專(zhuān)利名稱：：微生物中酶活性的誘導(dǎo)和穩(wěn)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及培育用于酶產(chǎn)生的微生物的方法和包含具有經(jīng)誘導(dǎo)和/或穩(wěn)定的活性的酶或微生物的組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)使用特定的生長(zhǎng)培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)微生物中所需酶活性的方法，以及涉及在酶或能產(chǎn)生所述酶的微生物內(nèi)穩(wěn)定所需活性的方法。
背景技術(shù)：
：長(zhǎng)期以來(lái)，微生物及其酶在各種產(chǎn)品的制備中用作生物催化劑。酵母在糖至醇的發(fā)酵中的作用是立即可以想到的例子。近年來(lái)，對(duì)微生物及其酶在通常被認(rèn)為是不符合酶用途的商業(yè)活動(dòng)中的應(yīng)用的興趣日益增長(zhǎng)。一個(gè)例子是微生物在工業(yè)加工，尤其是在廢物處理中的應(yīng)用。含腈化合物廣泛用于各種商業(yè)應(yīng)用。例如，腈用在許多具有商業(yè)用途的化合物的合成中，所述化合物包括胺、酰胺、脒、羧酸、酯、醛、酮、亞胺和雜環(huán)化合物。腈也可用作溶劑、除草劑，以及用在去污劑和防腐劑的合成中。一種商業(yè)上更重要的腈是丙烯腈，其用在丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸纖維、共聚物樹(shù)脂和腈橡膠的生產(chǎn)中。在腈的生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢物流經(jīng)常含有高濃度的危險(xiǎn)性含氮化合物。例如，所述廢物流可含有腈，諸如乙腈、丙烯腈、琥珀腈和富馬腈。此外，這樣的廢物流還可含有危險(xiǎn)性化合物，如氰化物、丙烯酰胺、丙烯醛和氰醇。由于危險(xiǎn)性廢物通常不能合法地排放到環(huán)境中，因此在商業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，處理廢物流以除去或治理一種或多種危險(xiǎn)性組分的方法是重要的。已完成一種用于處理氮廢物流的方法，其采用某些微生物將腈化合物轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的酰胺或酸。例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,940,316和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,001,081公開(kāi)了使用腈水合酶微生物由丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺。5通常，腈轉(zhuǎn)化微生物在涉及腈水合酶和酰胺酶的兩步反應(yīng)中降解脂肪族腈。在第一步中，腈水合酶催化所述腈(或氰醇)水解為相應(yīng)的酰胺(或羥基酸)。在第二步中，酰胺酶催化所述酰胺水解為相應(yīng)的酸或羥基酸。相似的是，一些微生物已顯示出通過(guò)腈水解酶的作用直接將芳香族腈轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的酸從而降解這些腈。由于起初的報(bào)道證明了丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺的生物轉(zhuǎn)化的潛在商業(yè)用途，因此，在所述腈的微生物降解中所涉及的酶已受到顯著關(guān)注。手性酸的酶法制備(諸如由氰醇前體得到羥基酸)的可能性也已成為該領(lǐng)域內(nèi)頗受關(guān)注的焦點(diǎn)。盡管有很有前景的結(jié)果，但是以上討論的腈水合酶/酰胺酶轉(zhuǎn)化的多種潛在應(yīng)用依然未得到完全開(kāi)發(fā)。微生物及其酶的日益增加的用途的另一個(gè)例子是天冬氨酸的形成。天冬酰胺酶I是催化天冬酰胺水解為天冬氨酸的酶，如下所示HOOCCHNH2CONH2+H20—HOOCCHNH2CH2COOH+麗3天冬酰胺酶I可在細(xì)菌、植物和很多動(dòng)物中找到；然而由于人白細(xì)胞不具有所必需的天冬酰胺合成酶，所以所述細(xì)胞不能生成天冬酰胺。因此已發(fā)現(xiàn)天冬酰胺酶I可有效治療人惡性白血病。白血病細(xì)胞通常具有低水平的天冬酰胺合成酶，所述酶有時(shí)候完全缺失。因此，白血病細(xì)胞通常需要外界來(lái)源的天冬酰胺。由于天冬酰胺酶I將天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，因此向患有白血病的患者施用天冬酰胺酶I進(jìn)一步限制了所述癌細(xì)胞的天冬酰胺的可供來(lái)源，并且起到使得所述細(xì)胞變?nèi)醯淖饔茫蛊涓菀资艿交煹挠绊?。因此，通常作為?lián)合療法的一部分與化療劑一起向白血病患者施用天冬酰胺酶I。在這樣的治療中所使用的天冬酰胺酶I目前獲自大腸桿菌(以異四聚體的形式)和歐文氏菌(五rvWm'")(以同四聚體的形式)，但這些來(lái)源各自具有缺點(diǎn)。例如，獲自大腸桿菌的天冬酰胺酶I不如獲自歐文氏菌的天冬酰胺酶I有效。然而，與使用大腸桿菌相比，使用歐文氏菌產(chǎn)生天冬酰胺酶I更加困難。此外，這些來(lái)源可導(dǎo)致在所分離的酶中存在不利的革蘭氏陰性毒素。因此，存在以下需求，即由各種微生物提高天冬酰胺酶I的產(chǎn)生，并避免同時(shí)產(chǎn)生有害的革蘭氏陰性毒素。穩(wěn)定性，是實(shí)用性生物催化劑的關(guān)鍵因素，已成為在許多商業(yè)應(yīng)用中使用腈水合酶和/或酰胺酶的重要障礙。雖然固定和化學(xué)穩(wěn)定劑是公認(rèn)的提高酶穩(wěn)定性的方法，但目前的固定和穩(wěn)定技術(shù)仍需要進(jìn)一步的發(fā)展。因此，在本領(lǐng)域中仍存在對(duì)在各種微生物中，尤其是在能產(chǎn)生在含腈化合物的降解中有用的酶的微生物中，誘導(dǎo)高水平的酶活性的方法的需求。此外，還存在對(duì)提高含腈化合物降解中的關(guān)鍵酶的穩(wěn)定性的方法的需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明主要涉及在微生物中誘導(dǎo)和穩(wěn)定酶活性的方法。本發(fā)明特別地采用產(chǎn)生腈水合酶的微生物來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量有用的酶。例如，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)產(chǎn)生來(lái)自腈降解微生物的腈水合酶(尤其是比先前可能水平更高的水平)、天冬酰胺酶I和酰胺酶的方法。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了提高諸如腈水合酶、天冬酰胺酶I和酰胺酶等各種酶的穩(wěn)定性的方法。本發(fā)明還提供了能隨時(shí)間流逝而保持商業(yè)有用水平的酶活性的生物解毒催化劑(尤其是加入了酶，如腈水合酶和酰胺酶)。所述生物解毒催化劑具體的特征在于，所述生物催化劑的酶活性，正如此處所描述，可受其環(huán)境的誘導(dǎo)和穩(wěn)定。本發(fā)明的具體特征在于，此處所公開(kāi)的方法可用于誘導(dǎo)其水平和穩(wěn)定性在實(shí)際生物解毒催化劑中均有用的酶活性。本發(fā)明的特征還在于誘導(dǎo)較高水平的天冬酰胺酶I的能力，所述天冬酰胺酶I來(lái)自包括(但不局限于)革蘭氏陽(yáng)性微生物在內(nèi)的微生物；以及提高這些天冬酰胺酶I活性的穩(wěn)定性的能力。本發(fā)明特別有利之處在于，能實(shí)現(xiàn)所述微生物的誘導(dǎo)和穩(wěn)定，而無(wú)需將諸如丙烯腈等危險(xiǎn)性腈排放到環(huán)境中。先前，認(rèn)為在某些微生物中誘導(dǎo)特定酶活性需要加入化學(xué)誘導(dǎo)劑。例如，在紫紅紅球菌(//z^fococcwAofitoc/zrows)和綠針假單胞菌(i^ewcfomo"osc/z/oraa//^)中的腈水合酶活性的誘導(dǎo)中，通常必須補(bǔ)充危險(xiǎn)化學(xué)品，如乙腈、丙烯腈和丙烯酰胺等。然而，僅根據(jù)本發(fā)明，已驚奇地發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)生腈水合酶的微生物中的高酶活性可通過(guò)使用諸如含有酰胺基的氨基酸及其衍生物等無(wú)危險(xiǎn)性培養(yǎng)基添加劑進(jìn)行誘導(dǎo)和穩(wěn)定。更具體而言，根據(jù)本發(fā)明，天冬酰胺、谷氨酰胺或其組合可用作誘導(dǎo)劑，而完全排除了諸如乙腈、丙烯腈和丙烯酰胺等危險(xiǎn)化學(xué)品。因此，本發(fā)明有利地提供了用于產(chǎn)生商業(yè)有用的酶和微生物的更安全方法，以及它們?cè)谄渌椒ㄖ械挠猛?，如用于廢物流的解毒。在優(yōu)選實(shí)施方式中，正如此處所述，本發(fā)明采用經(jīng)改進(jìn)的培養(yǎng)基、固定和穩(wěn)定技術(shù)，可以顯著提高許多酶和能產(chǎn)生所述酶的微生物的產(chǎn)量和穩(wěn)定性。例如，通過(guò)使用包含含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基可以提高誘導(dǎo)和穩(wěn)定作用。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括產(chǎn)生腈水合酶的微生物的培育方法。本發(fā)明優(yōu)先包括在包含一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物。在具體實(shí)施方式中，所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物包括來(lái)自紅球菌屬(genus//zoAcoccw)的細(xì)菌。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述含有酰胺基的氨基酸選自由天冬酰胺、谷氨酰胺或其組合組成的組。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在產(chǎn)生腈水合酶的微生物中誘導(dǎo)所需酶活性的方法。