專利名稱：：評估解凍細胞的存活能力的方法評估解凍細胞的存活能力的方法本發(fā)明涉及評估解凍細胞存活能力(viability)的方法。為了IVF過程中的成功率，刺激卵巢以產(chǎn)生多于一個的卵母細胞(oocyte)。結果，大多數(shù)IVF周期導致胚胎(embryo)的總數(shù)超過了用于在單個周期中轉移至個體患者的最適量(optimum)。對此問題合乎倫理和經(jīng)濟的方法是胚月臺冷藏(cryopreservation)。胚月臺冷藏允i午々者藏特大凄史量的(supernumeracy)優(yōu)質胚胎直至它們能在后面的周期中被轉移，從而減少了達到懷孕所需的刺激卵巢藥物處理周期的數(shù)目，并因此減少了患卵巢過度刺激綜合征(ovarianhyperstimulationsyndrome)的風險(Trounson，1986)，且提供了對多胎妊娠的防的水平的周期中替換(replacement)解凍的胚胎，因此增加了每個患者的懷孕率。大多數(shù)的輔助受孕單位常規(guī)地提供前核的或早期卵裂期(earlycleavagestage)的胚胎的冷藏。利用了速度受控冷凍技術在冷凍保護劑流體中緩慢冷卻胚胎，從體溫降至-196。C(此處所有的細胞過程停止)，在該溫度將它們儲藏于液氮容器中。所述的冷凍保護劑用于保護細胞免受損害。當將這些細胞解凍時，從液氮中取出它們，解凍，除去冷凍保護劑，和培養(yǎng)細胞。導致細胞損害以及危害解凍后功能和發(fā)育的幾個因素與冷卻和冷藏有關。細胞損害可由細胞內冰(intracellularice)的形成然后該細胞內冰的快速冷卻引起；細胞外冰的形成也導致在未結水部分電解質濃度的增加以及細胞脫水。利用膜溶質相互作用(membranesoluteinteraction)的體外才莫型4企測到脫水和復水(re-hydration)導致脂質膜上的機械應力并引起物理變形和相(phase)行為的改變。這些物理改變可在多種程度影響細胞可改變細胞膜和細胞器；已顯示圍繞胚胎的透明帶(zonapellucida)在冷藏過程中遭受(一定量的)硬化，以及紡錘體進而染色體分離會受到損害。近來，已顯示一些基因受到冷凍和解凍過程的誘導，這說明該細胞積極響應刺激(insult)。與冷凍保護劑組合的緩慢冷凍允許通過減少細胞內冰和減少溶質濃度增加的影響來保護細胞免于上述有害的機制(mechanism)。所述細胞外水驅動細胞經(jīng)由平衡過程脫水。更快速的方法，即玻璃化(vitrification)，使用高濃度(highlevel)的冷凍保護劑和非?？焖俚睦鋮s，以使細胞內水的形成最小化。它是非平衡方法。冷凍和水形成導致雙層(即兩層)脂質膜的脫水。借助冷凍(withfreezing)液體結晶至凝膠的相變導致磷脂的烴尾部的有序化成為更加緊密的和平行的陣列，這可引起對水和陽離子的滲透性增加、整合膜蛋白的分離、膜結合酶的活性降低、蛋白質的徑向擴散的降低。精子和卵母細胞很可能經(jīng)歷類似的作用，盡管它們的脂質構成非常不同。成熟卵母細胞具有位于減數(shù)分裂的紡錘體處的微管。將溫度降至25°C于10分鐘使微管破裂，而且完全分裂(dissolution)發(fā)生于0。C。在小鼠中重新升溫導致^f鼓管的重建，但是這不發(fā)生于人中，因為缺乏成核細管聚合(nucleatetubulepolymerization)所需的中心粒旁物質。因紡錘體解體，所得的卵母細胞往往可以具有非整倍性(aneuploidy)(即染色體數(shù)目異常)。冷凍還可通過降低透明帶的胰凝乳蛋白酶敏感性和皮質顆粒(corticalgranule)而影響受精。實際上殼可能太"堅硬"。Linford和Meyers使用單細胞凝膠電泳顯示精子可能受到損傷。線粒體也易受冷藏損傷。在冷藏和隨后的培養(yǎng)過程中，卵母細胞DNA的退化似乎涉及細胞凋亡(apoptosis)過程，并才全測到典型標記(classicmarkers)和胱天蛋白酶(caspase)。因此細胞經(jīng)歷程序性細胞死亡。感興趣的是，還激活了與應激反應有關的基因，包括與熱休克蛋白、氧化應激清除劑(scavenger)和涉及葡萄糖代謝的酶有關的基因。盡管胚胎冷藏通常被認為是安全的方法(Wood)，仍然存在關于該技術的長期安全性的爭議(Winston和Hardy，2002)。這主要是小鼠中進行的研究的結果，其中已顯示胚胎冷凍可影響植入前后期發(fā)育(latepreimplantationdevelopment)中的新陳代謝(Emiliani等，2000)和具有只在發(fā)育后期顯示的更精細的(subtle)長期效果(Dulioust等，1995)。也有才艮道人胚胎的冷凍改變了基因表達模式(Tachataki等，2003)。這些研究者發(fā)現(xiàn)第2天冷凍胚胎比第2天新鮮胚胎含有更少的結節(jié)性硬化基因(tuberoussclerosisgene)TSC2的mRNA。對于冷藏技術用途的主要關注是凍傷造成的可能的胚胎損失，這意味著一些健康胚胎可以不存活于冷凍和解凍的應激。凍傷造成的胚胎損失的精確數(shù)目可變化，但非?？赡艿氖抢鋬鰰鹨恍┡咛サ膿p失，可能與冷藏的那些胚胎的25-50%—樣多。對此的一種解釋是冷藏甚至可以作為更有活力的胚胎的"選擇門(selectiongate)",盡管這尚未得到證實。對于冷藏的另一關注是由冷凍/解凍胚胎產(chǎn)生的兒童中先天缺損的潛在風險。