懸細(xì)胞，反復(fù)三次凍融裂解細(xì)胞。細(xì)菌裂解液平衡20mlNi-NTA瓊脂糖凝月交柱(QiagenGmbH,Hilden,Germany),然后將細(xì)菌裂解產(chǎn)物過瓊脂糖凝膠柱，5ml/min。細(xì)菌裂解液流洗，含0-200m線性梯度咪唑的細(xì)菌裂解液洗脫結(jié)合蛋白。收集處于峰值的部分，20mM二石危蘇糖醇處理20分鐘，50mMTris-HCl,2mMEDTA,pH8.0溶液中透析。-80°C儲(chǔ)存，SDS-PAGE電泳判斷其純度大于90%。280nm處吸光度計(jì)算濃度，消光系數(shù)為21740M"cm-1。構(gòu)建編碼因子IX和因子IXE162C和因子IX416C突變體的DNA分別編碼因子IXE162C和因子IX416C的質(zhì)粒pHOJ338和pHOJ358的構(gòu)建方法是，使用(^11化1^0^1^6@定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，引物?duì)oHOJ137-f/oHOJ137-r和oHOJ155-f/oHOJ155-r(見表l)作為模板，按照廠商的說(shuō)明書(Stratagene,LaJolla,CA)進(jìn)行構(gòu)建。DNA測(cè)序識(shí)別所有正確的克隆序列。因子IX及其突變體的純化-因子IX及其突變體按照Arruda等(2001)說(shuō)ood，97,130-138中講述的方法純化，此外，收集含有因子IX的片段(Cys突變體)，50mMHEPES,100mMNaCl,10mMCaCl2,pH7.0溶液中透析，-80。C儲(chǔ)存。PEG-馬來(lái)酰亞胺修飾FIXCys突變體-選擇性還原步驟包括4.8mgFIXCys突變體，在含0.5mMGSH,20GSSG,和10|iMGrx2，總體積為4.4ml的50mMHEPES，100mMNaCl,10mMCaCl2,pH7.0緩沖液中，30。C孵育5小時(shí)。隨后，加入終濃度為0.8mM的PEG5k-馬來(lái)酰亞胺，PEG20k-馬來(lái)酰亞胺或PEG40k-馬來(lái)酰亞胺(溶于水中)選才奪性^^飾生成的游離石克醇。室溫，15分鐘，烷化石克醇和0.5mM半胱氨酸發(fā)生退火反應(yīng)。加入含過量鈣離子(終濃度20mM)的EDTA，將所有物質(zhì)加入經(jīng)緩沖液A(50mMHEPES,100mMNaCl,lmMEDTA,pH7.0)平tf的1mlHiTrapQFF(AmershamBiosciences,GEHealthcare)柱中，捕獲FIXCys突變體。緩沖液A流洗，緩沖液B加入安裝在HiTrap柱前面的HiLoadSuperdex20016/60pg柱(AmershamBiosciences)中，洗脫結(jié)合蛋白(IOmMGlyGly,150mMNaCl,10mMCaCl2,0.01%Tween80,pH7.0)。流速1ml/min,分離聚乙二醇化和非聚乙二醇化的蛋白，并測(cè)定280nm處的吸光度。峰值處含聚乙二醇化的FIXCys突變體，收集，-80。C儲(chǔ)存。39用于質(zhì)粒構(gòu)建的DNA寡核苷酸引物質(zhì)粒oH。J98-fpHOJ294oHOJ98-rpHOJ294oHOJ137-pHOJ338OHOJ137-pHOJ338oHOJ155國(guó)fOHOJ155-pHOJ358pHOJ358序列(5，—3，)GCCGCCGGCATATGAAGCTATACATTTACGATCACTGCCCCCGCCGCCCTCGAGAATCGCCATTGATGATAACAAATTGATTTGTGCTATGTAAATTCTACTGAAGCTTGCACCATTTTGGATAACATCACGTGATGTTATCCAAAATGGTGCAAGCTTCAGTAGAATTTACATAGGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTGCTAAGCGGCCGCTTCCCGGGAAGCGGCCGCTTAGCAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC參考文獻(xiàn)BegbieM.E.,MamdaniA.，GataianceS.,Eltringham-SmithL.J.,BhaktaV.,HortelanoG.，和SheffieldW.P.(2005)活化肽結(jié)構(gòu)域在控制血友病B小鼠血液中因子IX水平中的重要作用，r/2row6Z/aewoW94，1138-1147。BrandstetterH,BauerM,HuberR,LollarP,BodeW(1995)凝血因子IXa的X射線結(jié)構(gòu)與Xase活性和血友病B有關(guān)的活性位點(diǎn)和才莫塊結(jié)構(gòu)，/WA92，9796-9800。Chau,M.H.和Nelson,J.W.(1991).通過高效液相色譜直接測(cè)量谷胱甘肽和二硫代蘇糖醇之間的平tf,FEBSLett297,296-298。Fernandes,A.P.和Holmgren,A.(2004)谷氧還蛋白谷胱甘肽依賴型氧化還原酶，其功能遠(yuǎn)超簡(jiǎn)單的硫氧還蛋白備份系統(tǒng)，JWox^i^t/ax.iSVgwa/.,6，63-74。