優(yōu)選的是，所述方法包括在包含一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物。在具體實(shí)施方式中，通過(guò)所述方法誘導(dǎo)的酶活性包括腈水合酶活性、酰胺酶活性或天冬酰胺酶I活性。本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括其他處理步驟，諸如回收具有所需酶活性的經(jīng)培養(yǎng)的微生物，回收具有所需活性的酶，將所述微生物或來(lái)自所述微生物的細(xì)胞附加(affDC)在基質(zhì)上，以及交聯(lián)來(lái)自所述微生物的細(xì)胞。在更多其他實(shí)施方式中，本發(fā)明特別提供了用于在酶或能產(chǎn)生所述酶的微生物中穩(wěn)定所需活性的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，這樣的方法包括將所述酶，或者能產(chǎn)生所述酶的微生物，與一種或多種含有酰胺基的氨基酸相接觸。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述酶，或能產(chǎn)生所述酶的微生物可以被固定。所述固定可發(fā)揮將所述酶、微生物或細(xì)胞附加在基質(zhì)上以有助于使處理簡(jiǎn)便的作用。在其他實(shí)施方式中，這樣的固定可實(shí)際上發(fā)揮穩(wěn)定所誘導(dǎo)的活性，從而延長(zhǎng)所述誘導(dǎo)的活性能被利用的時(shí)間的作用。所述固定可包括所述酶、微生物或細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的表面附著。作為另外一種選擇，所述固定可包括將所述酶、微生物或細(xì)胞至少部分地俘獲在所述基質(zhì)中，或者通過(guò)將細(xì)胞與諸如戊二醛交聯(lián)而固定。這有利地使得具有受誘導(dǎo)活性的固定材料(例如催化劑)以如下的方式存在，即促進(jìn)所述催化劑與目標(biāo)材料的反應(yīng)，并且促進(jìn)所需產(chǎn)物的回收而同時(shí)將所述催化劑保持在反應(yīng)培養(yǎng)基中并且處于反應(yīng)模式中。在具體實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包括聚合材料，優(yōu)選為選自由藻酸鹽和含有酰胺基的聚合物組成的組。本發(fā)明也可包括其他基質(zhì)材料。根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定的活性的特征優(yōu)先在于，相對(duì)于初始活性而言，保持特定活性百分比。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述酶或所述能產(chǎn)生所述酶的微生物的所需活性經(jīng)穩(wěn)定使得在約25。C的溫度至少30天的時(shí)間以后，所需活性保持在由所述酶或所述能產(chǎn)生所述酶的微生物所表現(xiàn)出來(lái)的初始活性的至少約50%的水平。在更多其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于制備具有特定酶活性的酶或微生物的方法。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于制備具有腈水合酶活性的酶或微生物的方法。具體而言，所述方法包括通過(guò)在包含一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物從而誘導(dǎo)所述微生物中的腈水合酶活性，并回收所述具有腈水合酶活性的酶或微生物。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于制備具有天冬酰胺酶I活性或酰胺酶活性的酶或微生物的方法。本發(fā)明的特征還在于在微生物中多重誘導(dǎo)酶活性的能力，從而使得所述微生物或其產(chǎn)生的酶能降解多種化合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括通過(guò)在包含一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物從而在所述微生物中誘導(dǎo)對(duì)多種含腈化合物的腈水合酶活性。可選的是，所述方法進(jìn)一步包括回收具有降解多種含腈化合物的腈水合酶活性的所述酶和微生物。當(dāng)然，在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了多重誘導(dǎo)其他類(lèi)型活性的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了在本發(fā)明的方法中以及對(duì)于生產(chǎn)諸如生物過(guò)濾器等各種設(shè)備特別有用的新型組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含(a)包含一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基；(b)—種或多種產(chǎn)生酶的微生物；和(C)一種或多種酶。優(yōu)選的是，所述酶選自由腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶I及其組合組成的組。在其他實(shí)施方式中，所述一種或多種微生物包括選自由紅球菌屬(genusi/zo(iococcw51)、短桿菌屬(genus5rev/6acfeW簡(jiǎn))及其組合組成的組的細(xì)菌。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述一種或多種微生物可至少部分地固定在基質(zhì)上。參考以下附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述；然而，提供的這些附圖僅僅描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，而本發(fā)明并非局限于此。圖1是在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法的一個(gè)實(shí)施方式中，由在藻酸鈣中固定所提供的對(duì)腈水合酶活性的穩(wěn)定作用的圖解描述；圖2是在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法的一個(gè)實(shí)施方式中，由在聚丙烯酰胺中固定所提供的對(duì)腈水合酶活性的穩(wěn)定作用的圖解描述；圖3是在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，由在硬化的、聚乙烯亞胺交聯(lián)的藻酸鈣或聚丙烯酰胺中固定所提供的對(duì)腈水合酶活性的穩(wěn)定作用的圖解描述；圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法由通過(guò)戊二醛交聯(lián)的固定所提供的對(duì)腈水合酶活性的穩(wěn)定作用的圖解描述；以及圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式在用天冬酰胺誘導(dǎo)的紅球菌(i^o^coccw)DAP96253細(xì)胞中天冬酰胺酶I活性的圖解描述。具體實(shí)施例方式現(xiàn)在參考本發(fā)明的具體實(shí)施方式以及特別地參考隨之提供的各種附圖，在下文中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更完整的描述。實(shí)際上，本發(fā)明可以以許多不同的形式實(shí)施，而不應(yīng)當(dāng)理解為局限于此處所闡述的實(shí)施方式；更確切地說(shuō)，提供這些實(shí)施方式使得本公開(kāi)能滿足適用的法律要求。正如在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另有明確說(shuō)明，否則單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"、"所述"包括了復(fù)數(shù)形式的指代物。本發(fā)明源自于以下令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即通過(guò)將含有酰胺基的氨基酸或其衍生物加入到包含特定酶或能產(chǎn)生這些酶的微生物的培養(yǎng)物或者組合物中，可誘導(dǎo)和穩(wěn)定特定酶活性。此外，通過(guò)諸如附加、俘獲和交聯(lián)等固定方法可實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的穩(wěn)定。在具體實(shí)施方式中，提供了用于誘導(dǎo)高水平的來(lái)自腈降解微生物(包括產(chǎn)生腈水合酶的微生物)的腈水合酶和酰胺酶和提高所述腈水合酶的穩(wěn)定性的方法。此處描述的本發(fā)明的方法還提供了其他方法，這些方法可用于通過(guò)將所述腈部分轉(zhuǎn)化為酰胺和/或酸從而對(duì)含有腈化合物的組合物進(jìn)行解毒。這些方法也可以用于從諸如由制造和生產(chǎn)設(shè)備產(chǎn)生的廢物流等各種組合物中除去不需要的腈化合物。本發(fā)明通常提供了用于培養(yǎng)微生物(優(yōu)先為誘導(dǎo)特異性酶活性)的方法。優(yōu)選的是，所述方法包括在包含一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述含有酰胺基的氨基酸選自由天冬酰胺、谷氨酰胺、其衍生物，或其組合組成的組。例如，所述含有酰胺基的氨基酸可包括天然形式的天冬酰胺、無(wú)水天冬酰胺、天冬酰胺一水合物，天然形式的谷氨酰胺、無(wú)水谷氨酰胺和/或谷氨酰胺一水合物，每種均為L(zhǎng)-異構(gòu)體或DL-異構(gòu)體的形式。所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物在所述培養(yǎng)基中的濃度可根據(jù)所希望的最終培養(yǎng)結(jié)果而變化。例如，可為了產(chǎn)生具有特異性酶活性的微生物的目的而進(jìn)行培養(yǎng)。在另外的實(shí)施方式中，可為了從所述經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的微生物中形成和收集特異性酶的目的而進(jìn)行培養(yǎng)。在又一些實(shí)施方式中，可為了形成和收集具有相同或不同活性和功能的多種酶的目的而進(jìn)行培養(yǎng)?