在家畜工業(yè)中，大規(guī)模的胚胎冷凍和移植未導致先天缺損的增加。到目前為止，對那些出身于解凍胚胎的人后代(humanoffspring)的研究，未顯示相比于此群體的其余者懷孕結果出現(xiàn)異常性方面任何顯著的增加?？偟恼f來，冷藏導致植入可能性3040。/。的下降(Edgar等，2000和2005;El-Toukhy等，2003)。其它研究已顯示類似的冷凍解凍胚胎的臨床懷孕和植入率的范圍為10至30%和5至15%(VanderElst等，1997;Kowalik等，1998;Ubaldi等，2004)。在冷凍周期中的胚胎轉移成功率的降低歸因于這樣的事實冷藏胚胎必須另外忍受冷凍和解凍過程，該過程通常在本領域中被認為會改變內環(huán)境穩(wěn)定(homeostasis),新陳代謝、細胞完整性和發(fā)育潛能(developmentalpotential)。已知新陳代謝是早期胚胎健康所固有的，且當胚胎受到應激時新陳代謝立即擾亂(Houghton和Leese，2004;Lane和Gardner,2005綜述)。限制冷藏的成功的最重要因素之一是歸因于冷凍過程中冰晶形成的解凍后胚胎存活率(Liebermann等，2002)，所述水晶形成被認為損傷細胞膜和導致裂球(blastomere)裂解(Pal等，2004)。考慮到以上所述毫無疑義的是，盡管第一例冷藏之后成功的懷孕報導于1983，但冷藏的方法依然是相對新的且對胚胎和后續(xù)的后代的長期影響是未知的。冷藏的主要缺點是利用冷凍/解凍胚胎引起懷孕的成功率通常低于在"新鮮周期"中的成功率，植入可能性大體上下降30至40%。這些差異說明胚胎的冷凍和解凍會對胚胎的存活能力具有有害的影響。當處于冷凍狀態(tài)時冷藏胚胎可保持其存活能力的時間長度也是未知的。IVF的成功取決于用于轉移入子宮的最好胚胎的選擇。在轉移前，解凍胚胎，并檢查每個胚胎從而確定它是否醫(yī)學上適于轉移(能生存的，正常發(fā)育的胚胎)。沒有用于胚胎質量的準確試驗，且"優(yōu)質的胚胎"的區(qū)別是主觀的評估。目前使用形態(tài)學標準選擇胚胎。形態(tài)學評估包括計數(shù)胚胎中的細胞數(shù)和建立其"等級"；通常在1至4或者1至5級。然后可將等級和細胞數(shù)的測量組合從而給出具體胚胎的"得分"。對胚胎的評分是高度技巧性的工作，且花費一般臨床胚胎學家約3個月去學習。形態(tài)學評估的主要問題是其涉及的高度主觀性。它不提供發(fā)育潛能的穩(wěn)健檢驗(robusttest)，因為每個啟動的處理周期只有23。/。的平均成功率(REF，HFEA)。在解釋該低成功率(盡管是形態(tài)學上良好的胚胎的轉移)的可能原因中有子宮內膜的接受能力(Bourgain和Devroey，2003;Devroey等，2004;Lukassen等，2004)以及導致連接區(qū)收縮增加的創(chuàng)傷性胚胎轉移(Lesny和Killick的綜述，2004)。很多的數(shù)據(jù)表明在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的胚胎的基因表達圖式發(fā)生改變但是其形態(tài)學上顯示正常(Ho等，1995;Rizos等，2003;Rinaudo和Schultz，2004;Lee等，2004)。因此胚胎可能具有正常的形態(tài)但在其生物化學方面具有改變，這使得目前胚胎學家不可能選擇絕對最好的胚胎用于轉移。在顯微鏡分析之后，只有約50%的冷凍胚胎符合轉移的要求。據(jù)認為，未能存活于冷藏和解凍過程的那些胚胎可能產(chǎn)自活力較差的卵母細胞或精子。冷凍胚胎轉移過程的實際周期與在IVF周期中獲得的"新鮮"胚胎的實際周期相同。共同未決的專利申請WO01/53518顯示在分裂過程中氨基酸的消庫毛/出現(xiàn)("轉化，，)預示備用的"新鮮"人胚胎體外發(fā)育至胚泡期(blastocyststage)的能力(Houghton等，2002)以及導致轉移后懷孕和產(chǎn)生活的后代的能力(Brison等，2004)。這些發(fā)現(xiàn)是與一般理論一致的在發(fā)育的早期決定了發(fā)育能力，且植入前發(fā)育的早期中的擾動可具有長期的牽連(implication)。因為冷藏技術能提供輔助避孕的實際優(yōu)點，所以存在著對可靠地評估解凍后的卵或胚胎的發(fā)育能力的需求。冷藏不是良性的方法，且細胞的許多功能可受到影響。因而對已經(jīng)歷冷藏過程的胚胎的選擇標準不同于在"新鮮"胚胎的選擇中所使用的那些標準。冷凍過的胚胎一般生長較慢，因此形態(tài)學上非常不同于新鮮胚胎。當有著大量的胚胎可用于轉移時，對用于選擇最好胚胎的有效參數(shù)的需求是極為重要的。植入多胚胎已導致無法接受的高比率的多胞胎(multiplebirth)。輔助受孕的目的是制造健康嬰兒，因此減少多胎妊娠率是主要目的，且轉移單個胚胎是理想的。鑒定具有高植入潛能的胚胎的能力將允許更有效地選擇胚胎用于胚胎轉移和在不降低總的懷孕率的條件下降低多胎妊娠的可能性。對用于選擇最有可能發(fā)育至足月的解凍胚胎的有效參數(shù)的需求是極其重要的。
