專利名稱：肺結(jié)核疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種屬于分枝桿菌(Tl^coZ^"er/wm )屬的分離樣i生 物，其特征在于，其包括賦予PhoP-表型的Rv0757基因的失活和防 止DIM產(chǎn)生(DIM-表型)的第二基因的失活。另外，本發(fā)明包括背景技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)證實，4吏用疫苗來預(yù)防人類肺結(jié)核成為將近一個世紀(jì) 以來的巨大才兆戰(zhàn)。來源于牛分枝桿菌(M6ov&)的卡介苗(BCG) 是目前唯一在使用的肺結(jié)核疫苗并且是世界范圍內(nèi)^f吏用最廣泛的 疫苗。自20世纟己20年代開始，BCG疫苗的發(fā)展和普遍使用呈現(xiàn)顯 著的進步，具有能夠?qū)⒎谓Y(jié)核從世界根除的前景。但是，這些最初 的希望并沒有實現(xiàn)，而且由大量的效力試馬全的結(jié)果可以清楚，在這 種疾病已成為地方性疾病的第三世界地區(qū)中，現(xiàn)有形式的BCG疫 苗在控制疾病、特別是成年人呼吸形式的疾病中的使用是有限的 [4]。隨著對結(jié)核分枝桿菌(M /w&rcw/a^)的毒性和導(dǎo)致保護性免 疫產(chǎn)生的免疫反應(yīng)模式的越來越多的了解，使得開發(fā)優(yōu)于BCG的 疫苗成為可能。當(dāng)對宿主4妄種BCG時可獲得4交高的保護水平，這 一發(fā)現(xiàn)表明存活力和持久力是肺結(jié)核疫苗成功所必需的基本特性。 在本發(fā)明中，我們4吏用具有失活的Rv0757 (p/zoP )基因和p/zo尸 的第二獨立突變(其防止DIM的合成)的結(jié)核分枝桿菌菌抹作為 原型單劑量活疫苗，而且我們已指出，它在免疫低下的SCID小鼠中比BCG更能被減毒，且在小鼠中產(chǎn)生的保護水平與BCG所產(chǎn)生 的相當(dāng)，并且在豚鼠中產(chǎn)生比BCG更高的保護。p/zoP基因和p/^W —起形成的雙組分系統(tǒng)的部分，表現(xiàn)出與控 制胞內(nèi)病原體的關(guān)4建毒力基因轉(zhuǎn)錄的其它雙組分系統(tǒng)的高度相似 性。它還控制許多其它并非直接參與毒力的基因表達[19]。去除毒 力基因本質(zhì)上似乎并不是結(jié)核分枝桿菌減毒的唯一方法。已經(jīng)表 明，不能重新合成泛酸的結(jié)核分枝桿菌的泛酸營養(yǎng)缺陷型突變體， 在SCID小鼠中持續(xù)存在，但不會導(dǎo)致疾病發(fā)生[17]。單獨的亮氨 酸營養(yǎng)缺陷型，其毒力也被大大減弱且不能在SCID小鼠中進行體 內(nèi)復(fù)制[28]。因此，現(xiàn)在普遍4妄受這樣的原則基于結(jié)核分枝桿菌 的疫苗林可成功地被減毒，同時保留在牛分枝桿菌BCG中被抑制 的基因。過去，對于比BCG更有效的疫苗的研究基于這樣的觀念BCG 毒力的喪失本質(zhì)上是促進其完全保護效力缺失的一個因素[32]。因 此推i侖為結(jié)核分枝桿菌的新型減毒突變體，具有4交少的毒力，可 能成為更加有效的疫苗。然而，近期的研究顯示，自然感染結(jié)核分 枝桿菌和接種BCG在其產(chǎn)生抗肺結(jié)核的保護性免疫的能力上沒有 差異[34]。這提出了關(guān)于是否可能通過結(jié)核分枝桿菌的合理減毒來 改良BCG的問題。在這種情況下，發(fā)現(xiàn)在SCID小鼠模型中，具有 兩個獨立突變(1, PhoP蛋白質(zhì)合成和2,DIM合成)的組合的本發(fā) 明的突變結(jié)核分枝桿菌菌4朱，即4吏當(dāng)以高于BCG 10倍的劑量4吏用 時，相比BCG也更能被減毒，并且在豚鼠模型中具有比BCG更高 的保護程度，這些發(fā)現(xiàn)特別出乎預(yù)料并且具有重要的意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第 一 個方面涉及 一 種屬于分枝桿菌屬的分離微生物， 其特4i在于包4舌Rv 0757(/ /zo尸)基因的失活和防止DIM( phthioceroldimycocerosates )產(chǎn)生的第二基因的失活。在下文中，該分離樣i生 物將被稱為本發(fā)明的微生物。本發(fā)明的第二個方面涉及一種屬于分枝桿菌屬的分離微生物， 其特;f正在于包^舌，^f吏Rv 0757 (p/zoP )基因和防止DIM產(chǎn)生的； /zo尸 的第二獨立突變失活。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，所述的第二突變是 在Rv2930 ()基因中，包括DIM合成所必需的/adZ)26基因 的缺失。本發(fā)明的第三個方面涉及使用本發(fā)明的分離微生物來制備用 于預(yù)防動物肺結(jié)核、并且更加優(yōu)選地用于預(yù)防人類肺結(jié)核的疫苗的 應(yīng)用，以及肺結(jié)核疫苗目前在治療人類疾病如膀胱癌中所具有的其 它用途。以下在本發(fā)明的情況中，"結(jié)核分枝桿菌S02菌抹"用來表示 已通過Rv0757基因而失活并另外包4舌防止DIM (結(jié)核菌醇二蔗蠟 酸酯，phthiocerol dimycocerosates)產(chǎn)生的第二基因的失活的結(jié)核 分枝桿菌菌林的分離微生物，其中Rv0757基因是由結(jié)核分枝桿菌 MT103臨床菌才朱，才艮才居Pelicic等(1997 ) ( Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Afyco^c/er/ww fw6ercw/os7'51.尸rac iVa// /4cat/Sc/ tASM 94: 10955-10960 )所4皮露的方法，利用同源重纟且在結(jié) 核分枝桿菌的Rv0757基因的^^//位點插入卡那霉素抗性標(biāo)記構(gòu)建 而成。因此，本發(fā)明的所述菌4朱在來源于結(jié)核分斗支桿菌的存活減毒 疫苗中表現(xiàn)為兩個獨立的突變，獨立的p/zoP突變不會影響源自所 述基因的失活的疫苗的特性。實施例9纟皮露了如何構(gòu)建具有獨立雙 突變的分枝桿菌屬分離微生物，其產(chǎn)生與披露的結(jié)核分枝桿菌S02 菌才朱相同的表型。以下在本發(fā)明的情況中，疫苗將用來表示的藥物，其給藥對所 要預(yù)防的疾病可產(chǎn)生防雄卩。以下在本發(fā)明的情況中，BCG將用來表示自1921年以來被用 于4氐抗肺結(jié)核的現(xiàn)有疫苗。它是來源于牛分枝桿菌菌一朱的存活減毒 疫苗，其中該牛分枝桿菌菌抹在實驗室傳代培養(yǎng)后喪失了毒力，并 且現(xiàn)在我們知道其具有一百多個缺失基因(5)。以下在本發(fā)明的情況中，H37Rv 一尋用來表示已經(jīng);故測序的致 病結(jié)核分枝桿菌菌抹，Cole等將這些基因表示為Rv (Ref Cole W a/ 1998 Deciphering the biology of Afyco6a"e"'ww ZwZwcw/as7、 from the complete genome sequence. iV^we 393: 537-544)。以下在本發(fā)明的情況中，MT103將用來表示結(jié)核分枝桿菌臨 床分離菌(參考文獻15 Camacho等)。