；谒雠囵B(yǎng)基或混合物的總重量，加入到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基或混合物中的所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的量通?？勺罡哌_(dá)約10,000ppm(即約1重量％)。然而，本發(fā)明特別有利之處在于，可通過(guò)加入甚至更少的量而誘導(dǎo)酶活性。例如，在某些實(shí)施方式中，所述含li有酰胺基的氨基酸或其衍生物的濃度在約50ppm約5,000ppm，約100ppm約3,000ppm，約200ppm約2,000ppm，約250ppm約1500ppm，約500ppm約1250ppm或約500ppm約1000ppm的范圍。優(yōu)選的是，將所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物加入到全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。適合的全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通常是能向微生物提供其生長(zhǎng)所需的必要營(yíng)養(yǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其最低限度包括碳和/或氮源。一種可用的培養(yǎng)基的具體例子是可商購(gòu)獲得的R2A瓊脂培養(yǎng)基，其通常由瓊脂、酵母提取物、示蛋白胨(proteosepeptone)、酪蛋白水解物、葡萄糖、可溶性淀粉、丙酮酸鈉、磷酸氫二鉀和硫酸鎂構(gòu)成?？梢杂糜诒景l(fā)明的液體全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的另一個(gè)例子是酵母提取物麥芽提取物瓊脂(YEMEA)，其由葡萄糖、麥芽提取物和酵母提取物(但特別是不包括瓊脂)。當(dāng)然，在本領(lǐng)域中可用的任何全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基均可用于本發(fā)明，以上描述的培養(yǎng)基僅僅是為了舉例目的。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可包括使用其他的添加劑加入到所述全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。通常，根據(jù)本發(fā)明有用的其他添加物或營(yíng)養(yǎng)物是可有助于細(xì)胞生長(zhǎng)更好、細(xì)胞量更大或者加速生長(zhǎng)的那些添加物或營(yíng)養(yǎng)物。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述營(yíng)養(yǎng)完全的培養(yǎng)基可包括所述全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中已存在的所有碳水化合物源以外的碳水化合物源。如上所述，大多數(shù)培養(yǎng)基通常含有一些含量的碳水化合物(例如葡萄糖)；然而，根據(jù)本發(fā)明，有用的是包括其他的碳水化合物源。提供的過(guò)量碳水化合物的類(lèi)型可取決于所需的培養(yǎng)物產(chǎn)量。例如，在一些具體實(shí)施方式中，已發(fā)現(xiàn)加入諸如麥芽糖或麥芽糊精等碳水化合物提供了改善的天冬酰胺酶I的誘導(dǎo)。在另一實(shí)施方式中，鈷或其鹽能加入到所述混合物或培養(yǎng)基中。例如，向所述培養(yǎng)基中加入鈷(例如氯化鈷)可特別有利于增加由所述經(jīng)培養(yǎng)的微生物所產(chǎn)生的酶的質(zhì)量。在某些實(shí)施方式中，鈷或其鹽可加入到所述培養(yǎng)基中，從而使得所述鈷濃度量最高至約100ppm。優(yōu)選的是，鈷以約5ppm約100ppm，約10ppm約75ppm，約10ppm約50ppm或約10ppm約25ppm的濃度存在。在另一些實(shí)施方式中，尿素或其鹽可加入到所述混合物或培養(yǎng)基中。在某些實(shí)施方式中，尿素或其鹽可加入到所述培養(yǎng)基中，從而使得尿素濃度量最高至約10g/L。優(yōu)選的是，尿素以約5g/L約100g/L，約10g/L約75g/L，約10g/L約50g/L或約10g/L約25g/L的濃度存在。在具體實(shí)施方式中，尿素以約7.5g/L的濃度存在。所述培養(yǎng)基也可包括其他成分而不背離本發(fā)明。例如，其他合適的培養(yǎng)基成分可包括商業(yè)添加劑，諸如棉籽蛋白、麥芽糖、麥芽糊精和其他商業(yè)碳水化合物。本發(fā)明的特征特別在于能實(shí)現(xiàn)酶和能產(chǎn)生所述酶的微生物的誘導(dǎo)和穩(wěn)定而不需要危險(xiǎn)性的腈。如之前所指出，諸如腈水合酶活性等許多類(lèi)型的酶活性的誘導(dǎo)傳統(tǒng)上包括腈的補(bǔ)充，所述腈諸如乙腈、丙烯腈和琥珀腈等。此外，如果需要多重誘導(dǎo)(即，在單個(gè)酶中誘導(dǎo)活性以降解兩種類(lèi)型以上的腈)，通常需要包括兩種類(lèi)型以上的危險(xiǎn)性腈。本發(fā)明特別地來(lái)自于使用含有酰胺基的氨基酸及其衍生物，這是由于酶誘導(dǎo)劑不需要危險(xiǎn)化學(xué)品以促進(jìn)單個(gè)或多重酶誘導(dǎo)。具體而言，本發(fā)明有益之處在于，通過(guò)在所述培養(yǎng)基或混合物中使用含有酰胺基的氨基酸或其衍生物，可以使多重誘導(dǎo)成為可能。再次可見(jiàn)，這是非常令人吃驚的，因?yàn)橹霸谒雠囵B(yǎng)基中要求有多重腈化合物以誘導(dǎo)對(duì)兩種以上腈化合物的酶活性。然而，本發(fā)明通過(guò)使用完全安全的含有酰胺基的氨基酸實(shí)現(xiàn)了該特別有用的特征。因此，本發(fā)明對(duì)制備具有降解多種含腈化合物的活性的酶或微生物特別有用。此外，本發(fā)明的方法提供了對(duì)各種腈或酰胺，諸如具有單個(gè)ON部分、二腈(含有兩個(gè)C^N部分的化合物)或具有多個(gè)腈部分的化合物(例如丙烯醛氰醇)進(jìn)行解毒的能力。這些酶或微生物在此處指被多重誘導(dǎo)。雖然本發(fā)明不再需要危險(xiǎn)性化學(xué)品用于酶活性誘導(dǎo)，但并沒(méi)有排除使用這樣的其他誘導(dǎo)劑。例如，在具體實(shí)施方式中，一種或多種腈可用于協(xié)助特異活性的形成。例如，補(bǔ)充有琥珀腈和鈷的培養(yǎng)基可用于誘導(dǎo)天冬酰胺酶I活性。然而，腈的使用對(duì)于天冬酰胺酶I活性的誘導(dǎo)并非必須。更確切的是，盡管根據(jù)本發(fā)明，腈和其他危險(xiǎn)性化學(xué)品的使用的確是不優(yōu)選的，但是在具體實(shí)施方式中，如此使用也是可能的。根據(jù)本發(fā)明可培養(yǎng)各種微生物以供使用。通常，能產(chǎn)生具有此處所述的有用活性的酶的任何微生物可用在本發(fā)明中。在特定實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明有用的微生物包括能產(chǎn)生腈水合酶的微生物。如此處所使用，產(chǎn)生腈水合酶的微生物意指在通常被認(rèn)為能產(chǎn)生腈水合酶的同時(shí)，還能產(chǎn)生一種或多種其他酶的微生物。如此處進(jìn)一步描述，大多數(shù)微生物能產(chǎn)生多種酶，這樣的產(chǎn)生通常由所述微生物的環(huán)境所決定。由此，盡管根據(jù)本發(fā)明而使用的微生物以產(chǎn)生腈水合酶的微生物進(jìn)行公開(kāi)，但這樣的用語(yǔ)僅僅是指已知的這些微生物產(chǎn)生腈水合酶的能力，而并非限制所述微生物僅產(chǎn)生腈水合酶。相反，根據(jù)本發(fā)明有用的產(chǎn)生腈水合酶的微生物是至少能產(chǎn)生腈水合酶(即能產(chǎn)生腈水合酶或者產(chǎn)生腈水合酶和一種或多種其他酶)的微生物。在本領(lǐng)域內(nèi)已知大量產(chǎn)生腈水合酶的微生物。例如，屬于諾卡氏菌屬(McaW/a)[參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?4-129190]、紅球菌屬(//2odococcws)[參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?-470]、根瘤菌屬(T^'加^ww)[參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?-236977]、克雷伯氏菌屬(iC/^^W/a)[參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?-30982]、氣單胞菌屬[參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?-30983]、農(nóng)桿菌屬(jgra^cfe〃'ww)[參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?-154691]、芽孢桿菌屬(&"7/w)[參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?-187092]、假諾卡氏菌屬(尸wi^o"ocaW^)[參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?-56684]和假單胞菌屬(戶"z^^owaO的細(xì)菌是可根據(jù)本發(fā)明使用的產(chǎn)生腈水合酶的微生物的非限制性例子。此外，根據(jù)本發(fā)明有用的微生物的具體例子包括但不限制于諾卡氏菌屬中的禾中(Mcan/z'"5p.)、紅球菌屬中的種(W/zocfococc^".)、紫紅紅球菌(i/zocfococcwsAofifoc/zrai^)、克雷伯氏菌屬中的種(《/^w'e〃a、氣單胞菌屬中的種"eramo"osw.)、弗氏檸檬酸桿菌(C"ra6acfery^柳o^')、發(fā)根農(nóng)桿菌(」gra6aCen'wwr/n'zogewas)、根癌農(nóng)桿菌(々ra6acten'謂f畫(huà)咖c/e似)、黃黃色桿菌(Xa涵o6""eryZavos)、流黑歐文氏菌(五rw/w/am'gn;/7i^m)、腸桿菌屬中的禾中(E打&ra6acfersp.)、鏈霉菌屬中的種(5^e/tomycas)、根瘤菌屬中的種(i/z/zo6/www.)