發(fā)明內容根據(jù)本發(fā)明，本文提供了一種評估解凍細胞的存活能力的方法，其中所述細胞為配子(gamete)、胚胎(embiyo)、核體(karyoplast)、推定的干細胞群體、干細胞前體群體或者干細胞群體，所述方法包括在含有眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育解凍細胞和測定該培養(yǎng)基中至少一種M酸的濃度變化。出人意料的是，已發(fā)現(xiàn)單個人胚胎在氨基酸方面的解凍后新陳代謝可用于預測發(fā)育至胚泡期的能力。本發(fā)明的方法同樣適用于其它哺乳動物物種諸如牛和豬。牛胚胎是人的良好模型牛和人一樣通常為單排卵(monovulator)。牛胚胎的直徑還與人胚胎(140"大約相同，且具有作為氧、丙酮酸和葡萄糖消耗和/或乳酸生成測量的大致相似的能量代謝模式。體外生成(IVP)牛受精卵(zygote)在體外達到胚泡期的比例(20-40%)與人受精卵(20-50%)大約相同，且受精卵基因組激活啟動于緊密相關的階段(在人中4-8細胞；在牛中8-16細胞階段)。在桑椹胚(momla):胚泡轉變過程中，豬胚泡的氨基酸新陳代謝模式(profile)在質量上和數(shù)量上類似于由人胚胎給出的，這說明豬胚泡也是人的良好模型。該方法同樣容易適用于不同細胞類型，例如配子(處于任意發(fā)育階段)、核體、推定的干細胞群體、干細胞前體群體或者干細胞群體。這些細胞類型都可被冷凍，且適用本發(fā)明的普通原理。以最廣的意義使用術語存活能力(viability),其中包括胚胎發(fā)育至胚泡期，胚胎的成功植入和植入前篩選方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，如果變化滿足預定標準，則該方法包括選擇所述的用于進一步發(fā)育的解凍細胞的步驟。優(yōu)選該預定的標準是至少一種氨基酸的增加或減少。優(yōu)選培養(yǎng)基包含補充有葡萄糖、L-乳酸、丙酮酸和氨基酸的生理混合物的Earle's平衡鹽溶液。優(yōu)選使用HPLC然后是以鄰苯二曱醛(o-phthaldialdehyde)的衍生化來測量已用(spent)培養(yǎng)基中的氨基酸的濃度。在該方法的一種實施方案中，產(chǎn)生氨基酸消耗或生成模式。優(yōu)選氨基酸消耗或生成模式整體上用作評估解凍細胞的存活能力的選擇標記。在本發(fā)明的一個實施方案中，最有活力的(mostviable)解凍細胞的選擇基于一組氨基酸(通常包括2至7種氨基酸)，這組氨基酸的消耗或生成模式是該物種的健康、發(fā)育中的解凍細胞的指示?；蛘撸钣谢盍Φ慕鈨黾毎倪x擇基于單一的氨基酸，其消耗或生成模式是該物種的健康、發(fā)育中的細胞的指示。優(yōu)選解凍細胞源于任何的生物體，該生物體包括人、牛、豬、羊、任何家畜或稀有和受脅(threatened)物種。在優(yōu)選的實施方案中，該方法用于人。優(yōu)選用于選擇標記的氨基酸包括包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸中的一種或它們的組合。優(yōu)選該方法包括評估解凍的哺乳動物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入的能力，所述方法包括(i)將解凍的哺乳動物植入前胚胎在包含眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育，以及；(ii)測定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度的增加和/或減少以測定氨基酸轉化(turnover)，其中有著較小范圍的氨基酸轉化的解凍的哺乳動物植入前胚胎與發(fā)育至胚泡期和/或成功植入關聯(lián)。發(fā)育至胚泡期和/或植入的步驟。優(yōu)選解凍的哺乳動物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入是在將解凍的哺乳動物植入前胚胎轉移至培養(yǎng)基之后24小時、IO小時、6小時或更少時間內完成的。優(yōu)選使用該方法評估解凍的哺乳動物植入前胚胎用于植入和引起臨床懷孕的能力。通過植入之后15天的血清hCG檢測胚胎轉移后的臨床懷孕并通過在5周時胎心的存在來確認(Brison等，2004)。優(yōu)選從發(fā)育的第1天直至第4天來評估解凍的哺乳動物植入前胚胎。在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法還包括基于氨基酸模式選擇解凍的植入胚胎和將所選的解凍的哺乳動物植入前胚胎引入生物體的子宮(uterinetract)中。在本發(fā)明的一個實施方案中，解凍的哺乳動物植入前胚胎是源于體外成熟的卵的哺乳動物植入前胚胎。或者，解凍的哺乳動物植入前胚胎是源于體內成熟的卯的哺乳動物才直入前胚胎。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過胞質內精子注射(ICSI)制備解凍的哺乳動物植入前胚胎。在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法包括測定至少一種氨基酸(包括利用包含2至7種氨基酸的氨基酸組)的濃度的增大和/或減少，其氨基酸的轉化是該物種的解凍的哺乳動物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入的能力的指示。