以下在本發(fā)明的情況中，DIM-菌林將用來表示不能夠合成與 結(jié)核分枝桿菌的致病性相關(guān)的重要脂質(zhì)，結(jié)核菌醇二蔗蠟酸酯的結(jié) 核分枝桿菌復(fù)合菌群(complex)的菌4朱。在圖11中使用1A29菌 才朱，其由MT103菌才朱組成，其中Rv2930 (fadD26)基因通過在參考 文獻15 (Camacho a/. 1999 Identification of a virulence gene cluster of A^coZ a"er/wm fw6ercw/osfs by signature-tagged transposon mutagenesis. Afo/ M/cra6/o/ 34: 257-267)中披露的轉(zhuǎn)座子1096而失 活。以下在本發(fā)明的情況中，S02+ pS05將用來表示結(jié)核分枝桿 菌S02菌4朱，其中尺v0757突變通過具有分枝桿菌p/2o尸基因的復(fù) 制型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化而被尺W 757基因補償，但是它不能補償DIM合成， 它的表型為phoP+ DIM-。以下在本發(fā)明的情況中，結(jié)核分枝桿菌phoP-將用來表示由于 WW75 7基因在7 "W B^五/位點之間的缺失而失活的結(jié)核分枝4干 菌菌4朱，它的表型為phoP-DIM+。以下在本發(fā)明的情況中，Rv2930 (/^/Z)26)將用來表示位于負責(zé) 合成結(jié)核菌醇二蔗蠟酸酯的操縱子的起點的基因(參考文獻15 Camacho等1999),并且在結(jié)核分枝桿菌中去除該基因可產(chǎn)生穩(wěn)定 的DIM-表型。


圖1蛋白質(zhì)印跡分沖斤(Western BlotAnalysis)。 MT103、本發(fā)明的S02菌株和BCG Pasteur的胞外蛋白4是取物的蛋白質(zhì)印跡圖，其 中使用獲得的抗PhoP和ESAT-6的多克隆抗體。MT103菌林具有 ESAT6+和phoP+表型，S02菌才朱具有PhoP畫和ESAT6 +表型， BCG疫苗菌4朱是PhoP+和ESAT6-。圖2本發(fā)明的S02菌#^ SCID小鼠中的減務(wù)ft用。",噴霧感 染有20CFU的S()2、由pS05 (S02 + pS05)氺卜j嘗的S02和MT103 的SCID小鼠(n=10)的存活率曲線。存活天數(shù)的平均值為多于245 (S02)、 62.1±5.88 (S02十pS05)詳口 36.7±0.67 (MT103)天。通過噴 霧感染S02菌林的小鼠存活了 245個實驗日，而那些感染MT103 和由p/zo尸補償?shù)腟02菌4朱的小鼠在62天以前死亡。A,通過l爭月永注 射感染5.4 x 106 CFU的S02和2 x 105 CFU的BCG Pasteur的SCID 小鼠(n=7)的存活率曲線。這表明S02菌林的減毒水平高于目前 用于人類的肺結(jié)核疫苗BCG。圖3接種本發(fā)明的S02菌林和BCG的小鼠中的細J包免j^應(yīng)。Balb/c小鼠通過皮下注射4妄種8 x 103 CFU的BCG (Phipps)或 2.5 x 103CFU的本發(fā)明的S02菌林。結(jié)果表示為在接種之后每隔 一段時間脾中的總CD4+ZCD8+群體的百分比，以及在由完全結(jié)核 分枝桿菌抗原刺激之后總CD4+/ CD8+群體中表達IFN- Y的纟田月包的 百分比。*表示在特定的時間點上組間統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異(p< 0.005)。細胞免疫結(jié)果顯示，與接種BCG的小鼠相比，接種S02菌才朱的動物中的CD4+淋巴細胞的數(shù)量在14、 30、 45和60天較高， 并且在45天和60天抗結(jié)核分枝桿菌抗原的特異性IFN Y的產(chǎn)量顯 著。與接種BCG的小鼠相比，接種S02菌林的動物中的CD8+淋 巴細力包的凄t量在45天和60天一交高，并且在14天抗結(jié)核分枝4干菌 抗原的特異性IFN Y的產(chǎn)量顯著。圖4與BCG相比，本發(fā)明的S02在接種Balb/c的小鼠中的 保護效力。在接種本發(fā)明的S02菌林和BCG、靜脈感染結(jié)核分枝 桿菌H37Rv的Balb/c小鼠的肺(a )和脾(b )中回收的CFU的數(shù) 量。在接種S()2的小鼠的肺和脾中，CFU的減少與在接種BCG的 小鼠中得到的相似，而與未接種的小鼠相比表現(xiàn)為顯著的保護。圖5在接種本發(fā)明的S02菌林和BCG的豚鼠中，抗低劑量結(jié) 核分4支桿菌H37Rv的4呆護效力。在感染低劑量結(jié)核分枝桿菌H37Rv 的已接種的豚鼠和注射有生理鹽水的對照豚鼠的肺(a)和脾(b) 中l(wèi)og1QCFU/ml的平均值。數(shù)據(jù)代表4周后處死的所有動物(n-6) 中的平均CFU。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。在以低劑量感染結(jié)核分枝桿 菌并沖妻種S02的;3承鼠的肺和脾中，CFU的減少與在接種BCG中的 豚鼠中得到的相似，而與未接種的d、鼠相比則是顯著的。圖6在接種^^發(fā)明的S02菌林和BCG的豚鼠中，抗高劑量結(jié) 核分4支桿菌H37Rv的4呆護效力。"，已知在以低劑量進行感染的小 鼠和豚鼠中的保護實驗表明，在接種S02和BCG的小鼠中具有明 顯的4呆護作用而BCG和S02之間并沒有差異，因而4吏用以高劑量 進行感染的豚鼠模型。豚鼠在噴霧感染結(jié)核分枝桿菌H37Rv之后的 存活率曲線。6，肺部疾病的程度和感染的范圍，通過總的肺實變來 測量。每個在人道終點死亡的動物個體的值以"x"標(biāo)記。虛線表示組 的平均百分^f直(#在S02中對應(yīng)兩個動物)。c，耳又自每個處理組的豚 鼠的肺葉的代表性截面的低分辨率(x 30)圖像。條線代表lmm。 </, 在已接種和未接種的豚鼠的脾和肺中的平均CFU數(shù)。這個實驗表明，以高劑量感染結(jié)核分枝桿菌的豚鼠模型，接種S02的豚鼠的存 活顯著長于4妻種BCG的力參鼠，它們還產(chǎn)生4交少的肺部損傷，并且 與王見有的BCG疫苗相比，在月年和肺中具有4交^[氐凄t量的CFU。圖7.在Balb/C小鼠中靜樂^感染本發(fā)明的S02的減務(wù)ft用不 會通過^M嘗phoP而回復(fù)。與野生型MT103菌4朱以及補償有phoP (S02 + pS05)的菌才朱比4交，研究在Balb/C小鼠中,爭脈感染105CFU 的S02 (phoP-DIM-)菌4朱。通過在3周和6周后的測量，發(fā)現(xiàn)在脾 (7a脾)和肺(7b肺)中菌落總數(shù)(CFU)均得到減少。野生型菌 林的CFU的水平不會在補償?shù)木ㄖ械玫交貜?fù)。這些在免疫活性 小鼠中的實驗表明，出乎預(yù)料的減毒作用可能是由于不會通過phoP 補償而回復(fù)的第二附加突變。圖8.本發(fā)明的S02菌林不產(chǎn)生DIM，且DIM合成與突變無關(guān)。通過薄層色語法分析來源于不同的結(jié)核分枝桿菌菌林的 脂質(zhì)。8 a MT103菌4朱可以 見察到DIM產(chǎn)生，j旦是S02菌4朱和補 償p/zoP (S02 pS()5)基因的菌林不會產(chǎn)生DIM。這表明對于S02， 缺乏DIM與； /zo尸無關(guān)。8 b表明MT103菌4朱和4又失活了 p/ o尸 (MT103 A/ /zo尸::/7j;g)基因的MT103菌4朱，兩者都能合成DIM，這確 定了 DIM的產(chǎn)生與突變無關(guān)。