、百脈根瘤菌(W/zizo6/w附/o")、豌豆根桿菌(i/z&oWwm/egw/"cworw附)、i^feo6/wmmen.o"、季也蒙4叚絲酵母(G2W(i/(iagw/〃/^7wom/z7)、成團(tuán)、乏菌(og^/owerara)、月市炎克雷伯氏菌月市炎亞禾中(^7efe/e//a/wewwow."eswZwp.pwewwow/ae)、放射形土壤桿菌(Jgra6acten'訓(xùn)ra&okz"^)、史氏芽孢桿菌(Baa7/wssm/f/z")、嗜熱假諾卡氏菌(i^ew(iowoc"W"*/7wo/Mfl)、綠針假單胞菌(/^ewcfcwowasc/zforaap/^)、紅串假單胞菌(尸化i^owowos^yf/zra/o/^)、酮戊二酸短豐干菌(5z-ev沾ac&n.wmA:efc)g/w/am/cww)、纟工串纟工球菌(i/zocfococcuse/^/zrapo/^)禾口嗜熱假諾卡氏菌(尸"i/i/owocani/aAermo//^7")。在特另U優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的微生物包括紅球菌屬中的種(A/w^cocc附w.)DAP96253和DAP96255和紫紅紅球菌DAP96622。在其他實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明有用的微生物也可包括轉(zhuǎn)化體。具體而言，所述轉(zhuǎn)化體可以是其中插入和表達(dá)了從已知包括腈水合酶基因的微生物克隆的腈水合酶基因的任何宿主。例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,807,730公開(kāi)了使用大腸桿菌(&c/^n'c/z/aco//)作為宿主用作MT-10822菌株(FERMBP-5785)。當(dāng)然，可根據(jù)本發(fā)明使用其他類(lèi)型的基因工程細(xì)菌，只要所述細(xì)菌能產(chǎn)生如本文所述對(duì)本發(fā)明有用的一種或多種酶。在所給出的屬內(nèi)，并非所有的種表現(xiàn)出相同類(lèi)型的酶活性和/或產(chǎn)生。因此，可能的是通常已知包括能表現(xiàn)出所希望的活性的屬中有一種或多種通常不表現(xiàn)所需活性的種。因此，在更多實(shí)施方式中，宿主微生物可包括并不具體已知具有所需活性但來(lái)自于已知具有能產(chǎn)生所需活性的特定菌株的屬的細(xì)菌菌株?？上蜻@樣的菌株轉(zhuǎn)移能用于引起所需活性的一個(gè)或多個(gè)基因。這樣的菌株的非限制性例子包括馬紅球菌(i/zocfococcw"拜-)和圓紅球菌(i/2。(io(ioccus1g7o6enz/i^)PWD1。正如此處所使用的，酶活性通常指酶在諸如將一種化合物轉(zhuǎn)化為另一種化合物的過(guò)程中作為催化劑的能力。同樣，此處所指的所需活性可包括由一種或多種微生物活性表達(dá)的一種或多種酶的活性。在某些實(shí)施方式中，活性可用每質(zhì)量的酶或細(xì)胞的"單位"來(lái)表示(通?；诩?xì)胞的干重，例如，單位/mgcdw)。"單位"通常指在限定的一組條件下，作為時(shí)間的函數(shù)，將特定含量的化合物轉(zhuǎn)化為不同的化合物的能力。在具體實(shí)施方式中，l"單位"的腈水合酶活性可指在pH7.0，30°C的溫度下每分鐘每毫克細(xì)胞(干重)將1pmol的丙烯腈轉(zhuǎn)化為其對(duì)應(yīng)的酰胺的能力。相似地，l單位的酰胺酶活性可指在pH7.0，30。C的溫度下每分鐘每毫克細(xì)胞(干重)將1pmol的丙烯酰胺轉(zhuǎn)化為其對(duì)應(yīng)的酸的能力。此外，l單位的天冬酰胺酶I活性可指在pH7.0，3(TC的溫度下每分鐘每毫克細(xì)胞(干重)將l^imol的天冬酰胺轉(zhuǎn)化為其對(duì)應(yīng)的酸的能力。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征特別在于誘導(dǎo)出比使用先前已知的方法可能得到的活性更高的所需活性的能力。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明能在產(chǎn)生腈水合酶的微生物中誘導(dǎo)腈水合酶活性，所述腈水合酶活性高于或等于在相同微生物中用含腈化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所產(chǎn)生的腈水合酶活性高于在相同微生物中用含腈化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的腈水合酶活性可比在相同微生物中用含腈化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性高至少5%。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的腈水合酶活性比在相同微生物中用含腈化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性高至少10%、至少12%或者至少15%。根據(jù)本發(fā)明有用的微生物可從已知來(lái)源(諸如以上所述)選擇或者可包括新分離的微生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)在含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的混合物的存在下生長(zhǎng)菌株，適用于本發(fā)明的微生物可被分離并被鑒定為有用的微生物菌株。所述微生物可以從已知的來(lái)源分離或者選擇或者得到，或者可以根據(jù)在本發(fā)明的多重誘導(dǎo)后將腈混合物或腈與酰胺化合物的混合物或酰胺混合物解毒為相應(yīng)的酰胺和/或酸的能力而從未來(lái)來(lái)源進(jìn)行篩選。在此處提供的公開(kāi)的教導(dǎo)下，進(jìn)行測(cè)試以根據(jù)本發(fā)明確定所述微生物是否有用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言僅僅是常規(guī)試驗(yàn)的問(wèn)題。例如，在一項(xiàng)測(cè)試中，通過(guò)游離氨的檢測(cè)可確定腈水合酶或酰胺酶的存在。參見(jiàn)Fawcett，J.K.和Scott,J.E.，1960,"ARapidandPreciseMethodfortheDeterminationofUrea"，J!i^/zo/.13:156-159，在此引入作為參考。本發(fā)明有利地提供了用于培養(yǎng)微生物，尤其是產(chǎn)生腈水合酶的微生物的方法。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于在諸如產(chǎn)生腈水合酶的微生物等微生物中誘導(dǎo)所需酶活性的方法。優(yōu)先的是，所述方法包括在包含一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生腈水合酶的微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了使用補(bǔ)充有含有酰胺基的氨基酸或其衍生物(優(yōu)選包括天冬酰胺、谷氨酰胺或其組合)的培養(yǎng)基從而用于誘導(dǎo)腈解毒活性的方法。更具體而言，所述方法包括在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，并且可以收集所培養(yǎng)的微生物或者由所述微生物產(chǎn)生的酶。根據(jù)可用于得到最佳生物量的方法可培養(yǎng)和收獲所述微生物。在某些實(shí)施方式中，諸如當(dāng)在瓊脂板上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，所述微生物可培養(yǎng)至少約24小時(shí)，但通常少于六天。當(dāng)在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，所述微生物優(yōu)選在極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)約1小時(shí)約48小時(shí)，約1小時(shí)約20小時(shí)或者約16小時(shí)約23小時(shí)。如果需要更大的生物量，所述微生物可在所述發(fā)酵罐中培養(yǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間。在所述發(fā)酵階段結(jié)束時(shí)，所培養(yǎng)的微生物通常通過(guò)例如刮擦、離心、過(guò)濾或本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何其他方法進(jìn)行收集和濃縮。在具體實(shí)施方式中，可在進(jìn)一步指定的條件下培養(yǎng)所述微生物。例如，優(yōu)選在約3.0約ll.O的pH，更優(yōu)選為約6.0約8.0的pH進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)行培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為約4t:約55°C，更優(yōu)選為約15T:約37°C。此外，所溶解的氧壓優(yōu)先為約0.1。％100%，優(yōu)選為約4%約80%，并更優(yōu)選為約4%約30%。通過(guò)以環(huán)境空氣、純氧、過(guò)氧化物和/或其他能釋放氧氣的組合物的形式供應(yīng)氧氣，可以監(jiān)測(cè)所溶解的氧壓并將其保持在所需范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明還可以將微生物生長(zhǎng)和酶活性誘導(dǎo)的步驟分開(kāi)。例如，根據(jù)本發(fā)明可以在不含有誘導(dǎo)酶活性所必需的添加物的第一培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一種或多種微生物。這可被稱為所述微生物的生長(zhǎng)階段。在第二階段(即，誘導(dǎo)階段)，可將所培養(yǎng)的微生物轉(zhuǎn)移到含有誘導(dǎo)酶活性所必需的添加物的第二培養(yǎng)基中。這樣的第二培養(yǎng)基將優(yōu)先包含所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物，正如此處所描述。相類(lèi)似的是，所述誘導(dǎo)添加物可在所需微生物的培養(yǎng)過(guò)程中的任意時(shí)刻加入。例如，在所述微生物的開(kāi)始培養(yǎng)之前，所述培養(yǎng)基中可添加含有酰胺基的氨基酸或其衍生物。