因此，本發(fā)明提供一種評估解凍的哺乳動物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入的能力的方法，所述方法包括將單個解凍的哺乳動物植入前胚胎在包含眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育，測定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化，其中該濃度變化是解凍的哺乳動物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入的能力的指示。本發(fā)明還提供一種區(qū)別有發(fā)育能力(developmentallycompetent)和發(fā)育停止的(arresting)等級I胚胎的方法，其包括將等級I胚胎在含有眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育和測定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度的變化。發(fā)明詳述只通過實施例并參考了本發(fā)明圖1從發(fā)育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎的氨基酸消耗和出現(xiàn)。對于發(fā)育至胚泡期的胚胎n=21;而對于在胚泡期前發(fā)育停止的胚胎n=25。*尸<0.05;**尸<0.01;***尸<0.001不同于0的顯著性(significancefromzero)。具有相同上標的豎條是顯著不同的；a和b，尸二0.001;c，iM).0025;山尸=0.016;e，尸=0.032;f，P=0.0448。圖2從發(fā)育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎的總氨基酸的生成、消耗、轉化和余額(balance)。*P<0.05;"PO.01;***P<0.001顯著不同于發(fā)育停止的胚胎。圖3從發(fā)育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎所利用的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和。***P<0.001顯著不同于發(fā)育胚胎。圖4發(fā)育停止或發(fā)育至胚泡期的單獨的冷凍解凍的胚胎所利用的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和。圖5從發(fā)育的第2天至第3天等級I解凍的人胚胎的氨基酸消耗和出現(xiàn)。對于發(fā)育至胚泡期的胚胎n=6;對于在胚泡期前發(fā)育停止的胚胎n=13。承PO.05;**尸<0.01;***尸<0.001不同于0的顯著性。具有相同上標的豎條是顯著不同的；a，尸=0.014;b，尸=0.024;c，尸=0.029;d,尸=0.035;e，尸=0.0493;f，尸=0.050。圖6從發(fā)育的第2天至第3天等級I解凍的人胚胎的總氨基酸生成、消耗、轉化和余額。*尸<0.05顯著不同于發(fā)育停止的胚胎。方法獲得被告知的患者同意捐贈用于研究的備用冷凍人胚胎得自在StJames'sHospital,Leeds的輔助受孕單位進行體外受精(IVF)的患者。該工作得到了HumanFertilisationandEmbryologyAuthority(人受孕和胚胎管理局)(HFEA)以及合作機構的倫理委員會(EthicsCommittees)的完全倫理批準。如前所述(Balen，2001)進行卵巢刺激和卯母細胞收集。通常，使用長期垂體脫每文M^呈(longpituitarydesensitisationprotocol),以及鼻內那法瑞4木(nafarelin)給藥，然后是用人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG，Menogon，F(xiàn)erringPharmaceuticalsLtd)或者重組FSH(Puregon，OrganonLaboratoriesLtd)進行促性腺激素刺激。簡而言之，在hCG給藥36h后通過卵泡吸引術收集卵母細胞并于37°C在5%C02中在Medi-CultIVF培養(yǎng)基浸油(Medi-Cult)中培養(yǎng)。在hCG后約40小時，用最終濃度為70,000活動精子每毫升來授精卵母細胞-丘復合體(oocyte-cumuluscomplex),并培育過夜直至通過兩前核的存在來確認受精(授精后第1天)。在受精卵用于研究前，將受精卵同上在70pi的Medi-CultIVF培養(yǎng)基浸油的液滴中培育。在授精后第2天轉移最多3個胚胎，將任何剩余的胚胎冷凍并存儲于液氮中用于可能的將來用途。根據(jù)HFEA的指導，胚胎只可存儲5年，因此每年(onayearlybasis)聯(lián)系患者以確定他們是否愿意將他們的胚胎繼續(xù)存儲、放棄或捐贈用于研究。將這些捐贈用于研究的胚胎以干式運輸(inadryshipper)運輸至York以用于本研究。