圖9用于失活/似//>26基因的質(zhì)粒構(gòu)建。圖10用于失活/7/lO尸基因的質(zhì)津立構(gòu)建。圖11小鼠中減毒作用的研究氣管接種的Balb/C小鼠的存活 率曲線，用以研究結(jié)核分枝桿菌的不同菌林的減毒作用。H37Rv和 MT103對應(yīng)于沒有突變的結(jié)核分枝桿菌菌林，所有的小鼠均在第 IO周之前死亡。50%的種結(jié)分枝桿菌DIM- (1A29)菌林的小鼠存活到20周之后。所有接種S02 (phoP-和DIM-突變體)的動物 存活了 20個實驗周。圖12.豚鼠的存活率和重量曲線，以研究50倍疫苗劑量的SO2 的毒性。為了表明S02是無毒的，對6只豚鼠接種50倍的疫苗劑 量。經(jīng)過持續(xù)6個月的實驗之后，存活率為100%。經(jīng)過這6個月， 發(fā)現(xiàn)所有動物重量都得到增加，這表明了 S02菌林的無毒性(Y= 對應(yīng)各個感染周的重量(以克計)，乂=時間(以周計))。圖13.已接種的豚鼠在感染結(jié)核分枝桿菌后的存活率。豚鼠中的保護研究，300天之后的存活率未接種的豚鼠(鹽)、接種現(xiàn)有 BCG疫苗的豚鼠、接種結(jié)核分枝桿菌p/zo尸-菌林的豚鼠或接種S02 (p/zoP-和DIM-突變體)的豚鼠的存活率曲線。在皮下接種后，使 動物感染高劑量的結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)的有毒菌林以研究存活 率。60天后，6只未4妄種的月豕鼠死亡，而4妾種S02、/ /zo尸- 和BCG 的組存活。在感染300天后，3只4妻種BCG和p/zoP-的月豕鼠死亡， 與之相比，4妻種S()2的組中只有一只死亡，這表明p/7oP突變體的 保護作用類似于現(xiàn)有疫苗BCG,而phoP-和DIM-雙突變體，S02 的接種，在豚鼠中保護作用更好。圖14.豚鼠中的保護研究，400天之后的存活率對圖13中所 示實驗的繼續(xù)。6只未接種的豚鼠在60天后死亡。在感染400天之 后，3只來自4妻種S02的組的月豕鼠(圖14a)存活，而只有一只接 種BCG(圖14a和圖14b)和phoP- (圖14b)的豚鼠存活，再次表 明/ /7o尸突變體的^f呆護作用類卩以于BCG，而phoP-和DIM-雙突變 體，SQ2的接種，在400個實驗日之后保護作用更好。
具體實施方式
本發(fā)明的一個方面涉及一種屬于分枝桿菌屬的分離微生物，其特征在于包括賦予PhoP-表型的Rv0757基因的失活和防止DIM產(chǎn) 生(DIM-表型)的第二基因的失活。另外，本發(fā)明包括使用所述凝: 生物用于制備預(yù)防肺結(jié)核的疫苗的應(yīng)用，以及疫苗本身。貫穿本發(fā)明指出了分離的結(jié)核分枝桿菌屬的phoP- DIM-菌林， 如何由于它們獲得的減毒水平和它們產(chǎn)生的保護水平，而表現(xiàn)出使 它們特別適合用作疫苗的特點。為了證明減毒作用，對免疫低下的SCID小鼠噴霧接種S02 (phoP-DIM-)菌株。所述小鼠(圖2a)的存活顯著長于感染野生型 菌才朱的小鼠。另外，在S02+pS05 (phoP+DIM-)菌4朱中這種減毒作 用由/7/w尸得到補償(圖8a)。此夕卜，當(dāng)在免疫活性Balb/C小鼠中通過靜脈注射進行減毒研究 時(圖7),與野生型MT103菌林相比，S02存在明顯的減毒，但 是出乎預(yù)料的是這種減毒不被p/70尸補償，因為對于免疫活性小鼠， S02+ PS05 (phoP+ DIM-)菌4朱的毒性與野生型菌4朱相同。4又對S02 (DIM-, /7/zo尸-)菌4朱與DIM-菌4朱的Balb/C小鼠進4亍比4交的存活研究 表明，接種S02具有出乎預(yù)料更高的存活率(圖11)。在靜脈感染的SCID小鼠中S02和BCG的存活比較研究顯示， S02菌抹的減毒水平高于目前用于人類抗肺結(jié)核的疫苗BCG (圖 2b)。在4妻種50倍疫苗劑量(在對批量BCG的質(zhì)量控制中^f吏用) 的豚鼠中的毒性研究表明，經(jīng)過6個月的研究，豚鼠體重增加并且 沒有表現(xiàn)宏 見上或者孩O見上可見的與肺結(jié)核相適合的組織損傷，從而證實了 S02的減毒和無毒性(圖12)。這種出乎預(yù)料的減毒和無毒性是由于PhoP-DIM-表型，而且這些突變體保持對抗肺結(jié)核藥物 的敏感性，使得可以進行常規(guī)治療。由此表明，在Balb/c小鼠中開展的疫苗實驗，直到感染后4周， 在肺和脾中由本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌S02菌抹和BCG產(chǎn)生的保護 水平是相似的。如果我們比較接種小鼠的脾中的CD4+和CD8+的 相對比例，可以發(fā)現(xiàn)與4妻種BCG的小鼠相比，在4妄種本發(fā)明的S02 菌林的小鼠中CD4+和CD8+都具有較高的百分比。另夕卜，當(dāng)這些 細月包由來源于培養(yǎng)濾液的抗原進4于刺激，則在"t妻種后45天和60天， 在接種本發(fā)明的S()2菌林的小鼠中可測量到CD4+/IFN-Y+顯著較 高的百分比。盡管在每個時間點上均不顯著，在接種本發(fā)明的S02 菌^K的小鼠中卻測量到CD4+/IFN- Y十的相似的趨勢。該數(shù)據(jù)表明， 與接種BCG相比，接種本發(fā)明的S02菌林產(chǎn)生更好的T細胞活化 這是通過對CD4+/ifn- y十的合成進^f亍測量而得到的。已知對結(jié)核 分枝桿菌的保護性免疫通常依賴于TH,-型細胞免疫反應(yīng)的產(chǎn)生(特 征為，從抗原的特異性T細胞中分泌IFN-y )，可以推斷通過本發(fā) 明的S02菌株引起的相對較高水平的T細胞活化有助于其產(chǎn)生強保 護反應(yīng)的能力。另夕卜，通過使用不同的系統(tǒng)和測試才莫型和各種條件，我們已經(jīng) 設(shè)法表明小鼠模型對于研究BCG與S02相比之下的保護差異的相 對能力。表明這兩種疫苗，S02 (phoP畫DIM畫)和BCG,在小鼠才莫 型中提供保護。采取一種方案，用豚鼠以更加顯著和逐漸更加嚴(yán)格的實驗來比 較疫苗。這種比較疫苗的系統(tǒng)方法可以為鑒別最佳候選疫苗(為此， 應(yīng)進行進一步的試馬全)3是供一個有益的出發(fā)點。通常認為豚鼠更易 被肺結(jié)核感染，因此可以成為這種疾病較為顯著的模型[30]。與小 鼠相比，力豕鼠的優(yōu)勢是，該疾病的病理與在人類肺結(jié)核中7見察到的 相似，因此它是用于測試疫苗效力的合適的才莫型。在近期關(guān)于結(jié)合分枝桿菌的泛酸和亮氨酸雙營養(yǎng)缺陷型突變體的噴霧疫苗研究中， 在噴霧施用結(jié)核分枝桿菌5周后，在接種豚鼠的肺和脾中獲得與牛分枝桿菌BCG相當(dāng)?shù)谋Ｗo水平，其中兩種疫苗導(dǎo)致感染對脾的有 限擴散[34]。在另一項使用表達ESAT-6的重組BCG的研究中，只 在脾中觀察到高于牛分枝桿菌BCG的保護水平[6]，這表明提高的 保護局限于防止感染從肺部擴散的能力。為了進行本感染，對豚鼠接種低劑量的結(jié)核分枝桿菌H37Rv, 直到感染后4周，在月申和月年中由4妾種本發(fā)明的S02菌抹和BCG產(chǎn) 生的保護水平都是相似的。兩種疫苗都l是供了非常有效的保護，與 接受生理鹽水的對照組相比，使肺和脾中的CFU減少了大約2 log。 ^旦是在兩個疫苗組之間沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異。