作為另外一種選擇，所述微生物可以在培養(yǎng)基上培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間從而培育所述微生物，而在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定時(shí)刻加入含有酰胺基的氨基酸或其衍生物從而在所述微生物中誘導(dǎo)所需活性。此外，可以在所述微生物的生長(zhǎng)完成以后將所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物加入到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(或者加入到包含之前生長(zhǎng)好的微生物的單獨(dú)混合物中)以誘導(dǎo)所需活性。如上所述，本發(fā)明的方法特別有利于誘導(dǎo)所需的酶活性。包括此處所描述在內(nèi)的許多類(lèi)型的微生物能產(chǎn)生各種具有各種活性的酶。正如在本領(lǐng)域內(nèi)通常所理解的，在微生物培養(yǎng)中誘導(dǎo)的酶活性的類(lèi)型可根據(jù)所使用的微生物菌株、所使用的培育方法和與生長(zhǎng)培養(yǎng)基一起使用的添加物而變化。令人驚奇的是，本發(fā)明可以通過(guò)使用含有酰胺基的氨基酸或其衍生物來(lái)誘導(dǎo)各種酶活性。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了選自由腈水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶I組成的組的一種或多種酶的誘導(dǎo)。在具體實(shí)施方式中，可通過(guò)在包含一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種來(lái)自于紅球菌屬的細(xì)菌從而誘導(dǎo)這些酶。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明能同時(shí)誘導(dǎo)腈水合酶和酰胺酶。這特別有利于工業(yè)應(yīng)用，如含腈廢物流的處理。該處理要求將腈轉(zhuǎn)化為酰胺的第一處理和將酰胺轉(zhuǎn)化為酸的第二處理。同時(shí)產(chǎn)生腈水合酶和酰胺酶的能力將不再需要分別制備所述酶并且基本允許進(jìn)行單一處理步驟。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明特別提供了天冬酰胺酶I活性的誘導(dǎo)。令人驚奇的是，已發(fā)現(xiàn)在添加了含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中，在紫紅紅球菌(i/2ot/ococcwsr/zo^c/^m^)，DAP96622(革蘭氏陽(yáng)性)、或紅球菌屬中的種(iWoco謂^.)，DAP96253(革蘭氏陽(yáng)性)中誘導(dǎo)天冬酰胺酶I活性。根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方式也可以優(yōu)先地使用紅球菌屬的其他菌株。其他能產(chǎn)生天冬酰胺酶I的菌株包括綠針假單胞菌(ATCC43051)(革蘭氏陽(yáng)性)、綠針假單胞菌(ATCC13985)(革蘭氏陽(yáng)性)、紅串紅球菌(i^o^coccwseo^rapofc)(ATCC47072)(革蘭氏陽(yáng)性)和酮戊二酸短桿菌(SreW^cfen'Mwfetog/wtomz'CMW)(ATCC21533)(革蘭氏陽(yáng)性)，因此，本發(fā)明的有利之處還在于能在革蘭氏陽(yáng)性菌中誘導(dǎo)天冬酰胺酶I活性。一旦根據(jù)此處所描述的方法進(jìn)行誘導(dǎo)，已收獲的微生物的所需活性(例如腈水合酶、酰胺酶或天冬酰胺酶I活性)能有利地被穩(wěn)定。用于處理廢水的酶的商業(yè)用途，以及各種酶的其他商業(yè)用途通常受到所誘導(dǎo)的活性的不穩(wěn)定性的限制。例如，在25"C溫度，新鮮細(xì)胞通常在24小時(shí)內(nèi)失去其初始活性的至少50%。因此，當(dāng)將細(xì)胞用作催化劑時(shí)，所述細(xì)胞必須在需要時(shí)進(jìn)行制備而不能被保存以供將來(lái)使用。腈水合酶活性可通過(guò)加入含腈化合物而穩(wěn)定；然而，這再次使得必須使用不利的危險(xiǎn)化學(xué)品。本發(fā)明同樣解決了這個(gè)問(wèn)題。例如，具有誘導(dǎo)的腈水合酶活性的細(xì)胞可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行穩(wěn)定，而無(wú)需危險(xiǎn)化學(xué)品，這使得所述細(xì)胞能具有可用的酶活性長(zhǎng)達(dá)一年的時(shí)間。因此，本發(fā)明穩(wěn)定了酶或者能產(chǎn)生這些酶的微生物，使得所誘導(dǎo)活性的實(shí)際活性得以延長(zhǎng)，大大超過(guò)通常的可用活性時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)加入一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物提供如此的穩(wěn)定。所述含有酰胺基的氨基酸或其衍生物可在培養(yǎng)所述微生物時(shí)加入到所述微生物中，或者可加入到包含已誘導(dǎo)酶活性的微生物、細(xì)胞或亞單元酶的混合物中。如先前描述的任何含有酰胺基的氨基酸或其衍生物可用于根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方式使誘導(dǎo)的活性穩(wěn)定。在其他實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)固定所培養(yǎng)的微生物或源自其的細(xì)胞能提供穩(wěn)定。例如，收獲自所述微生物的細(xì)胞、收獲自所述微生物的酶或者所述經(jīng)誘導(dǎo)的微生物自身可固定到基質(zhì)上作為穩(wěn)定所述經(jīng)誘導(dǎo)的活性的手段。在某些實(shí)施方式中，所述酶、細(xì)胞或微生物至少部分地埋在所述基質(zhì)中。通?？捎糜诟郊蛹?xì)胞、酶或微生物的任何基質(zhì)都可根據(jù)本發(fā)明來(lái)使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包括藻酸(alginate)或其鹽。藻酸是具有19分別以(l-4)-連接的f3-D-甘露糖醛酸(M)和其C-5差向異構(gòu)體a-L-古洛糖醛酸(G)殘基的均聚嵌段的線性共聚物，所述均聚嵌段以不同順序或嵌段共價(jià)地相連在一起。所述單體可出現(xiàn)在連續(xù)G殘基(G嵌段)、連續(xù)M殘基(M嵌段)、交替M和G殘基(MG嵌段)的均聚嵌段中或者無(wú)規(guī)嵌段中。在優(yōu)選實(shí)施方式中，藻酸鈣用作所述基質(zhì)。特別優(yōu)選的是已用聚乙烯亞胺交聯(lián)形成硬化藻酸鈣基質(zhì)的藻酸鈣。該固定技術(shù)的進(jìn)一步描述可在Bucke，C.(1987)，"CellImmobilizationinCalciumAlginate",M"/zoA/"五"^wo/ogy，第135巻，B部分(K.Mosbach編輯)第175-189頁(yè)中找到，在此以參考的方式引入。使用聚乙烯亞胺交聯(lián)的藻酸鈣的固定的穩(wěn)定作用在圖1中進(jìn)行圖示，將在以下實(shí)施例2中進(jìn)一步描述。在另一實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包含含有酰胺基的聚合物。任何包含一個(gè)或多個(gè)酰胺基團(tuán)的聚合物可根據(jù)本發(fā)明而使用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包括聚丙烯酰胺聚合物。使用丙烯酰胺的固定的穩(wěn)定作用在圖2中圖示，將在以下實(shí)施例3中進(jìn)一步描述。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)交聯(lián)可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。例如，由經(jīng)誘導(dǎo)的微生物收獲的細(xì)胞可化學(xué)交聯(lián)形成細(xì)胞凝集體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，由經(jīng)誘導(dǎo)的微生物收獲的細(xì)胞用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。例如，細(xì)胞能懸浮在去離子水和戊二醛的混合物中，隨后加入聚乙烯亞胺直到完成最大絮凝。所述已交聯(lián)的細(xì)胞(通常為許多細(xì)胞形成的顆粒形式)可通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾進(jìn)行收獲。該技術(shù)的進(jìn)一步描述在Lopez-Gallego,等，"EnzymeStabilizationbyGlutaraldehydeCrosslinkingofAbsorbedProteinsonAminatedSupports",/B/ofec/2"0/.119:70-75中提供，將其在此以參考的方式引入。戊二醛交聯(lián)的穩(wěn)定作用在圖4中圖示，將在以下實(shí)施例5中進(jìn)一步描述。在另一實(shí)施方式中，所述微生物可裝入膠囊中或者被固定，而不是被允許保持經(jīng)典的布朗運(yùn)動(dòng)。如此的固定有助于所述微生物的收集、保持和再使用，并且通常包括將所述微生物附加至基質(zhì)。如上所述，如此的附加也能促進(jìn)所述微生物的穩(wěn)定，或者可僅僅有助于方便處理所述經(jīng)誘導(dǎo)的微生物或酶?？赏ㄟ^(guò)通常認(rèn)為可用于微生物的固定的任何方法諸如吸附、靜電結(jié)合和共價(jià)結(jié)合等固定所述微生物。通常，所述微生物固定在能有助于從混合物或溶液(諸如解毒反應(yīng)混合物)中回收所述微生物的固體載體上。合適的固體載體包括但不限于顆粒活性炭、混合料、木質(zhì)殘余物產(chǎn)品(例如木片、木材、木塊、破碎的墊料或樹(shù))、金屬或金屬氧化物顆粒(例如氧化鋁、釕、氧化鐵)、離子交換樹(shù)脂、DEAE纖維素、0￡八￡-8￡1140￡乂@聚合物、陶瓷珠子、交聯(lián)聚丙烯酰胺珠子、方塊(cube)、金屬小球或其他凝膠形式、藻酸鹽珠子、K-角叉菜膠方塊，以及由于固有磁性而能從所述水溶液中回收的固體顆粒。