使用SydneyIVF解凍試劑盒(Cook，Queensland,Australia)將胚胎解凍并置于浸礦油的10plEBSS培養(yǎng)基液滴中約3小時，該EBSS培養(yǎng)基補充有0.5%的HSA,ImM的葡萄糖，0.47mM的丙酮酸(pyruvate)，5mM的乳酸(lactate)和氨基酸的J妄近生理的混合物(aclosetophysiologicalmixtureofaminoacid)(Tay等，1997)。每個患者的胚胎在治療組和所評估的胚胎的發(fā)育等級和階段之間隨機化(Houghton等，2002)。然后將這些胚胎在空氣中于37°C在含有5%的C02和20%或者5%的02的增濕氣氛中在4nl的相同培養(yǎng)基液滴中單獨地培養(yǎng)24h(從第2天至第3天)。在培育后，評估胚胎的形態(tài)學，并將胚胎單獨置于10^1預平衡的培養(yǎng)基液滴中，并在5%或20%的02下培育直至發(fā)育的第5天。將已用的培養(yǎng)基儲存于-80。C。又一次評估發(fā)育階段和等級，然后將胚胎在5%或20%的02下的4jal預平衡的培養(yǎng)基液滴中單獨放置24h直至發(fā)育的第6天。在將胚胎從液滴中移出之前，評價胚胎發(fā)育階段和等級。將已用的培養(yǎng)基儲存于-80。C。氨基酸分析將無胚胎的對照液滴在與含有胚胎的那些液滴相同的培養(yǎng)亞(dish)中培育，從而允許在整個培養(yǎng)周期中氨基酸濃度的任何非特異性變化。解凍已用培養(yǎng)基，并用23nl的HPLC級水稀釋2nl等分試樣。利用附接于JascoF920熒光探測儀和4.5x250mm的HypersilODS-16柱(JonesChromatography)的Kontron500通過反相HPLC進行氨基酸分析，如前所述(Houghton等，2002)。筒單地說，通過使25iiil樣品與等體積的試劑(1(^1的2-巰基乙醇和5ml的鄰苯二曱醛(OPA)試劑)自動反應來完成衍生化。以1.3毫升/分鐘的流速操作洗脫梯度。溶劑A由18ml的四氫吹喃(FisherChemicals),200ml的曱醇和800ml的乙酸鈉(83mmo1/1，pH5.9)組成。溶劑B由800ml的曱醇和200ml的乙酸鈉(83mmo1/1，pH5.9)組成。利用該方法不可能檢測到脯氨酸和半胱氨酸。統(tǒng)計分析利用Anderson-Darling正態(tài)檢驗來分析所有的數(shù)據(jù)以確定它們是否為正態(tài)分布。利用l-樣品t-檢驗或1樣品Wilcoxon檢驗來檢驗氨基酸消耗/出現(xiàn)的數(shù)據(jù)不同于0的顯著性，這取決于該數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布的。利用Student'st-檢驗或Mann-WhitneyU檢驗分析發(fā)育停止的胚胎和發(fā)育中的胚胎的氨基酸模式間的差異。通過Student'st-檢驗分析氨基酸消耗、出現(xiàn)、轉化和余額之間的差異。結果第2天至第3天解凍胚胎的氨基酸轉化培養(yǎng)基顯著地消耗了絲氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸(圖1)，同時出現(xiàn)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。隨后未能發(fā)育至胚泡期的解凍胚胎消耗了谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸，而生成了天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。發(fā)育至胚泡期的那些解凍胚胎和胚泡形成前發(fā)育停止的那些胚胎之間在谷氨酰胺(P-O.OOl)、丙氨酸(P二0.001)、甘氨酸(P^.0025)、谷氨酸^=0.016)、精氨酸(P^.032)和賴氨酸(P^.0448)的利用上存在顯著的差異(圖1)。出乎意料的是，隨后未能發(fā)育至胚泡期的一群冷凍/解凍的第2天至第3天的胚胎比發(fā)育至胚泡期的那些含有更多的等級I胚胎(表l),但是隨后發(fā)育至胚泡的等級I胚胎與胚泡形成前發(fā)育停止的等級I胚胎之間，在每胚胎的裂球平均數(shù)上不存在差異。同樣地，在這兩組之間不存在總平均裂球數(shù)之間的差異(表1)?？偟膩碚f，在胚泡期之前發(fā)育停止的胚胎在氨基酸轉化、消耗(P岣.Oll)和生成(P二0.009)顯著更多的氨基酸方面，比它們發(fā)育中的對等物(counterpart)在代謝上更活躍(圖2)。有趣的是，已發(fā)現(xiàn)發(fā)育中的胚胎在它們的氨基酸轉化方面是平衡的，也就是說，消耗量等于生成量；然而發(fā)育停止的胚胎具有負的余額，也就是說，從培養(yǎng)基中消耗的氨基酸多于它們生成的氨基酸(圖2)。發(fā)育至胚泡期的那些胚胎和在胚泡形成前發(fā)育停止的那些胚胎之間，在從第2天到第3天谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和上存在著顯著的差異(PO.001)(圖3)。使用單獨胚胎的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和，可能以91%準確性預測哪些胚胎將發(fā)育至胚泡期(圖4)。