我們可以斷 定，在感染后如此短的時期內(nèi)要證明新疫苗相對于BCG的更強的 效力是困難的。這是由于，事實上當(dāng)前4妄種BCG的動物器官中的 CFU(菌落形成單位)非常低以至于實驗不具備區(qū)分能力來顯示CFU 顯著的額外減少。在力參鼠的其他存活研究中發(fā)現(xiàn)，雖然接種BCG 相比于未接種的對照(或者接種無效疫苗)產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)上的顯著 性保護，然而即使對于低劑量結(jié)核分枝桿菌的感染，這種保護也只 是部分的。在感染后60到80周以低劑量進行施用的研究中，有些 接種BCG的對照沒有保護任何豚鼠[35]，而有些則保護了低百分比 的(20%至30%)的動物[36][37]。另一方面，以高劑量施用，可能 導(dǎo)致比通常用于評<介TB疫苗的^f呆護效力更嚴(yán)重的疾病。對于本發(fā)明，我們4吏用相對高劑量的結(jié)核分枝桿菌H37Rv進 行噴霧感染，研究周期延長到180天。我們這樣啦支是為了產(chǎn)生更嚴(yán) 格水平的感染，能夠顯示出本發(fā)明的S02菌株潛在的保護效力，同 時促進相對于BCG的辨別水平。在存活方面，與未4妄種的對照相 比，接種BCG的動物組顯著地被保護，并且盡管在我們的研究中 使用相對高劑量的感染，它們表現(xiàn)出的整體保護水平與在其它研究 中觀察到的相似。另外，通過幾種指標(biāo)的測量，包括延長的存活和肺部損傷的實變程度，我們還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的S02 (phoP- DIM-)菌才朱 與BCG相比其保護效力在統(tǒng)計學(xué)上顯著性4是高。這種疾病的減纟復(fù) 形式可能是直接造成接種本發(fā)明的S02菌抹的動物具有較高存活 率的原因。本發(fā)明所披露的結(jié)果顯示，根據(jù)多種標(biāo)準(zhǔn)，S02菌林和由此屬 于分枝桿菌屬(特別是來源于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群)的具有phoP-DIM-表型的微生物是比BCG更有效的疫苗。在SCID小鼠中，其 比BCG更加減毒，其為小鼠纟是供至少與BCG同樣良好的保護性免 疫，并且產(chǎn)生更強的細胞免疫反應(yīng)。此夕卜，在感染高劑量H37Rv 的豚鼠中進行的保護實驗中，具有DIM- phoP-表型的菌林產(chǎn)生 100%的豚鼠存活率，而在相同情況下BCG只達到33%的存活率。 這種《呆護與疾病的嚴(yán)重程度和細菌負荷的減少相關(guān)。為了檢查S()2 (phoP- DIM-)的保護水平是否由于p/2o尸突變或 者是否可能由于DIM的額外突變，在豚鼠中通過高劑量感染進行 了另 一項4妄種實'瞼。6只動物的組4妻種BCG、 S02 CP/zoP- DIM-)和 結(jié)核分枝桿菌/ /2o尸-DIM+, 6只用作對照的動物未進行接種。實 驗持續(xù)400天。在這項另外的實-驗中，未接種的豚鼠在70天前死亡。在感染 300天之后，沖妻種BCG和p/7oP- DIM+的3只月豕鼠死亡，相比之下 才妄種S02的組中只有一只死亡，這表明由DIM+突變體產(chǎn)生 的4呆護與現(xiàn)有疫苗BCG相似，而在月承鼠才莫型中接種S02, p/zoP-和 DIM-雙突變體的保護作用更好(圖13)。在400天之后，在4妄種 S02(圖14a)的組中有3只月豕鼠存活，而只有1只接種BCG (圖14a 和圖14 b )和phoP- DIM+(圖14 b )的豚鼠存活，這表明phoP畫DIM+ 突變體的保護類似于BCG，而在400個實馬全日之后接種S02， / /zoP-和DIM-雙突變體的保護作用更好，出乎預(yù)料比BCG更強的保護效 力不〗又歸結(jié)于； /zo尸-突變，還歸結(jié)于S02雙突變/ /zo尸-DIM-。因此，本發(fā)明的第 一 個方面涉及 一 種屬于分枝桿菌屬的分離微生物，其特征在于包含以下基因的失活或缺失a p/w尸基因或者一個或多個調(diào)控p/2o尸基因或由/7/70尸調(diào)控的基因，以及b.防止DIM產(chǎn)生的第二基因。在本發(fā)明的 一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的分離樣i生物的特 4i在于，通過Rv0757基因的失活或在夬失來失活； /7o尸基因。在本發(fā)明的另 一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的分離樣史生物的 iHM正在于，通過Rv2930 (7^^D20基因的缺失或失活來失活DIM的 產(chǎn)生。在本發(fā)明的又 一 種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的分離樣t生物的 特征在于，其包含Rv2930和Rv0757基因的缺失或失活。在本發(fā)明的另一種實施方式中，本發(fā)明的分離微生物的特征在 于，分枝桿菌屬的物種屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群。本發(fā)明的第二個方面涉及用于制備本發(fā)明的分離孩么生物的方 法，其包含a. 失活或缺失/ /w尸基因或一個或多個調(diào)控/ /zoP基因的基因， ^尤選失活或擊夬失Rv0757基因，以及b. 失活或缺失防止DIM產(chǎn)生的第二基因，優(yōu)選缺失或失活 Rv2930 (7a必2"基因。本發(fā)明的第三個方面涉及使個體免疫由肺結(jié)核引起的癥狀的 疫苗(下文中，稱為本發(fā)明的疫苗)，其中所述疫苗包含至少一種 本發(fā)明的分離微生物。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，疫苗還包含藥物可^妾受的賦 形劑。本發(fā)明的第四個方面涉及用于制備藥物、優(yōu)選疫苗的方法，其 包含將本發(fā)明的分離微生物以治療有效的劑量結(jié)合至用于給藥于 人或動物的合適的介質(zhì)中，并且選擇性地添加藥理學(xué)上適合疫苗生 產(chǎn)的賦形劑。所述藥物適合用于治療膀胱癌、治療或預(yù)防肺結(jié)核，或作為載 體或佐劑?？蓛?yōu)選地用來使個體免疫肺結(jié)核引起的癥狀。本發(fā)明的第五個方面涉及使用本發(fā)明的分離微生物從而制備 用于予貞防和/或治療人類或動物力市結(jié)核的疫苗的應(yīng)用。貫穿本說明書和權(quán)利要求，詞語"包含"及其變化形式(variant) 并不表示排除其它的4支術(shù)特征、添加劑、成〗分或步驟。對于本領(lǐng)域 中的沖支術(shù)人員，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢和特點將部分源自本i兌明 書，部分源自實施本發(fā)明之時。提供以下實施例和附圖，作為本發(fā) 明的非限制性的示例性實施例。實施例實施例1. #才3十和方法/蛋白l提取^^龍瘦伊遊。分別在O、 4、 8、 12和16周獲4尋 抗PhoP蛋白的多克隆抗體，其接受了 4劑量的PhoP(0.5mg)。使用 ELISA實'瞼(ZEU-Immunotec Zaragoza，西班牙)才全測到抗-PhoP抗體?？笶SAT-6的單克隆抗體由S.Cole友好4是供[24]。