所述催化劑的形狀是可變的(原因在于所述顆粒體的所需動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與能影響催化劑活性的體積/表面積關(guān)系相結(jié)合)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，受誘導(dǎo)的微生物被固定在已用聚乙烯亞胺交聯(lián)的藻酸鹽珠子上或者固定在聚丙烯酰胺類(lèi)型的聚合物中。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過(guò)將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)酰胺或酸而對(duì)腈混合物進(jìn)行解毒的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括將腈降解微生物的培養(yǎng)物施加到腈混合物中，并用含有酰胺基的氨基酸的混合物或其衍生物對(duì)所述微生物進(jìn)行足夠長(zhǎng)時(shí)間的多重誘導(dǎo)從而將所述腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺。作為另外一種選擇，所述方法包括將多重誘導(dǎo)的微生物施加于腈混合物足夠長(zhǎng)的時(shí)間從而將所述腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺。當(dāng)將所述微生物施加于廢物流時(shí)，所述微生物可以是正在生長(zhǎng)(活躍分裂)或靜息(非活躍分裂)的。當(dāng)所述方法要求必須施用生長(zhǎng)活躍的微生物的培養(yǎng)物時(shí)，所述施用條件優(yōu)選為支持或維持細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)所述方法要求必須施用非活躍分裂的微生物的培養(yǎng)物時(shí)，所述施用條件優(yōu)選為支持酶活性。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于處理來(lái)自于具有廢物的生產(chǎn)廠的廢物流，所述廢物通常含有高濃度的腈、氰醇或其他能進(jìn)行酶降解的化學(xué)品。例如，本發(fā)明提供了解毒方法以對(duì)來(lái)自腈生產(chǎn)廠的水性廢物流中的腈化合物的混合物或腈與酰胺化合物的混合物進(jìn)行解毒。此外，本發(fā)明能用于處理丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)生產(chǎn)中的廢物流，其中丙烯腈用在所述ABS的生產(chǎn)中。本發(fā)明還提供了能用于對(duì)在諸如空氣、蒸汽、氣溶膠和水或水溶液等流出物中的腈化合物的混合物、腈與酰胺化合物的混合物和酰胺化合物的混合物進(jìn)行解毒的生物過(guò)濾器中。例如，如果存在揮發(fā)性腈化合物，可從發(fā)現(xiàn)有所述揮發(fā)物的固體或水溶液中除去所述揮發(fā)物，并且應(yīng)當(dāng)進(jìn)行各步驟以將所述揮發(fā)物俘獲在生物過(guò)濾器中。一旦被俘獲，所述揮發(fā)物可按照本文所述，利用微生物的純培養(yǎng)物或提取物進(jìn)行解毒。本發(fā)明還提供了多種試劑盒，所述試劑盒包含已被多重誘導(dǎo)的微生物的培養(yǎng)物，所述微生物能對(duì)腈化合物的混合物、腈與酰胺化合物的混合物或酰胺化合物的混合物進(jìn)行解毒。所述微生物可以是活躍分裂的微生物或者凍干的微生物，并能直接加入到含有所述腈和/或酰胺化合物的水溶液中。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑盒包含受誘導(dǎo)的凍干樣品。所述微生物也可如此處所述固定在固體載體上。其他試劑盒組分可包括，例如，本文所述的用于誘導(dǎo)所述微生物的多種誘導(dǎo)添加物的混合物，以及諸如小瓶、包裝組件等其他試劑盒組件，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。實(shí)施例現(xiàn)在將具體參考多個(gè)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。以下實(shí)施例并非旨在限制本發(fā)明，而僅是提供示例性實(shí)施方式。實(shí)施例1對(duì)腈水合酶和酰胺酶進(jìn)行誘導(dǎo)使用多種類(lèi)型的誘導(dǎo)劑(1000ppm)對(duì)在紅球菌(朋o必coccwwp.)DAP96253菌株中的腈水合酶活性和酰胺酶活性的誘導(dǎo)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在含有IOppm鈷和7.5g/L尿素并添加有丙烯腈、天冬酰胺或谷氨酰胺的YEMEA培養(yǎng)基中培養(yǎng)三份不同的樣品。對(duì)每份樣品中的特異性腈水合酶活性和特異性酰胺酶活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果提供在下表1中，活性以單位/mgcdw(celldryweight,細(xì)胞干重)提供。一單位的腈水合酶活性指在pH7.0，3(TC的溫度下每分鐘每毫克細(xì)胞(干重)將1pmol的丙烯腈轉(zhuǎn)化為其對(duì)應(yīng)的酰胺的能力。一單位的酰胺酶活性指在pH7.0，3(TC的溫度下每分鐘每毫克細(xì)胞(干重)將lpmol的丙烯酰胺轉(zhuǎn)化為其對(duì)應(yīng)的酸的能力。表l添加物腈水合酶活性(單位/mgcdw)酰胺酶活性(單位/mgcdw)丙烯腈162.237.59天冬酰胺170.5013.24谷氨酰胺173.4510.39從表1可以看出，天冬酰胺或谷氨酰胺作為腈水合酶活性的誘導(dǎo)劑的能力超過(guò)了丙烯腈誘導(dǎo)該活性的能力。此外，使用谷氨酰胺作為誘導(dǎo)劑使得酰胺酶活性比使用丙烯腈所得的酰胺酶活性高大約37%，而相比于丙烯腈，天冬酰胺提供了約高74%的活性。實(shí)施例2使用藻酸鈣固定來(lái)穩(wěn)定腈水合酶活性進(jìn)行測(cè)試以對(duì)在所述培養(yǎng)基中使用天冬酰胺誘導(dǎo)腈水合酶的細(xì)胞的相對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基或者使用添加了天冬酰胺的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)紅球菌屬(i/wtfococcww.)DAP96253菌株。從所述培養(yǎng)物中回收細(xì)胞并將其固定在藻酸鈣珠子(23mm直徑)上。為準(zhǔn)備所述珠子，制備了25g的4%藻酸鈣溶液(在24ml的5mMTRIS-HCl(pH7.2)中的lg藻酸鈣)，將25mg的偏高碘酸鈉溶解其中(在25'C攪拌1小時(shí)或者直至所有藻酸鹽溶解)。將待固定的細(xì)胞在50mMTRIS-HC1中懸浮，至50ml的終體積，而在攪拌下將所述細(xì)胞溶液加入到所述藻酸鹽混合物中。通過(guò)將所述混合物通過(guò)27G皮下注射用針頭擠出到500ml的0.1MCaCl2中形成珠子。將所述珠子在所述CaCV溶液中固化1小時(shí)，并用水進(jìn)行洗滌。制備了四份樣品用于評(píng)價(jià)樣品1-與沒(méi)有用天冬酰胺培養(yǎng)的細(xì)胞一起形成珠子，但將天冬酰胺加入到包含所述珠子的混合物中；樣品2-與用天冬酰胺培養(yǎng)的細(xì)胞一起形成珠子，并將天冬酰胺加入到包含所述珠子的混合物中；樣品3-與用天冬酰胺培養(yǎng)的細(xì)胞一起形成珠子，并將丙烯腈和乙腈的混合物加入到包含所述珠子的混合物中；和樣品4-與用丙烯腈和乙腈培養(yǎng)的細(xì)胞一起形成珠子，并將天冬酰胺加入到含有珠子的混合物中。在樣品34中，丙烯腈和乙腈以各自為500ppm的濃度加入。在樣品14中的每一份中，天冬酰胺以1000ppm加入。所固定的細(xì)胞保持約150小時(shí)的時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)剩余的腈水合酶活性。測(cè)試結(jié)果圖示在圖1中。為評(píng)價(jià)經(jīng)穩(wěn)定的活性，測(cè)試了相當(dāng)量的細(xì)胞，將O時(shí)刻的相當(dāng)量等分試樣的全細(xì)胞的活性設(shè)為100%。將相當(dāng)量等分試樣的催化劑在適宜的溫度下進(jìn)行溫育。在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間，從溫育中取出整份等分試樣并測(cè)定酶活性。對(duì)于最初10小時(shí)，每2小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。第1060小時(shí)，每4小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，隨后每12小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖1所見(jiàn)，誘導(dǎo)細(xì)胞在藻酸鈣中的固定提供了與使用危險(xiǎn)性的含腈化合物實(shí)現(xiàn)的穩(wěn)定水平非常相似的腈水合酶活性的穩(wěn)定，并且沒(méi)有缺點(diǎn)(例如，健康和規(guī)章問(wèn)題)。實(shí)施例3使用聚丙烯酰胺固定來(lái)穩(wěn)定腈水合酶活性進(jìn)行測(cè)試以對(duì)在所述培養(yǎng)基中使用天冬酰胺誘導(dǎo)腈水合酶的細(xì)胞的相對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用添加了天冬酰胺的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)紅球菌屬(i^otfococcw^.)DAP96253菌株。從所述培養(yǎng)物中回收細(xì)胞并固定在交聯(lián)聚丙烯酰胺方塊(2.5mmx2.5mmxlmm)上。制備聚丙烯酰胺溶液，并加入所需加載量的細(xì)胞。將所述含有細(xì)胞的聚丙烯酰胺交聯(lián)形成凝膠，并切割為所述的方塊。沒(méi)有向所述聚丙烯酰胺加入其他已知的穩(wěn)定劑。制備了兩份樣品以用于進(jìn)行評(píng)價(jià)樣品1-具有低細(xì)胞負(fù)載量的方塊(用每40mL的細(xì)胞懸浮液中含有l(wèi)g細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行制備)；樣品2-具有高細(xì)胞負(fù)載量的方塊(用每40mL的細(xì)胞懸浮液中含有4g細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行制備)。