Gilbert,H.F.(1995)，石克醇/二石克化物交換平tlf和二石克《建穩(wěn)定性，40MethodsEnzymol.257,8-28。Grant,C.(2001),小型綜述谷胱甘肽/谷氧還蛋白和石危氧還蛋白系統(tǒng)在酵母生長(zhǎng)和應(yīng)激反應(yīng)中的作用,Mol.Microbiol.39,533-541。Grimberg,J.,Maguire,S.,和Belluscio,L.(1989)，制備質(zhì)粒和染色體大腸桿菌DNA的簡(jiǎn)單方法，NucleicAcidsRes〃,8893。Holmgren,A.,Aslund,F.(1995),谷氧還蛋白，MethodEnzymol.Z52,283-292。Hoffman,C.S.和Winston,F.(1987),10分鐘DNA制備，有效釋放用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的自體質(zhì)粒，Gene57,267-272。HoffmanM.和MonroeD.M.,III(2001)基于細(xì)月包的止血才莫型，T7z圓6腸,W85，958-965。HopfnerK.P.,LangA.,KarcherA.,SichlerK.,KopetzkiE.,BrandstetterH.,HuberR.，BodeW.,EnghR.A.(1999)凝血因子IXa:Tyr99的松弛構(gòu)象阻斷底物結(jié)合，5Yrw"w"Fo/t/wg&JeWg".7,989-96。Loferer,H.,Wunderlich,M.,Hennecke,H.,和Glockshuber,R.(1995)，與胞質(zhì)硫氧還蛋白細(xì)胞，暴露于周質(zhì)的細(xì)菌硫氧還蛋白樣蛋白具有氧化還原特性，J.Biol.Chem.，,26178-26183。Luikenhuis,S.,Perrone,G.,Dawes,I.W.,和Grant,C.M.(1998).酉良酒酵母含有兩個(gè)谷氧還蛋白基因，其為抗活性氧所需，Mol.Biol.Cell9,1081-1091。Lundberg，M.,Johansson,C.，Chandra,J.,Enoksson,M.,Jacobsson,G.,Ljung,J.,Johansson,M.,和Holmgren,A.(2001).具有線粒體和核同種型的新的人谷氧還蛋白(Grx2)的克隆和表達(dá)，JBiolChem276,26269-26275。McCarthy等(2002),在動(dòng)脈內(nèi)和皮下施用給狗和獼猴之后重組因子IX的藥代動(dòng)力學(xué)，ThrombHaemost,87(5):824-30。Rodriguez-Manzaneque,M.T.,Ros,J.,Cabiscol,E.,Sorribas,A.,和Herrero,E.(1999),Grx5谷氧還蛋白在釀酒酵母抗蛋白氧化損傷中起關(guān)鍵作用，MolCellBioWP,8180-8190。Oe,T.,Ohyagi,T.,Naganuma,A.(1998)通過高爻支液相色i普用熒光才全測(cè)測(cè)定y-谷氨酰谷胱甘肽和其它低分子量好u醇化合物，J.Chrom.B,7眠285-289。Ostergaard,H.,Tachibana,C.,和Winther,J.R.(2004).在真核細(xì)胞胞液中監(jiān)測(cè)二疏鍵形成,JCellBiol風(fēng)337-345。Padilla,C.A.,Martinez-Galisteo,E.,Barcena,J.A.,Spyrou,G.,和Holmgren,A.(1995)，從胎盤純化人谷氧還蛋白，其氨基酸序列、結(jié)構(gòu)比較和cDNA克隆，EurJBiochem"7,27-34。Riddles,P.W.,Blakeley,R.L.,和Zerner,B.(1979),Ellman試劑5,5'-二硫代二(2-硝基安息香酸)，重新檢查，Anal.Biochem.9《75-81。Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,和Maniatis,T.(1989),分子克隆實(shí)馬全指南.(冷泉港，NY:冷泉港實(shí)驗(yàn)室)。SchmidtA.E.和BajajS.P.(2003)因子IX和因子IXa的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系,7>￡"<^C"ni^wwcMed13，39-45。Takahashi,N.和Creighton,T.E.(1996),大腸桿菌硫氧還蛋白活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基的反應(yīng)性和離子化，Biochemistry35,8342-8353。Wang,E.C.W.，Hung，S,H.,Cahoon,M.,Hedstrom,L.(1997)Cysl91-Cys220二硫鍵在胰蛋白酶中的作用工程化底物特異性的新目標(biāo),尸roto力i"gz>zee〃>7g,10,405-411。Vlamis-Gardikas,A.,Aslund,F.,Spyrou,G.,Bergman,T.，和Holmgren,A.(1997).