分枝桿菌 的無細胞蛋白質(zhì)^是耳又物是由在Middlebrook 7H9-ADC肉湯中生長的 對數(shù)生長期的早期培養(yǎng)物遵循常規(guī)方法制備而成[25]。結(jié)核分枝桿 菌蛋白質(zhì)才是耳又物通過0.22 |um孑L徑的Millex-GP過濾器(Millipore， Bedford, MA)進行過濾。收集培養(yǎng)了 5-6周的結(jié)核分枝桿菌H37Rv 培養(yǎng)濾液，用45% (w/v)的辟b酸銨沉淀培養(yǎng)濾液蛋白質(zhì)。根據(jù)常規(guī) 方法進行免疫蛋白印跡分析。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗 體(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)作為第二抗體。厶2 SC/D V、葳4染/,^"為N^Vf,。關(guān)于SCID小鼠的這項工作 是依照關(guān)于實驗室動物保護的歐洲法律，在"Germans Trias i Pujol" 大學(xué)醫(yī)院的動物管理委員會的監(jiān)it下開展的。SCID CB-17/Icr Ico 無特定病原(spf)的小鼠從查理斯河(Bagneux Cedex，法國)獲得。 為了進4亍噴霧感染，將小鼠置于空氣感染裝置(Glas-col Inc., Terre Haute, IN, USA)的接觸室中。在噴霧器隔間中充滿7ml結(jié)核分枝桿 菌懸浮液從而在肺中提供大約20活細菌的吸取量。每個實驗組使 用10只小鼠。對于靜脈感染，7只小鼠的組通過鼠尾側(cè)脈感染200 pl含有相當(dāng)于2xl05、 2xl04和2xl()3的活BCG和5.4 x 106、 5.4 x 105和5.4x04的活結(jié)核分枝桿菌/ /zo尸菌林的劑量的PBS。被處 理小鼠之間存活時間的差異的顯著性通過使用Mantel-Haenszel檢 驗來確定?；罹嫈?shù)這樣進行連續(xù)稀釋組織勻漿，涂抹于 Middlebrook 7H11 + OADC瓊脂上，并在生長3周后進4亍分析。對 于組織學(xué)分析，將組織固定在曱醛-鹽緩沖液中并包埋于石蠟中。切 下5卞m厚的切片并用Ziehl-Neelsen染泮牛染色。/.3 ^發(fā)T"凝神本發(fā)鄉(xiāng)的和SCG后，Ba/6/c V、葳哞細^^名 瘦激活的測定。4只Balb/c小鼠的組在皮下接種8xl03 CFU的BCG (Phipps)或2.5 x 103CFU的4^發(fā)明的S02菌林之后，在7、 14、 21、 28、 45和60天凈皮處死。耳又出脾，》欠置至ij 2ml的RPMI i咅養(yǎng)基 和含有0.5mg/ml II型月交原酶(Worthington, NJ, USA)的10%胎牛血清和2U/ml脫氧核并唐核酸酶(GIBCO)中，在37。C下，以5%的C02， 培育1小時。然后^吏它們通過70 jim細胞篩(Falcon, Becton Dickinson 70 |am Nylon 35-2350 ),用注射器柱塞壓石卒，并用培養(yǎng)基 洗滌。對細胞進行離心，去除上清夜，用裂解緩沖液去除紅細胞[26]。 在離心和用RPMI培養(yǎng)基洗滌之后，將細胞重新懸浮在FACS緩沖 液(PBS 1 x , pH 7.2, 1% BSA)中，并計凄t。通過用抗-CD4-FITC或 抗畫CD8-FITC的單克隆抗體i咅育106細胞來標(biāo)記細月包表面，在4。C 下以1:20的比例在含有1%BSA和0.1%疊氮化鈉的PBS中進4亍-希 釋并保持20分鐘，使用FACScan血細胞計數(shù)器進行分析。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌4朱在補充有OADC(Difco實驗室， Difco Laboratories)的Middlebrook 7h9 i咅養(yǎng)基(Difco實馬全室)中i咅 養(yǎng)。在培養(yǎng)l個月以后，分離細菌團(bacterial mass),收集培養(yǎng)濾 液。所述濾液的抗原用45% (w/v)的石克酸銨沉淀，對其進4于洗滌并 再次溶解在PBS中。為了刺激細胞，將lxl(^脾細胞重新懸浮在每 孔中100|ul RPMI培養(yǎng)基中，并用10 |Lig結(jié)核分一支桿菌培養(yǎng)濾液抗原 進4亍培育，在37。C下以5% c02懸浮在lOO]ul PBS中4呆持72小時。 對細胞和培養(yǎng)基進4亍離心，去除上清夜，在計凄t和4企測存活力之后， 如上所述，每管中2.5x105纟田月包在cd4+或cd8+細月包的表面上進行 標(biāo)記。在洗滌之后，在溶解在PBS中的0.1%皂香中重新懸浮細胞 并于4。C下培育20分鐘。通過用100 )ul標(biāo)記有藻紅蛋白(PE)的 單克隆抗-IFN-y的1/20稀釋液，在4。C下對細月包進4亍黑暗下培養(yǎng) 20分鐘來才全測細月包內(nèi)ifn- y 。用100 4希釋在PBS中的4%多聚 曱醛固定細胞。20分鐘后使用FACScan血細胞計數(shù)器分析樣品。 同型對照是Ab-FITC ( 1:20稀釋液)十Ab匿PE ( 1:20稀釋液)。a4-本犮鄉(xiāng)的S(92在^a/6/c V、葳^的沐護效力。遵循關(guān)于實-驗 動物保護的歐洲指令，在巴黎的巴斯德研究所(Pasteur Institute) 的動物研究室(Animal Facility)的P3高安全實-驗室(P3 High Security Laboratory )中，以受4空制的條4牛飼養(yǎng)所有的動物。Balb/c小鼠組(每組7只)在尾基部進行107CFU的本發(fā)明的S02菌抹或 BCG (Pasteur)的皮下4妄種。在4妄種后8周，對所有小鼠均靜3永注 射2.5 x 105 CFU的結(jié)核分枝桿菌H37Rv。在注射后4周，小鼠祐二 處死?；罹嫈?shù)這才羊進4亍連續(xù)稀釋組織勻漿，在Middlebrook7H11 +瓊脂OADC肉湯中培養(yǎng)，三周后基于S02菌4木的卡那霉素抗性表 型對本發(fā)明的S()2菌4朱的結(jié)核分4支桿菌H3 7Rv的生長進4于4企測。/.5-本^伊/的S(92 ^萬豕武哞的/^護效力。使用豚鼠的實驗工作 是根據(jù)關(guān)于實驗動物的英國法律而開展的，并且經(jīng)過了英國Porton Down的衛(wèi)生^呆護木L構(gòu)(Health Protection Agency )的當(dāng)；也4侖J里委員 會(ethics committee)的i人可。站偉寸生Dunkin-Hartley月豕鼠是乂人纟至斗亥 準(zhǔn)的供應(yīng)商處(UK Home Office) (David Hall, Burton-on畫Trent， UK 或Harlan Ltd UK, Bicester, UK)獲4尋，對4也們進4亍完全隔離飼養(yǎng)。圖 6中給出的結(jié)果顯示S02菌4朱產(chǎn)生了優(yōu)于BCG的保護。圖13和14 中給出的結(jié)果顯示S02突變體出乎預(yù)料的保護是由于其雙表型 DIM-/尸/zoP-。入6-/庶^/,滋/帀。6支豚鼠的組在頸后部皮下接種250|iil: 5xl04 CFU的BCG Pasteur; 5xl04 CFU的本發(fā)明的S02;或生理鹽水。在 如上所述使用包括Henderson儀器(contained Henderson apparatus ) 進行噴霧感染之前，使動物^木止12周[27]。使用Collison噴霧器， 由結(jié)核分沖支4干菌H37Rv的細樣i顆并立產(chǎn)生平均直徑2|um(直徑范圍 0.5-7 pm)的噴霧，并且直4妄施用到動物的口鼻部。該噴霧由含有 2xl06 CFU/ml的水中的懸浮'液產(chǎn)生乂人而產(chǎn)生經(jīng)計算大約為10-50 CFU/肺的保留吸入劑量。在施用后4周，評i"介^呆護。通過腹力莫應(yīng)用過量的戊巴比妥鈉來 處死動物。從脾和肺(左前葉和中前葉，右中葉和右后葉)中無菌 地耳又出組織，放置于無菌容器中。材料在-20。C下保藏，然后準(zhǔn)備 進4亍纟田菌i十凄t。