所固定的細(xì)胞保持約150天的時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)剩余的腈水合酶活性。測(cè)試結(jié)果圖示在圖2中。為評(píng)價(jià)經(jīng)穩(wěn)定的活性，測(cè)試了相當(dāng)量的細(xì)胞，將O時(shí)刻的相當(dāng)量等分試樣的全細(xì)胞的活性設(shè)為100%。將相當(dāng)量等分試樣的催化劑在適宜的溫度下進(jìn)行溫育。在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間，從溫育中取出整份等分試樣并測(cè)定酶活性。對(duì)于最初10小時(shí)，每2小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。第1060小時(shí)，每4小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。從第5天至第40天，每12小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。從第40天至第576天，平均每10天對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖2所見(jiàn)，用聚丙烯酰胺穩(wěn)定的細(xì)胞在誘導(dǎo)后保持活性長(zhǎng)達(dá)150小時(shí)。此外，以低濃度負(fù)載的聚丙烯酰胺固定細(xì)胞在誘導(dǎo)后約45小時(shí)依然表現(xiàn)出初始活性的50%，以高濃度負(fù)載的聚丙烯酰胺固定細(xì)胞在誘導(dǎo)后約80小時(shí)依然表現(xiàn)出初始活性的50%。實(shí)施例4用藻酸f丐或聚丙烯酰胺固定來(lái)穩(wěn)定腈水合酶活性進(jìn)行測(cè)試以對(duì)在所述培養(yǎng)基中使用天冬酰胺誘導(dǎo)腈水合酶的細(xì)胞的相對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。所述測(cè)試特別比較了聚丙烯酰胺或藻酸鈣中的固定所提供的穩(wěn)定性。使用添加了天冬酰胺的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)紅球菌屬(i^^fococcw孚)DAP96622菌株以誘導(dǎo)腈水合酶活性。從培養(yǎng)物中回收細(xì)胞以用于固定。通過(guò)采用實(shí)施例3中描述的方法將所述天冬酰胺誘導(dǎo)細(xì)胞固定在聚丙烯酰胺方塊(2.5mmx2.5mmxlmm)中從而制備測(cè)試樣品l。作為比較，用丙烯腈獨(dú)立誘導(dǎo)的細(xì)胞也固定在聚丙烯酰胺方塊中以進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)采用實(shí)施例2中描述的方法將所述天冬酰胺誘導(dǎo)細(xì)胞固定在藻酸f丐珠子(23mm直徑)中從而制備測(cè)試樣品2。作為比較，采用實(shí)際含腈廢水(稱為NSB/WWCB)作為誘導(dǎo)添加物制備一份樣品。采用含有存在于丙烯腈制造廢物流中占主導(dǎo)的腈和酰胺的合成混合物(也包括硫酸銨并特別地不包括氰化氫)(稱為FCw/AMSw/oHCN)作為誘導(dǎo)劑制備第二比較樣品。所固定的細(xì)胞保持約576天的時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)剩余的腈水合酶活性。測(cè)試結(jié)果圖示在圖3中。為評(píng)價(jià)經(jīng)穩(wěn)定的活性，測(cè)試了相當(dāng)量的細(xì)胞。將O時(shí)刻的相當(dāng)量等分試樣的全細(xì)胞的活性設(shè)為100%。相當(dāng)量等分試樣的催化劑在適宜的溫度下進(jìn)行溫育。在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間，從溫育中取出整份等分試樣并測(cè)定酶活性。對(duì)于最初10小時(shí)，每2小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。第1060小時(shí)，每4小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。從第5天至第40天，每12小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。從第40天至第576天，平均每10天對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)施例5使用戊二醛固定來(lái)穩(wěn)定腈水合酶活性進(jìn)行測(cè)試以對(duì)在所述培養(yǎng)基中使用天冬酰胺誘導(dǎo)腈水合酶活性的細(xì)胞的相對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。所述測(cè)試特別比較了通過(guò)戊二醛交聯(lián)進(jìn)行固定而提供的穩(wěn)定性。使用添加了天冬酰胺的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)紅球菌屬(i^ocfococcww.)DAP96253菌株和紫紅紅球菌DAP96622菌株以誘導(dǎo)腈水合酶活性。從所述培養(yǎng)物中回收細(xì)胞并將其如此處所述用戊二醛交聯(lián)。所固定的細(xì)胞保持約576天的時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)剩余的腈水合酶活性。測(cè)試結(jié)果圖示在圖4中。為評(píng)價(jià)經(jīng)穩(wěn)定的活性，測(cè)試了相當(dāng)量的細(xì)胞。將O時(shí)刻的相當(dāng)量等分試樣的全細(xì)胞的活性設(shè)為100%。相當(dāng)量等分試樣的催化劑在適宜的溫度下進(jìn)行溫育。在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間，從溫育中取出整份等分試樣并測(cè)定酶活性。對(duì)于最初10小時(shí)，每2小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。第1060小時(shí)，每4小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。從第5天至第40天，每12小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。從第40天至第576天，平均每10天對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖4所見(jiàn)，相比于以上描述的其他穩(wěn)定方法，通過(guò)戊二醛交聯(lián)固定的兩個(gè)菌株表現(xiàn)出或多或少更小的初始活性。然而，通過(guò)戊二醛交聯(lián)固定的兩個(gè)菌株表現(xiàn)出優(yōu)異的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，在576天后保持多達(dá)約65%的活性。實(shí)施例6天冬酰胺和谷氨酰胺對(duì)產(chǎn)生腈水合酶的微生物的生長(zhǎng)的作用評(píng)價(jià)了各種產(chǎn)生腈水合酶的微生物的相對(duì)生長(zhǎng)。所有菌株均在含有7.5g/L的尿素和10ppm鈷(以氯化鈷提供)并添加有天冬酰胺(ASN)、谷氨酰胺(GLN)或者同時(shí)有天冬酰胺和谷氨酰胺的YEMEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。加入3.SmM的天冬酰胺和谷氨酰胺。生長(zhǎng)溫度在26。C30。C范圍內(nèi)。通過(guò)視覺(jué)觀察對(duì)生長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并以以下等級(jí)進(jìn)行評(píng)級(jí)(-)指沒(méi)有可檢測(cè)的生長(zhǎng)；(+/-)指幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)；(+)指很少生長(zhǎng)；(++)指良好的生長(zhǎng)；(+++)指非常好的生長(zhǎng)；而(++++)指優(yōu)異的生長(zhǎng)。結(jié)果提供在下表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例8天冬酰胺和谷氨酰胺對(duì)天冬酰胺酶I產(chǎn)生的作用評(píng)價(jià)了在各種產(chǎn)生腈水合酶的微生物中天冬酰胺酶I產(chǎn)生的誘導(dǎo)。所有菌株均在含有7.5g/L的尿素和10ppm鈷(以氯化鈷提供)并添加有天冬酰胺(ASN)、谷氨酰胺(GLN)或者同時(shí)有天冬酰胺和谷氨酰胺的YEMEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。加入3.8mM的天冬酰胺和谷氨酰胺。作為比較，評(píng)價(jià)了添加丙烯腈(AN)、丙烯酰胺(AMD)或丙烯腈和丙烯酰胺的酶產(chǎn)生。生長(zhǎng)溫度在26t:3(TC范圍內(nèi)。評(píng)價(jià)了以每mg細(xì)胞干重中的單位計(jì)的天冬酰胺酶I水平，結(jié)果提供在表5中。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例9在紅球菌屬(i^oAcoccw平)DAP96253細(xì)胞中天冬酰胺酶I活性的誘導(dǎo)使用兩相培養(yǎng)基(作為20升發(fā)酵的接種體來(lái)源)培育紅球菌屬(i/2^fococcww.)DAP96253。向改進(jìn)的R2A培養(yǎng)基(含有取代了示蛋白胨3(PP3)的棉籽水解物)中補(bǔ)充加入培養(yǎng)基/碳水化合物(或者YEMEA、葡萄糖或者麥芽糖)。在時(shí)刻t-10h開(kāi)始以1000(il/min的連續(xù)速率加入天冬酰胺(0.15M溶液)。在發(fā)酵過(guò)程結(jié)束時(shí)，產(chǎn)生了每毫克細(xì)胞干重中159單位的丙烯腈特異性腈水合酶，每毫克細(xì)胞干重中22單位的酰胺酶和16g/1充滿細(xì)胞的濕重(cellpackedwetweight)。