當確定了等級I胚胎的氨基酸模式時，隨后發(fā)育至胚泡期的那些胚胎與在胚泡形成前發(fā)育停止的那些等級I胚胎相比，在氨基酸消耗/出現(xiàn)上存在顯著差異(圖5)。兩組間具體的差異存在于賴氨酸(P二0.014)、甘氨酸(P二0.024)、色氨酸(P二0.029)、精氨酸(P^.035)、谷氨酸(P二0.0493)和谷氨酰胺(P^.050)的利用上。應注意的是等級I發(fā)育停止的胚胎和發(fā)育中的胚胎之間，在裂球平均數(shù)上不存在顯著的差異(表l)。在總氨基酸的消耗、出現(xiàn)或者氨基酸的余額上，等級I胚胎不顯示顯著的差異(圖6)。然而，發(fā)育停止的等級I胚胎在氨基酸轉化方面比發(fā)育至胚泡期的那些胚胎在代謝上更活躍。表l:解凍后胚胎的等級分布和平均裂球數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>討論在從培養(yǎng)基中的氨基酸消耗和氨基酸出現(xiàn)方面測定了冷凍解凍的人胚胎第2天至第3天的新陳代謝，并用于預測它們發(fā)育至胚泡期的能力。這是首次對冷藏人胚胎的能量代謝的研究。獲得的氨基酸模式可用于預測哪個解凍胚胎將發(fā)育至胚泡期；該現(xiàn)象獨立于第2天的胚胎等級和裂球數(shù)。具有發(fā)育至胚泡期能力的那些胚胎比發(fā)育停止的胚胎在代謝上更溫和(quiet),具有更低的氨基酸生成、消耗和轉化速度。類似于Brison等(2004)的研究，冷藏胚胎的氨基酸模式研究還能預測植入和活的后代。這些研究者使用對/人發(fā)育的第1天到第2天測得的ICSI胚胎的氨基酸模式的逆向分析(retrospectiveanalysis)。只基于形態(tài)學在第2天選擇用于轉移的胚胎，并發(fā)現(xiàn)天冬酰胺、甘氨酸和亮氨酸的轉化與臨床懷孕相關。具體地，它們也獨立于已知的預測指標(predictor)如女性年齡、基礎FSH水平、胚胎細胞的數(shù)目和等級。該技術提供了一種靈敏的方法，所述方法可容易地轉化到(translateinto)IVF臨床，和被胚胎學家利用來選擇有發(fā)育能力的解凍胚胎用于轉移。氨基酸模式的使用已證明不但在逆向選擇哪個冷凍解凍的胚胎將發(fā)育至胚泡期上有效，而且在給胚胎學家提供在一群最好等級I胚胎中對發(fā)育潛能進行區(qū)別的工具方面也是有效的。參考文獻BalenAH(2001).GnRHagonistsandsuperovulationforassistedconception.InfertilityandReproductiveMedicineClinicsofNorthAmerica,12,89-104.BourgainC和Devroey，P(2003》TheendometriuminstimulatedcyclesforIVF.HumanReproductionUpdate,9,515-22.BrisonDR，HoughtonFD，F(xiàn)alconerD等(2004)'IdentificationofviableembryosinIVFbynon-invasivemeasurementofaminoacidturnover.HumanReproduction,19，2319-2324.DevroeyP,BourgainC,MacklonNS和FauserBC(2004).ReproductivebiologyandIVF:ovarianstimulationandendometrialreceptivity.TrendsinEndocrinologyandMetabolism,15，84-90.DulioustE，ToyamaK，BusnelMC等(l995).Long-termeffectsofembryofreezinginmice.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA.，92，589-93.EdgarDH,BourneH,SpeirsAL和McBainJC(2000).Aquantitativeanalysisoftheimpactofcyropreservationontheimplantationpotentialofhumanearlycleavagestageembryos.HumanReproduction,15,175-179.Edgar,DH,ArcherJ和BourneH(2005).Theapplicationandimpactofcryopreservationofearlycleavagestageembryosinassistedreproduction.HumanFertility,8，225-230.El-ToukhyT，KhalafY,Al畫DaraziK等(20(B).Effectofblastomerelossontheoutcomeoffrozenembryoreplacementcycles.FertilityandSterility,79，1106-1111.Emiliani,S，VandenBerghM，VanninA-S,BiramaneJ和EnglertY(2000).Comparisonofethyleneglycol,1,2-propanediolandglycerolforcryopreservationofslow-cooledmousezygotes,4-cellembryosandblastocysts.HumanReproduction,15，905-910.Ho，Y，WrigglesworthK,EppigJJ和SchultzRM(1995).PreimplantationdevelopmentofmouseembryosinKSOM:augmentationbyaminoacidsandanalysisofgeneexpression.MolecularReproductionandDevelopment,41,232-238.HoughtonFD,HawkheadJA,HumphersonPG等(2002).Non-invasiveaminoacidturnoverpredictshumanembryodevelopmentalcapacity.HumanReproduction,17，999-1005.[Corrigenda(2003).HumanReproduction,18,1756-1757]HoughtonFD和LeeseHJ(2004).Metabolismanddevelopmentalcompetenceofthepreimplantationembryo.EuropeanJournalofObstetricsandGynecologyandReproductiveBiology,115S,S92-S96.KowalikK，PalermoDQBarmatL等(1998).Comparisonofclinicaloutcomeaftercryopreservationofembryosobtainedfromintracytoplasmicsperminjectionandin-vitrofertilization.HumanReproduction,10，2848-2851.LaneM和GardnerDK(2005).Understandingcellulardisruptionsduringearlyembryodevelopmentthatperturbviabilityandfetaldevelopment.ReproductionFertilityandDevelopment,17，371-378.LesnyP和KillickSR(2004).Thejunctionalzoneoftheuterusanditscontractions.BritishJournalofObstetricsandGynaecology,111，1182-9.LukassenHG,SchonbeckY，vanLieropMJ等(2004).HormonalstimulationforIVFtreatmentpositivelyaffectstheCD56bright/CD56dimNKcellratiooftheendometriumduringthewindowofimplantation.MolecularHumanReproduction,10,513-20.PalL,KovacsG，WittB等(2004).Postthawblastomeresurvivalispredictiveofthesuccessoffrozen-thawedembryotransfercycles.FertilityandSterility,82,821-826.PeggDE(2005).Theroleofvitrificationtechniquesofcryopresevationinreproductivemedicine.HumanFertility,8，231-239.Rinaudo，P和SchultzRM(2004).Effectsofembryocultureonglobalpatternofgeneexpressioninpreimplantationmouseembryos.Reproduction,128，30卜311.RizosD，Gutierrez-AdanA，Perez-GameloS等(2003》Bovineembryocultureinthepresenceorabsenceofserum:implicationsforblastocystdevelopment,cryotolerance,andmessengerRNAexpression.BiologyofReproduction,68,236-243.Tachataki,M,WinstonRM和TaylorDM(2003).QuantitativeRT畫PCRrevealstuberoussclerosisgene,TSC2，mRNAdegradationfollowingcryopreservationinthehumanpreimplantationembryo.MolecularHumanReproduction,10,593-601.TayJI，RutherfordAJ，KillickSR等(1997).Humantubalfluid:production,nutrientcompositionandresponsetoadrenergicagents.HumanReproduction,12，2451-2456.TrounsonA(1986).Preservationofhumaneggsandembryos.FertilityandSterility,46，1-12.Ubaldi,F,RienziL，BaroniE等(2004).Cumulativepregnancyratesaftertransferoffreshandthawedembryos.EuropeanJournalofObstetrics,GynecologyandReproductiveBiology,115，Suppl1:S106-9.VanderElst,J，VandenAbbeelE,VitrierS等(1997).Selectivetransferofcryopreservedhumanembryoswithfarthercleavageafterthawingincreasesdeliveryandimplantationrates.HumanReproduction,7,1513-1521.WinstonRML和HardyK(2002).AreweignoringpotentialdangersofinvitrofertilizationandrelatedtreatmentsNatureCellBiology,4(Sl)，S14-S18.權利要求1.一種評估解凍細胞的存活能力的方法，其中所述細胞是配子、胚胎、核體、推定的干細胞群體、干細胞前體群體或者干細胞群體，所述方法包括在含有眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育解凍細胞和測定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化。2.根據(jù)權利要求1的方法，其還包括如果所述變化滿足預定的標準則選擇所述的解凍細胞用于進一步發(fā)育的步驟。3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中培養(yǎng)基包含Earle's平衡鹽溶液，所述Earle's平衡鹽溶液補充有葡萄糖、L-乳酸、丙酮酸以及氨基酸的生理混合物。4.根據(jù)任意前述權利要求的方法，其中使用HPLC然后是以鄰苯二曱醛的衍生化來測量在已用的培養(yǎng)基中氨基酸的濃度。5.根據(jù)任意前述權利要求的方法，其中產(chǎn)生了氨基酸消耗或生成模式。6.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述氨基酸消耗或生成模式整體上用作評估解凍細胞的存活能力的選擇標記。7.根據(jù)權利要求6的方法，其中最有活力的解凍細胞的選擇是基于通常包括2至7種氨基酸的一組氨基酸，這組氨基酸的消耗或生成模式是該物種的健康、發(fā)育中的解凍細胞的指示。8.根據(jù)權利要求6的方法，其中最有活力的解凍細胞的選擇是基于單一的氨基酸，其消耗或生成模式是該物種的健康、發(fā)育中的細胞的指示。9.根據(jù)任意前述權利要求的方法，其中所述解凍細胞源于任意的生物體，該生物體包括人、牛、豬、羊、任意家畜或者稀有和/或受脅物種。10.根據(jù)權利要求9的方法，其中該方法用于人。11.根據(jù)權利要求10的方法，其中用于選擇標記的氨基酸包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸中的一種或它們的組合。12.根據(jù)權利要求10的方法，其中用于選擇標記的氨基酸是谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸。13.—種區(qū)分有發(fā)育能力的和發(fā)育停止的等級I胚胎的方法，其包括在含有眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育等級I胚胎和測定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化。14.根據(jù)權利要求13的方法，其還包括如果所述變化滿足預定的標準則選擇所述的等級I胚胎用于進一步發(fā)育的步驟。15.根據(jù)權利要求13或權利要求14的方法，其中產(chǎn)生了氨基酸消耗或生成一莫式。16.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述氨基酸消耗或生成模式整體上用作評估細胞的存活能力的選擇標記。17.根據(jù)權利要求16的方法，其中最有活力的細胞的選擇是基于一組氨基酸，優(yōu)選賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。全文摘要本發(fā)明涉及一種評估解凍細胞的存活能力的方法，其中所述細胞是配子、胚胎、核體、推定的干細胞群體、干細胞前體群體或者干細胞群體。該方法包括將解凍細胞在包含眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育和測定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化。文檔編號C12N5/08GK101405387SQ200780010271公開日2009年4月8日申請日期2007年1月26日優(yōu)先權日2006年1月27日發(fā)明者亨利·J·利斯,弗蘭切斯卡·D·霍頓申請人:諾沃塞勒斯有限公司