4吏用^走壽爭口十片；曼；責(zé)系纟充(rotating blade maceratorsystem) ( Ystral) 4吏組織在10ml (肺)或5ml (脾)的無菌去離子 水中均質(zhì)化?；罴毎媈t這樣進行連續(xù)稀釋組織勻漿，在 Middlebrook 7H11 +瓊脂OADC中培養(yǎng)，并在3周后4企測結(jié)核分 枝桿菌的生長。將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為logw從而對其進行分析，并通過學(xué)生 氏t測驗將每個疫苗組的活結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量與接種生理鹽水的^于照ia進4亍比4交。7. 7"豕i〖^/惑染,寄刺量的錄類—為V乂Vf,y^的/^^^試。在噴霧 施用結(jié)核分枝桿菌的前10周，對6只豚鼠的組皮下4妻種5 x 104 CFU 的本發(fā)明的S()2或BCG (Danish 1331)。才艮據(jù)前面段落中所才皮露的 進行噴霧施用設(shè)作，使用5 x 107CFU/ml的懸浮液從而為肺部提供 大約500CFU。施用之后，在第3等級的防護下(ACDP)飼養(yǎng)動物， 定期控制其重量改變，并在施用后180天或者在人道終點(失去最 大體重的20%)人道地處死它們。如上所述地進行死后樣品的收集 和處理，除了使用在福爾馬林中固定，用蘇木精和伊紅(H-E)染 色的肺部組織切片的圖像分析來測量肺部實變。使用Kaplan Meier 存活評^介來比4交動物的存活，4吏用Log Rank分布分析來確定統(tǒng)計 顯著性差異。通過ANOVA分析CFU和損傷實變數(shù)據(jù)，使用Fisher 氏成對比4交來比 一交組的平均值。實滋辦2潛核為V餅,—尸的特性通過觀察細菌大小和具有失活的p/2o尸基因的生長細胞的索狀 凈爭4生(cording property),為p/20尸基因參與分沖支4干菌的遺^(專回^各 (genetic circuit)的全局調(diào)控提供了證據(jù)。已知分泌抗原作為抵抗 月市結(jié)核的^f呆護作用的決定性因素的關(guān)4建特性，我們希望確定； /20尸 基因突變的多向性效果是否延伸為影響主要的免疫顯性抗原 ESAT-6的合成。對S02菌4朱、BCG和MT103使用誘導(dǎo)的抗PhoP 蛋白和ESAT-6的抗體進4亍免疫蛋白印跡分析。結(jié)果清楚地顯示 PhoP蛋白在結(jié)核分枝桿菌MT103和BCG菌才朱中進4亍組成性表達，而在本發(fā)明的S02菌抹中則才艮本不存在。相反，在S02菌抹 的培養(yǎng)物的上清4支中ESAT-6的表達水平與/人MT103的親本菌4朱中 才全測到的相似，并且正如所泮牛，在BCG中沒有4企測到ESAT-6蛋白。/惑染f本發(fā)效的,禱和5CG的小葳的存活在噴霧感染(大約20CFU ) MT103菌4朱、S02和補償/ /zoP基 因的S02(S02 + pS05)之后評價免疫低下SCID小鼠的存活[23]。所 有感染S02的小鼠存活超過245天。相反，所有感染MT103或補 償?shù)慕Y(jié)核分枝桿菌S02-pS05的SCID小鼠在感染后62天已經(jīng)死 亡，這表明補償菌林的毒力的回復(fù)(圖2a)。在靜脈給藥之后，還對SCID小鼠中S02菌抹的減毒與BCG 進4亍比專交。SCID小鼠組通過尾部側(cè)月永4妄種多種劑量(2 x io5、 2x 104 ,口 2 x io3 CFU )的BCG Pasteur或S02菌才朱(5.4 x io6、 5.4x 105和5.4 x 104 CFU )。在感染后3周而^皮處死的小鼠亞組的感染 肺泡巨噬細胞的組織學(xué)染色顯示，與BCG相比，感染結(jié)核分4支桿 菌S02菌4朱的小鼠的肺中的耐醇-酸細菌的凄t量4交少。所有4妄種專交 高劑量BCG ( 2 x 105 CFU )的BCG的小鼠在感染后92天已經(jīng)死亡(平均存活時間89 ±3.5天)(圖2b)。相反，所有感染最高劑量 的SO (5.4x 106CFU)的小鼠在120天后存活(圖2b )。在死亡時， 感染2x 105CFU的BCG的小鼠的肺中的細菌負^f，如果與感染5.4 xl06CFU的S02的小鼠相比，至少高10(H咅。^滋斧i/ 4 Sa/6/c V、葳的定量和CDS+及^"。為了比較通過接種本發(fā)明的S02和BCG所引起的細胞免疫激 活作用，在^妻種后7、 14、 30、 45和60天，乂人皮下4妻種有本發(fā)明 的S02菌4朱和BCG Phipps的至少4只5a/6/c小鼠組的脾中收集細 月包懸浮液，并通過細月包熒光測定術(shù)來確定CD4+和CD8+細月包的相對比例(圖3 )。在接種后14天，S02^妄種與BCG接種相比，產(chǎn)生 顯著較多數(shù)量的CD4+細胞，并在45天后產(chǎn)生顯著較多數(shù)量的 CD8+細胞。這些脾細胞用來源于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液的總抗原 刺激。3天之后，通過流式細胞儀分析淋巴細胞的數(shù)量，結(jié)合特異 性抗體來4企測01)4+/008+細胞和IFN- Y的胞內(nèi)合成。在4妾種45天 之后，與BCG相比，S02接種引起顯著較高比例的CD4+/IFN- y + 產(chǎn)生細月包(圖3 )。在特定的時間點之后，在S02組中的產(chǎn)生CD8+/ IFN-y+的細胞的比例始終較高(在14天顯著不同)。,滋辦5 /h/6/c V、成^適過本發(fā)效的5(92 ,J^的沐護^^瘦。已經(jīng)證明本發(fā)明的S02菌抹在SCID小鼠中被減毒，我們想要 確定觀察到的毒力的減弱是否在突變菌抹上會產(chǎn)生某種保護特性。 我們對Balb/c小鼠皮下4妻種本發(fā)明的S02菌才朱或BCG (Pasteur)。 在接種后8周，對所有小鼠靜脈注射2.5 x 105 CFU的結(jié)核分枝桿 菌H37Rv。在注射后4周小鼠一皮處死。通過測量/人兩組小鼠的肺和 脾回收的活結(jié)核分枝桿菌H37Rv的lt量來確定〗呆護水平(圖4)。 如果與以生理鹽水處理的對照相比，兩種疫苗都產(chǎn)生了相似卻又顯 著的保護水平(p<0.05)。在肺中和脾中都記錄到了結(jié)核分枝桿菌 H37Rv生長的抑制，分別減少了大約1.5 1ogK)和1.3 1ogl。CFU?！妒└玧/ 6本發(fā)鄉(xiāng)的5(92在萬豕歲^的沐護#名瘦在小鼠接種實驗中獲得的結(jié)果顯示本發(fā)明的S02菌抹的減毒 4吏它具有與BCG Pasteur相似的疫苗特性。j旦是，普遍認為豚鼠是 人類肺結(jié)核更合適的模型，由于在疾病的發(fā)展和病理學(xué)方面具有許 多相似性。因此這種動物才莫型是用于評1介疫苗的效力的更合適的系 統(tǒng)。