產(chǎn)生的各種酶的量提供在表5中。由此處可見(jiàn)，由所述DAP96253細(xì)胞產(chǎn)生了每毫克細(xì)胞干重中159單位的腈水合酶、22單位的丙烯酰胺酶和16單位的天冬酰胺酶I。實(shí)施例10培養(yǎng)基組成對(duì)紅球菌屬(i/zo^coccw平)DAP96253細(xì)胞中天冬酰胺酶I產(chǎn)生的作用進(jìn)行測(cè)試以評(píng)價(jià)根據(jù)所使用的誘導(dǎo)劑對(duì)天冬酰胺酶I活性的作用。具體而言，采用天冬酰胺、谷氨酰胺、琥珀腈和異戊腈作為誘導(dǎo)劑(每種均以1000ppm加入)進(jìn)行測(cè)試。從表6可以看到，天冬酰胺能誘導(dǎo)24.6單位/mg細(xì)胞干重的天冬酰胺酶I活性。谷氨酰胺或琥珀腈也表現(xiàn)出誘導(dǎo)天冬酰胺酶I活性的能力。當(dāng)向YEMEA中加入麥芽糖時(shí)得到更高的天冬酰胺酶I活性。當(dāng)與葡萄糖或者麥芽糖組合時(shí)，在培養(yǎng)基中包括鈷(550ppm)也能導(dǎo)致提高。_^_在含有碳水化合物添加物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的紅球菌屬DAP96253、#s^中的天冬酰胺酶I的水平訪守"」YEMEA-葡萄糖YEMEA-麥芽糖不含有鈷含有鈷不含有鈷含有鈷天冬酰胺5.36.58.724.6谷氨酰胺1.51.99.38.1琥珀腈6.58.511.010.0異戊腈3.52.96.87.0受益于在前文描述中所呈現(xiàn)的教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員會(huì)想到此處所闡述的本發(fā)明的許多改進(jìn)和其他實(shí)施方式。因此，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不局限于所公開(kāi)的具體實(shí)施方式，改進(jìn)和其他實(shí)施方式也意欲包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。盡管此處采用了具體的術(shù)語(yǔ)，它們也僅是以普遍和描述性的意義進(jìn)行使用，而并非是為了限制的目的。權(quán)利要求1.一種在產(chǎn)生腈水合酶的微生物內(nèi)誘導(dǎo)所需酶活性的方法，所述方法包括在含有至少約50ppm的一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述所需酶活性選自由腈水合酶活性、酰胺酶活性、天冬酰胺酶I活性及其組合組成的組。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物包括選自由紅球菌屬(ge畫(huà)i/2ot/ococcus)、短桿菌屬(genus5/^v/Zac&n'ww)、j叚單胞菌屬(genus/^ewfifomowas)、假i若卡氏菌屬(genus/^ez^cwocw^a)、諾卡氏菌屬(genusMcaW/(3)及其組合組成的組的細(xì)菌。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物包括選自由紫紅紅球菌(i^^fococcww/zo^c/zraw)DAP96622和紅球菌屬(i^o&coccwsw.)DAP96253及其組合組成的組的細(xì)菌。5.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述一種或多種含有酰胺基的氨基酸選自由天冬酰胺、谷氨酰胺或其組合組成的組。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述一種或多種含有酰胺基的氨基酸以約50ppm約5000ppm的濃度存在。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基不含有任何含腈化合物。8.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括固定所述微生物。9.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述經(jīng)誘導(dǎo)的產(chǎn)生腈水合酶的微生物具有的酶活性高于或等于相同的酶在用含腈化合物誘導(dǎo)時(shí)的活性。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述經(jīng)誘導(dǎo)的產(chǎn)生腈水合酶的微生物具有的酶活性比相同的酶在用含腈化合物誘導(dǎo)時(shí)的活性高至少5%。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步含有鈷。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步含有尿素。13.—種在酶或能產(chǎn)生所述酶的微生物中穩(wěn)定所需活性的方法，所述方法包括將所述酶或能產(chǎn)生所述酶的微生物與含有至少約50ppm的一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物相接觸。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述一種或多種含有酰胺基的氨基酸選自由天冬酰胺、谷氨酰胺和其組合組成的組。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述一種或多種含有酰胺基的氨基酸以約50ppm約5000ppm的濃度存在。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述酶或所述能產(chǎn)生所述酶的微生物的所需活性經(jīng)穩(wěn)定使得在25i:的溫度至少30天的時(shí)間以后，所需活性保持在由所述酶或所述能產(chǎn)生所述酶的微生物所表現(xiàn)出來(lái)的初始活性的至少約50%的水平。17.—種用于穩(wěn)定腈水合酶的方法，所述方法包括以基質(zhì)固定所述腈水合酶或能產(chǎn)生所述腈水合酶的微生物，從而使得在25。C的溫度至少30天的時(shí)間以后，所述活性保持在由所述腈水合酶或所述能產(chǎn)生所述腈水合酶的微生物所表現(xiàn)出來(lái)的初始活性的至少約50%的水平。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述基質(zhì)選自由藻酸鹽和含有酰胺基的聚合物組成的組。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述含有酰胺基的聚合物包括聚丙烯酰胺。20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述固定包括將來(lái)自所述微生物的細(xì)胞與戊二醛交聯(lián)。21.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述微生物包括選自由紅5求菌屬(genusA/zo(iococcRs)、矢豆木干菌屬(genus5reW6"cfen'wm)、假單胞菌屬(genus)、假諾卡氏菌屬(genus尸化wdowocaWa)、諾卡氏菌屬(genusMx^W/fl)及其組合組成的組的細(xì)菌。22.—種組合物，所述組合物包含(a)含有至少約50ppm的一種或多種含有酰胺基的氨基酸或其衍生物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基；(b)—種或多種產(chǎn)生酶的微生物；和(C)一種或多種選自由腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶I及其組合組成的組的酶。23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中，所述一種或多種含有酰胺基的氨基酸選自由天冬酰胺、谷氨酰胺及其組合組成的組。24.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中，所述一種或多種含有酰胺基的氨基酸以約200ppm約2000ppm的濃度存在。25.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中，所述一種或多種微生物包括選自由紅球菌屬(genusi/z。(iococ譜)、短桿菌屬(genus5revA"c&〃'ww)、假單胞菌屬(genusi^ew(^omo"os)、f叚i若卡氏菌屬(genusi^z^o"ocaW/a)、諾卡氏菌屬(genusMcaW/a)及其組合組成的組的細(xì)菌。26.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中，所述一種或多種微生物包括選自由紫紅紅球菌(T^ocfococcwWzocfoc/zraws)、紅球菌屬(朋O(sfoco簡(jiǎn)s)DAP96253、酮戊二酸短桿菌(5reWZ)acfeW訓(xùn)fetog/wton'cwm)及其組合組成的組的細(xì)菌。27.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中，所述一種或多種微生物至少被部分固定。28.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步含有鈷。29.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步含有尿素。全文摘要本發(fā)明涉及用于在酶或能產(chǎn)生所述酶的微生物中誘導(dǎo)所需活性的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及穩(wěn)定在微生物中的活性的方法。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)和穩(wěn)定腈水合酶活性、酰胺酶活性和天冬酰胺酶I活性的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含具有被誘導(dǎo)和/或被穩(wěn)定的活性的酶或者微生物的組合物。文檔編號(hào)C12N11/04GK101410506SQ200780011311公開(kāi)日2009年4月15日申請(qǐng)日期2007年1月30日優(yōu)先權(quán)日2006年1月30日發(fā)明者喬治·E·皮爾斯,吉恩·德拉戈,桑熱塔·甘谷利申請(qǐng)人:佐治亞州立大學(xué)研究基金會(huì)