來(lái)自大腸桿菌的非典型谷氧還蛋白-谷氧還蛋白2的克隆、過表達(dá)和表征，J.Biol.Chem.272,11236-11243。Yang,Y.,Jao,S.,Nanduri,S.,Starke,D.W.,Mieyal,J.J.,和Qin,J.(1998).人硫醇轉(zhuǎn)移酶(谷氧還蛋白)C7S,C25S,C78S,C82S突變體的反應(yīng)性，其谷胱甘?；旌隙蚧镏虚g體反映催化特異性，Biochemistry37,17145-17156。權(quán)利要求1.循環(huán)半壽期延長(zhǎng)的FIX類似物，其中在位點(diǎn)44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。2.權(quán)利要求1的FIX類似物，其中在位點(diǎn)146-180的天然氨基酸殘基中至少有一個(gè)被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增加。3.權(quán)利要求2的FIX類似物，其中E162位的氨基酸殘基被結(jié)合化學(xué)基團(tuán)的半胱氨酸殘基取代，所述化學(xué)基團(tuán)使得FIX多肽的分子量增力口。4.上述任一權(quán)利要求的FIX類似物，其中化學(xué)基團(tuán)選自聚乙二醇(PEG)。5.權(quán)利要求4的FIX類似物，其中聚乙二醇的平均分子量為500-100,000,例如1000-75,000或2,000-60,000。6.上述任一權(quán)利要求的FIX類似物，其中類似物的循環(huán)半壽期至少為野生型FIX的1.5倍。7.上述任一權(quán)利要求的FIX類似物，當(dāng)用凝血實(shí)-驗(yàn)測(cè)定時(shí)，其中類似物的生物活性至少為野生型FIX的20%。8.—種制備上述任一權(quán)利要求的FIX類似物的方法，包括a)選擇性還原工程化FIX多肽，該多肽在選自44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415之一的位點(diǎn)至少包括一個(gè)非天然半胱氨酸，其通過二硫鍵與低分子量硫醇(RS-CYS)結(jié)合，方法是使低分子量硫醇結(jié)合的FIX與包含氧化還原緩沖體系的混合物反應(yīng)；b)與之同時(shí)或隨后，將至少一個(gè)選擇性還原的半胱氨酸(HS-Cys)部分與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合。9.一種制備權(quán)利要求1-7中任一權(quán)項(xiàng)的FIX類似物的方法，其包括a)選擇性還原工程化FIX多肽，該多肽在選自44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415之一的位點(diǎn)至少包括一個(gè)非天然半胱氨酸，其通過二硫鍵與低分子量硫醇(RS-CYS)結(jié)合，方法是使低分子量硫醇結(jié)合的FIX與包含三芳基膦-3,3',3"-三磺酸化合物的混合物反應(yīng)；b)與之同時(shí)或隨后，將至少一個(gè)選擇性還原的半胱氨酸(HS-Cys)部分與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合。10.權(quán)利要求8-9的方法，其中化學(xué)基團(tuán)選自聚乙二醇(PEG)。11.權(quán)利要求10的方法，其中化學(xué)基團(tuán)是聚乙二醇，尤其是平均分子量為500-100,000,例如1000-75,000或2，000-60,000的PEG。12.—種治療血友病患者的藥物制劑，其包含有效治療劑量的權(quán)利要求1-7的FIX類似物和藥學(xué)上可接受的載體。13.—種治療血友病患者的方法，其包括給予患者有效治療劑量的權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)FIX類似物的和藥學(xué)上可接受的載體。14.權(quán)利要求13的方法，其中治療包括每周至少一次的治療。15.權(quán)利要求14的方法，其中治療包括每周只進(jìn)行一次的治療。全文摘要本發(fā)明涉及FIX類似物，與天然FIX相比，其激活前在血流中的循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)(患者注射一周后，F(xiàn)IX的活性仍至少為注射后初始活性峰值的5％)。本發(fā)明所要求保護(hù)的FIX類似物包含一個(gè)插入型氨基酸殘基，此氨基酸殘基與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合而進(jìn)一步被修飾，所述化學(xué)基團(tuán)增加FIX類似物的分子量。文檔編號(hào)C12N9/64GK101484576SQ200780019090公開日2009年7月15日申請(qǐng)日期2007年5月24日優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日發(fā)明者H·R·斯特尼克,H·奧斯特加德,O·H·奧爾森,T·D·斯蒂恩斯特魯普申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克保健股份有限公司