為了研究本發(fā)明的S02菌抹的保護效力，我們開展了這樣的實 驗，其包括以低劑量(10-50 CFU)和高劑量(500 CFU)對接種的動物 進行噴霧施用。對6只豚鼠的組進行皮下接種本發(fā)明的S02或者BCG。接種后10周，對所有的豚鼠給藥結(jié)核分枝桿菌H37Rv的吸 入劑。接受低劑量的動物在4周后處死，計數(shù)肺和脾中的細菌負荷。 通過比4交乂人每個處理組的"豕鼠的器官中回收的活結(jié)核分枝桿菌 H37Rv的數(shù)量來確定保護效力。在這個實驗中，在未接種的對照動 物和那些^妻種BCG或結(jié)核分枝桿菌S02的動物之間，肺和脾中 CFU的減少是顯著不同的(口=0.005)。 ^f旦是4妻種的組之間沒有發(fā)現(xiàn)顯 著性差異(圖5 )。接受高劑量的豚鼠在施用180后天或者當(dāng)發(fā)現(xiàn)失去了 20%的體種/未感染的動物中觀察到的進行比較。在吸入后的實驗階段中，所 有的未4妻種J豕鼠和4只4妾種BCG的月豕鼠由于嚴(yán)重和不斷積累的疾 病，在時間終點(time end point) ( 180天)之前、在人道終點凈皮處 死(圖6a)。相比之下，所有接種本發(fā)明的S02菌抹的豚鼠在本研 究持續(xù)期間一直存活下來。接種本發(fā)明的S02菌抹的豚鼠的存活顯 著長于那些接種BCG的豚鼠(p = 0.018),而接種BCG的豚鼠的 存活又顯著長于用生理鹽水處理的對照豚鼠(p = 0.0049)。另夕卜， 接種S02菌林的豚鼠體重增加并且沒有表現(xiàn)出任何疾病的可見或 臨床體征。通過總的肺實變測量的肺部疾病的程度在不同的處理組之間 也有所不同。正如所預(yù)碎+的，在未4妄種的豚鼠中，乂見察到疾病的最 高發(fā)展7jc平，在該組動物中，測量到76%的實變的平均百分比(圖 6b、 6c)。在接種BCG的豚鼠中肉芽肺的聚結(jié)也4艮明顯，其中在肺 中測量到70%的平均實變。相反，在接種本發(fā)明的S02菌4朱的力參鼠 中觀察到4交少的實變(大約50%)，這種實變顯著地少于(pO.05)未 4妄種的動物和那些4妻種BCG的動物(圖6c)。通過在月申和脾的組織勻漿中的細菌計數(shù)還反映了病情嚴(yán)重程度的降低。在接種的組中，在兩種器官中都 見察到了對于結(jié)核分一支桿菌H37Rv生長的抑制水 平的差異。與接種BCG的豚鼠相比，從接種S02的豚鼠中回收的 CFU的凄t量減少了 lxlogK)以上，并且在脾中這種減少在統(tǒng)計學(xué)上 是顯著的(p<0.05)(圖6d)。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的S02菌株在 賦予感染的豚鼠較高的存活率，降低肺中疾病的嚴(yán)重程度以及防止 感染擴散到力卑的方面，是優(yōu)于BCG的。實滋斧^7本發(fā)鄉(xiāng)的S02的減#^€由亍尸/zo尸-Z)/M-雙^f 。在Balb/C小鼠中通過靜脈注射S02 (phoP-DIM-)菌林和野生型 MT103菌林以及補償phoP (S02 + pS05)的菌林進行比較的感染研 究表明，通過靜脈注射在Balb/C小鼠中感染S02的減毒不會通過 才卜^f嘗phoP而回復(fù)。3和6周后測量到的脾(7a脾)和肺(7b肺) 中的菌落(CFU)的減少不會在補償菌林中被回復(fù)，因為它在免疫 活性小鼠中是無毒的，這些實驗表明出乎預(yù)料的減毒可能是由于第 二附加突變(圖7)。通過薄層色i普法對結(jié)核分枝桿菌不同菌林的脂質(zhì)研究表明， S02菌4朱不產(chǎn)生DIM,并且這與phoP突變無關(guān)(圖8 )。為了表明S()2是無毒的，對6只豚鼠接種50倍的疫苗劑量。 經(jīng)過持續(xù)6個月的實-驗之后，存活率是100%。經(jīng)過6個月，在所 有的動物中觀察到了體重增加，表明S02菌抹的無毒性(￥=重量 (以克計)和感染周。X二時間(以周計))(圖12)。還研究了對于抗肺結(jié)核藥物的敏感性。確定抗肺結(jié)核藥物乙胺 丁醇、異煙肼、利福平和纟連霉素抗結(jié)核分一支桿菌菌一朱H37Rv、作為 對照的MT103 (野生型)和S02菌一木的最小抑制濃度(MIC )。數(shù)值(微克/ml)顯示/ /7o尸基因失活后，S02候選疫苗菌林保留了其 對臨床使用最普遍的抗肺結(jié)核藥物的敏感性。乙胺丁醇 異煙肼 利福平 鏈霉素H37Rv2 0.5 < 0.004 <0.5MT1032 0.5 < 0.004 <0.5S02 2 0.25 < 0.004 <0.5在氣管接種的BalbC小鼠中的減毒研究顯示，用結(jié)核分枝桿菌 DIM- (1A29)菌抹有50%的小鼠存活到了 20周之后。所有接種S02 (phoP-和DIM-突變體)的動物都出乎預(yù)料地存活了 20個實-驗周 (圖11 )。對4姿種并通過噴霧感染結(jié)核分斗支4干菌H37Rv的豚鼠中的〗呆護 進行研究。豚鼠存活到了 300天之后。在皮下接種之后，動物以高 劑量感染結(jié)核分枝桿菌(H"Rv)的毒性菌林以研究存活。在60天 之后，沒有,皮4妄種的6只月豕鼠已死亡，而4妄種S02, p/2oP-和BCG 的組存活。在感染300天之后，3只4妄種BCG和/ / oP-的月豕鼠已 死亡，相比之下^妻種S02的組中^f又有一只死亡，這表明/ /w尸突變 體的保護類似于現(xiàn)有疫苗BCG，而接種S02， phoP-和DIM-雙 突變體在豚鼠模型中保護作用更好(圖13 )。這些在豚鼠中的保護研究持續(xù)了 400天，但在60天之后有6 只未4妻種的力豕鼠已經(jīng)死亡。在感染400天之后，3只來源于4妄種S02 的組的豚鼠(圖14a)存活，而只有1只接種BCG (圖14a和14b) 和phoP-(圖14b)的豚鼠存活，這再次表明p/zo尸突變體的保護類似于BCG,而4妻種S02， phoP-和DIM-雙突變體在400個實-驗 日后保護作用更好。實滋辦9差于遞過/a6/D26差^缺關(guān)的^史采溝建候逸席「潛^"瘦麥用于構(gòu)建缺失fadD26 ( zV^/D26 )基因的突變體的結(jié)核分枝桿 菌菌一朱是S()2 (其含有通過插入卡那霉素抗性基因(cassette)而失 活的p/zo尸基因)和MT103臨床菌才朱。1. 質(zhì)并:i的構(gòu)建1.1克隆參與DIM合成的/at氾26基因。使用來自結(jié)核分枝桿 菌H37Rv的基因組DNA并4吏用引物fadD26Fw (SEQ ID NO:l)和 fadD26Rv (SEQ ID NO:2)，通過PCR擴增基因。將PCR產(chǎn) 物4翁入pGEM-T Easy載體(Promega)中乂人而構(gòu)建質(zhì)4立pAZl。1.2 /aJD26基因的缺失和潮霉素抗性基因的插入。在pAZl中 /a^D26的Z awHI-EcoRV位點之間插入pWM27 (Malaga等2003) 的5awHI-五coRV片斷，該SamHI-五coRV片斷含有res-Q/^g-res基因(由解離酶識別的res位點使得在第二傳代中消除抗性標(biāo)記成為 可能)。1.3用于通過同源重組失活基因的自殺載體(suicide vector )的 構(gòu)建。用X/wI消化質(zhì)粒pAZ3，釋放/"(iD26::n/^g插入片斷，將其 整合到pJQ200X載體中，以相同的酶使其線性化。最終的質(zhì)粒命 名為pAZ5。2. 結(jié)核分枝桿菌DIM-菌4朱的構(gòu)建。2.1將質(zhì)粒pAZ5插入結(jié)核分枝桿菌S02和MT103菌4朱中。2.2單一重組子的篩選。在潮霉素(20 iug/ml)中培養(yǎng)包含質(zhì)粒的 細菌，測它對慶大霉素(10 |ag/ml)的抗性。2.3雙重組子的篩選。在2%蔗糖(Pelicic等1997 )和潮霉素中 培養(yǎng)單一重組子，并檢測它們對慶大霉素的敏感性。3>人4/^//)26突變中去除抗生素抗性標(biāo)記。3.1為了去除res-Q/^g-res基因并產(chǎn)生不具有抗生素抗性標(biāo)i己的 突變，插入含有^解離酶的質(zhì)粒pWM19并通過慶大霉素抗性進行 篩選。然后通過在39。C下在2%蔗糖中培育/人而去除質(zhì)粒(Malaga 等2003 )。實施例2.2-用于構(gòu)建缺失Ap/zaP A/^/D26的雙突變體的結(jié)核 分4支桿菌菌才朱是MT103 A/^/D26。4.質(zhì)4:i的構(gòu)建4.1 / /zoP基因的克隆。使用結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組 DNA并^f吏用引物phoPF ( SEQ ID NO:3 )和phoPR( SEQ ID NO:4 )， 通過PCR擴增p/zo尸基因。將PCR產(chǎn)物插入pGEM-T Easy載體 (Promega)中從而構(gòu)建質(zhì)粒pAZll。4.2戶/w尸基因的缺失和卡那霉素抗性基因的插入。在pAZll中 p/zoP的5c/I-H'oRV位點之間插入含有res-QAw-res基因的pCG122 的5awHI-五c'oRV片斷(Malaga等2003)/人而構(gòu)建pAZ13。4.3用于通過同源重組失活基因的自殺質(zhì)并立的構(gòu)建。用1/wl質(zhì) 粒消化pAZ13，釋方文p/zo尸::QAm插入片斷，將其整合到pJQ200X 載體中，用相同的酶使其線性化。最終的質(zhì)粒命名為pAZ15。5. 結(jié)核分枝桿菌Ap/70尸A/a^D26雙突變體菌林的構(gòu)建。5.1將質(zhì)粒pAZ15插入結(jié)核分沖支桿菌MT103 A/^/Z)26菌4朱中。5.2單一重組子的篩選。在卡那霉素(20 lag/ml)中培養(yǎng)包含質(zhì)粒 的細菌并一全測其對慶大霉素(10 |ug/ml)的抗性。5.3雙重組子的篩選。在2%蔗沖唐(Pelicic等1997)和卡那霉素 中培養(yǎng)單 一 重組子并一企測其對慶大霉素的每丈感性。6. 乂人Ap/zo尸突變中去除4元生素^U生才示i己。6.1為了去除res-Q々m-res基因并產(chǎn)生沒有抗生素抗性標(biāo)記的突 變，插入含有Y5解離酶的質(zhì)粒pWM19,并通過潮霉素抗性(20iug/ml) 進4亍篩選。然后通過在39。C下在2%蔗凈唐中培育乂人而去除質(zhì)粒 (Malaga等2003)。參考文獻1. 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權(quán)利要求
1.一種屬于分枝桿菌屬的分離微生物，其特征在于，所述分離微生物包括以下基因的失活或缺失a)phoP基因或者一個或多個調(diào)控所述phoP基因或由phoP調(diào)控的基因，以及b)防止DIM產(chǎn)生的第二基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離微生物，其中所述/ /20尸基因通過Rv0757基因的失活或在夾失而#:失活。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的分離微生物，其中DIM 的產(chǎn)生通過Rv2930 (/a^D2?；虻膿魥A失或失活而凈皮失活。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離微生物，其中所述微生物的特征在 于，其包含所述Rv2930和Rv0757基因的擊夾失或失活。
5. 根據(jù)前一項權(quán)利要求中任一項所述的分離微生物，其中所述分 枝桿菌屬的物種屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群。
6. 用于構(gòu)建才艮據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的分離樣i生物的方 法，其包括a) 失活或缺失所述；7/zo尸基因或者一個或多個調(diào)控所述 p/2o尸基因或由/7/w尸調(diào)控的基因，以及b) 失活或在夾失防止DIM產(chǎn)生的第二基因。
7. 根據(jù)前一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述phoP基因通過所 述Rv0757基因的失活而^皮失活。
8. 才艮據(jù)權(quán)利要求6或7中任一項所述的方法，其中DIM的產(chǎn)生 通過Rv2930 (/a^D20基因的缺失或失活而被失活。
9.權(quán)利要求1-5中任一項所述的分離^f鼓生物。
10. 4艮據(jù)前一項權(quán)利要求所述的疫苗，其還包括藥理學(xué)可4妾受的贈〔形劑。
11. 用于制備根據(jù)權(quán)利要求9-10中任一項所述的用于免疫接種或 預(yù)防由肺結(jié)核引起的癥狀的疫苗的方法，其至少包括a) 將才艮據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的分離樣t生物以治 療有效劑量并入適于^于人類或動物纟會藥的介質(zhì)中，以及b) 可選地添加藥理學(xué)上適合于生產(chǎn)疫苗的賦形劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的用作藥物的分離微生物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的用作疫苗的分離微生物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13中任一項所述的用于治療膀胱癌的藥物。
15. 才艮據(jù)—又利要求12或13中任一項所述的用于治療或預(yù)防肺結(jié)核 的藥4勿。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12或13中任一項所述的作為載體或者佐劑的藥物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的分離微生物在制備根據(jù)權(quán) 利要求9或10中任一項所述的用于預(yù)防或免疫4妄種人類或動 物的月市結(jié)核的疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種屬于分枝桿菌屬的分離微生物，其特征在于其包括使賦予PhoP-表型的基因Rv0757失活，以及使防止DIM(DIM-表型)產(chǎn)生的第二基因失活。另外，本發(fā)明包括使用所述微生物來生產(chǎn)用于免疫接種或預(yù)防肺結(jié)核的疫苗。
文檔編號C12N1/20GK101405386SQ200780010366
公開日2009年4月8日 申請日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月24日
發(fā)明者卡洛斯·馬丁蒙塔涅斯, 埃斯特·佩雷斯埃朗, 布里吉特·吉凱爾, 熱蘇斯·貢薩洛阿森西奧, 艾因霍阿·阿韋斯阿里瓦斯 申請人:薩拉戈薩大學(xué)